Спосіб лікування експериментального алергічного енцефаломієліту з використанням фетальних нейроклітин

Спосіб лікування експериментального алергічного енцефаломієліту з використанням фетальних нейроклітин, що включає ін’єкційне введення суспензії фетальних нейроклітин, який відрізняється тим, що як фетальні клітини застосовують алогенні фетальні нейроклітини другої половини вагітності, додатково здійснюють звільнення вказаної суспензії від мертвих клітин та їх уламків шляхом 20-хвилинної преінкубації при кімнатній температурі та вводять її субокципітально. (19) (21) u200603685 (22) 04.04.2006 (24) 15.08.2006 (46) 15.08.2006, Бюл. № 8, 2006 р. (72) Цимбалюк Віталій Іванович, Маркова Ольга Володимирівна, Пічкур Леонід Дмитрович, Васлович Вікторія Вікторівна, Касяненко Юрій Анатолійович (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ 3 в репаративний процес включається загальний попередник усіх клітин нервової тканини - невральні стовбурові клітини та попередники олігодендроцитів. Цей зумовило застосування клітин незрілого мозку в лікуванні ЕАЕ. На сьогодні одним з основних підходів до лікування ЕАЕ є імуносупресивна терапія, яку в останній час доповнюють автотрансплантацією гемопоетичних стовбурових клітин, особливо при тяжких формах захворювання. Цей підхід дозволяє перепрограмувати імунну систему хворих тварин та індукувати толерантність до автоантигенів. Цей підхід є ефективним з точки зору ліквідації запального процесу та затухання алергічних реакцій, проте він передбачає використання алогенних гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку і недостатньо впливає на процеси відновлення вже зруйнованих мієлінових оболонок периферичних нервів. Найближчим аналогом (прототипом) способу лікування ЕАЕ є спосіб, який передбачає введення суспензії живих фетальних клітин, що відповідають ураженим відділам головного і спинного мозку, у лімфатичний вузол. Дану маніпуляцію проводять 3-4 рази з інтервалом 5-7 днів між маніпуляціями [1]. На першому етапі лікування проводять заготівлю фетальніх клітин другого триместра вагітності, потім - ін’єкційне введення фетальних клітин реципієнту у лімфатичний вузол, причому таких трансплантацій може бути 3-4 на курс лікування. Описаний спосіб дозволяє досягти лікувального ефекту у частини пацієнтів, зменшити кількість загострень, збільшити термін ремісії, що було підтверджено даними неврологічного обстеження. Проте одним з факторів, які стримують використання цього способу і змушують більш прискіпливо розглядати результати такого лікування, є розвиток ускладнень після трансплантації фетальних нейроклітин. Так, в дослідженні Миронова Н.В. та інш. (1999) протягом періоду спостереження у 22% випадків після лікування мали місце ускладнення у вигляді алергічних реакцій. Одною з можливих причин розвитку ускладнень є присутність у суспензії, що вводиться, клітинних уламків, клітинних тіл з порушеною цілісністю клітинної оболонки, що завжди має місце при отриманні суспензій з ембріональних та фетальних тканин, їх кріоконсервуванні та культивуванні. Вказані компоненти суспензії, що трансплантується, можуть розглядатися як баласт, який негативно впливає на результати лікування. Завдання, яке вирішує корисна модель, що заявляється, полягає в удосконаленні способу лікування ЕАЕ з використанням фетальних нейроклітин за рахунок оптимізації складу суспензії фетальних нейроклітин, що вводиться, внаслідок чого реціпієнт отримує донорські алогенні клітини з більш високим відновлюючим потенціалом, які не провокують місцеве алергічне запалення, можуть продукувати трофічні фактори та самі інтегруватися в ЦНС реціпієнта, здійснювати замісний ефект, поповнюючи кількісний склад попередників олігодендроцитів, забезпечуючи тим самим умови для 16852 4 ремієлінізації аксонів і зменшення моторного дефіциту. Технічний результат, що досягається корисною моделлю, буде полягати у зниженні частоти несприятливих побічних ефектів. Поставлене завдання досягається тим, що у відомому способі лікування ЕАЕ з використанням фетальних нейроклітин, який включає ін’єкційне введення суспензії фетальних нейроклітин, згідно корисної моделі, в якості фетальних клітин застосовують алогенні фетальні нейроклітини другої половини вагітності, додатково здійснюють звільнення вказаної суспензії від мертвих клітин та їх уламків шляхом 20-хвилинної преінкубації при кімнатній температурі та вводять її субокципитально. Відмінною особливістю способу, що заявляється, є те, що тварині з ЕАЕ субокципитально трансплантують клітинну суспензію, склад якої попередньо оптимізують шляхом звільнення від клітинних уламків та тіл мертвих клітин. Нейрохірургічний підхід - субокципитальне введення - забезпечує доставку необхідних клітинних субстанцій у місця руйнування мієліну, суттєво знижує небажані втрати лікувального ефекту, пов’язані з можливим швидким розпадом трофічних факторів та загибеллю стовбурових клітин. Звільнення суспензії від клітинних уламків, тіл мертвих клітин та живих клітин з вираженими адгезивними властивостями (інфільтруючі ЦНС макрофаги) дозволяє суттєво покращити результати лікування рухових порушень у щурів і знизити частоту розвитку ускладнень у вигляді тимчасового посилення алергічного запалення, прискорити поновлення рухливості тварин. Покращення рухових функцій забезпечується поновленням мієлінізації аксонів. За відомими літературними даними такий спосіб лікування ЕАЕ з використанням фетальних нейроклітин невідомий. Запропонований спосіб лікування здійснюється наступним чином. Забір фетальних нейроклітин самки щура другої половини вагітності проводять шляхом видалення плодів з заплідненої матки. Після цього плід звільняють від навколоплідних оболонок, вилучають тканину головного мозку, звільняють від оболонок та отримують суспензію клітин за допомогою механічної дезагрегації. У тканині ЦНС у другій половині вагітності [2] присутні попередники олігодендроцитів, які можуть сприяти після трансплантації посиленню мієліноутворення, продукуючи відповідні трофічні фактори в органі-мішені (ЦНС). Крім того, вони самі можуть інтегруватися в ЦНС реципієнта, здійснювати замісний ефект, поповнюючи кількісний склад попередників олігодендроцитів, забезпечуючи тим самим умови для ремієлінізації аксонів і зменшення моторного дефіциту. Перед використанням суспензії нейроклітин визначають їх фізико-хімічні властивості, життєздатність, морфологічні показники, функціональну повноцінність. Дно стерильної пластикової чашки Петрі малого діаметру (5см) зрошують стерильним фізіологічним розчином. Потім суспензію нейроклітин переносять у чашку Петрі, розподіляють рівномірно по дну чашки та залишають на 15-20 хвилин у горизонтальному положенні при кімнатній 5 16852 температурі. Суспензію збирають шприцом в ампулу. Наркотизованим тваринам вистригають шерсть на шиї, змащують шкіру 3% спиртовим розчином йоду, проводять пункцію потиличної цистерни і вводять оптимізовану клітинну суспензію у об’ємі 0,05мл (2млн. клітин) інсуліновим шприцом. Введення меншої ніж 2х106 кількості фетальних клітин є малоефективним, оскільки розвивається ефект замалої сили, а застосування більшої кількості клітин може супроводжуватися негативними побічними явищами. Таку трансплантацію на курс лікування проводять одноразово. Конкретний приклад втілення. Білим безпородним щурам розводки віварію Інституту нейрохірургії АМН України у подушечки лап вводили енцефалітогенну емульсію [3]. Через 18 діб відбирали щурів з вираженими клінічними проявами захворювання (ступінь тяжкості ЕАЕ 2-3 бали). Потім з цих тварин формували 2 групи (основну і групу порівняння). Щурам основної групи (група №1) субокципітально трансплантували оптимізовану суспензію фетальних нейроклітин, а щурам групи №2 ендолюмбально трансплантували суспензію фетальних клітин без етапу оптимізації складу. Протокол операції. Назва операції - субокципітальне введення суспензії алогенних фетальних нейроклітин. Після наркотизації тваринам у велику потиличну цистерну введено по 0,05мл (2млн. клітин) оптимізованої (шляхом контакту з пластиковою поверхнею, [4]) суспензії клітин фетального алогенного головного мозку. Через добу після операції неврологічна оці 6 нка стану щурів - стан середньої тяжкості. Суттєве погіршення стану мало місце у 2 з 13 щурів. У післяопераційному періоді (14 діб після операції) методом електронної мікроскопії досліджено ступінь регенераторних змін у спинному мозку. Для цього проводили морфометрію та визначали співвідношення діаметру мієлінової оболонки до діаметру осьового циліндра [5]. У 80% випадків розрахований коефіцієнт дорівнював коефіцієнту, що був отриманий при дослідженні здорових тварин. Результати наведені у таблиці. Щурам групи порівняння (група №2) субокципітально трансплантували суспензію фетальних нейроклітин без етапу оптимізації складу. Протокол операції. Назва операції - субокципітальне введення суспензії алогенних фетальних нейроклітин. Після наркотизації у велику потиличну цистерну тваринам було введено у велику потиличну цистерну по 0,05мл (2млн. клітин) суспензії клітин фетального алогенного головного мозку. Через добу після операції неврологічна оцінка стану щурів - стан середньої тяжкості та важкий. Суттєве погіршення стану мало місце у 6 з 16 щурів. У післяопераційному періоді (14 діб після операції) методом електронної мікроскопії досліджений ступінь регенераторних змін у спинному мозку як співвідношення діаметру мієлінової оболонки до діаметру осьового циліндра [5]. Тільки у 30% випадків розрахований коефіцієнт дорівнював коефіцієнту, що був отриманий при дослідженні здорових тварин. Результати наведені у таблиці. Таблиця Номер групи Кількість тварин 1 13 Кількість випадків погіршення стану на 1-у добу після операції, % 15,4 2 16 37,5 Коефіцієнт товщини мієлінової оболонки через 2 тижня після операції 0,38 (0,33-0,47) 0,41 (0,34-0,53) Р1,2