Спосіб визначення вірусного навантаження

Реферат: Спосіб визначення вірусного навантаження включає приготування з досліджуваного матеріалу препарату, нанесення моноклональних антитіл, обробку антивидовою міченою ФІТЦ сироваткою з подальшою оцінкою інтенсивності флуоресценції клітин на ФМЕЛ-1А. З метою підвищення точності діагностики визначають інтенсивність флуоресценції (ІФ) шляхом обчислення різниці середньої флуоресценції клітин і фону, за його значенням визначають ступінь вірусного навантаження: 1,67-1,89 - слабкий; 1,90-2,17 - середній; 2,18-2,78 - високий ступінь навантаження. UA 97513 U (12) UA 97513 U UA 97513 U 5 10 15 20 Корисна модель належить до вірусології. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб виявлення вірусів в інфекційному матеріалі від хворих і тварин шляхом використання ФМЕЛ-1 А, що дозволяє провести кількісну оцінку вірусного навантаження. З метою підвищення точності діагностики визначають інтенсивність флуоресценції (F) шляхом обчислення різниці середньої флуоресценції клітин і фону, за його значенням визначають ступінь вірусного навантаження. Суть способу полягає в наступному: з дотриманням запобіжних заходів у пацієнта проводять взяття крові з антикоагулянтом (гепарин, 20 од/мл). На знежирених предметних скельцях готують адгезивні відбитки, для чого в лунки діаметром 0,5 см із стрічки Parafilm "M" з підкладкою з полизину розкапується отримана суспензія лейкоцитів (еритроцитарна суспензія), яку потім висушують на повітрі. Адгезивні відбитки фіксують в суміші етилового спирту і ацетону у співвідношенні 1:1, проводячи через спирти, знижуючи концентрації 96 % - 15 хв, 60 % - 10 хв, 30 % - 5 хв. Потім проводиться забарвлення препаратів для непрямої імунофлуоресценції з використанням специфічних сироваток і антивидових імуноглобулінів, мічених ФІТЦ. Перегляд препарату проводять за допомогою люмінесцентного мікроскопа з використанням імерсійної системи і нефлуоресційного масла. Для об'єктивної оцінки вірусного навантаження в інфекційному матеріалі використовується ФМЕЛ-1 А, визначають інтенсивність флуоресценції (F) шляхом обчислення різниці середньої флуоресценції клітин і фону: 1,67-1,89 - низький; 1,902,17 - середній; 2,18-2,78 - високий ступінь навантаження. Інтенсивність ( F ) виражається в умовних одиницях флуоресценції (УОФ) за формулою: F  F / Fф , 25 де F - середнє значення інтенсивності флуоресценції 10 клітин; F ф - середнє значення інтенсивності флуоресценції фону. Порівняльні критерії визначення вірусного навантаження методом ПЛР і запропонованим способом наведено в табл. 1. Таблиця 1 Діапазон вірусного навантаження запропонованим способом і методом ПЛР Використаний метод МФА (F, УОФ) ПЛР (МО/мл) 30 35 40 45 50 Низький 1,67-1,89 700.000 Як видно з даних табл. 1, при проведенні паралельних діагностичних досліджень визначена межа вірусного навантаження запропонованим методом співпадає з результатами ПЛР, що свідчить про специфічність способу. Приклад 1. Використання запропонованого методу для вивчення вірусного навантаження у пацієнтів з персистуючою герпесвірусною інфекцією. З дотриманням запобіжних заходів проводили забір крові з антикоагулянтом (гепарин, 20 од/мл) у 130 пацієнтів із встановленим діагнозом - персистуюча герпесвірусна інфекція. Виділяли лейкоцитарну і еритроцитарну масу за стандартною методикою (Караулов А.В. Клінічна імунологія, -М., 1999 г. - 604 с). На знежирених предметних скельцях готували адгезивні відбитки, для чого в лунки діаметром 0,5 см із стрічки Parafilm "M" з підкладкою з полизину розкапували отриману суспензію лейкоцитів (для визначення HSV - еритроцитарну суспензію), яку потім висушували на повітрі. Адгезивні відбитки фіксували в суміші етилового спирту і ацетону у співвідношенні 1:1, проводячи через спирти, знижуючи концентрації 96° - 15 хв, 60° - 10 хв, 30° - 5 хв. Потім проводили забарвлення препаратів для непрямої імунофлуоресценції з використанням специфічних герпетичних сироваток за відомою методикою. Використовували комерційні моноклональні сироватки фірми "Santa Cruz Biotechnologu, Inc" до вірусів: Mouse Herpes Simplex Virus-1 Ig, Mouse Herpes Simplex Virus-2 Ig, Mouse Varicella Zoster Virus Ig, Mouse Anti Epstein-Barr Virus Ig, Mouse Cytomegalo Virus Mosaic Ig, Mouse Herpes Simplex Virus-6 Mosaic Ig; та антивидові імуноглобуліни, мічені ФІТЦ. На мазки наносили робоче розведення специфічної сироватки на 15 хв, а після промивання дистильованою водою наносили антивидові імуноглобуліни, мічені ФІТЦ і мазки поміщали на 25 хв. у термостат при 37±0,5 °C. По закінченні зазначеного часу мазки промивали дистильованою водою, підсушували фільтрувальним папером і переглядали у люмінесцентному мікроскопі з використанням імерсійної системи і нефлуоресцІйного масла. Перегляд препаратів проводили 1 UA 97513 U 5 на люмінісцентному мікроскопі ЛЮМАМ Р5 при збільшенні 90×7. Для об'єктивної оцінки вірусного навантаження використовували ФМЕЛ-ІА, визначали інтенсивність флуоресценції (F) шляхом обчислення різниці середньої флуоресценції клітин і фону за наведеною формулою. Для порівняння паралельно проводили досліди за відомим способом шляхом визначення вірусного навантаження за допомогою RT-ПЛР. Порівняльні дані досліджень методом RT-ПЛР і запропонованим способом наведено в табл. 2. Таблиця 2 Порівняльні дані визначення вірусного навантаження у пацієнтів з персистуючою герпесвірусною інфекцією запропонованим способом і методом RT-ПЛР Герпесвіруси HSV1,2 CMV EBV HHV6 VZV 10 15 Ступінь вірусного навантаження МФА (F, УОФ) ПЛР (МО/мл) 2,56 Високий 790.000 високий 2,73 Високий 880.000 високий 2,07 Середній 400.000 середній 1,68 Низький 150 низький 1,74 Низький 300 низький З табл. 2 видно, що результати іммунолюмінесцентного аналізу з розрахунком інтенсивності флуоресценції повністю співпадають з результатами RT-ПЛР дослідження крові, що говорить про ефективність і специфічність запропонованого способу та можливість його використання як альтернативного дослідження вірусного навантаження у хворих з герпесвірусної інфекцією. Запропонований спосіб визначення вірусного навантаження шляхом визначення інтенсивності флуоресценції (ІФ) дозволяє підвищити точність діагностики вірусних захворювань та контролювати ефективність лікувальної терапії. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб визначення вірусного навантаження, що включає приготування з досліджуваного матеріалу препарату, нанесення моноклональних антитіл, обробку антивидовою міченою ФІТЦ сироваткою з подальшою оцінкою інтенсивності флуоресценції клітин на ФМЕЛ-1А, який відрізняється тим, що з метою підвищення точності діагностики визначають інтенсивність флуоресценції (ІФ) шляхом обчислення різниці середньої флуоресценції клітин і фону, за його значенням визначають ступінь вірусного навантаження: 1,67-1,89 - слабкий; 1,90-2,17 середній; 2,18-2,78 - високий ступінь навантаження. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2