Спосіб ізоляції альговірусів мікроводорості phaeodactylum tricornutum (bacillariophyta) з проб морської води

Спосіб ізоляції альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyta) з проб морської води, що включає інокуляцію індикаторних культур мікроводоростей пробами морської води, який відрізняється тим, що вивчення проб води проводять після їх збереження протягом 8-43 днів. Винахід належить до прикладної гідробіології, зокрема до морської вірусології і може бути використаний для значного підвищення результативності ізоляції альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum з проб морської води з метою вивчення їх екології і властивостей, а також екології їх хазяїв - мікроводоростей. Віруси грають важливу і не до кінця вивчену роль в екології морів, роблячи істотний вплив на численні біогеохімічні процеси, ефективно регулюючи чисельність і видову різноманітність представників угруповань бактеріо- і фітопланктону, через трансдукцію викликаючи еволюцію цих мікроорганізмів, беручи участь у формуванні глобального клімату та ін. Значення альговірусів в екології фітопланктону, як основного первинного виробника органічної матерії, відповідального за утилізацію вуглекислого газу і постачання кисню в гідросферу і атмосферу, переоцінити важко. Проте, альговіруси є найменш вивченими серед морських вірусів, у зв'язку з чим, і представляють особливий інтерес як сучасний об'єкт досліджень. Розуміння екології вірусів в гідросфері базу ється на результатах, отриманих при використанні фахівцями безлічі різних методів. Вивчення характеристик окремих морських вірусів збагачує знання по екології водних вірусів. Тому методи ізоляції вірусів і їх удосконалення не втрачають своєї актуальності. Відомий «Спосіб ізоляції альговірусів одноклітинних водоростей, на прикладі Platymonas viridis Rouch (Chlorophita)" (див. Пат.65864а UA №2003065499) заснований на інокуляції індикаторних культур мікроводоростей пробами морської води або іншим матеріалом з подальшим спостереженням появи лізису, що візуально відзначається в експерименті в порівнянні з контролем. Недоліки способу (аналога) полягає в тому, що не були враховані деякі особливості екології вірусів мікропланктону і їх хазяїв. Так не була вивчена і описана можливість відмінностей в чутливості методу і його результативності при інокуляції різних культур мікроводоростей свіжими пробами морської води і пробами після їх збереження протягом 8-43 днів. Відомо, що збереження проб води протягом 5-7 днів збільшує чисельність вірусів мікропланктону на порядок (див. Borcheim Knut, Bratbak G., (19) UA (11) 97293 (13) C2 (21) a201003881 (22) 06.04.2010 (24) 25.01.2012 (46) 25.01.2012, Бюл.№ 2, 2012 р. (72) СТЕПАНОВА ОЛЬГА АРСЕНТІЇВНА (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ ІМ. О.О. КОВАЛЕВСЬКОГО НАН УКРАЇНИ (56) UA 65864 A, 15.04.2004 (5 стор.). Stepanova O.A. “Influence of a tetranucleotide, CGCG, on marine algal viruses”, Ukrainica Bioorganica Acta 1 (2005) 25-27 (2 арк.). Степанова О.А. «Вирусы в крымском регионе черного моря (результаты 1994-2010 гг.)», Наук. зап. Терноп. нац. пед. ун-ту. Сер. Біол., 2010, №3 (44), ISSN 2078-2357 (2 арк.). Степанова О.А., Климчук Д.А., Новиченко В.Н. Первая изоляция альговирусаDunaliella viridis Teod. (Chlorophyta) из черноморской среды», До 3 97293 Heldal M. Enumeration and biomass estimation of planktonic bacteria and viruses by transmission electron microscopy // Appl. and Environ. Microbiol. 1990, 56 №2, P.352-356). Ця специфічна особливість екології вірусів мікропланктону і була врахована при удосконаленні способу-аналога (див. Пат.65864а UA №2003065499) і створенні винаходу «Підвищення результативності способу ізоляції альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyta) з проб морської води». Проте в прототипі (Borcheim et al., 1990) вказано 57 днів зберігання морської води, після чого при прямому рахунку чисельність вірусів мікропланктону збільшується на порядок. У пропонованому винаході йде мова не про загальну чисельність 4 вірусів мікропланктону, яка в основному представлена бактеріофагами (Borcheim et al., 1990; Waterbury J.B. Viruses of marine bacteria // Oceanus. 1992, 35, N3, P.107-108), а про окремих представників вірусних угруповань віропланктону - альговіруси або штами альговірусу мікроводорості Phaeodactylum tricornutum, чисельність яких при тривалому зберіганні збільшується на 3-4 порядки. У таблиці представлені результати ізоляції штамів альговірусу мікроводорості Phaeodactylum tricornutum, отримані як при використанні свіжої морської води, так і після її збереження. Ізоляція штамів альговірусу мікроводорості Phaeodactylum tricornutum (PTV) з свіжих проб чорноморської води й тих, що зберігалися 8-43 дні. Таблиця Місяць і рік забору проб з 4-х станцій 02.2008 03.2008 04.2008 № станції, бухти Севастополя 06.2008 12.2007 №9, Карантинна бухта (колишня мідійна ферма) №7-8 Відкрите море («Віха») №17 Севастопольська бухта (Равелін) №4, Мартинова бухта (мідійна ферма). Час збереження води в днях Разом PTV, виділених із свіжої води/води, яка зберігалась 8-43 дні. -/PtV -/PtV PtV/PtV PtV/PtV -/ -/ -/PtV PtV/PtV PtV/PtV -/ -/PtV -/PtV -/PtV PtV/PtV -/PtV -/ -/PtV PtV/PtV PtV/PtV -/PtV 8 днів 11 днів 28 днів 35 днів 43 дні -12 PTV -/4PtV 3PtV/4PtV 4PtV/4PtV -/2PtV Примітка: (-) - негативний результат, -/PtV, -/-, PtV/PtV - вірусні ізоляти (або їх відсутність) З результатів, представлених в таблиці, видно, що з 20 зразків свіжої морської води було ізольовано 7 штамів PTV. Проте після збереження цих 20 зразків води було ізольовано вже 16 штамів PTV. У разі ізоляції альговірусів від зразків свіжій 1 морської води титр вірусів був визначений до 10 інфекційної одиниці в 1 мл води, тобто не менше ніж 1 віріон в 1 мл морської води. І лише в березні 3 2008 р. він був до 10 інфекційних одиниць в 1 мл, тобто не менше 1000 віріонів в 1 мл води. Титри 16 штамів PTV, ізольованих від зразків води після 3 4 зберігання, були в межах від 10 до 10 інфекційних одиниць в 1 мл води, тобто не менше ніж 1000-10000 віріонів в 1 мл морської води. Наші результати показали, що використання зразків морської води після зберігання понад 8 днів дає кращу можливість ізоляції штамів альговірусу мікроводорості Phaeodactylum tricornutum, чим використання свіжої проби морської води. Логічно припустити, що збільшення на 3-4 ступеня числа вірусів в зразках води після тривалого зберігання - результат активної вірусної інфекції в окремих клітинах їх хазяїв. Так, якщо віруси не були виділені з 2 мл свіжій морської води, це могло бути пов'язано з тим, що їх концентрація була менше ніж 10-100 віріонів в 1 літрі, тобто 1 віріон в 10-100 мл. Але після декількох днів зберігання такої проби води активна вірусна інфекція морських водоростей могла завершитися збільшенням числа вірусів до 1000-10000 віріонів в 1 мл. Таке значне збільшення числа вірусів після зберігання морської води дозволяє успішніше проводити їх ізоляцію біологічними методами з використанням індикаторних культур морських водоростей. Таким чином, на основі отриманих результатів ми запропонували підвищити результативність способу ізоляції альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyta) з проб морської води шляхом такого методичного удосконалення, як використання для ізоляції вірусів морської води після збереження протягом 8-43 днів (при кімнатній температурі і освітленні). Наша пропозиція бере до уваги особливості екології вірусів і хазяїв в морському середовищі. В основі винаходу «Спосіб ізоляції альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyta) з проб морської води» було поставлено задачу удосконалити і підвищити чутливість способу ізоляції альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum шляхом вивчення проб води після їх збереження понад 8 днів, що приводить до збільшення чисельності альговірусів і, відповідно, до збільшення результативності позитивних знахідок. Поставлена задача досягається шляхом використання рідкої культури мікроводорості Phaeodactylum tricornutum у стадії активного зростання (логарифмічна фаза) з подальшим дода 5 ванням до неї в рівних об'ємах досліджуваної проби морської води, яка зберігалася від 8 до 43 днів. Про наявність в пробі альговірусів судять по змінах, що відбуваються в експерименті (спостерігається зникнення червоно-коричневого кольору і каламутності, які є в контролі), за відсутності змін в контролі (культура мікроводорості з додаванням стерильної морської води). Методично пропонований спосіб виконується, як аналоговий з однією умовою - для зараження культури мікроводорості використовується проба морської води (об'єм 1 л) після збереження в прозорій ємкості (скло або пластмаса) за кімнатних умов 8-43 дні. Спосіб реалізується таким чином. Всі описувані процедури пропонованого способу ізоляції альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum проводили при використанні стерильного скляного лабораторного посуду. Як індикаторна культура для ізоляції з проб морської води альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum використовували музейну культуру мікроводорості Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyta), отриману у відділі екологічної фізіології водоростей ІнБПМ НАНУ. Культуру культивували в плоскодонних колбах ємкістю 250-1000 мл в стабілізуючому середовищі Гольдберга при температурі і від 14° до 28 °С і при природній розсіяній освітленості 700-800 лк, або при штучному світлі - не менше 400 лк. Штучне освітлення застосовували в осінньо-зимовий період, коли тривалість світлового періоду дня різко скорочується. Культуру мікроводорості Phaeodactylum tricornutum використовували для ізоляції альговірусів в логарифмічній стадії росту (активній фазі 4 5 зростання) при концентрації не вище 10 -10 кл/мл. При такій щільності клітин культура виглядає червоно-коричневою і люба пригноблююча дія на неї добре помітна. Проби морської води зберігали в об'ємі 1 л в скляній або пластмасовій прозорій ємкості в умовах кімнатної температури (від 14° до 28 °С) і освітленні (при природній розсіяній освітленості 700800 лк, або при штучному світлі - не менше 400 лк). Час зберігання проб морської води складав від 8 до 43 днів. Проведення експерименту: до 2,0 мл культури мікроводорості Phaeodactylum tricornutum, що знаходиться в бактеріологічній пробірці, додається 2,0 мл морської води, яка зберігалася 8-43 дні при кімнатній температурі і освітленні. Як контроль використовується 2,0 мл культури мікроводорості з додаванням 2,0 мл стерильної морської води або стабілізуючого середовища Гольдберга. Експеримент і контроль у бактеріологічних пробірках поміщають в штатив і зберігають в кімнатних умовах (температура від 14° до 28 °С) з природним (700800 лк) або штучним світлом (400-500 лк). Спостереження ведеться впродовж 20 днів. Наявність альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum в досліджуваних пробах 97293 6 морської води визначається по змінах в експерименті - пригноблення або інгібірування зростання мікроводорості - в порівнянні з контролем. Ефект пригноблення спостерігається через 4-7 днів від початку експерименту - мікроводорості осідають на дно, що свідчить про порушення їх рухливості, а надосадок набуває прозорості. Осад спочатку виглядає як плівка на дні пробірки. Потім він поступово блідне і іноді повністю зникає. У контролі спостерігається рівномірний червоно-коричневий колір. Надосадок використовується в подальших пасажах до появи пригноблення зростання мікроводорості. При подальших пасажах (2,0 мл надосадочної прозорої рідини з експерименту додавали до 2,0 мл культури мікроводорості Phaeodactylum tricornutum) ефект пригноблення закріплювався, а час до появи перших ознак пригноблення зменшувався. При проведенні послідовних пасажів встановлювали стабільний латентний період - час до появи перших ознак інгібірування, який складав 3-4 дні, але для деяких штамів альговірусу Phaeodactylum tricornutum цей період становив 24 годині. Якщо ж пригноблення росту мікроводорості спочатку було викликано не вірусами, а, наприклад, токсином або іншим хімічним реагентом, то при подальших пасажах його ефект слабів і врешті-решт пропадав. Якщо ефект пригноблення мікроводорості закріплювався, то після накопичення передбачуваного альговірусного ізоляту, можна проводити його вивчення - визначення інфекційного титру, вивчення морфологічних і біофізичних властивостей, в т.ч. вплив хлороформу, антибіотиків, заморожування, титрування, наявність перехресних зв'язків (контактів з іншими видами мікроводоростей з проявом лізису), серологічні дослідження, очищення, концентрація, електронна мікроскопія та ін. Запропонований спосіб має ряд переваг - дозволяє підвищити результативність ізоляції альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum з проб морської води в 2 і більше разів, в порівнянні з аналоговим (прототипним) способом. - дає правильніше уявлення про розподіл альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum і, відповідно, самій мікроводорості в гідросфері, оскільки є чутливішим способом в порівнянні з аналоговим (прототипним). - не вимагає спеціального лабораторного оснащення, і застосовний в польових умовах, завдяки простоті проведення і доступності. - свідчить про можливість в польових умовах збереження близько 43 днів і транспортувань проб морської води в об'ємі не менше 1 л (у скляній або пластмасовій прозорій ємкості) в умовах температури від 14 до 28 °С і при природній розсіяній освітленості (700-800 лк) або при штучному світлі (не менше 400 лк) з метою ізоляції альговірусів мікроводорості Phaeodactylum tricornutum вже в лабораторних умовах. 7 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 97293 8 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601