Спосіб оцінки ефективності трансплантації аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку при ішемії нижніх кінцівок в експерименті

Спосіб оцінки ефективності трансплантації аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку при ішемії нижніх кінцівок (ІНК), що включає проведення клінічного обстеження й інструментальних методів дослідження, який відрізняється тим, що додатково в сироватці крові щурів з ІНК визначають активність креатинкінази (КК) і лактатдегідрогенази (ЛДГ) і, якщо величини активності цих ферментів у процесі лікування досягають їх фізіологічних рівнів від 4016,15 до 4091,03 МО/л для КК і від 542,53 до 545,89 МО/л для ЛДГ, тобто збільшуються в разі їх зниження нижче нижньої межі фізіологічних коливань до терапії і зменшуються в разі підвищення за верхню межу фізіологічних коливань до лікування, трансплантацію оцінюють як ефективну, а за відсутності змін активності даних ферментів у процесі терапії або за наявності негативної динаміки, трансплантацію оцінюють як неефективну. (19) (21) a201014326 (22) 30.11.2010 (24) 25.11.2011 (46) 25.11.2011, Бюл.№ 22, 2011 р. (72) КОМАРЕВЦЕВ ВІТАЛІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, ШИПІЛОВА ІННА ВОЛОДИМИРІВНА, КОМАРЕВЦЕВА ІРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, АНДРОСОВ ЄВГЕН ДМИТРОВИЧ, КОМАРЕВЦЕВА КАТЕРИНА ВІТАЛІЇВНА, АНДРОСОВА МАРИНА ЄВГЕНІЇВНА (73) ДЕРЖАВНИЙ ЗАКЛАД "ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ" (56) И.В.Шипилова, Динамика содержания лактатдегидрогеназы и креатинкиназы в сыворотке крови при ишемии нижней конечности на фоне применения аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в эксперименте, Український журнал екстремальної медицини імені Г.О.Можаєва, Том 9, №3, 2008. C. 98-101. Frank P. Barry, J. Mary Murphy, Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization, Osiris Therapeutics Inc., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36 (2004) 568-584. И.В. Бабушкина , Т.Е. Курильская и др., Характер влияния клеточной трансплантации на течение патологического процесса в условиях подавления белкового синтеза в организме, бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2010, № 6 (76), Часть 1 , Экспериментальные исследования в биотехнологии и медицине, 06.2010. С. 156-159. И.А.Комаревцева, И.В.Шипилова, Состояние уровня фрагментированной ДНК, свободного сфингозина и их связь с антиоксидантной системой при введении мезенхимальных стволовых клеток животным с ишемией нижней конечности, Українсь C2 2 UA 1 3 во нижніх кінцівок, але й відомими труднощами лікування ІНК, що призводить до зниження якості життя, необхідності у високій ампутації, значної загальної смертності. Одним із нових напрямів у лікування хворих на ІНК є трансплантація їм аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку (ТАМСККМ). Показані безпечність та ефективність клітинної терапії як у тварин, так і людини, однак явно недостатньо об'єктивних критеріїв доказу цієї ефективності. Для вибору оптимальної схеми лікування ІНК у кожному конкретному випадку важливо мати об'єктивні критерії ефективності протиішемічної терапії. Тому вельми важливими є спроби виявлення нових, патогенетично значущих тестів наявності ІНК та оцінки результатів проведеного лікування. Існує спосіб оцінки ефективності ТАМСККМ при ІНК шляхом використання такого критерію, як біль у стані спокою [Tateishi-Yuyama E. et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischemia by autologous transplantation of bonemarrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial // Lancet.-2002. - V. 360. - P. 427-435]. Однак згаданий критерій, по-перше, є досить суб'єктивним, а, по-друге, лише в 80 % пацієнтів з ІНК відмічається його зменшення після ТАМСККМ, у той час як у 8 % - навіть посилення. Відомий також спосіб оцінки ефективності ТАМСККМ при ІНК хворих, який включає додаткове врахування загоєння виразок на їх ішемізованих кінцівках [Esato К. et al. Neovascularization induced by autologous bone-marrow cells implantation in peripheral arterial disease // Cell Transplant.-2002. - V. 11(8). -P. 747-752]. Але даний критерій, хоча й є більш об'єктивним, ніж попередній, має місце тільки в 44-67 % пацієнтів з ІНК після здійснення їм ТАМСККМ. Тому був запропонований спосіб оцінки ефективності ТАМСККМ при ІНК хворих, що передбачає додаткове використання показника, отриманого за допомогою інструментального методу дослідження, а саме - кровотоку за Допплером [Teiji О. Treament for limb ulcer with severe ischemia: therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow // Wound Repair Regen.-2004.-V. 12(1).-A5]. Однак ангіографічно розвиток коллатерального кровообігу фіксується лише в 60-78 % випадків дослідження ішемізованих кінцівок після проведення пацієнтам ТАМСККМ. У зв'язку з цим були запропоновані й інші інструментальні показники - перфузійний індекс і тиск кисню [Higashi Y. et al. Autologous bonemarrow mononuclear cell implantation improves endothelium-dependent vasodilation in patients with limb ischemia // Circulation.-2004. - V. 109. - P. 12151218]. Цей спосіб є найбільш ефективним з існуючих і тому вибраний як прототип. До недоліків прототипу належить недостатня його інформативність, оскільки відомі показники свідчать тільки про посилення оксигенації тканин, а до того ж їх покращання виявляються не в усіх 100 % випадків дослідження. Все це, а також відносно висока вартість дослідження не дозволяють 96710 4 використовувати зазначений спосіб для оцінки ефективності лікування хворих на ІНК у повсякденній практиці. Задачею винаходу було підвищення відсотка виявлення, до того ж об'єктивних критеріїв оцінки ефективності ТАМСККМ при експериментальній ІНК з урахуванням їх патогенетичної значущості. Указана задача досягається шляхом визначення в сироватці крові щурів з ІНК, яким вводяться аутологічні мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку (АМСККМ), активності креатинкінази (КК) і лактатдегідрогенази (ЛДГ), тобто ферментів, які є основними, що характеризують саме ішемічне пошкодження скелетної мускулатури. Запропонований спосіб надасть можливість своєчасно оцінювати ефективність використаної терапії залежно від інтенсивності показників ферментемії й використовувати одержані дані для обґрунтованої розробки подальшої лікувальної тактики не тільки експериментальних тварин, а й хворих на ІНК. Одночасне визначення до й після лікування в сироватці крові активності двох ферментів, які відіграють ключову роль в енергетичному забезпеченні м'язової тканини, особливо в умовах недостатнього надходження кисню, і мають на цій підставі певні органоспецифічні властивості щодо цієї тканини, забезпечує під впливом лікування більш точну, більш надійну, більш об'єктивну, тобто більш діагностично інформативну оцінку змін функціонального стану ішемізованої нижньої кінцівки. Діагностика ішемічних пошкоджень нижніх кінцівок звичайно проводиться на підставі клінічних ознак, які в цілому створюють уявлення про ступінь ішемії. Поряд з цим, зміни метаболічних параметрів, викликаних ішемією, повинні віддзеркалювати регіональні й загальні реакції організму у відповідь на порушення гемодинаміки місцевого характеру. Порушення гемодинаміки в крупних магістральних судинах і в системі мікроциркуляції приводить до регіональної ішемії. Організм на розвиток ішемії крім підвищення згортання крові відповідає катаболічними зсувами й розвитком системної запальної реакції. Порушення цілісності плазматичної мембрани міозитів приводить до виходу великих білкових молекул, якими є ферменти. Навіть незначне порушення цілісності плазматичної мембрани клітини приводить до зникнення градієнта концентрації одновалентних катіонів, яке є характерною ознакою живої клітини. Величина активності цитозольних ферментів служить маркером кількості ушкоджених міозитів. Відомо, що генерація аденозинтрифосфату (АТФ) із креатинфосфату й аденозиндифосфату в м'язовій тканині в умовах недостатнього кровопостачання може здійснюватися за рахунок креатинкіназної реакції. Вивчення динаміки активності КК має не тільки діагностичну цінність для оцінки тяжкості ураження, але й дає можливість судити про репаративні процеси в скелетній мускулатурі. Для більш повної оцінки порушення енергетичного гомеостазу й ступеня пошкодження м'язової тканини при модульованих умовах експерименту було проведено вивчення й динаміки активності ЛДГ. Більш 5 96710 довгостроковим механізмом адаптації до зменшення кровопостачання скелетної мускулатури є анаеробний гліколіз, у регуляції протікання якого приймає участь ЛДГ - фермент, що завершує внутрішній окислювально-відновний цикл. Наша пропозиція щодо використання вищевказаних біохімічних показників в якості критеріїв оцінки ефективності ТАМСККМ при ІНК базується на вперше встановленій авторами заявленого способу в експериментальних умовах закономірності, яка полягає в тому, що за змінами саме цих показників є можливість судити як про ступінь ішемічного пошкодження скелетної мускулатури, так і про ефективність лікування, що проводиться. Раніше запропоновані показники як критерії оцінки ефективності ТАМСККМ при ІНК не використовувалися. Заявлений спосіб здійснюється таким чином. У сироватці практично здорових щурів, щурів з ІНК, але без проведення ТАМСККМ, а також з її здійсненням на тлі ІНК визначають активність КК і ЛДГ. На підставі отриманих даних оцінюють ефективність лікування ішемічного пошкодження скелетної мускулатури тварин. Для підтвердження ефективності заявленого способу оцінки ефективності ТАМСККМ при ІНК було обстежено три групи білих безпородних статевозрілих щурів-самців масою 160-200 г: І - без ІНК (інтактна), II - з ІНК без введення АМСККМ 6 (контрольна) і III - з ІНК і введенням АМСККМ (дослідна). ІНК в двох останніх групах тварин вивчали на моделі редукованого кровообігу, яку формували шляхом лігування з подальшим перерізом стегнової артерії під тіопенталовим наркозом. Введення АМСККМ дослідній групі щурів проводили через тиждень після операції. Клітини вводили внутрішньом'язово по ходу судиннонервового пучка в кількості 5 млн. Дослідження проводились у динаміці: через 10, 12, 14, 21, 28 і 34 доби після лігування й перерізання стегнової артерії в контрольній групі й на 3, 5, 7, 14, 21 й 28 добу після введення АМСККМ у дослідній групі. Кожна група включала по 6 щурів. У процесі дослідження було встановлено, що протягом перших двох тижнів спостереження значення активності КК у групі тварин з ІНК, яким не вводили АМСККМ, були вірогідно нижчими (р