Спосіб ізоляції альговірусів одноклітинних водоростей, наприклад platymonas viridis rouch (chlorophita)

Передбачуваний винахід відноситься до прикладної гідробіології і водяної вірусології і може бути використаний для ізоляції альговірусів з водойм з метою подальшого вивчення, а також для непрямого підтвердження наявності у водоймах мікроводоростей, чуттєви х до альговірусів. Мікроводорості водойм - важлива ланка в трофічному ланцюзі гідробіонтів. Певну роль у загибелі мікроводоростей відіграє вірус-наведений лізис, який призводить до 3-5% щоденної втрати їхньої чисельності. Зниження кількості фітопланктону не тільки негативно позначається на балансі органічного вуглецю в гідросфері, але і побічно впливає на підвищення вмісту СО 2 в атмосфері, підсилюючи тепличний ефект. Морська мікроводорость Platymonas viridis Rouch (Chlorophita) поширена повсюдно і, звичайно, цілорічно в Чорному морі. Відома стійкість цієї водорості до впливу полютантів. Однак, практично відсутня інформація про патогенну чорноморську авто хтонну мікрофлору, у т.ч. і про альговіруси мікроводорості P. viridis. Відомий спосіб (див. Крисс А.Е. Бактеріофаг у глибинах моря / Морська мікробіологія (глибоководна) - М.: Видав-во АН СРСР, 1959, -С.258-261), заснований на принципі виділення морського бактеріофага на культурі чуттєвих морських бактерій. У пробірки з 3мл м’ясо-пептонного бульйону додавали 1мл води середньої проби чи 1мл суспензії середнього зразка мулу і петля відповідної 18-20-годинної бульйонної культури, що виділена з води чи мулу. Бактеріофагію спостерігали в засіяному культурою бульйоні, до якого додавали фільтрат, отриманий методом підсіву чи пасажу. Вона проявлялася у вигляді характерної аглютинації культури, чи про неї можна було судити в перші 6 годин спостережень по відсутності каламуті чи зменшенню каламуті бульйону в порівнянні з контрольною пробіркою, яку засівали тією ж культурою без додавання фільтрату. Недоліки способу полягають у тім, що він розроблений і застосовується для бактеріальних культур, а не для водоростей. Автор винаходу використав описані А.Е. Криссом прояви взаємодії бактеріальної чуттєвої (індикаторної до бактеріофага) культури з передбачуваним бактеріофагом. Взаємодія бактерій і вірусів полягала в аглютинації бактеріальної культури й у просвітлінні суміші культури бактерій і вірусів. Цей прояв пригнічення бактеріальної культури при взаємодії клітини і вірусу в рідкому живильному середовищі автор і поклав в основу свого способу ізоляції альговірусів з морського середовища на культурі чуттєви х водоростей. Автор використав культуру мікроводоростей у живильному середовищі Гольдберга за аналогією з бактеріальною культурою в бульйоні. В основу винаходу «Спосіб ізоляції альговірусів одноклітинних водоростей, наприклад, Platymonas viridis Rouch (Chlorophita)» поставлена задача шляхом виявлення взаємодії чуттєвої (індикаторної до бактеріофага) культури мікроводоростей з передбачуваним бактеріофагом, забезпечення дослідників простим і надійним способом виділення альговірусів одноклітинних водоростей. Поставлена задача досягається шляхом використання культури мікроводорості P. viridis на логарифмічній стадії, яку заражають досліджуваним матеріалом (морська вода, мантійна рідина мідій, 10%-ні водяні суспензії організмів обростання) у рівних об'ємах. Про наявність патогенних мікроорганізмів у досліджуваному матеріалі судять за змінами у досліді в порівнянні з контролем. Для закріплення ефекту пригнічення розвитку проводять наступні пасажі в культуру мікроводоростей виявленого інгібіруючого матеріалу. Спосіб реалізується таким чином. До 2,0мл культури мікроводорості (у бактеріологічній пробірці в стабілізуючому середовищі Гольдберга), що знаходиться в логарифмічній стадії додаються 2,0мл досліджуваного матеріалу (морська вода, відцентрифуговані 10хв при 2тис. об/хв мантійна рідина чи 10%-ні суспензії з обрастателів). Як контроль використовують 2,0мл культури мікроводорості з додаванням 2,0мл стерильної морської води чи стабілізуючого середовища Гольдберга. Дослід і контроль освітлюється природним чи штучним світлом (400-500лк). Спостереження ведеться протягом 20 днів. Наявність патогенних мікроорганізмів у досліджуваному матеріалі визначається за змінами у досліді в порівнянні з контролем. У досліді мікроводорості осідають на дно, що свідчи ть про порушення їхньої рухливості, а надосад стає прозорим і безбарвним. Осад поступово блідне, іноді цілком зникає. У контролі він залишається зеленим, а інтенсивність забарвлення збільшується в приповерхньому шарі. Надосад з досліду використовується в наступних пасажах до появи реакції пригнічення. Накопичений передбачуваний альговірусний ізолят піддається подальшому вивченню: вплив хлороформу, антибіотиків, заморожування, титрування і серологічного дослідження, електронна мікроскопія й ін. Приклад реалізації способу. Всі описувані процедури пропонованого способу ізоляції патогенних альговірусів проводили при використанні стерильного скляного лабораторного посуду. Як індикаторну культур у для ізоляції альговірусів з досліджуваного матеріалу (морська вода, мантійна рідина мідій, 10%-на водяна суспензія тканин обростателів стулок раковин, каменів і інших об'єктів) використовували музейну культуру мікроводорості Platymonas viridis Rouch (Сhlоrорhita), отриману у відділі фітопланктону ІнБПМ НАН України. Мікроводорості культивували в плоскодонних колбах ємністю 250-1000мл у стабілізуючому (підтримуючому) середовищі Гольдберга при температурному режимі від 14° до 28°С, при природній розсіяній освітленості 700800лк, або при штучному світлі - не менш 400лк. Штучне освітлення застосовували в осінньо-зимовий період, коли тривалість світлового періоду доби різко скорочується. Культуру мікроводоростей використовували для зараження досліджуваним матеріалом у логарифмічній стадії зростання при концентрації не вище 104кл/мл. При такій щільності клітин культура мікроводорості Platymonas viridis має яскраво-зелене забарвлення і будь-якій вплив на неї дуже добре помітно. Досліджуваний матеріал - морську воду - не піддавали попередній обробці. Її використовували для зараження культури мікроводорості протягом 1-2год. після забору води і не зберігали, тому що відбувається розпад передбачуваних у матеріалі альговірусів, що різко знижує імовірність їхнього виділення. Перед зараженням досліджуваним матеріалом мікроводорость Platymonas viridis розливали по 2,0мл у стерильні бактеріологічні пробірки з використанням стерильних піпеток. Потім у пробірки додавали по 2,0мл досліджуваного матеріалу. У контроль - до 2,0мл культури мікроводорості додавали 2,0мл стабілізуючого середовища Гольдберга. Потім дослідні і контрольні пробірки переносили до штативу і залишали в умовах, описаних вище (при температурному режимі від 14° до 28°С, при природній розсіяній освітленості 700-800лк, або при штучному світлі - не менше 400лк). Спостереження вели протягом 20 днів. Через 7-14 днів спостерігали ефект пригнічення культури мікроводоростей у досліді, який свідчив про наявність у матеріалі патогенних мікроорганізмів. Цей ефект проявлявся в осіданні клітин водорості на дно і просвітлінні надосадової рідини. Через кілька днів осад на дні починав бліднути, а надосадова рідина ставала прозорою. При подальших пасажах (2,0мл надосадової прозорої рідини з досліду додавали до 2,0мл культури мікроводорості) ефект пригнічення розвитку закріплювався, а час до появи перших ознак інгібування скорочувався. При проведенні послідовних пасажів установлювали інкубаційний період (час до появи перших ознак пригнічення), що складав 24-48год. Якщо ж пригнічення було викликано не мікробіологічним об'єктом, а, наприклад, токсином чи іншим хімічним реагентом, то при наступних пасажах його ефект слабшав і кінець кінцем зникав. Якщо ефект інгібування закріплювався, то після накопичення патогенного мікроорганізму, можна проводити його вивчення - визначення титру ін фекційності, вивчення морфологічних та біофізичних власти востей, визначення розміру альговірусів шля хом фільтрування, серологічні дослідження та інше. Запропонований спосіб має ряд переваг: - вперше запропонований спосіб для пошуку альговірусів у морському середовищі на прикладі одноклітинної водорості Platymonas viridis. - не вимагає спеціальних лабораторних умов і може бути застосованим у польових умовах завдяки простоті проведення.