Спосіб відділення вірусного навантаження від зразка панкреатину

Реферат: Винахід належить до способу відділення вірусного навантаження від зразка панкреатину. UA 98820 C2 (12) UA 98820 C2 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід відноситься до способу практично кількісного відділення вірусного навантаження від зразка панкреатину й високочутливому способу кількісного визначення вірусного навантаження у зазначеному зразку панкреатину. Панкреатин являє собою вже давно відому суміш різних компонентів, що мають фізіологічну активність, яку одержують з панкреатичних залоз ссавців. Основними компонентами панкреатину є травні ферменти, насамперед панкреатична ліпаза, а також амілази й протеази. Завдяки його коштовним терапевтичним властивостям і високому ступеню безпеки при застосуванні панкреатин протягом тривалого часу використовують з більшим успіхом як фармацевтичний препарат у ферментній замісній терапії. Щодо цього найбільше значення має панкреатична ліпаза, однак амілази й протеази також вносять значний вклад у терапевтичну сприятливу дію панкреатину. Для терапевтичних потреб панкреатин, як правило, одержують з великої рогатої худоби («бичачий панкреатин») або свиней («свинячий панкреатин»), при цьому свинячий панкреатин з кількісної точки зору має найбільше значення. Методи одержання панкреатину для терапевтичних потреб добре відомі, наприклад, вони описані у публікації EP 0115023 А. Внаслідок того, що панкреатин одержують з організму тварин, вихідні продукти можуть містити небажані біологічні компоненти, такі як бактеріальні або вірусні домішки. Однак протягом більше ніж 100 років комерційного застосування фармацевтичних продуктів, що містять панкреатин, не було зафіксовано жодного випадку шкідливого впливу панкреатину, що містить вірусні домішки, на пацієнтів. Проте, компанії, що роблять фармацевтичні продукти, які одержують з біологічних тканин і/або загальної води організму, випробовують весь зростаючий тиск із боку регулюючих адміністративних органів відносно підвищення рівня безпеки продуктів, що випускаються ними, шляхом зниження вмісту всіх домішок до максимального низького рівня незалежно від того, чи вважається розглянута домішка патогенною для чи людини ні. Таким чином, для застосування панкреатину у фармакологічних продуктах бажано мати у своєму розпорядженні надійні аналітичні методи виявлення й кількісної оцінки таких біологічних домішок. Дотепер не був розроблений надійний метод кількісного виявлення або виділення вірусних домішок у зразку панкреатину. Це, очевидно, обумовлене тим, що компоненти панкреатину, які мають ферментативну активність, несумісні з лініями клітин, які, як правило, застосовують для розмноження вірусів за допомогою методів, відомих звичайним фахівцям у даній області, що ускладнює або навіть унеможливлює визначення титру вірусу у зразку панкреатину. Тільки в останні роки був розроблений метод, що дозволяє виділяти й визначати вірусне навантаження у зразку панкреатину (див. неопубліковану заявку на патент РСТ/ЕР2007/054880). Однак, оскільки вірусне навантаження в отриманих з організму тварин препаратах типу панкреатину дуже мала, то продовжує зберігатися потреба у розробці методів, що мають високу чутливість, виділення й визначення вірусного навантаження у фармацевтичних препаратах, насамперед, у препаратах панкреатину, призначених для фармацевтичного застосування. Таким чином, в основу винаходу було покладене завдання розробити високочутливий спосіб практично кількісного виділення вірусного навантаження зі зразка панкреатину й спосіб кількісного визначення вірусного навантаження у цьому зразку панкреатину. Зокрема, завдання винаходу полягало у тому, щоб розробити спосіб практично кількісного виділення інфекційного вірусного навантаження зі зразка панкреатину й спосіб кількісного визначення інфекційного вірусного навантаження у цьому зразку панкреатину. При створенні винаходу зненацька було встановлено, що вірусне навантаження, насамперед інфекційне вірусне навантаження, у зразку панкреатину можна практично кількісно визначати з високою чутливістю у тому випадку, коли вірусне навантаження спочатку виділяють зі зразка панкреатину за допомогою багатостадійного процесу центрифугування й потім виділене вірусне навантаження кількісно оцінюють з використанням добре відомих вірусологічних методів. В опублікованому JP 12856990 вже був описаний метод концентрування або виділення вірусів гепатиту з використанням нестандартної комбінації низькошвидкісного центрифугування й ультрацентрифугування. Перший варіант здійснення винаходу відноситься до способу виділення вірусного навантаження зі зразка панкреатину, який полягає у тому, що здійснюють наступні стадії, на яких: а) готують рідкий дослідний зразок панкреатину, придатний для центрифугування, зі зразка панкреатину, не змінюючи його вірусного навантаження; 1 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 б) піддають щонайменше одну визначену частину дослідного зразка панкреатину, отриманого на стадії а) способу, щонайменше одному низькошвидкісному центрифугуванню в умовах, в яких віруси, що характеризуються константами седиментації 120 S, не утворюють дебрис; в) відкидають всі тверді відкладення, які необов'язково утворюються на стадії б) способу під час низькошвидкісного центрифугування, і зберігають супернатант дослідного зразка панкреатину; г) піддають щонайменше одну визначену частину супернатанта дослідного зразка панкреатину, отриманого на стадії в) способу, першому ультрацентрифугуванню у середовищі зі східчастим градієнтом, де тривалість першого ультрацентрифугування й відносну відцентрову силу для першого центрифугування вибирають таким чином, щоб вірусне навантаження кількісно транспортувалося з супернатанта дослідного зразка панкреатину у першу цільову фракцію, що перебуває вище приграничного шару або у приграничному шарі між розташованим зверху компонентом градієнта з найменшою концентрацією й розташованим знизу компонентом градієнта з наступною більше високою концентрацією; і кількісно виділяють першу цільову фракцію, що необов'язково включає будь-який дебрис, присутній після центрифугування, що містить вірусне навантаження, з супернатанта дослідного зразка панкреатину; д) піддають першу цільову фракцію, отриману на стадії г), другому ультрацентрифугуванню, де друге ультрацентрифугування здійснюють при відносній відцентровій силі, що перевищує відносну відцентрову силу при першому ультрацентрифугуванні, у градієнтному середовищі того ж типу, що використовують для першого ультрацентрифугування, де градієнтне середовище являє собою градієнтне середовище з більше високою концентрацією у порівнянні з концентрацією компонента градієнта з найменшою концентрацією у першій цільовій фракції, і є) одержують другу цільову фракцію, що містить вірусне навантаження шляхом відкидання верхніх 75 об. % або більше рідини верхнього шару, що відповідає першій цільовій фракції, і одержують нижню фракцію, що відповідає нижнім 25 об. % або менше рідини верхнього шару, і повний шар градієнтного середовища з більше високою концентрацією за винятком будь-якого дебрису, що необов'язково є присутнім після центрифугування. Другий варіант здійснення винаходу відноситься до способу кількісного визначення вірусного навантаження у зразку панкреатину, насамперед інфекційного вірусного навантаження у зразку панкреатину. Наприклад, у другому варіанті здійснення винаходу на додаток до способу, запропонованому у першому варіанті здійснення винаходу, здійснюють після стадії є) способу додаткову стадію ж) способу, який полягає у тому, що кількісно визначають вірусне навантаження у зразку панкреатину шляхом визначення титру вірусної інфекції у цільовій фракції, яка містить вірусне навантаження, що дозволяє визначати інфекційне вірусне навантаження у дослідному зразку. Якщо спеціально не зазначене інше, то всі технічні й наукові поняття, які вживаються нижче, повинні мати у кожному випадку таке ж значення, що звичайно має на увазі фахівець у конкретній області техніки. Діапазони температур, зазначені нижче у даному описі, наприклад, у форматі «0-15°С», означають діапазон температур від 0°C до 15°C, включаючи у кожному випадку границі діапазону. Інтервали часу, зазначені нижче у даному описі, наприклад, у форматі «30-120 хв», означають інтервал часу від 30 хв до 120 хв, включаючи у кожному випадку границі діапазону. Інтервали часу, зазначені нижче у даному описі, наприклад, у форматі «2-8 год», означають інтервал часу від 2 год до 8 год, включаючи у кожному випадку границі діапазону. Діапазони відносної відцентрової сили, зазначені нижче у даному описі, наприклад, у форматі «1500-5000 x g», означають відносну відцентрову силу, що перебуває у діапазоні від 1500 x g до 5000 x g, включаючи у кожному випадку границі діапазону. Діапазони об'єму, зазначені нижче у даному описі, наприклад, у форматі «10-15 мл», означають діапазон об'єму від 10 мл до 15 мл, включаючи у кожному випадку границі діапазону. Діапазони мір довжини, зазначені нижче у даному описі, наприклад, у форматі «80-100 мм», означають діапазон мір довжини від 80 мм до 100 мм, включаючи у кожному випадку границі діапазону. Спосіб, запропонований у винаході, можна застосовувати для всіх типів панкреатину тваринного походження й зокрема його можна застосовувати для звичайних, що поступають у продаж, типів свинячого панкреатину й бичачого панкреатину. Переважно спосіб здійснюють на зразках свинячого панкреатину. Спосіб, запропонований у винаході, у цілому можна застосовувати для виділення вірусного навантаження зі зразка панкреатину й наступного кількісного визначення вірусного навантаження у зразку панкреатину. Зокрема, спосіб можна застосовувати для виділення й кількісного визначення вірусного навантаження у зразках панкреатину, де вірусне навантаження являє собою ротавірус А корів, вірус енцефаломіокардиту (EMCV), цирковірус свиней (PCV), 2 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 парвовірус свиней (PPV), ротавірус А свиней, тешовірус свиней і/або вірус захворювання свиней з везикулярним синдромом (SVDV). Завдяки дуже близьким властивостям людський Коксаки-вірус В 5/1 можна використовувати як модель для перевірки придатності способу, запропонованого у винаході, для виділення й/або кількісного визначення SVDV. Завдяки дуже близьким властивостям ротавірус А корів (наприклад, штам В 223) можна використовувати як модель для перевірки придатності способу, запропонованого у винаході, для виділення й/або кількісного визначення ротавірусу А свиней. Спосіб, запропонований у винаході, можна застосовувати також для визначення вірусного навантаження, обумовленого вірусом гепатиту E (HEV), у зразку панкреатину шляхом виділення вірусного навантаження відповідно до описаного способу й наступного аналізу за допомогою відомих методів, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або тощо. Застосовуваний на стадії а) способу, запропонованого у винаході, рідкий дослідний зразок панкреатину, який можна використовувати для центрифугування, одержують зі зразка панкреатину без зміни або модифікації у ньому вірусного навантаження, насамперед інфекційного вірусного навантаження. Це можна здійснювати, наприклад, шляхом готування суспензії дослідного зразка панкреатину зі зразка панкреатину. Суспензію дослідного зразка панкреатину готують, наприклад, шляхом об'єднання зразка панкреатину з середовищем для культури клітин, яка придатна для лінії клітин, що використовується для культивування призначених для вивчення видів вірусу, і з одним або декількома антибіотиком(ами), придатним(и) для цієї мети. В іншому варіанті здійснення винаходу суспензію дослідного зразка панкреатину одержують шляхом об'єднання зразка панкреатину з фізіологічним розчином, зокрема, із забуференним фосфатом фізіологічним розчином («ЗФР», рН 7,2). Як правило, для одержання розчину антибіотиків, що необов'язково застосовують на стадії а) способу, можна використовувати будь-які антибіотики. Як правило, застосовують антибіотики широкого спектра дії або суміші таких антибіотиків широкого спектра дії. Придатні антибіотики можна вибирати, наприклад, із групи, що включає антибіотики β-лактамового типу, такі як пеніциліни, цефалоспорини (включаючи оксацефеми й карбацефеми), карбапенеми й монобактами; стрептоміцин (включаючи стрептоміцину сульфат); неоміцини (включаючи неоміцин А, неоміцин В і паромоміцин); канаміцини (включаючи канаміцин, гентаміцин, амікацин і тобраміцин); спектиноміцин; тетрацикліни (включаючи тетрациклін, окситетрациклін, доксициклін і міноциклін); макролідні антибіотики (включаючи еритроміцин, кларитроміцин, рокситроміцин, азитроміцин, йозаміцин і спіраміцин); інгібітори гірази (включаючи налідиксинову кислоту, циноксацин, піпемідинову кислоту, норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин і флероксацин); антагоністи фолієвої кислоти (включаючи сульфонамідні антибіотики, діамінобензилпіримідини та їх комбінації); хлорамфенікол; лінкозаміди; глікопептидні антибіотики (включаючи ванкоміцин і тейкопланін); фосфоміцин; поліпептидні антибіотики (включаючи поліміксин В, колістин, бацитрацин і тиротицин) і мупіроцин. Кращими антибіотиками є стрептоміцину сульфат і пеніцилін, і суміші стрептоміцину сульфату й пеніциліну, наприклад, «коктейль» з антибіотиків. Один або декілька антибіотиків можна застосовувати, наприклад, у вигляді розчину у розчиннику, що придатний для одного або декількох антибіотиків у кожному випадку, тобто у вигляді розчину антибіотиків. Суспензію дослідного зразка панкреатину, як правило, готують при охолодженні до температури 0-15°C, наприклад, до температури 4- 10°C. Компоненти для одержання суспензії дослідного зразка панкреатину, як правило, перемішують при охолодженні на льоді протягом щонайменше 30 хв, наприклад, 30-120 хв, переважно 45-90 хв, зокрема, протягом 50 або 60 хв. Ціль охолодження суспензії дослідного зразка панкреатину у кожному випадку полягає у тому, щоб уникнути або щонайменше істотно знизити будь-яку небажану дезактивацію вірусного навантаження, обумовлену компонентами, що мають ферментативну активність, які є присутніми у зразку панкреатину. У тому випадку, коли для готування суспензії дослідного зразка панкреатину використовують середовище для культур клітин, то вибір середовища для культур клітин, що застосовується у кожному випадку для готування суспензії дослідного зразка панкреатину на стадії а) способу, визначається тим, які види вірусів потрібно виділяти й/або кількісно визначати за допомогою способу, запропонованого у винаході. Для культивування й виявлення конкретних видів вірусів використовують дозволені для застосування культури клітин, в яких види вірусів, що підлягають вивченню, ініціюють, якщо це можливо, цитопатичний ефект (CPE). CPE приводить до модифікації заражених вірусом клітин, яку можна виявляти за допомогою світлової мікроскопії. Якщо види вірусів розмножуються у культурі клітин без CPE, то, як правило, таке розмноження можна, проте, виявити за допомогою добре відомих непрямих методів виявлення. 3 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Якщо, наприклад, потрібно виділити й/або кількісно визначити ротавірус А корів, то можна, наприклад, застосовувати для його культивування клітини нирки ембріона мавпи (клітини лінії MA-104). У цьому випадку як середовище для культури клітин можна застосовувати добре відому модифіковану за методом Дульбекко середовище Голка (середовище Дульбекко). Якщо потрібно виділити й/або кількісно визначити EMCV, то для його культивування можна застосовувати клітини нирки свині (клітини лінії PK-15) або клітини нирки ембріона свині (клітини лінії SPEV). У випадку клітин лінії PK-15 можна застосовувати як придатне середовище для культури клітин, наприклад, добре відоме мінімальне незамінне середовище (MEM). У випадку клітин лінії SPEV як середовище для культури клітин можна застосовувати середовище Дульбекко. Якщо, наприклад, потрібно виділити й/або кількісно визначити PCV, то для його культивування можна використовувати, наприклад, клітини лінії PK-15. Якщо, наприклад, потрібно виділити й/або кількісно визначити PPV, то для його культивування можна використовувати, наприклад, клітини нирки свині (клітини лінії SK-6). У цьому випадку як середовище для культури клітин можна застосовувати, наприклад, середовище Дульбекко. Якщо, наприклад, потрібно виділити й/або кількісно визначити ротавірус А свиней, то для його культивування можна використовувати, наприклад, клітини лінії MA-104. Якщо, наприклад, потрібно виділити й/або кількісно визначити тешовірус свиней, то для його культивування можна використовувати, наприклад, клітини лінії PK-15. Якщо, наприклад, потрібно виділити й/або кількісно визначити SVDV, то для його культивування можна використовувати, наприклад, клітини лінії SPEV. Фахівець у даній області має відомості про те, які лінії клітин придатні для культивування конкретних видів вірусів і які середовища для культивування клітин можна використовувати для цієї мети. Види вірусів, які можна застосовувати згідно з даним винаходом, і придатні для цієї мети лінії клітин можна одержувати з відповідних джерел, таких, наприклад, як «Американська колекція типових культур (American Type Culture Collection)», Манассас, США (ATCC), «Німецька колекція мікроорганізмів і клітинних культур ГмбХ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Брауншвейг, Німеччина (DSMZ), «Інститут ФрідріхаЛеффлера (Friedrich-Loffler-Institut)», Федеральний дослідницький інститут ветеринарії (Federal Research Institute for Animal Health), Інзель Риме, Німеччина (FLI) або «Відділення ветеринарної служби (Veterinary Service Division)» «Департаменту сільського господарства й сільського розвитку (Department of Agriculture and Rural Development)», Белфаст, Великобританія (DARD). На стадії б) способу дослідний зразок панкреатину, отриманий на стадії а) способу, можна або використовувати повністю, або можна використовувати визначену частину дослідного зразка панкреатину, зокрема, визначений об'єм цього дослідного зразка панкреатину. Переважно дослідний зразок панкреатину, отриманий на стадії а) способу, використовують повністю. На стадії б) способу при здійсненні низькошвидкісного центрифугування можна створювати умови, в яких віруси, що характеризуються константами седиментації 120 S, насамперед від 120 S до 5000 S, ще не утворюють дебрис. Як правило, віруси, що характеризуються константами седиментації 120 S, насамперед віруси, що характеризуються константами седиментації від 120 S до 5000 S, ще не утворюють дебрис, коли низькошвидкісне центрифугування здійснюють при відносно невеликих відцентрових силах, що становлять у кожному випадку менше 15000 x g, переважно становлять у кожному випадку 8000-15000 х g, найбільше переважно становлять у кожному випадку 102000-13500 x g, наприклад, становлять у кожному випадку 10800 x g. Тривалість стадії низькошвидкісного центрифугування звичайно становить щонайменше 5 хв, як правило, 5-60 хв, насамперед 10-45 хв, переважно 10-30 хв, наприклад, 15 хв. У кращому варіанті здійснення стадії б) способу стадії низькошвидкісного центрифугування здійснюють при охолодженні до температури 0-15 C, наприклад, до температури 4-10 C, переважно в охолоджуваній центрифузі. Мета здійснення процедур низькошвидкісного центрифугування на стадії б) способу полягає в основному у видаленні з суспензії панкреатину таких компонентів панкреатину, як нерозчинні частки й тощо, які руйнуються у процесі виділення й/або кількісного визначення вірусного навантаження у зразку панкреатину, для одержання супернатанта дослідного зразка панкреатину, придатного для подальшого процесингу. Таким чином, тверді відкладення, які необов'язково одержують на стадіях низькошвидкісного центрифугування, як правило, відкидають при здійсненні стадії в), у той час як супернатант використовують на наступній стадії г) способу. Стадії низькошвидкісного центрифугування з наступним відкиданням необов'язково отриманих при цьому твердих відкладень, як правило, повторюють доти, поки тверді відкладення не перестають утворюватися. Як правило, після здійснення 1-3 повторів, зокрема, уже після одного повтору, не потрібно додаткових повторів стадій низькошвидкісного центрифугування з наступним відкиданням необов'язково отриманих при цьому твердих 4 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відкладень. В одному з варіантів здійснення винаходу тверде відкладення, отримане при здійсненні стадії б) способу, може являти собою осад або дебрис. В одному з варіантів здійснення винаходу здійснюють відмивання відкладення, отриманого на стадіях низькошвидкісного центрифугування, перед його відкиданням один раз або більше, наприклад, 1-3 рази, за допомогою придатної рідини для відмивання. Придатною рідиною для відмивання може служити, наприклад, сам супернатант дослідного зразка панкреатину, отриманий після низькошвидкісного центрифугування, що потім можна застосовувати на стадії г) способу. Якщо рідина для відмивання відмінна від супернатанта дослідного зразка панкреатину, то після завершення відмивання відкладення її поєднують з супернатантом дослідного зразка панкреатину й потім використовують на стадії г) способу. Найбільше переважно здійснювати відмивання відкладення зазначеним вище чином перед здійсненням стадії г) способу у тому випадку, коли вірусне навантаження зразка панкреатину являє собою EMCV. Конкретним варіантом здійснення винаходу є також супернатант дослідного зразка панкреатину, який можна одержувати відповідно до зазначених вище стадій а)-в) способу. Як середовище зі східчастим градієнтом для стадії г) способу, як правило, використовують східчастий двофазний градієнт сахарози. Середовище зі східчастим градієнтом переважно являє собою градієнт, отриманий за допомогою 50% (мас/об.) забуференного розчину сахарози й 20% (мас/об.) забуференного розчину сахарози. Як буфер для розчинів сахарози можна застосовувати, наприклад, нейтральні буфери (тобто буфери зі значенням рН приблизно 7). Переважно як буфер застосовують ЗФР («забуференний фосфатом фізіологічний розчин», рН 7,2). Як правило, використовують стерильні середовища з градієнтом. Двофазний східчастий градієнт сахарози зазначеного вище типу забезпечує найбільш придатні умови для осадження й отже для виділення вірусів, які можуть бути виявлені. Крім того, східчасті градієнти сахарози, насамперед отримані як зазначено вище за допомогою 50% (мас/об.) необов'язково забуференного розчину сахарози й 20% (мас/об.) забуференного розчину сахарози, створюють придатні осмотичні умови, які не приводять до дезактивації будь-якого присутнього вірусного навантаження. Ультрацентрифугування, що здійснюється на стадії г) способу, гарантує, наприклад, що вірусне навантаження, джерелом якогоє зразок панкреатину, практично кількісно переноситься з супернатанта дослідного зразка панкреатину у середовище зі східчастим градієнтом. Поняття «практично кількісно» у цьому випадку означає, що вірусне навантаження, яке спочатку додане до дослідного зразка, виділяється настільки поеністю, що різниця між титром вихідного вірусного навантаження й титром вірусного навантаження, виділеного у результаті ультрацентрифугування, дорівнює або становить менше половини одиниці десяткового логарифма титру вірусу (0,5 log-одиниці). Крім того, перше ультрацентрифугування відповідно до стадії г) способу гарантує, що вірусне навантаження переноситься у першу цільову фракцію, досить віддалену від дослідного зразка панкреатину, щоб можна було механічно відокремити її від дослідного зразка панкреатину без якого-небудь повторного змішання фаз, що порушує необхідне відділення. Стадію г) способу звичайно здійснюють шляхом внесення в ультрацентрифужну пробірку взятого у певному обсязі середовища для градієнтного центрифугування (градієнтного середовища) з найбільшою концентрацією, на яку нашаровують взяті у певному обсязі градієнтні середовища з наступними більше низькими концентраціями. Цей процес повторюють стільки разів, скільки необхідно для одержання багатофазного градієнтного середовища, де кінцевий (верхній) шар являє собою об'єм рідкого дослідного зразка панкреатину, з якого потрібно виділити вірусне навантаження. У випадку двофазного градієнтного середовища на обсяг градієнтного середовища з наступною більше низькою концентрацією відразу нашаровують об'єм рідкого дослідного зразка панкреатину або суспензії дослідного зразка панкреатину (об'єм дослідного зразка панкреатину), призначеного для центрифугування. У випадку двофазного градієнтного середовища це дозволяє створювати в ультрацентрифужній пробірці наступну послідовність фаз (зверху донизу): перший шар, що представляє собою об'єм дослідного зразка панкреатину (верхній шар), потім обсяг градієнтного середовища з найменшою концентрацією (середній шар, наприклад, що представляє собою 20% (мас/об.) забуференного розчину сахарози) і, нарешті, обсяг градієнтного середовища з найбільшою концентрацією (нижній шар, що покриває дно ультрацентрифужної пробірки; наприклад, 50% (мас/об.) забуференний розчин сахарози). При нашаровуванні кожного з обсягів необхідно дотримувати обережності для того, щоб гарантувати, що на відповідних границях не виникало турбулентності або перемішування. Перша цільова фракція, що використовується на стадії г) способу, як правило, являє собою (І) частину градієнтного середовища з найменшою концентрацією, яка досить віддалена й 5 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 відділена від об'єму дослідного зразка панкреатину, і (II) весь обсяг градієнтного середовища з наступною більше високою концентрацією. У випадку двофазного градієнтного середовища цільова фракція являє собою, наприклад, частину градієнтного середовища з найменшою концентрацією, яка досить віддалена й відділена від об'єму дослідного зразка панкреатину, і весь обсяг градієнтного середовища з найбільшою концентрацією, що простягається до дна ультрацентрифужної пробірки, необов'язково включаючи дебрис, який перебуває на дні цієї пробірки. При розрахунку положення першої або другої цільової фракції, яка досить віддалена від об'єму дослідного зразка панкреатину для того, щоб можна було здійснювати наступне відділення, варто мати на увазі, що одержувані розрахунком значення для положення часток (тобто положення вірусних часток, виділених зі зразка панкреатину), як правило, відповідають вершині гауссовського розподілу. У такому випадку частки повинні бути розподілені як вище, так і нижче їх отриманого розрахунком положення. Таким чином, при визначенні необхідної відстані цільової фракції від об'єму дослідного зразка панкреатину необхідно брати додатковий запас для обліку гауссовського розподілу положень часток. Вірусне навантаження звичайно переносять у цільову фракцію, яка досить віддалена від об'єму дослідного зразка панкреатину для того, щоб можна було здійснювати наступне відділення, якщо частки, що характеризуються константою седиментації, що становить 120 S, зокрема від 120 S до 5000 S, мігрували внаслідок ультрацентрифугування з об'єму дослідного зразка панкреатину щонайменше на 10 мм, наприклад, щонайменше на 15 мм, щонайменше на 20 мм, щонайменше на 25 мм або щонайменше на 30 мм у градієнтне середовище з найменшою концентрацією. У випадку описаного вище двофазного градієнтного середовища градієнтне середовище з найменшою концентрацією являє собою 20% (мас/об.) забуференного розчину сахарози. В одному з варіантів здійснення стадії ультрацентрифугування практично всі частки, що характеризуються константою седиментації, що становить 120 S, зокрема, що становить від 120 S до 5000 S, повністю проходили через градієнтне середовище з найменшою концентрацією й концентрувалися у приграничному шарі, що примикає до градієнтного середовища з наступною більше високою концентрацією (тобто на «сахарозній подушці»). Фахівець у даній області повинен мати відомості про придатні методи розрахунку й вміти застосовувати відповідні умови для ультрацентрифугування. Придатні умови для ультрацентрифугування можна визначати на основі характеристик вірусу(ів), що підлягає(ють) виділенню зі зразка панкреатину (наприклад, щільності й константи седиментації), при цьому мається на увазі, що можна застосовувати добре відомі спрощення (див., наприклад, Lebowitz і ін., «Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review»; Protein Science 11, 2002, cc. 2067-2079). За умови, що перше ультрацентрифугування здійснюють з використанням звичайних об'ємних співвідношень і у середовищі зі східчастим градієнтом, переважно у двофазному східчастому градієнті сахарози, то вірусне навантаження, як правило, транспортують у першу цільову фракцію, придатну для наступного виділення за допомогою другого ультрацентрифугування, якщо перше ультрацентрифугування здійснюють протягом щонайменше 1 год, як правило, щонайменше 4 год, наприклад, протягом щонайменше 9 год, наприклад, протягом 9-20 год, зокрема, протягом 12-18 год. Придатна відносна відцентрова сила для першого ультрацентрифугування, зазначеного у даному описі, становить щонайменше 50000 x g і/або менше 150000 x g. В одному з варіантів здійснення першої стадії ультрацентрифугування зазначену стадію здійснюють протягом 12-18 год при відносній відцентровій силі, що становить 50000-150000 x g,B об'ємних співвідношеннях, що звичайно застосовуються для ультрацентрифугування, і у градієнті, отриманому з використанням 50% (мас/об.) забуференного розчину сахарози й 20% (мас/об.) забуференного розчину сахарози. В іншому варіанті здійснення першої стадії ультрацентрифугування зазначену стадію здійснюють протягом 15-17 год при відносній відцентровій силі, що становить 70000-120000 x g, B об'ємних співвідношеннях, що звичайно застосовуються для ультрацентрифугування, і у градієнті, отриманому з використанням 50% (мас/об.) забуференного розчину сахарози й 20% (мас/об.) забуференного розчину сахарози. Об'ємні співвідношення, що звичайно застосовуються для ультрацентрифугування, одержують, наприклад, у тому випадку, коли застосовують звичайні ультрацентрифужні пробірки. Звичайними ультрацентрифужними пробірками у цьому випадку є, наприклад, пробірки, що мають об'єм 10-50 мл, зокрема, 25-50 мл. У тому випадку, коли на стадії г) способу використовують звичайну ультрацентрифужну пробірку, обсяг середовища для градієнтного ультрацентрифугування з найбільшою концентрацією (наприклад, 50% (мас/об.) забуференного розчину сахарози) може становити, наприклад, до 2 мл, обсяг градієнтного середовища з наступною більше низькою концентрацією (наприклад, 20% (мас/об.) 6 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забуференного розчину сахарози) може становити, наприклад, до 14 мл, і об'єм дослідного зразка панкреатину може становити, наприклад, до 17 мл. Друге ультрацентрифугування здійснюють на стадії д) з використанням першої цільової фракції, отриманої на стадії г), поміщаючи зазначену першу цільову фракцію на подушку градієнтного середовища. Зазначена подушка градієнтного середовища являє собою, наприклад, градієнтне середовище того ж типу, що застосовували при здійсненні першого ультрацентрифугування, при цьому градієнтне середовище являє собою градієнтне середовище з більше високою концентрацією у порівнянні з концентрацією компонента градієнта з найменшою концентрацією першої фракції. Наприклад, якщо у випадку першого ультрацентрифугування східчастий градієнт для центрифугування при використанні описаної вище системи являє собою 20% (мас/об.) забуференного розчину сахарози й 50% (мас/об.) забуференного розчину сахарози, то отримана перша цільова фракція являє собою забуференний розчин сахарози з концентрацією більше 20% (мас/об.) і менше 50% (мас/об.). У цьому випадку сахарозна подушка може являти собою 50% (мас/об.) забуференного розчину сахарози. Перша цільова фракція, що використовується на стадії г), як правило, містить також весь, необов'язково присутній після першого центрифугування. Друге ультрацентрифугування здійснюють протягом щонайменше 1 год, як правило, протягом щонайменше 2 год, наприклад, протягом 2-8 год, зокрема, протягом 3-6 год. Придатна відносна відцентрова сила для зазначеного у даному описі другого ультрацентрифугування становить щонайменше 100000 x g, наприклад, перевищує 150000 x g, наприклад, становить 150000-350000 x g. B одному з варіантів здійснення другої стадії ультрацентрифугування зазначену стадію здійснюють протягом 3-6 год при відносній відцентровій силі 200000-350000 x g при об'ємних співвідношеннях, загальноприйнятих при здійсненні ультрацентрифугування. В іншому варіанті здійснення другої стадії ультрацентрифугування зазначену стадію здійснюють протягом 4,5-5,5 год при відносній відцентровій силі 250000-300000 x g при об'ємних співвідношеннях, загальноприйнятих при здійсненні ультрацентрифугування. Об'ємні співвідношення, що звичайно застосовуються для ультрацентрифугування, одержують, наприклад, у тому випадку, коли застосовують звичайні ультрацентрифужні пробірки. Звичайними ультрацентрифужними пробірками у цьому випадку є пробірки, що мають об'єм 1015 мл, зокрема, 12-13 мл; внутрішній радіус 6-8 мм, зокрема, 7 мм, і висоту 80-100 мм, зокрема, 85-95 мм. У тому випадку, коли на стадії г) способу використовують звичайну ультрацентрифужну пробірку, обсяг градієнтної подушки (наприклад, 50% (мас/об.) забуференного розчину сахарози) може становити, наприклад, до 0,5 мл, а об'єм першої цільової фракції може становити, наприклад, до 10 мл. Даний винахід дозволяє проводити виявлення з межею виявлення, що становить аж до однієї інфекційної одиниці на один грам зразка панкреатину, який використовується як вихідний продукт. У кращому варіанті здійснення стадій г) і д) способу поза залежністю від інших вибраних умов ультрацентрифугування здійснюють при охолодженні до температури 0-15 C, переважно до температури 4-10 C. На цій стадії способу можна застосовувати звичайні охолоджувані центрифуги, відомі фахівцеві у даній області. На стадіях г) і д) способу, як правило, застосовують звичайну, що поступає у продаж, ультрацентрифугу, таку як охолоджувана ультрацентрифуга з ротором з хитними склянками, наприклад, ультрацентрифуга Sorvall з ротором з хитними склянками моделі «ТН-641». Фахівець у даній області, опираючись, насамперед на додаткову технічну інформацію, наведену в описі даного винаходу, може підвищувати або знижувати масштаб описаних вище стадій низькошвидкісного центрифугування й стадій ультрацентрифугування, запропонованих у винаході, у будь-якому необхідному ступені. На стадіях г) і є) способу першу або другу цільову фракцію, що містить вірусне навантаження, кількісно виділяють з супернатанта дослідного зразка панкреатину й першої цільової фракції відповідно. Виділення, як правило, здійснюють, встановлюючи мітку на ультрацентрифужну пробірку на попередньо певній висоті границі фракції-мішені. Потім весь обсяг, що перебуває вище цієї границі, видаляють від обсягу, що залишився, наприклад, шляхом аспірації. Аспірацію можна здійснювати, наприклад, за допомогою звичайного шлангового насоса, трубопроводу й капілярів, які перед цим варто піддати стерилізації. Придатна швидкість відкачки становить, наприклад, 2 мл/хв. У процесі аспірації варто вживати заходів для того, щоб капіляр шлангового насоса завжди перебував на верхній границі рідини. Цільову фракцію, що залишилася в ультрацентрифужній пробірці, можна потім видаляти з ультрацентрифужної пробірки добре відомим методом за допомогою звичайної одноканальної 7 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 піпетки, переважно зі стерильним кінцем. У цей же час можна видаляти будь-який осад, що все ще залишається в ультрацентрифужній пробірці, наприклад, шляхом повторного усмоктування й ресуспендування з використанням одноканальної піпетки. Один з варіантів здійснення винаходу відноситься також до виділеної другої цільової фракції, яку можна одержувати за допомогою стадій а)-е) способу. Якщо потрібно здійснювати спосіб кількісного визначення вірусного навантаження у зразку панкреатину, то після стадії є) способу варто здійснювати стадію ж) способу. На стадії ж) способу вірусне навантаження у зразку панкреатину кількісно визначають шляхом визначення титру вірусної інфекції у цільовій фракції, що містить вірусне навантаження. У цьому випадку кількісне визначення титру вірусної інфекції у цільовій фракції можна здійснювати згідно робочим процедурам, добре відомим в області вірусології, наприклад, за допомогою добре відомого методу визначення титру вірусної інфекції (VITD). Можна, наприклад, розводити другу цільову фракцію у відповідному співвідношенні придатним середовищем для культивування клітин або соляним розчином, наприклад, ЗФР, для одержання дослідного зразка, призначеного для визначення вірусу. Як придатні середовища для культивування клітин можна використовувати зазначені вище середовища, у кожному випадку відповідним досліджуваним видам вірусів. В одному з варіантів здійснення винаходу для виключення помилкових позитивних відповідей («хитів») на присутність вірусної інфекції розведену або нерозведену цільову фракцію можна фільтрувати через мікрофільтр перед кількісним визначенням вірусного навантаження на стадії ж). Придатне розведення можна одержувати, наприклад, шляхом розведення цільової фракції середовищем для культивування клітин або соляним розчином до досягнення первісного об'єму супернатанта дослідного зразка панкреатину, що використовується на стадії г) способу. Потім як перший крок можна спочатку готувати добре відомим методом серійні розведення дослідних зразків, призначених для визначення вірусу, наприклад, з використанням коефіцієнтів розведення 1:2, 1:5 або 1:10 або також комбінацій зазначених стадій розведення, для здійснення кількісного VITD. Потім як другий крок можна здійснювати добре відомим методом інокуляцію придатної суспензії клітин дослідними зразками, призначеними для визначення вірусу, що мають різні концентрації з серійних розведень, після чого дають сформуватися шару клітин на призначених для визначення вірусу дослідних зразках з різними концентраціями. Після цього для виключення помилкових позитивних відповідей на наявність вірусної інфекції, які можуть бути обумовлені присутністю мікроорганізмів, таких як інертні бактерії або мікоплазми, як правило, доцільно здійснювати фільтрацію дослідних зразків, призначених для визначення вірусу, перед здійсненням інокуляції ними клітин-детекторів. Для цієї мети дослідний зразок, призначений для визначення вірусу, або розведений дослідний зразок, призначений для визначення вірусу, можна фільтрувати через фільтр із відповідним розміром пор, такий як мікрофільтр, наприклад, мікрофільтр із розміром пор (тобто діаметром пор) від 0,1 до 10 мкм (включаючи границі зазначеного діапазону; тобто здійснювати мікрофільтрацію), переважно від 0,1 до 0,45 мкм, як правило, мікрофільтр із розміром пор (тобто діаметром пор) 0,1 мкм. Потім фільтрат можна використовувати як дослідний зразок для подальших досліджень. Після цього як третій крок в інокульованих дослідних зразках визначають рівень інфекції за допомогою методу, що залежить від типу інфекції. Коли, наприклад, можна використовувати CPE як індикатор зараження шару клітин, то CPE визначають добре відомим методом після закінчення приблизно 4-7 днів. Титрування (за методом кінцевих розведень) дослідних зразків, призначених для визначення вірусу, дозволяє у цьому випадку кількісно визначати присутню у вихідному зразку дозу, що інфікує. Титрування звичайно здійснюють шляхом розведення з коефіцієнтів 10, тобто на основі десяткової логарифмічної шкали. На практиці звичайно розраховують середню (50%) дозу, що інфікує (ID50). У випадку декількох паралельних партій виявлене значення ID50 відповідає найбільшому (зворотна величина) розведенню дослідного зразка, призначеного для визначення вірусу, при якому CPE можна виявити рівно у половині партій. Результати необов'язково можна додатково коректувати або інтерполювати добре відомим методом за допомогою комп'ютера. Найбільше широко розповсюдженими методами розрахунку титрів вірусів є методи Спірмана й Кербера (див. C. Spearman, Br. J. Psychol. 2,1908, сс. 227-242, і G. Karber, Arch. Exp. Path. Pharmak. 162, 1931, сс. 480-483; а також Bundesanzeiger [Federal gazette] № 84, 4 травня 1994 p.) або Reed і Muench (див. Reed LJ., Muench H., Am. J. Hyg. 27, 1938, сс. 493-497). Можна використовувати також інші індикатори зараження клітинного шару, такі, наприклад, як індукція вірусного антигену або індукція бляшки. Фахівцеві у даній області відомі такі методи і їхні застосування для розглянутого випадку, наприклад, вони описані у таких підручниках по вірусології, як H.W. Doerr 8 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і W.H. Gerlich, «Medizinische Virologie», вид - в Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1-е вид, 2002 p., або у більше сучасних виданнях цієї книги. Спосіб, запропонований у даному винаході, можна застосовувати насамперед для аналізу більших зразків панкреатину, що використовуються як вихідний продукт. Використання більших кількостей вихідного продукту, як правило, дозволяє визначати вірусне навантаження з більшою чутливістю, а саме, виявляти більше низьку кількість інфекційних одиниць на грам продукту. Так, спосіб, запропонований у даному винаході, найбільше придатний для аналізу вихідного продукту у кількості, що становить щонайменше 5 г, наприклад, 8,10 або 12 г. Приклади Всі процедури, зазначені у наведених нижче прикладах, здійснювали у стерильних умовах на стерильному лабораторному столі. Необхідно дотримувати всіх процедур, які звичайно застосовують у вірусологічних лабораторіях, наприклад, процедури, що забезпечують безпеку. Застосовували, серед іншого, наступні матеріали: 1. розчин антибіотиків, 1,0 г стрептоміцину сульфату й 1,2 г пеніциліну розчиняли у 20 мл двічі дистильованої води й фільтрували через фільтр із розмірами пор 0,2 мкм. Потім фільтрат розділяли на аліквоти об'ємом по 1 мл і необов'язково зберігали при - 20 C до використання; 2. середовище Дульбекко, середовище для культур клітин, що використовували для клітин лінії SK 6, клітин лінії SPEV і клітин лінії MA 104; 3. одноканальні піпетки зі стерильними кінцями; 4. FCS, фетальну телячу сироватку, що одержували від фірми Bio Whittaker (сироватка); 5. колби для культур тканин, стерильні, площа дна колби становила у кожному випадку 25, 75 або 175 см ; 6. MEM, середовище для культур тканин, доповнену 1,5 г/л бікарбонату натрію й ImM піруватом, що використовували для клітин лінії PK-15; 7. титраційні мікропланшети, стерильні, 96-ямкові з кришкою; 8. суспензію PAN, 10%-у суспензію, панкреатину; відважували 8,0 г свинячого панкреатину (якщо не зазначене інше) у стерильних умовах і вносили у лабораторну склянку, поєднували з 8 мл розчину антибіотиків і (якщо не зазначене інше) з 64,0 мл конкретного відповідного середовища для клітинних культур або ЗФР і (якщо не зазначене інше) суспендували протягом 60 хв у крижаній лазні при перемішуванні; 9. буфер Pardee, буфер Pardee, що містить діоксид вуглецю; 10. ЗФР, стерильний «забуференний фосфатом фізіологічний розчин» (рН 7,2); 11. піпетки, стерильні; 12. наконечники для піпеток, стерильні у стерильних піддонах; 13. пластикові мішки, непроникні для СО2, забезпечені застібкою («Anaerocult » фірми Merck); 14. поліклональне антитіло до PPV, кон'юговане з флуоресцеінізотіоціанатом (ФІТЦ), здобували у фірми NatuTec GmbH; 15. пробірки, стерильні місткістю 15 і 50 мл; 16. розчин сахарози, 20%, забуференний ЗФР, стерильний; концентрацію регулювали добре відомим методом за допомогою звичайного рефрактометра; 17. розчин сахарози, 50%, забуференний ЗФР, стерильний; концентрацію регулювали добре відомим методом за допомогою звичайного рефрактометра; 18. пробірки із кришкою, що загвинчується, стерильні; 19. розчин трипсину, «TrypL Express », здобували у фірми INVITROGEN; 20. шланговий насос, здобували у фірми «ismaTec», швидкість накачування аж до 5,8 мл/хв; 21. охолоджувану ультрацентрифугу, «Sorvall® Pro 80» з ротором типу «ТН-641»; 22. ультрацентрифужні пробірки, стерильні місткістю 11 мл, розміри 9 x 90 мм; 23. блоки для розведень, 96-ямкові місткістю по 1,0 мл/ямку; 24. клітини лінії MA-104: здобували у фірми FLI; 25. клітини лінії PK-15: здобували у фірми DARD; 26. клітини лінії SK-6: здобували у фірми FLI; 27. клітини лінії SPEV: здобували у фірми FLI; 28. суспензії клітин ліній SK 6, SPEV і PK-15, призначені для тестування, що містять у 200000 клітин/мл у середовищі для культур клітин, доповненої 10% FCS; 29. стерильні мікропробірки типу Falcon місткістю 15 мл. Приклад 1: Дослідження шкідливого впливу панкреатину на різні лінії клітин При проведенні виявлення вірусів у матеріалі дослідних зразків з використанням клітинних культур необхідно оцінювати шкідливий вплив підлягаючому вивченню зразка панкреатину на клітини для того, щоб мати можливість виключити помилкові негативні результати при оцінці CPE. Тому були 9 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проведені описані нижче дослідження з оцінки шкідливого впливу суспензії дослідного зразка панкреатину на різні лінії клітин. Для тестування шкідливого впливу брали порції суспензії PAN об'ємом по 0,5 мл, яку позначали як «дослідний зразок суспензії панкреатину». Низькошвидкісне центрифугування: Частину суспензії PAN, що залишилася, центрифугували протягом 15 хв при 10000 об/хв (10800 x g) і 4°С у звичайній охолоджуваній центрифузі (Biofuge® 22R Heraeus SEPATECH® з фіксованим кутом ротора №3745). Після низькошвидкісного центрифугування супернатант центрифугували ще протягом 15 хв при 10000 об/хв і 4°С і позначали його як «супернатант, отриманий після низькошвидкісного центрифугування», який застосовували для титрування вірусів і ультрацентрифугування. Два осади, отримані у кожному випадку після низькошвидкісного центрифугування, поєднували (загальний об'єм 1 мл), ресуспендували у 9 мл відповідного придатного середовища для культур клітин і позначали як «осад» або дебрис. Перше ультрацентрифугування: дослідний зразок «супернатанта, отриманого після низькошвидкісного центрифугування» піддавали першому ультрацентрифугуванню на ультрацентрифузі. Для цієї мети вносили за допомогою піпетки по 2 мл 50% (мас/об.) розчину сахарози у таку кількість ультрацентрифужних пробірок, яка була потрібна для здійснення аналізу. Тримаючи ультрацентрифужну пробірку під нахилом, обережно нашаровували 14 мл 20%-ого розчину сахарози поверх 50%-ого розчину сахарози, при цьому між двома розчинами утворювався помітний розділяючий шар. Потім також обережно й уникаючи турбулентності й перемішування на 20%-ий розчин сахарози нашаровували шар узятого як описано вище дослідного зразка «супернатанта, отриманого після низькошвидкісного центрифугування», об'ємом 17,0 мл. Після цього ультрацентрифужні пробірки підвішували в ультрацентрифужний ротор. Для цієї мети у кожному випадку дві ультрацентрифужні пробірки на протилежних сторонах ротора врівноважували за допомогою ЗФР, вставляли у відповідні тримачі і щільно закривали прикладеною до пробірки кришкою. Після установки тримачів у ротор дослідні зразки центрифугували протягом 16 год при 10 C і 22000 об/хв (87000 x g). Після ультрацентрифугування ультрацентрифужні пробірки виймали із тримачів на стерильному лабораторному столі й наносили мітку на висоті 5 см від дна ультрацентрифужної пробірки. За допомогою шлангового насоса, трубопроводу й капілярів, які попередньо були простерилізовані, рідину, що перебуває вище мітки, видаляли шляхом аспірації з ультрацентрифужної пробірки при швидкості відкачування 2 мл/хв, при цьому капіляр завжди перебував на верхній границі рідини. Цю отриману у такий спосіб першу фракцію позначали як «верхня фракція після першого ультрацентрифугування». «Нижню фракцію після першого ультрацентрифугування» (1,5 мл), що залишилася в ультрацентрифужній пробірці, у кожному випадку видаляли з ультрацентрифужної пробірки за допомогою одноканальної піпетки. Будьякий осад, що міг залишитися на дні ультрацентрифужної пробірки, ресуспендували шляхом повторного усмоктування за допомогою одноканальної піпетки й також видаляли. «Нижню фракцію після першого ультрацентрифугування», що міститься у всіх пробірках, поєднували й використовували безпосередньо для другого ультрацентрифугування. До здійснення наступної обробки дві отримані у такий спосіб фракції зберігали при 4 C або, у випадку тривалого зберігання, при -20 C. Друге центрифугування здійснювали у двох пробірках місткістю по 11 мл протягом 5 год при 4 C і 272000 x g. Спочатку у пробірки вносили подушку градієнтного середовища, що представляє собою 50% (мас/об.) розчин сахарози (0,5 мл). Потім 5 мл першої цільової фракції нашаровували на градієнтну подушку й здійснювали зазначене ультрацентрифугування. Після відкидання верхньої фракції з дна кожної пробірки видаляли по 1,5 мл для виключення дебрису. Потім дослідні зразки, що представляють собою «дослідний зразок суспензії панкреатину», «супернатант після низькошвидкісного центрифугування», «осад» (після низькошвидкісного центрифугування), «верхню фракцію після першого ультрацентрифугування» і «нижню фракцію після першого ультрацентрифугування» (після доведення об'єму до 5,0 мл), а також «верхню фракцію після другого ультрацентрифугування» і «нижню фракцію після другого ультрацентрифугування», аналізували у відношенні їхнього шкідливого впливу на різні лінії клітин. Для цього готували у кожному випадку серійні розведення дослідних зразків. Всі призначені для тестування дослідні зразки піддавали додатковому розведенню з коефіцієнтом 2, починаючи з розведення 1:5, за допомогою відповідного придатного середовища для культур клітин. У титраційні мікропланшети додавали у 8 повторностях порції по 100 мкл на ямку суспензії клітин, що містить клітини лінії PK-15, SPEV або SK 6, у кожному випадку 100 мкл отриманих розведень дослідних зразків до 100 мкл свіжеодержаної суспензії клітин. Коли тестували клітини лінії MA 104, то використовували титраційні мікропланшети із шаром клітин, 10 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нанесеним за 24 год до цього. Для цієї мети у кожному випадку середовище для культур клітин видаляли з ямок і заміняли 100 мкл свіжого середовища для культур клітин, що не містить сироватку, одержуючи кінцеві розведення дослідного зразка 1:10,1:20,1:40,1:80,1:160 і тощо. Як контроль у вісім ямок кожного титраційного мікропланшета вносили по 100 мкл середовища для культур клітин замість 100 мкл серійних розведень. Пари планшетів разом із пробіркою, що містить 4 мл буфера Pardee, і фільтрувальним папером поміщали у повітронепроникні пакети й щільно закривали за допомогою закриваючого зажиму. Потім планшети інкубували при 36 ± 1°С протягом періоду часу аж до 7 днів. Протягом періоду інкубації планшети щодня обстежували за допомогою мікроскопа відносно рівня CPE, тобто відносно лізису клітин і/або дегенеративних змін клітин і відсутності утворення шару клітин у результаті шкідливого впливу панкреатину. Кінцеве обстеження проводили через сім днів. Титрування повторювали у тому випадку, якщо дегенеративні зміни клітин виявляли вже у контролях при здійсненні кінцевого зчитування. Результати тестування різних дослідних зразків у відношенні їхнього шкідливого впливу на різні лінії клітин свідчать про відсутність шкідливого впливу «нижньої фракції після другого ультрацентрифугування», отриманої з панкреатину, на різні лінії клітин. Результати продемонстрували, що «нижня фракція після першого ультрацентрифугування» і «нижня фракція після другого ультрацентрифугування», які піддавали першій або першій й другій стадії ультрацентрифугуванню згідно з винаходом відповідно й в яких сконцентроване вірусне навантаження, робили істотно більше низький шкідливий вплив на досліджені лінії клітин у порівнянні з усіма іншими дослідними зразками. Приклад 2: Аналіз впливу різних концентрацій панкреатину на вірусне навантаження Описаний вище спосіб двохстадійного ультрацентрифугування, запропонований у даному винаході, застосовували для виділення вірусів із суспензій з різними концентраціями порошкоподібного панкреатину. Виділення вірусів з панкреатину було передумовою для визначення низьких вірусних навантажень шляхом титрування з використанням чутливих ліній клітин: 8 г лікарської субстанції змішували з 8 мл розчину антибіотиків (1,0 г стрептоміцину сульфату й 1,2 г пеніциліну G на 20 мл стерильного ЗФР) і 64 мл ЗФР і перемішували у лазні з крижаною водою протягом 60 хв; отриману суспензію центрифугували при 4 C протягом 15 хв при 10800 x g; супернатант після першого центрифугування ще один раз піддавали центрифугуванню при 4 C протягом 15 хв при 10800 x g. Супернатант, отриманий після низькошвидкісного центрифугування, використовували для першого ультрацентрифугування. Перше ультрацентрифугування здійснювали з використанням східчастого градієнта сахарози (на 2 мл 50% (мас/об.) сахарози й 14 мл 20% (мас/об.) сахарози, що містяться у чотирьох центрифужних пробірках, нашаровували 17 мл супернатанта після низькошвидкісного центрифугування). Ця процедура дозволяє відокремлювати вірусні частки від основної частини суспензії панкреатину при відповідних умовах. Віруси із суміші віруси/суспензія панкреатину концентрувалися у приграничному шарі між 50% (мас/об.) і 20% (мас/об.) сахарозою при відповідних умовах центрифугування. Розчинні панкреатинові компоненти залишалися після центрифугування у супернатанті, що перебуває над вірусним шаром. Вірусну фракцію відокремлювали від панкреатинових шарів шляхом фракціонованого відсмоктування градієнта сахарози. Отриману вірусну фракцію знову піддавали ультрацентрифугуванню для подальшого концентрування вірусів на 50% (мас/об.) сахарозній подушці. Перше центрифугування здійснювали у чотирьох пробірках місткістю по 36 мл протягом 16 год при 4°С і 87000 x g. Після центрифугування з дна кожної пробірки видаляли по 5 мл продукту. Потім здійснювали друге центрифугування у двох пробірках місткістю по 11 мл протягом 5 год при 4°C і 272000 x g. Із дна кожної пробірки видаляли по 5 мл продукту. У результаті одержували 3 мл вірусного концентрату з 8 г порошкоподібного панкреатину. Зразки зберігали при -20°C. Аналізи інфективності. Аналіз інфективності заснований на припущенні про те, що низьке вірусне навантаження у зразку можна виявляти за допомогою трьох послідовних пасажів зразка з використанням чутливих ліній клітин. Віруси, що містяться в ньому, можуть інфікувати нові клітини й ампліфікуватися при цих пасажах, приводячи до збільшення вірусного титру. Застосовуючи численні методи культивування з використанням більших об'ємів можна після трьох пасажів клітин виявляти навіть один інфекційний вірус, що характеризується такою низкою швидкістю ампліфікації, як 10 (10 вірусів на 1 інфекційний вірус після інкубації протягом 6 днів), по утворенню приблизно 1000 бляшок на клітинному газоні після третього пасажу. 11 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Тому вірусні фракції, екстраговані зі зразків панкреатину, застосовували для здійснення трьох послідовних пасажів з використанням клітин лінії SK6 для виявлення інфекційних парвовірусів свиней. 1-й пасаж (вірусна фракція об'ємом 1 мл = 2,66 г панкреатину) Однією третю кожного індивідуального вірусного концентрату (1 мл з 3 мл) здійснювали інокуляцію для культури тканин, що містяться у колбі, площею 75 см ЗО мл середовища для культури клітин, доповненої 5% FCS, і вирощеного протягом 24 год субконфлюентного газону клітин лінії SK6. Культуру клітин, що міститься у колбі, інкубували при°37 ± 1 C протягом 6 днів. Формування цитопатичних ефектів (бляшки) перевіряли у процесі інкубації й по закінченні періоду інкубації за допомогою інвертованого мікроскопа. Пасаж припиняли шляхом створення вірусного/клітинного лізату за допомогою двох циклів заморожування/відтавання всього вмісту колби для культури тканини. Вірусний/клітинний лізат піддавали низькошвидкісному центрифугуванню (2800 x g протягом 15 хв), одержуючи вільний від клітин супернатант. Цей супернатант після низькошвидкісного центрифугування (30 мл на партію) фільтрували через фільтр із розміром пор 0,1 мкм як міра безпеки для зниження можливого забруднення лізату мікоплазмами. 2-й пасаж Для другого пасажу кожної партії підготовлювали колбу для культури тканини площею 75 см , що містить 22,5 мл середовища для культури клітин, доповненої 5% FCS, і вирощений протягом 24 год газон клітин лінії SK6. Додавали 7,5 мл супернатанта культури клітин, отриманого після першого пасажу (= 25%). Колби інкубували протягом 6 днів при 37 ± 1°С і перевіряли у відношенні цитопатичного ефекту за допомогою інвертованого мікроскопа. Лізат вірусів/клітинної культури (30 мл на партію) одержували відповідно до процедури, описаної для першого пасажу. 3-й пасаж Для кожної партії готували колби для культури тканини площею 75 см відповідно до описаної вище процедури. У кожну колбу вносили по 7,5 мл лізату вірусів/клітинної культури, отриманого після 2-го пасажу (= 25%), і 22,5 мл середовища для клітинної культури, доповненої 5% FCS. Колби інкубували протягом 6 днів при 37 ± 1 C і обстежували у відношенні цитопатичних ефектів за допомогою інвертованого мікроскопа. Лізат вірусів/клітинної культури (30 мл на партію) одержували відповідно до процедури, описаної для 1-го й 2-го пасажів. 4. Виявлення парвовірусу свиней (PPV) за допомогою імунозабарвлювання з використанням кон'югованих з ФІТЦ антитіл до PPV Підготовлювали титраційні 96-ямкові мікропланшети й вирощений протягом 24 год газон клітин лінії SK6. 30 ямок інфікували, вносячи у кожну по 100 мкл лізату вірусів/клітинної культури, отриманого після 3-го пасажу (= 10%), та інкубували при 37 ± 1°С протягом 24 год. Після інкубації відокремлювали супернатант клітинної культури від клітин і газон клітин фіксували з використанням охолодженої на льоді суміші, що містить 80% ацетону й 20% метанолу. У кожну ямку додавали по 100 мкл розчину кон'югованого з ФІТЦ антитіла до PPV і планшети інкубували протягом 45 хв при 37 ± 1°С. Після видалення розчину антитіла газон клітин тричі відмивали ЗФР і покривали 15%-им розчином гліцерину у ЗФР. Виявлення клітин, інфікованих парвовірусом, здійснювали за допомогою інвертованого мікроскопа в УФ-світлі. Паралельно зі зразками панкреатину на тих же титраційних мікропланшетах здійснювали титрування парвовірусу свиней NADL-2 з відомим титром як позитивний контроль. Пасажі всіх тестуємих зразків на клітинах лінії SK6 здійснювали паралельно з позитивними контролями відповідно до описаної вище процедури. За допомогою цього методу виявилося можливим порівнювати формування бляшок/цитопатичних ефектів, типових для парвовірусу свиней, при використанні зразків панкреатину й позитивних контролів. Результати, отримані при культивуванні, представлені у таблиці 1. 12 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 При першому пасажі з використанням трьох тестуємих зразків через 6 днів після зараження не було виявлено CPE. Не було виявлено CPE при трьох пасажах зразка 0436. Тільки при третьому пасажі зразка 0436 були виявлені слабкі дегенеративні зміни клітин, які, однак, не були ідентичні виявленими цитопатичним ефектам, характерним для зразків 0437 і 0438. Одиночні бляшки у газоні клітин були виявлені при другому пасажі зразка 0437 через чотири дні після зараження. Через 6 днів після зараження приблизно на 20% газону клітин у колбі були виявлені CPE. Після третього пасажу приблизно на 30% І газону клітин були виявлені цитопатичні ефекти/бляшки. Одиночні бляшки були виявлені через 3 дні після зараження при другому пасажі зразка 0438. У процесі подальшого здійснення пасажу формування бляшок тривало й приводило до майже конфлюентним областям CPE. При третьому пасажі через 2 дні після зараження були виявлені чіткі прояви CPE. Інкубація протягом 4 днів після зараження приводила до формування конфлюентних областей CPE. Після третього пасажу у колбах для культури тканини лізат вірусів/клітинної культури, отримані після третього пасажу, переносили у титраційні мікрошіаншети, що містять газони клітин лінії SK6, для цієї мети: Вносили 30 разів по 100 мкл для кожної партії у 30 ямок паралельно у два планшети. На цих же планшетах титрували використовувані як позитивний контроль клітини, заражені парвовірусом свиней NADL-2. Планшети інкубували при 37 ± 1 C, перший планшет служив для виявлення цитопатичних ефектів, а другий планшет служив для виявлення парвовірусу свиней за допомогою імунозабарвлювання. Перший планшет інкубували протягом 6 днів. По закінченні періоду інкубації для зразків 0437 і 0438 були виявлені такі ж цитопатичні ефекти, що й для використовуваного як позитивний контроль PPV NADL-2. Для зразка 0436 не було виявлено ніяких проявів CPE. 13 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 Супернатант культури із другого титраційного мікропланшета видаляли через 24 год після початку інкубації. Короткий період інкубації повинен зменшувати можливість виявлення клітин, що піддалися вторинній інфекції парвовірусами, які вивільнилися з первинно інфікованих клітин. Газон клітин фіксували й забарвлювали за допомогою кон'югованого з ФІТЦ антитіла до PPV і обстежували з метою виявлення інфікованих клітин за допомогою інвертитрованого мікроскопа в УФ-світлі. Це являє собою аналог титрування бляшки й дає можливість визначати титр вірусу у лізаті, отриманому після третього пасажу. Були отримані наступні результати: Жодна з 30 ямок, які були інфіковані вільним від клітин вірусним лізатом, отриманим після третього пасажу зразка 0436, не містила клітин з вираженою флуоресцентністю. На додаток до протестованих 3 мл (= 10%) переносили ще 30 х 100 мкл вільного від клітин вірусного лізату у титраційний мікопланшет, що містить газон клітин лінії SK6, інкубували протягом 24 год при 37 + 1°С, фіксували й забарвлювали за допомогою антитіла до PPV. У цих 30 додаткових ямках не було виявлено інфікованих клітин. Цей результат корелює з результатами, отриманими при пасажах зразка 0436 у колбах для культури тканини, і результатами, отриманими після третього пасажу у титраційних мікропланшетах, які здійснювали для виявлення цитопатичних ефектів. У випадку зразків 0437 і 0438 всі 30 ямок, які були забарвлені антитілом до PCV, містили клітини з вираженою флуоресценцією, такі ж, як і використовувані як позитивний контроль клітини, заражені PPV NADL-2. Як продемонстровано вище, спосіб, запропонований у даному винаході, дозволяє виявляти одну інфекційну одиницю на 1 г панкреатину, і тим самим він являє собою високочутливий спосіб виділення й визначення вірусного навантаження у зразку панкреатину. Крім того, на відміну від способів, заснованих на методах молекулярної біології, таких як виявлення молекул нуклеїнової кислоти за допомогою методів ампліфікації, таких як ПЛР, спосіб, запропонований у даному винаході, дозволяє визначати інфекційні одиниці. Таким чином, виявляється можливим розрізняти інфекційне й неінфекційне вірусне навантаження або загальне вірусне навантаження, обумовлене методами молекулярної біології. В іншому варіанті здійснення винаходу пасажі й виявлення можна здійснювати поетапно (як описане вище) або застосовуючи паралельний підхід. Паралельний підхід означає, що під час здійснення одного пасажу вже може бути визначене вірусне навантаження після попереднього пасажу. З використанням цього підходу можна одержувати результат після всіх пасажів і, якщо результат одержують після першого пасажу, то це означає, що результат одержують у більш ранній момент часу, чим при використанні поетапного підходу. Це може бути важливим, наприклад, з погляду підвищення ефективності тимчасових витрат і/або, наприклад, гарантії якості у виробничих процесах, оскільки можна починати випуск відповідного зразка або продукту у більш ранній момент часу. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 45 50 55 1. Спосіб відділення вірусного навантаження від зразка панкреатину, який полягає у тому, що здійснюють наступні стадії, на яких: а) готують рідкий дослідний зразок панкреатину, придатний для центрифугування, зі зразка панкреатину, не змінюючи його вірусного навантаження; б) піддають щонайменше одну визначену частину дослідного зразка панкреатину, отриманого на стадії а) способу, щонайменше одному низькошвидкісному центрифугуванню в умовах, в яких віруси, що характеризуються константами седиментації ≥120 S, не утворюють дебрис; в) відкидають всі тверді відкладення, які необов'язково утворюються на стадії б) способу під час низькошвидкісного центрифугування, і зберігають супернатант дослідного зразка панкреатину; г) піддають щонайменше одну визначену частину супернатанта дослідного зразка панкреатину, отриманого на стадії в) способу, першому ультрацентрифугуванню у середовищі зі східчастим градієнтом, де тривалість першого ультрацентрифугування й відносну відцентрову силу для першого центрифугування вибирають таким чином, щоб вірусне навантаження кількісно транспортувалося з супернатанта дослідного зразка панкреатину у першу цільову фракцію, що перебуває вище приграничного шару або у приграничному шарі між розташованим зверху компонентом градієнта з найменшою концентрацією й розташованим знизу компонентом градієнта з наступною більш високою концентрацією, і кількісно виділяють першу цільову фракцію, що необов'язково включає будь-який дебрис, присутній після центрифугування, що містить вірусне навантаження, з супернатанта дослідного зразка панкреатину; 14 UA 98820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 д) піддають першу цільову фракцію, отриману на стадії г) способу, другому ультрацентрифугуванню, де друге ультрацентрифугування здійснюють при відносній відцентровій силі, що перевищує відносну відцентрову силу при першому ультрацентрифугуванні, у градієнтному середовищі того ж типу, що використовують для першого ультрацентрифугування, де градієнтне середовище являє собою градієнтне середовище з більш високою концентрацією у порівнянні з концентрацією компонента градієнта з найменшою концентрацією у першій цільовій фракції, і е) одержують другу цільову фракцію, що містить вірусне навантаження, у результаті відкидання верхніх 75 об. % або більше рідини верхнього шару, що відповідає першій цільовій фракції, і одержують нижню фракцію, що відповідає нижнім 25 об. % або менше рідини верхнього шару, і повний шар градієнтного середовища з більш високою концентрацією за винятком будь-якого дебрису, який необов'язково є присутнім після центрифугування. 2. Спосіб за п. 1, в якому після здійснення стадії е) способу додатково здійснюють стадію ж) способу, на якій кількісно визначають вірусне навантаження у зразку панкреатину шляхом визначення титру вірусної інфекції у другій цільовій фракції, що містить вірусне навантаження. 3. Спосіб за п. 2, в якому перед здійсненням кількісного визначення вірусного навантаження розведену або нерозведену другу цільову фракцію фільтрують через мікрофільтр. 4. Спосіб за п. 1, в якому на стадії а) способу готують суспензію дослідного зразка панкреатину шляхом об'єднання зразка панкреатину з середовищем для клітинної культури, придатної для лінії клітин, яку застосовують для культивування підлягаючого дослідженню типу вірусу, або з соляним розчином і з одним або декількома антибіотиками. 5. Спосіб за п. 4, в якому щонайменше одну зі стадій а) - е) здійснюють при охолодженні до температури 0-15 °C. 6. Спосіб за п. 1, в якому низькошвидкісне центрифугування на стадії б) способу у кожному випадку здійснюють при відносній відцентровій силі менше 15000×g. 7. Спосіб за п. 1, в якому низькошвидкісне центрифугування на стадії б) способу у кожному випадку здійснюють при відносній відцентровій силі, що становить 8000-15000×g. 8. Спосіб за п. 1, в якому низькошвидкісне центрифугування на стадії б) способу здійснюють протягом щонайменше 5 хв. 9. Спосіб за п. 1, в якому перше ультрацентрифугування на стадії г) способу здійснюють протягом щонайменше 9 год. 10. Спосіб за п. 1, в якому перше ультрацентрифугування на стадії г) способу здійснюють при відносній відцентровій силі менше 150000×g. 11. Спосіб за п. 1, в якому друге ультрацентрифугування на стадії д) способу здійснюють протягом щонайменше 2 год. 12. Спосіб за п. 11, в якому друге ультрацентрифугування на стадії г) способу здійснюють при відносній відцентровій силі більше 150000×g. 13. Спосіб за п. 1, в якому середовище зі східчастим градієнтом, що застосовують на стадії г) способу, являє собою східчастий двофазний градієнт сахарози. 14. Спосіб за п. 13, в якому середовище зі східчастим градієнтом являє собою градієнт, що складається з 50 % (мас./об.) забуференого розчину сахарози й 20 % (мас./об.) забуференого розчину сахарози. 15. Спосіб за п. 1, в якому градієнтне середовище з більш високою концентрацією, що застосовується на стадії д) способу, являє собою градієнтне середовище, що містить 50 % (мас./об.) забуференого розчину сахарози. 16. Спосіб за п. 1, в якому зразок панкреатину являє собою зразок свинячого панкреатину. 17. Спосіб за п. 1, в якому вірусне навантаження у дослідному зразку панкреатину являє собою ротавірус А корів, вірус енцефаломіокардиту, цирковірус свиней, парвовірус свиней, ротавірус А свиней, тешовірус свиней, вірус гепатиту Е свиней і/або вірус захворювання свиней з везикулярним синдромом. 18. Спосіб за одним із попередніх пунктів, в якому зразок панкреатину, що застосовується як вихідний продукт, містить щонайменше 5 г панкреатину. 19. Виділена друга цільова фракція, отримана способом за п. 1. 20. Виділена друга цільова фракція за п. 19, де на стадії а) способу за п. 1 одержують дослідний зразок панкреатину у вигляді суспензії дослідного зразка панкреатину шляхом об'єднання зразка панкреатину з середовищем для культури клітин, придатним для лінії клітин, яку застосовують для культивування призначеного для дослідження типу вірусу, або з соляним розчином і з одним або декількома антибіотиками. 21. Виділена друга цільова фракція за п. 20, в якій фізіологічний розчин являє собою забуферений фосфатом фізіологічний розчин. 15 UA 98820 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 16