Спосіб зниження вірусного навантаження у зразках сироватки і плазми крові

Спосіб зниження вірусного навантаження у зразках сироватки і плазми крові шляхом обробки специфічним імуносорбентом біологічної рідини і подальшим видаленням імуномагнітного сорбенту, який відрізняється тим, що імуносорбент біологі 3 47278 амінопропілтриетоксисилан (АПТЕС) із питомою поверхнею 54м2/г. Перед кон'югуванням Ig - ВГС редукують β-меркаптоетанолом. Наявність аміногруп на поверхні магнетиту та тіогруп редукованих молекул Ig дозволяє ковалентно зв'язувати їх за допомогою гетеробіфункціонального реагенту малеімідобензойної кислоти -N-гідроксісукцініміду ефіру (м.б.с). Магніточутливі частки осаджують постійним магнітом. Вірусне навантаження у сироватці або плазмі крові людини з діагнозом вірусний гепатит С, підтверджений ПЛР, знижують обробкою біологічної рідини специфічним сорбентом. Приклад конкретного виконання Усі процедури виконують асептична, у ламінарно-потокових шафах із класом захисту не нижче 2. В роботі використовують стерильні розчини Ig. Для редукції Ig до його розчину в 0,1М фосфатному буфері (ФБР) рН 6,0 з 5нМ ЕДТА додають βмеркаптоетанол до кінцевої концентрації 0,7М. Залишають при перемішуванні при 37°С на 90хв. По закінченні редукції розчин Ig діалізують проти 0,1М ФБР рН 6,0 з 5нМ ЕДТА. Магнетит-АПТЕС, функціоналізований аміногрупами, стерилізують (обробкою спиртом або озоном). Для кон'югування 4 до магнетиту - АПТЕС додають 0,01М ФБР рН 7,0 з 0,09М NaCl. Зшиваючий реагент м.б.с. 4,5мг розводять у 400 μℓ діметилформаміду і додають до 100мг магнетиту в буфері, залишають при 30°С на 60хв при перемішуванні. Відмивають не менше 3 разів 0,1М ФБР рН 6,0 з 5нМ ЕДТА, використовуючи постійний магніт для осадження часток. До активованих відмитих часток додають редуковані Ig ВГС, що пройшли діаліз, та залишають для кон'югації на 16-24 годин при постійному перемішуванні. Відмивають тричі промивним буфером, додають 0,1М ФБР рН 6,0 з 1% б.с.а., 0,1% ацетил-цістеіну для блокування тіогруп, що не прореагували, інкубують при 37°С 60хв, відмивають ФБР. Імуномагнітний біосорбент готовий до застосування. На кожні 100мг імуносорбенту додають 1мл позитивної за результатами ПЛР сироватки або плазми. Залишають на контакт на 1-3 години, періодично перемішуючи. Імуномагнітний сорбент осаджують зовнішнім магнітом, сироватку або плазму відбирають. Сироватку або плазму, що пройшли обробку імуномагнітним сорбентом, і вихідні зразки тестують у ПЛР. Результати зниження вірусного навантаження представлені в таблиці. Таблиця Розмір питомої поЗшиваючий реагент для Активність вихідної Біосорбент приготоверхні функціоналіковалентного зв'язувансироватки/плазми у влений на основі зованого магнетиту ня ПЛР (м2/г) магнетит -gглутаральдегід 36 + АПС + Ig - ВГС магнетит-g-АПС + Ig глутаральдегід 37 + - ВГС магнетит-БТМПА + глутаральдегід 37 + Ig - ВГС Магнетит - АПТЕС + м.б.с. 54 + Ig - ВГС Застосування імуномагнітного біосорбенту, отриманого ковалентним зв'язуванням із використанням зшиваючого реагенту м.б.с, у лабораторних умовах дозволило зменшити вірусне навантаження у зразках сироватки/плазми до негативних значень (у межах чутливості ПЛР-тест-системи, що використовувалась). Показано, що ефективність імуномагнітного біосорбенту залежить від методу отримання кон'югату функціоналізований магнетит - Ig - ВГС. Таким чином, імуномагнітний біосорбент, отриманий ковалентним зв'язуванням по тіогрупах високоавідних Ig - ВГС і магнетиту, функціоналізованому аміносилоксаном, забезпечив зниження вірусного навантаження сироватки/плазми крові людини, що були позитивні у ПЛР, до негативних значень. Комп’ютерна верстка А. Рябко Активність сироватки/плазми після обробки імуномагнітним біосорбентом + + + Джерела інформації: 1. Zheng Yaotong. Адсорбция и удаление микроорганизмов из воды с помощью колонок, содержащих песок, покрытый металлической гидроокисью. Chin. J. Appl. and Environ. Biol. 2004. 10, №4, с.475-479. 2. Sharma Amy, Raviv Yossef et al. Complite inactivation of Venezuelau equine encephalitis virus by 1,5 - iodonaphthyl azide. Biochem. and Biophys.Res.Commun. 2007. 358, №2, p.392-398. 3. Reichl Herwig. Method of inactivating prions (slow viruses) conventional viruses and other infections agents in biological material. United States Patent 5633349, МПК6 С07К 014/435; G12N 007/06, 1997. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601