Спосіб визначення факторів ризику захворювання на хворобу альцгеймера

Реферат: Винахід належить до способу для виявлення генетичних варіантів, які пов'язані з розвитком хвороби Альцгеймера, і ідентифіковані відповідним чином генетичні варіанти. Винахід також забезпечує способи лікування за допомогою активного агента (наприклад, специфічним активним агентом та/або у більш ранньому віці) після виявлення описаних генетичних варіантів. В деяких варіантах втілення генетичний варіант є поліморфізмом (DIP) видалення/вставки ТОММ40 гену. Також представлено набори для визначення, чи є суб'єкт під підвищеним ризиком розвитку пізнього початку хвороби Альцгеймера. Додатково представлені набори для визначення, чи є суб'єкт сприйнятливим до лікування заявленого стану за допомогою активного агента. UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Споріднені заявки Ця заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою US61/088,203, яку було подано 12 серпня 2008 року, за попередньою заявкою US 61/186,673, яку було подано 12 червня 2009 року та за попередньою заявкою US 61/224,647 від 10 липня 2009 року, розкриття кожної з яких включено тут як посилання у повному об‟ємі. Галузь винаходу Винахід належить до галузі геноміки, генетики, фармакогенетики й біоінформатики, включаючи аналіз геному й вивчення зміни послідовності ДНК. Винахід також належить до вивчення зв‟язку між змінами у послідовності ДНК і прогнозуванням сприйнятливості людини до певної хвороби, розладу чи стану та/або відповіді на конкретний препарат або лікування. Передумови створення винаходу Пошук генетичних маркерів, пов'язаних з комплексом захворювань, на теперішній час триває. Повногеномне скринінгове дослідження з аналізом однонуклеотидного поліморфізму (SNP) продовжується з метою виділенням ApoE регіонів як найбільш важливої області для вивчення хвороби Альцгеймера (Coon та ін., J. Clin. Psychiatry 68: 613-8 (2007); Li та ін., Arch. Neurol. 65: 45-53 (2007)). Ізоформи ApoE4 раніше вважалися тісно пов'язаними з підвищеним ризиком розвитку пізнього початку хвороби Альцгеймера. (Pericak- Vance та ін., Am. J. Hum. Genet. 48, 1034- 50 (1991); Martin та ін., 2000, US Patent No. 6,027,896 to Roses, та ін., US Patent No. 5,716,828 to Roses та ін.) Взаємовідношення є дозозалежним (Yoshizawa та ін.,1994; Schellenberg, 1995). Тобто, носій двох алелів ApoE4 найбільш вірогідно впливає на розвиток пізнього початку хвороби Альцгеймера (late-onset Alzheimer„s disease (LOAD)), ніж носій тільки одного алелю ApoE4, і в більш ранньому віці (Corder та ін., Science 261, 921-3 (1993)). Все ж таки, на алелі Е4 припадає лише близько 50% від спадкової форми хвороби Альцгеймера. Одним поясненням є те, що ApoE4 просто виступає у ролі сурогатного маркеру для чогось в близькому неврівноваженому зчепленні. Альтернативно, враховуючи недавнє відкриття ролі механізму дії ApoE4 в мітохондріальній токсичності, негативні ефекти ApoE4 можуть бути скасовані або посилені іншим продуктом гена кодованої області (Chang та ін., 2005). Оскільки статус ApoE також пов'язаний з ризиком ішемічної хвороби серця і, ймовірно, також є причиною багатьох інших захворювань і розладів, передумови вивчення регіонів ApoE не обмежується хворобою Альцгеймера, а є потенційно більш широкими (Mahley та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 5644-51 (2006)). У більш широкому сенсі, дослідження варіантних послідовностей для процесів або механізмів, які стосуються генів у неврівноваженому зчепленні з іншими генетичними ділянками, які відомі як такі, що залучені у складні патологічні процеси, будуть забезпечувати цінною інформацією для розшифрування механізмів цих захворювань. Короткий зміст винаходу Запропонований тут спосіб для визначення генетичного варіанту, що пов'язаний з розвитком стану, що заявляється (наприклад, більш ранній чи більш пізній початок зазначеного захворювання), який містить: (a) визначення у біологічних зразках, що містять ДНК-нуклеотидні послідовності, які отримані множиною індивідуальних людських об‟єктів у заявленому генетичному локусі, де об‟єкти включають обидва (i) суб'єкти, що постраждали внаслідок заявленого стану, і (іі) суб'єкти, що не постраждали внаслідок заявленого стану, (б) ідентифікація генетичних варіантів на вказаному генетичному локусі з нуклеотидних послідовностей, що спостерігаються у вказаній множині суб'єктів (наприклад, з використанням аналізу вирівнювання множинних послідовностей); (с) картування вказаних генетичних варіантів шляхом побудови філогенетичного дерева зазначених нуклеотидних послідовностей зазначених суб'єктів, зазначене дерево, що містить гілки, які ідентифікують варіантні зміни між зазначеними суб'єктами (наприклад, варіант змін в тому ж цистроні); (d) визначення генетичних варіантів, що представлені у вигляді гілок зазначеного дерева та визначення відношення постраждалих та не постраждалих суб'єктів з метою ідентифікувати такі зміни, що призводять до зміни відношення постраждалих та непостраждалих суб'єктів (переважно де початковою точкою є генетичний варіант, що представляє найбільше число суб‟єктів); і далі, виявлення генетичного варіанту або групи варіантів (гаплотип), де співвідношення постраждалих і непостраждалих суб'єктів суттєво відрізняється від одного або декількох суміжних варіантів у зазначеному дереві (наприклад, принаймні, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, чи 90 % різниці), щоб таким чином визначити генетичний варіант, що асоційований з розвитком зазначеного заявленого стану. У деяких варіантах втілення усі суб'єкти є носіями відомого поліморфізму, що пов‟язаний із заявленим станом. 1 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах втілення заявлений стан є нейродегенеративним захворюванням, хворобою обміну речовин (наприклад, дисліпідемію), серцево-судинним захворюванням, психічним розладом або раком. У деяких варіантах втілення хворобами заявленого стану є захворювання, при якому ApoE та/або TOMM40 залучені у патогенез захворювання. У деяких варіантах втілення заявлений стан пов‟язаний із збільшенням чи зменшенням мітохондріальної дисфункції. У деяких варіантах втілення заявлений стан є шизофренією. У деяких варіантах втілення заявлений стан є цукровим діабетом ІІ типу. У деяких варіантах втілення заявлений стан є хворобою Паркінсона. У деяких варіантах втілення заявлений стан є хворобою Альцгеймера. У деяких варіантах втілення відомим фактором ризику поліморфізму є алель аполіпопротеїну Е (наприклад, ApoE 2, ApoE 3 або ApoE 4). У деяких варіантах втілення заявлений генетичний локус є у неврівноваженому зчепленні з відомим поліморфізмом. У деяких варіантах втілення заявлений генетичний локус знаходиться у тій же хромосомі і менше ніж на 10, 20, 30, 40 чи 50 пар основ далі від відомого поліморфізму. У деяких варіантах втілення генетичний локус є TOMM40. Також запропоновано спосіб визначення підвищеного ризику розвитку заявленого стану, що включає: а) визначення у біологічному зразку, що має ДНК, генетичного варіанту, що ідентифікується способом за будь-яким з попередніх пунктів, носієм якого є індивідуальний суб‟єкт; а потім (b) визначення, чи підпадає суб'єкт під підвищений ризик розвитку заявленого стану, коли генетичний варіант присутній. В подальшому запропоновано спосіб визначення підвищеного ризику розвитку хвороби Альцгеймера у суб‟єкта (наприклад, суб‟єкт, що є носієм принаймні одного Apo E3 алеля), який включає: а) визначення у біологічному зразку, що містить ДНК, взятому від суб‟єкта, наявності або відсутності генетичних варіантів гену TOMM40, що пов‟язаний з підвищенням або зниженням ризику хвороби Альцгеймеру, а також b) визначення, чи є суб'єкт під підвищеним або зниженим ризиком розвитку хвороби Альцгеймера, коли генетичний варіант присутній чи відсутній. У деяких варіантах втілення це визначається тим, чи має суб'єкт Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 чи E4/E4. У деяких варіантах втілення це визначається тим, чи має суб'єкт Apo E3/E3 або E3/E4. У деяких варіантах втілення спосіб включає етап с) призначення при лікуванні ефективної кількості активного агента проти хвороби Альцгеймера суб‟єкту, який знаходиться під підвищеним ризиком розвитку хвороби Альцгеймера. У деяких варіантах втілення етап призначення проводиться у суб‟єкта у більш ранньому періоді, коли суб‟єкт визначений як такий, що знаходиться під підвищеним ризиком наявності або відсутності генетичного варіанту у порівнянні з суб‟єктом, у якого генетичний варіант не є присутнім або відсутній (наприклад, для пацієнтів з ApoE 4/4, починаючи з віку 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 або 53 й безперервно через кожен наступний рік в подальшому, краще, ніж починаючи з віку 55 і більше; для пацієнтів з ApoE 4/3 у віці 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, або 58, й безперервно через кожен наступний рік, краще, ніж починаючи з віку 60 та більше; для хворих з ApoE 3/3 у віці 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, або 63 й безперервно через кожен наступний рік, краще, ніж починаючи з віку 65 та більше; для пацієнтів з ApoE 2/3 у віці 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, або 68 й безперервно через кожен наступний рік, краще, ніж починаючи з віку 70 або більше). У деяких варіантах втілення активний агент вибрано з групи, що містить інгібітори ацетилхолінестерази, антагоністи рецепторів NMDA, антагоністи чи модулятори PPAR (наприклад, препарати тіазолідиндіонового або глітазарового класів), антитіла, злиті білки, терапевтичні молекули РНК, і комбінації таких. В деяких варіантах активним агентом є розиглітазон або його фармацевтично прийнятна сіль. У деяких варіантах втілення генетичний варіант TOMM40 є варіантом, що представлений у Таблиці 1, як вказано нижче. Також запропоновано спосіб лікування суб‟єкта (наприклад, суб‟єкт, який має щонайменше один ApoE 3) з алелем хвороби Альцгеймера шляхом призначення суб‟єкту лікувальноефективної кількості активного агента проти хвороби Альцгеймера; удосконалення включає: призначення активного агента суб‟єкту у більш ранньому віці, коли суб‟єкт є носієм генетичного варіанту TOMM40 гену, пов‟язаного з підвищеним ризиком хвороби Альцгеймера у порівнянні з відповідним суб'єктом, який не несе генетичний варіант (наприклад, для пацієнта з ApoE 4/4 у віці 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 або 53 й безперервно, через кожний наступний рік, краще, ніж починаючи з віку 55 років або більше; для пацієнта з ApoE 4/3 у віці 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 або 58 й безперервно, через кожен наступний рік, краще, ніж починаючи з віку 60 років й більше; пацієнта з ApoE 3/3 у віці 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 або 63 й безперервно, через кожен 2 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наступний рік, краще, ніж починаючи з віку 65 років та більше; пацієнта з ApoE 2/3 у віці 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 або 68 й безперервно через кожен наступний рік, краще, ніж починаючи з віку 70 років та більше). У деяких варіантах втілення суб‟єкти є хворими з Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, E4/E4. У деяких варіантах пацієнти є хворими з Apo E3/E3 або E3/E4. В деяких варіантах втілення активний агент вибраний з групи, що складається з інгібіторів ацетилхолінестерази, антагоністів рецепторів NMDA; агоністів або модуляторів PPAR (наприклад, препарати тіазолідиндіонового або глітазарового класів), антитіл, злитих білків, терапевтичних молекул РНК, а також їх комбінацій. У деяких варіантах втілення активним агентом є розиглітазон або його фармацевтично прийнятна сіль. В деяких варіантах втілення генетичний варіант гену TOMM40 є поліморфізмом видалення/вставки (DIP). У деяких варіантах втілення DIP є полі-Т поліморфізмом видалення/вставки (наприклад, між 5 та 100, або 10 та 80, або 20 та 50 парами нуклеотидів полі-T). У деяких варіантах втілення генетичний варіант TOMM40 є варіантом, зазначеним у Таблиці 1, яка представлена нижче. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523, rs10602329 або DIP3. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523. Далі пропонується спосіб лікування заявленого стану, в якому заявлений стан пов'язаний з ApoE та/або TOMM40, для пацієнтів, які потребують такий, спосіб включає етапи: (а) визначення наявності або відсутності генетичного варіанту, визначеного способом за пунктами 1-12, що здійснюється для окремих пацієнтів для створення генетичного профілю пацієнта, а потім, якщо профіль підтверджує, що пацієнт реагує на активний агент, (b) призначення активного агента пацієнту в лікувально-ефективній кількості для лікування заявленого стану. У деяких варіантах втілення активний агент вибрано з групи, що складається з інгібіторів ацетилхолінестерази, антагоністів рецепторів NMDA, агоністів або модуляторів PPAR (наприклад, препарати тіазолідиндіонового або глітазарового класів), антитіл, злитих білків, терапевтичних молекул РНК та їх комбінацій. У деяких варіантах втілення активний агент є розиглітазон або його фармацевтично прийнятна сіль. У деяких варіантах втілення генетичний варіант гену TOMM40 є поліморфізмом виділення/вставки (DIP). У деяких варіантах втілення DIP є поліморфізмом вставки. У деяких варіантах втілення DIP є полі-Т поліморфізмом виділення/вставки (наприклад, між 5 та 100, або 10 та 80, або 20 та 50 парами основ полі-T вставка). У деяких варіантах втілення генетичний варіант TOMM40 є варіант TOMM40, що зазначено у Таблиці 1, як представлено нижче. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523, rs10602329 або DIP3. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523. Також представлено спосіб лікування суб‟єкта з хворобою Альцгеймера, що включає: а) виявлення у біологічному зразку, що містить ДНК, взятого від хворого, на наявність або відсутність генетичного варіанту гену TOMM40, пов'язаного з сприйнятливістю до активного агента; і, якщо генетичний варіант присутній, (b) призначення активного агента цьому пацієнту в лікувально-ефективній кількості для лікування хвороби Альцгеймера. У деяких варіантах втілення пацієнт має принаймні один алель ApoE3. У деяких варіантах втілення хворий має Apo E3/E3 або E3/E4. У деяких варіантах втілення активний агент вибраний з групи, що складається з інгібіторів ацетилхолінестерази, антагоністів рецепторів NMDA, агоністів або модуляторів PPAR (наприклад, препарати тіазолідиндіонового або глітазарового класів), антитіл, злитихбілків, терапевтичних молекул РНК, а також їх комбінацій. У деяких варіантах втілення активним агентом є розиглітазон або його фармацевтично прийнятна сіль. У деяких варіантах втілення генетичний варіант гену TOMM40 є поліморфізмом (DIP) видалення/вставки. У деяких варіантах втілення DIP є поліморфізмом вставки. У деяких варіантах втілення DIP є полі-T поліморфізмом видалення/вставки (наприклад, між 5 і 100, або 10 і 80, або 20 і 50 парами основ полі-T). В деяких варіантах втілення генетичний варіант є варіантом гену TOMM40, зазначеним у Таблиці 1, як вказано нижче. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523, rs10602329 або DIP3. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523. Далі передбачено використання активного агента проти хвороби Альцгеймера для приготування лікарського препарату для забезпечення способу лікування хвороби Альцгеймера відповідно до пунктів, що викладені вище. Також пропонується використання активного агенту проти хвороби Альцгеймера та для проведення способу лікування хвороби Альцгеймера. Пропонується спосіб визначення прогнозу для пацієнтів з ризиком розвитку хвороби Альцгеймера, включаючи отримання профілю пацієнта, де отримання профілю пацієнта 3 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включає: виявлення наявності або відсутності хоча б одного ApoE алеля в біологічному зразку пацієнта і виявлення наявності або відсутності хоча б одного TOMM40 поліморфізму (DIP) видалення/вставки, що розташовані в інтроні 6 або інтроні 9 у гені TOMM40, і далі перетворення профілю пацієнта в прогноз, в якому присутність ApoE алелів і наявність принаймні одного TOMM40 поліморфізму DIP ідентифікує пацієнта як особу з ризиком розвитку хвороби Альцгеймера. У деяких варіантах втілення DIP є поліморфізмом вставки. У деяких варіантах втілення DIP є полі-T поліморфізм видалення/вставки (наприклад, між 5 і 100, або 10 і 80, або 20 і 50 полі-T). У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523, rs10602329 або DIP3. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523. У деяких варіантах втілення спосіб додатково включає в себе виявлення у пацієнта одного з Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, E4/E4. У деяких варіантах втілення пацієнт є з Apo E3/E3 або E3/E4 пацієнт. Також запропоновано спосіб поділу пацієнтів на підгрупи клінічних випробувань способу терапії хвороби Альцгеймера, спосіб включає: виявлення наявності або відсутності хоча б одного ApoE алеля в біологічну зразку пацієнта і виявлення наявності або відсутності хоча б одного поліморфізму (DIP) TOMM40 видалення/вставки, розташованих в інтроні 6 або інтроні 9 у гені TOMM40, де пацієнти розділені на підгрупи для клінічних випробувань терапії, заснованої на наявності або відсутності з, принаймні одного ApoE та/або TOMM40 DIP алеля. У деяких варіантах втілення DIP є поліморфізмом вставки. У деяких варіантах втілення DIP є полі-T поліморфізмом вставки (наприклад, між 5 і 100, або 10 і 80, або 20 і 50 полі-T вставки). У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523, rs10602329 або DIP3. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523. У деяких варіантах втілення спосіб додатково включає виявлення у пацієнта одного з: Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, E4/E4. У деяких варіантах втілення суб‟єктом є Apo E3/E3 або E3/E4 пацієнт. Далі запропоновано спосіб для ідентифікації пацієнтів у клінічних випробуваннях для лікування хвороби Альцгеймера, що включає: а) виявлення пацієнтів з діагнозом хвороби Альцгеймера, і b) визначення прогнозу для пацієнтів з діагнозом хвороби Альцгеймера, що включає отримання профілю пацієнту, у якому профіль включає: i) виявлення наявності або відсутності хоча б одного ApoE алеля в біологічному зразку пацієнта, ii) виявлення наявності або відсутності хоча б одного поліморфізму (DIP) TOMM4 видалення/вставки, розташованих в інтроні 6 або інтроні 9 у TOMM40 гені і iii) перетворення профілю пацієнта в прогноз, де прогноз включає передбачення, чи пацієнти є кандидатами на клінічні випробування для лікування хвороби Альцгеймера. У деяких варіантах втілення DIP є поліморфізмом вставки. У деяких варіантах втілення DIP є полі-T поліморфізмом видалення/вставки (наприклад, між 5 і 100, або 10 і 80, або 20 і 50 поліT). У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523, rs10602329 або DIP3. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523. У деяких варіантах втілення додатково спосіб включає виявлення пацієнтів з Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, E4/E4. У деяких варіантах втілення суб‟єктом є пацієнт з Apo E3/E3 або E3/E4. Набір для визначення, чи є пацієнт з підвищеним ризиком розвитку пізнього початку хвороби Альцгеймера, що включає: (А) принаймні один реагент, що специфічно визначає ApoE 3, ApoE 4, або ApoE 2, де реагент обраний з групи, що складається з антитіл, які вибірково зв'язують ApoE 3, ApoE 4, або ApoE 2, і олігонуклеотидних зондів, що зв'язуються з ДНК, що кодує їх; (В) принаймні один реагент, що специфічно визначає наявність або відсутність хоча б одного поліморфізму (DIP) TOMM40 видалення/вставки, що розташовані в інтроні 6 або інтроні 9 гену TOMM40; і (С) інструкції для визначення того, чи суб‟єкт є з підвищеним ризиком розвитку пізнього початку хвороби Альцгеймера шляхом: (i) виявлення наявності або відсутності ApoE ізоформ у пацієнта за допомогою принаймні одного реагента; (ii) виявлення наявності або відсутності хоча б одного поліморфізму (DIP) TOMM40 видалення/вставки, що локалізований в інтроні 6 або інтроні 9 у TOMM40 гені; і (iii) визначення, чи є або не є пацієнт під підвищеним ризиком розвитку пізнього початку хвороби Альцгеймера, спостерігаючи, чи наявність ApoE ізоформи і TOMM40 DIP або відсутність виявляється чи ні принаймні за допомогою одного реагенту, де присутність ApoE ізоформа і TOMM40 DIP вказує на те, що пацієнт є під підвищеним ризиком розвитку пізнього початку захворювання хвороби Альцгеймера. У деяких варіантах втілення, принаймні, один реагент та інструкції упаковані в один контейнер. 4 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах втілення DIP є поліморфізмом вставки. У деяких варіантах втілення DIP є полі-T поліморфізмом видалення/вставки (наприклад, між 5 і 100, або 10 і 80, або 20 і 50 поліT). У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523, rs10602329 або DIP3. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523. У деяких варіантах втілення етап визначення додатково включає виявлення чи є суб‟єкт суб‟єктом з Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, або E4/E4. У деяких варіантах втілення пацієнт є пацієнтом з Apo E3/E3 або E3/E4. Запропоновано набір для визначення, чи є пацієнт чутливим до лікування заявленого стану, в якому заявлений стан пов'язаний з ApoE та/або TOMM40, активним агентом, де набір включає: (А) принаймні один реагент, що специфічно визначає ApoE 3, ApoE 4, або ApoE 2, де реагент вибраний з групи, що складається з антитіл, які вибірково зв'язують ApoE 3, ApoE 4, або ApoE 2, і олігонуклеотидних зондів, що зв'язуються з ДНК, яка кодує такі; (В) принаймні один реагент, що специфічно визначає наявність або відсутність принаймні одного поліморфізму (DIP) TOMM40 видалення/вставки, що локалізований в інтроні 6 або інтроні 9 в TOMM40 гені; і (С) інструкції для визначення того, що суб'єкт чутливий до лікування заявленого стану заявленим активним агентом: (i) визначення наявності або відсутності ApoE ізоформи у пацієнта з принаймні одним реагентом; (ii) виявлення наявності або відсутності хоча б одного TOMM40 поліморфізму (DIP) видалення/вставки, локалізованого в інтроні 6 або в інтроні 9 в TOMM40 гені; і (iii) визначення того, чи пацієнт чутливий або ні до лікування, шляхом вивчення, чи наявність ApoE ізоформ і TOMM40 DIP визначається або ні принаймні одним реагентом, в якому присутність ApoE 3 та TOMM40 DIP вказує на те, що суб'єкт реагує на лікування активним агентом. У деяких варіантах втілення принаймні один реагент та інструкції упаковані в один контейнер. У деяких варіантах втілення DIP є поліморфізмом вставки. У деяких варіантах втілення DIP є полі-T поліморфізмом видалення/вставки (наприклад, між 5 і 100, або 10 і 80, або 20 і 50 парами нуклеотидів полі-T). У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523, rs10602329 або DIP3. У деяких варіантах втілення DIP є rs10524523. У деяких варіантах втілення етап визначення додатково включає виявлення, чи є пацієнт пацієнтом з Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, або E4/E4. У деяких варіантах втілення суб‟єкт є пацієнтом з Apo E3/E3 або E3/E4. Слід розуміти, що всі вищевикладені варіанти можуть бути скомбіновані будь-яким шляхом та/або в будь-якій комбінації. Зазначені вище та інші об'єкти і аспекти представленого винаходу пояснюються більш докладно у кресленнях, що додаються, і в описі, який викладено нижче. Короткий опис креслень Фігура 1 демонструє загальну схему для виявлення генетичних варіантів у заданій ділянці геномної послідовності генетичного локусу заявленого стану, які можуть бути пов‟язані із заявленим станом відповідно до деяких варіантів втілення. Фігура 2 показує графік середнього віку початку хвороби Альцгеймера як функції спадкування п'яти загальних генотипів ApoE і представляють ApoE 4 як фактор ризику хвороби Альцгеймера (1993). Фігура 3 показує регіони А, В та С хромосоми 19, які є типовими генетичними локусами заявленого стану. Ген TOMM40 є у безпосередній близькості до гену ApoE та кодує 40 kD протеїн, орієнтований на зовнішній мітохондріальній мембрані. TOMM40 взаємодіє з ApoE безпосередньо в регуляції мітохондріального імпорту білку та представляє гіпотезу щодо наявності певного варіанту (варіантів) TOMM40, що збільшує підвищений ризик хвороби Альцгеймера, асоційований із залежною від дози присутністю ApoE 3 алеля. Фігура 4 демонструє філогенетичне дерево, сформоване з використанням послідовності даних для AS випадок/контроль когорти суб‟єктів. А і В відносяться до двох основних філогенетичних гілок, які виходять з першої точки гілкування. Довжини різноманітних алелів rs10524523 („523) у кожній термінальній гілці цього дерева позначені. APOE алель, що зв‟язаний у цис-положенні з кожним rs10524523 відрізком алелю, також вказаний. Фігура 5 є схематичною діаграмою філогенетичного дерева, що базується у регіоні В, сконструйованому для TOMM40, яка демонструє відсоткове співвідношення ApoE фенотипів у двох основних угрупуваннях або гілках варіантів TOMM40 у цьому регіоні. Фігура 6 є схематичним уявленням локусу TOMM40-ApoE, який включає LD ділянку, яка показує блоки гаплотипу і регіони суб‟єкту у первинній послідовності у досліджуваному (R1) (23 Kb) і підтвердженому (R2) (10 Kb) дослідженнями (NCBI Build 36.3). LD ділянка показує дані 5 UA 103200 C2 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 карти гаплотипів (CEU аналітичну панель), визначення блоку гаплотипу солідної основи, r рівні з D‟/LOD з кольоровою схемою, представленою різними лінійними характеристиками. Фігура 7 показує представництво філогенетичних дерев з виділенням варіантів. 7А: SNP варіанти, гілка А у порівнянні з В, E6–E10 представляють TOMM40 екзони та вертикальні лінії показують приблизні положення SNP. Виділення двох основних гілок має сильну бутстрап підтримку (973/1000). 7В: rs10524523 довжина поліморфізмів. Описові статистики надаються по кожній групі довжин поліморфізмів. Декілька довгих гаплотипів, які формують індивідуальні зовнішні групи у дереві або дуже маленькі гілки у групі, ідентифіковані як «Решта». Фігура 8 представляє гістограми довжини rs10524523 довжини поліморфізму з розбивкою на ApoE генотипи 3/3 (8А), 3/4 (8В) та 4/4 (8С). N=210 гаплотипів (AS вибірки). Фігура 9 показує зв'язок між віком початку хвороби Альцгеймера (AD) та довжиною rs10524523 поліморфізму пацієнтів з AD з початком між 60 та 68 роками. Діаграми розмаху показують 95% діапазону (вертикальні лінії), середній (горизонтальні лінії діаграми) та інтерквартіальний діапазон (діаграма). Детальний опис Представлений винахід пояснюється більш детально нижче. Цей опис не претендує на докладний перелік всіх різних шляхів, якими винахід може бути реалізовано, або всіх ознак, які можуть бути додані до даного винаходу. Наприклад, ознаки, проілюстровані у відношенні до одного втілення, можуть бути включені до інших варіантів втілення, і ознаки, проілюстровані у відношенні до особливого варіанту втілення, можуть бути видалені з цього варіанту втілення. Крім того, численні зміни та доповнення до різних варіантів втілення, запропонованих тут, будуть очевидні для фахівця у цій галузі в світлі даного розкриття, яке не виходить за межі даного винаходу. Таким чином, наступний опис має намір ілюструвати деякі особливості втілення винаходу і не вичерпно зазначає всі перестановки, комбінації та їх варіації. Як використано в описі винаходу і доданій формулі, особисті форми (“a”, “an” та “the”) мають на увазі включення форм множини також, якщо з контексту не випливає інше. Також, використане тут "та/або" відносяться до і охоплюють будь-які і всі можливі комбінації одного або декількох з перерахованих пунктів також, як відсутність комбінації, коли інтерпретується як альтернатива ("або"). Представлений винахід належить до способів виявлення генетичної мінливості в ділянках, що представляють певний інтерес для складних захворювань і розладів. Це відноситься також до відкриття найбільш інформативних генетичних маркерів на основі зв‟язків з інформацією про фенотип. В одному з варіантів втілення винахід може бути використаний для локалізації генетичних маркерів, пов'язаних із сприйнятливістю до певної хвороби, розладу або стану. В іншому варіанті дані, що стосуються відповіді суб‟єкта на варіант лікування чи ліки, можуть бути включені до філогенетичного аналізу для локалізації генетичних маркерів, пов'язаних з позитивною відповіддю на це лікування або медикамент (тобто, фармакогенетика). Методи можуть застосовуватися на будь-якому наборі даних генетичної варіації з особливого локусу. Дивися Фіг.1 для блок-схеми методики пошуку генетичних факторів ризику відповідно до цього винаходу. В одному аспекті аналіз генетичної мінливості базується на варіантних послідовних даних. У другому аспекті структура не охоплена використанням даних диплоїдного генотипу, що дозволяє уникнути необхідності як експериментального, так і обчислювального виведення компонентних гаплотипів. (див. U.S. No. 6,027,896, Roses та ін.). У іншому аспекті представлений метод може бути застосований до неохарактеризованої алельної зміни, що є результатом дослідження мішені нуклеїнової кислоти в експериментальній процедурі, що забезпечує запис даного варіанту послідовності, але фактично не забезпечує цілісної послідовності. Базова структура генетичної мінливості також корисна для виведення конститутивних гаплотипів з даних диплоїдного генотипу. Надається перевага та передбачається, що методи, які описані тут, будуть використовуватися у поєднанні з іншою клініко-діагностичною інформацією, відомою чи описаною у даній галузі, яка використовується в оцінці пацієнтів з захворюваннями або розладами (наприклад ті, у яких припускають зв'язок з мітохондріальною дисфункцією (наприклад, хвороба Альцгеймера або інші нейродегенеративні розлади)), або для оцінки суб‟єктів, у яких припускають можливість ризику розвитку таких захворювань. Винахід може бути застосований для виявлення генетичних факторів ризику для інших комплексних захворювань, розладів або станів. Розкриття усіх посилань патентів США, цитованих тут, включається таким чином як посилання у повному об‟ємі. 1. Визначення Використані тут наступні поняття: 6 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 «Заявлений стан» відноситься до певного стану, хвороби або розладу, визначених для філогенетичного дослідження та/або наступного діагнозу або прогнозування. «Стан», що використано тут, включає, але не обмежується станами, пов‟язаними з ApoE та/або TOMM40, та/або мітохондріальною дисфункцією, наприклад, нейродегенеративними захворюваннями, захворюваннями обміну речовин, психічними розладами і раком. Приклади станів, в яких ApoE та/або TOMM40 мали місце, включають, але не обмежують, серцево-судинні захворювання, хвороби обміну речовин, нейродегенеративні захворювання, неврологічні травми або захворювання, аутоімунні захворювання (наприклад, розсіяний склероз (Pinholt M, та ін. Apo E in multiple sclerosis and optic neuritis: the apo E-epsilon4 allele is associated with progression of multiple sclerosis. Mult Scler. 11:511-5 (2005); Masterman, T. & Hillert, J. The telltale scan: APOE 4 in multiple sclerosis. Lancet Neurol. 3: 331 (2004), психоневрологічний системний червоний вовчак (Pullmann Jr. R, та ін. Apolipoprotein E polymorphism in patients with neuropsychiatric SLE. Clin Rheumatol. 23: 97-101 (2004), etc.)); вірусну інфекцію (наприклад, захворювання печінки, асоційовані з інфекційним гепатитом С (Wozniak MA, та ін. Apolipoprotein E- 4 protects against severe liver disease caused by hepatitis C virus. Hepatol. 36: 456-463 (2004)), ВІЛ-інфекція (Burt TD, та ін. Apolipoprotein (apo) E4 enhances HIV-1 cell entry in vitro, and the APOE epsilon4/epsilon4 genotype accelerates HIV disease progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105:8718-23 (2008)), etc.)); перелом шийки стегна/остеопороз (Pluijm SM, та ін. Effects of gender and age on the association of apolipoprotein E epsilon4 with bone mineral density, bone turnover and the risk of fractures in older people. Osteoporos Int. 13: 701-9 (2002)); мітохондріальні захворювання (Chang S, та ін. Lipid- and receptor-binding regions of apolipoprotein E4 fragments act in concert to cause mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102:18694-9 (2005)); старіння (Schächter F, та ін. Genetic associations with human longevity at the APOE and ACE loci. Nat Genet. 6:29-32 (1994); Rea IM, та ін., Apolipoprotein E alleles in nonagenarian subjects in the Belfast Elderly Longitudinal Free-living Ageing Study (BELFAST). Mech. Aging and Develop. 122: 1367-1372 (2001)); запалення (Li L, та ін., Infection induces a positive acute phase apolipoprotein E response from a negative acute phase gene: role of hepatic LDL receptors. J Lipid Res. 49:1782-93 (2008)); та розлади пам‟яті (Caselli RJ, та ін. Longitudinal modeling of age-related memory decline and the APOE epsilon4 effect. N Engl J Med. 361:255-63 (2009)). «Серцево-судинні захворювання», як використано тут, відносяться до хвороби, що пов‟язана з серцем та/або кровоносними судинами, що включають, але не обмежені, хворобою коронарних артерій. (Song Y, та ін. Meta-analysis: apolipoprotein E genotypes and risk for coronary heart disease. Ann Intern Med. 141:137-47 (2004); Bennet AM, та ін., Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk. JAMA 298:1300-11 (2007)), атеросклероз (Norata GD, та ін. Effects of PCSK9 variants on common carotid artery intima media thickness and relation to ApoE alleles. Atherosclerosis (2009) Jun 27. [Epub ahead of print], doi:10.1016/j.atherosclerosis 2009.06.023; Paternoster L, та ін. Association Between Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness May Suggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke. Stroke 39:48–54 (2008)), ішемічна хвороба серця(Schmitz F, та ін., Robust association of the APOE 4 allele with premature myocardial infarction especially in patients without hypercholesterolaemia: the Aachen study. Eur. J. Clin. Investigation 37: 106-108 (2007)), васкулярні захворювання, такі як ішемічний інсульт (Peck G, та ін. The genetics of primary haemorrhagic stroke, subarachnoid haemorrhage and ruptured intracranial aneurysms in adults. PLoS One. 3:e3691 (2008); Paternoster L, та ін. Association Between Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness May Suggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke. Stroke 39:48–54 (2008)), судинна деменція (Bang OY, та ін. Important link between dementia subtype and apolipoprotein E: a metaanalysis. Yonsei Med J. 44:401-13 (2003); Baum L, та ін. Apolipoprotein E epsilon4 allele is associated with vascular dementia. Dement Geriatr Cogn Disord. 22:301-5 (2006)), та ін. «Нейродегенеративні захворювання», що використані тут, відносяться до хвороби Альцгеймера (Corder EH, та ін. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science 261:921-3 (1993).; Corder EH, та ін. There is a pathologic relationship between ApoE-epsilon 4 and Alzheimer's disease. Arch Neurol. 52:650-1 (1995)), хвороби Паркінсона (Huang X, та ін. Apolipoprotein E and dementia in Parkinson disease: a meta-analysis. Arch Neurol. 63:189-93 (2006); Huang X та ін. APOE-[epsilon]2 allele associated with higher prevalence of sporadic Parkinson disease. Neurology 62:2198-202 (2004); Martinez, M. та ін. Apolipoprotein E4 is probably responsible for the chromosome 19 linkage peak for Parkinson's disease. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 136B, 172–174 (2005)), хвороби Хантінгтона та інших, менш загальних захворювань та розладів, при яких функція нейронів знижена, наприклад, вікова макулярна дегенерація (Thakkinstian A, та ін. Association between 7 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 apolipoprotein E polymorphisms and age-related macular degeneration: A HuGE review and metaanalysis. Am J Epidemiol. 164:813-22 (2006); Bojanowski CM, та ін. An apolipoprotein E variant may protect against age-related macular degeneration through cytokine regulation. Environ Mol Mutagen. 47:594-602 (2006)). “Неврологічна травма або хвороба” включає, але не обмежує, наслідки після травми голови (Zhou W, та ін. Meta-analysis of APOE4 allele and outcome after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 25:279-90 (2008); Lo TY, та ін. Modulating effect of apolipoprotein E polymorphisms on secondary brain insult and outcome after childhood brain trauma. Childs Nerv Syst. 25:47-54 (2009)), мігрень (Gupta R, та ін. Polymorphism in apolipoprotein E among migraineurs and tension-type headache subjects. J Headache Pain. 10:115-20 (2009)), вазогенний набряк (James ML, та ін. Apolipoprotein E modifies neurological outcome by affecting cerebral edema but not hematoma size after intracerebral hemorrhage in humans. J Stroke Cerebrovasc Dis. 18:144-9 (2009); James ML, та ін. Pharmacogenomic effects of apolipoprotein e on intracerebral hemorrhage. Stroke 40:632-9 (2009)), та ін. «Хвороби обміну речовин», як використано тут, включають, але не обмежуються, дисліпідемією (Willer CJ, та ін. Newly identified loci that influence lipid concentrations and risk of coronary artery disease. Nat Genet. 40:161-9 (2008); Bennet AM, та ін., Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk. JAMA 298:1300-11 (2007)), і стадією ниркової недостатності (Oda H, та ін. Apolipoprotein E polymorphism and renal disease. Kidney Int Suppl. 71:S25-7 (1999); Hubacek JA, та ін. Apolipoprotein E Polymorphism in Hemodialyzed Patients and Healthy Controls. Biochem Genet. (2009) Jun 30. [Epub ahead of print] DOI 10.1007/s10528-0099266-y.), хронічною нирковою хворобою (Yoshida T, та ін. Association of a polymorphism of the apolipoprotein E gene with chronic kidney disease in Japanese individuals with metabolic syndrome. Genomics 93:221-6 (2009); Leiva E, та ін. Relationship between Apolipoprotein E polymorphism and nephropathy in type-2 diabetic patients. Diabetes Res Clin Pract. 78:196-201 (2007)), хворобою жовчного міхура (Boland LL,та ін. Apolipoprotein E genotype and gallbladder disease risk in a large population-based cohort. Ann Epidemiol. 16:763-9 (2006); Andreotti G, та ін. Polymorphisms of genes in the lipid metabolism pathway and risk of biliary tract cancers and stones: a population-based casecontrol study in Shanghai, China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 17:525-34 (2008)), цукровим діабетом (ІІ типу) (Elosua R, та ін. Obesity Modulates the Association among APOE Genotype, Insulin, and Glucose in Men. Obes Res. 11:1502–1508 (2003); Moreno JA, та ін. The Apolipoprotein E Gene Promoter (–219G/T) Polymorphism Determines Insulin Sensitivity in Response to Dietary Fat in Healthy Young Adults. J. Nutr. 135:2535-2540 (2005)), метаболічним синдром, жовчнокам‟яною хворобою (Abu Abeid S, та ін. Apolipoprotein-E genotype and the risk of developing cholelithiasis following bariatric surgery: a clue to prevention of routine prophylactic cholecystectomy. Obes Surg. 12:354-7 (2002)), та ін. «Психіатричний розлад», як використано тут, відноситься до шизофренії (Kampman O, та ін. Apolipoprotein E polymorphism is associated with age of onset in schizophrenia. J Hum Genet. 49:355-9 (2004); Dean B. та ін., Plasma apolipoprotein E is decreased in schizophrenia spectrum and bipolar disorder. Psychiatry Res. 158:75-78 (2008)), обсесивно-компульсивного розладу (ОКР), приймання наркотиків, нікотинозалежності, алкогольної залежності, а також біполярного афективного розладу (Dean B. та ін., Plasma apolipoprotein E is decreased in schizophrenia spectrum and bipolar disorder. Psychiatry Res. 158:75-78 (2008)), та інших захворювань, розладів та станів психіатричного характеру. «Розвиток стану», як використано тут, відноситься до будь-якого первинного діагнозу захворювання, розладу або іншого медичного стану чи загострення вже існуючої хвороби, розладу або медичного стану для суб‟єктів, яким вже було поставлено діагноз. «Діагноз» або «прогнозування», як використано тут, відносять до використання інформації (наприклад, генетична інформація або дані інших молекулярних тестів з біологічних зразків, ознаки і симптоми, висновки фізичного обстеження, результати когнітивного дослідження, та ін.), передбачення найбільш вірогідних результатів, термінів та/або сприйнятливості до особливого лікування для даного захворювання, розладу або стану на основі порівняння множини осіб, що об‟єднані загальними нуклеотидними послідовностями, симптомами, ознаками, сімейними анамнезами або іншими даними, що мають відношення до оцінювання статусу здоров‟я пацієнта. «Біологічний зразок», як використано тут, відноситься до матеріалу, який потенційно містить заявлені нуклеїнові кислоти. Біологічні зразки, що містять ДНК, включають волосся, шкіру, ротовий мазок та біологічні рідини, такі як кров, сироватка, плазма, мокротиння, лімфатична рідина, сперма, слиз піхви, фекалії, сеча, спинномозкова рідина і тому подібне. Виділення ДНК з таких зразків добре відомо спеціалістам у даній галузі. 8 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 «Суб‟єкт», відповідно до деяких варіантів втілення винаходу, є особою, чий генотип (генотипи) або гаплотип (гаплотипи) повинні бути визначені й записані у поєднанні зі станом особи (тобто, хворобою або статусом розладу) та/або сприйнятливістю до медикаменту або лікування. Нуклеотидні послідовності від множини суб‟єктів використовуються для конструювання філогенетичного дерева, а потім аналогічні нуклеотидні послідовності від окремих суб‟єктів можуть бути порівняні з тими, що є у філогенетичному дереві, для діагностичних та прогностичних цілей. «Ген», як використано тут, означає сегмент ДНК, який містить всю інформацію для регуляції біосинтезу РНК продукту, включаючи промотори, екзони, інтрони та інші нетранслюючі регіони, які контролюють експресію. «Генетичний локус» або «локус», як використано тут, означає локалізацію у хромосомі або молекулі ДНК, як правило, відповідного гену або фізичної, або фенотипічної ознаки, або частини нуклеотиду, або фрагменту секвенування нуклеотидів. Локуси є множинною формою локусу. «Ампліфікація», як застосовано до нуклеїнових кислот тут, відноситься до будь-якого методу, результатами якого є утворення однієї або більше копій нуклеїнової кислоти, де, переважно, ампліфікація є експоненціальною. Один з методів для ферментативної ампліфікації специфічних послідовностей ДНК є відомим як полімеразна ланцюгова реакція, як описано Saiki та ін., 1986, Science 230:1350-1354. Праймери, що використовуються у ПЛР, звичайно мають довжину від 10 до 50 або більше нуклеотидів та, як правило, принаймні, біля 15 нуклеотидів для забезпечення найкращої специфічності. Продукований дволанцюговий фрагмент зветься «амплікон» та може змінюватися по довжині від всього лише біля 30 нуклеотидів до 20000 і більше. "Маркер" або "генетичний маркер", як використано тут, є відомим варіантом послідовності ДНК, зокрема локусу. Зміни можуть бути присутніми у осіб і обумовлені мутацією або спадкуванням. Генетичний маркер може бути короткою послідовністю ДНК, такою як зміни однієї пари основ в оточенні послідовності (один нуклеотидний поліморфізм, SNP), або довгою, подібною до мінісателітів. Маркери можуть бути використані для вивчення взаємозв'язку між спадковим захворюванням і його генетичними причинами (наприклад, специфічна мутація гена, що призводить до дефектних або інших небажаних форм білка). "Генетичний фактор ризику", як використано тут, означає генетичний маркер, пов'язаний з підвищеною сприйнятливістю до стану, захворювання або розладу. Це може також мати відношення до генетичного маркеру, пов'язаного з конкретною сприйнятливістю до обраного препарату або заявленого лікування. "Пов'язаний з", як використовується тут, означає наявність разом двох або більше ознак частіше, ніж можна було б очікувати від одиничного випадку. Наприклад, зв‟язок включає ознаку на поверхні білих кров'яних клітин, так званих HLA (HLA означає лейкоцитарний антиген людини). Певний тип HLA, HLA типу B-27, пов'язаний з підвищеним ризиком для ряду захворювань, включаючи анкілозуючий спондиліт. Анкілозуючий спондиліт у 87 разів частіше зустрічається у людей з HLA B-27, ніж у загальній популяції. Суб‟єкт "з підвищеним ризиком розвитку стану", пов‟язаним з генетичним фактором ризику, є таким, що схильний до стану, має генетичну схильність до стану та/або більш схильний до розвитку стану, ніж суб‟єкти, у яких генетичний ризик фактору відсутній. Наприклад, суб'єкт "з підвищеним ризиком розвитку хвороби Альцгеймера" через наявність одного або двох ApoE 4 алелів має більше шансів на розвиток хвороби Альцгеймера, ніж суб'єкт, який не несе ApoE 4 алель. "Поліморфізм", як використано тут, має відношення до наявності двох або більше різних нуклеотидних послідовностей, зокрема локуса ДНК геному. Поліморфізми можуть слугувати як генетичними маркерами, так і відноситися до генетичних варіантів. Поліморфізми включають нуклеотидні заміни, вставки, видалення і мікросателіти і можуть, але не призводять до виявлення відмінностей в експресії функції гена або білка. Поліморфний сайт є нуклеотидною позицією всередині локуса, в якому нуклеотидна послідовність варіює у відношенні до послідовності, принаймні однієї особи в популяції. "Поліморфізм видалення/вставки" або "DIP", як використано тут, є вставкою одного або декількох нуклеотидів в одному з варіантів послідовності по відношенню до іншої. Якщо відомо, який із алелів представляє собою мінорні алелі, термін "видалення" використовується при мінорному алелі видалення нуклеотиду, і термін "вставки" використовується, коли мінорний алель є додаванням нуклеотиду. Термін "поліморфізм видалення/вставки" також використовується, коли є декілька форм або подовжень і мінорний алель не є очевидним. Наприклад, для полі-Т поліморфізму, описаного тут, спостерігається кілька подовжень поліморфізму. 9 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Дані поліморфізму", як використано тут, означають інформацію щодо одного або більше з таких варіантів для специфічного гену: розташування поліморфних сайтів; послідовність зміни в цих об'єктах; частота поліморфізмів в одній або декількох популяціях; різні генотипи та/або гаплотипи, визначені для гена, частота одного або більше з цих генотипів та/або гаплотипів в одній або декількох популяціях, а також будь-яка відома асоціація (асоціації) між ознаками та генотипом або гаплотипом для гену. «Гаплотип», як використано тут, має відношення до генетичного варіанту або комбінації варіантів, які несе принаймні одна хромосома індивідуума. Гаплотип часто включає кілька суміжних поліморфних локусів. Всі частини гаплотипу, як використаного тут, зустрічаються на тій же копії хромосоми або гаплоїдної молекули ДНК. За відсутності доказів іншого, гаплотип, як передбачається, представляє комбінацію множини локусів, які могли бути передані разом під час мейозу. Кожна людина несе в собі пару гаплотипів для будь-якого даного генетичного локусу, що складається з послідовностей, успадкованих від гомологічних хромосом від двох батьків. Ці гаплотипи можуть бути однаковими або можуть представляти два різних генетичних варіанта для даного локусу. Гаплотипування - це процес визначення одного або декількох гаплотипів у особи. Гаплотипування може включати використання сімейних успадкувань, молекулярних методів та/або статистичних висновків. "Варіант", "варіація " або "генетичний варіант", як використано тут, відносяться до специфічної ізоформи гаплотипів в популяції, специфічна форма відрізняється від інших форм того самого гаплотипу послідовністю, принаймні одного, а часто більше, ніж одного, варіантних сайтів або нуклеотидів в послідовності гена. Послідовності в цих варіантних сайтах, які відрізняються між різними алелями гена, називаються "варіанти генних послідовностей", "алелі", "варіації " або "варіанти". Термін "альтернативна форма" відноситься до алелю, який може бути відокремлений від інших алелів при наявності принаймні одного, а часто і більше ніж один варіантних сайтів в послідовності гена. Інші терміни, відомі з рівня техніки як еквівалентні "варіаціям" або "варіантам", включають мутації і однонуклеотидні поліморфізми (SNPs). Посилання на присутність варіації або варіацій означає особливі варіації, тобто особливі нуклеотиди в особливих поліморфних сайтах, скоріше, ніж присутність будь-якої варіацій в гені. «Ізоформа», як використано тут, означає особливу форму гену, мРНК, кДНК або білку, який кодується такими, що відрізняється від інших форм його специфічною послідовністю та/або структурою. Наприклад, ApoE 4 ізоформа аполіпопротеїну Е як протилежна ізоформам ApoE2 або ApoE 3. "Цистрон", як використано тут, означає ділянку ДНК, знайдену на одній хромосомі, яка містить генетичний код для одного поліпептиду і функціонує як спадкова одиниця. Цистрон включає екзони, інтрони і регуляторні елементи, пов'язані з однієї функціональною одиницею (наприклад, ген). Цей термін походить від класичного цис-транс-тесту для визначення можливості генетичних елементів функціонально взаємодіяти, незалежно від того, чи розташовані вони в одній молекулі ДНК ("транс" комплементація) чи тільки тоді, коли вони розташовані в одній молекулі ДНК ("цис" активні елементи). Термін "генотип" в контексті даного винаходу відноситься до конкретної алельної форми гена, яка може бути визначена, зокрема, нуклеотидом (нуклеотидами), присутнім в послідовності нуклеїнових кислот на конкретному сайті (сайтах). Генотип може також вказувати на пару алелів, представлених на одному або декількох поліморфних локусах. Для диплоїдних організмів, таких як людина, два гаплотипи складають генотип. Генотипуванням є будь-який процес для визначення генотипу особи, наприклад, шляхом ампліфікації нуклеїнових кислот, зв‟язування антитіл або іншими хімічними методами. У результаті генотип може бути безфазовим. Це означає, що не відомо, чи знайдені послідовності будуть отримані від однієї батьківської хромосоми або іншої. "Неврівноважене зчеплення", як використано тут, означає невипадкову асоціацію алелей у двох або більше локусах. Неврівноважене зчеплення описує ситуацію, в якій деякі комбінації алелів або генетичних маркерів зустрічаються більш-менш часто в популяції, ніж можна було б очікувати від випадкового формування гаплотипів з алелів на основі їх частоти. Невипадкові асоціації між поліморфізмами в різних локусах вимірюється ступенем неврівноваженого зчеплення. "Множинне вирівнювання послідовностей" або " MSA", як використовується тут, означає вирівнювання з трьох або більше нуклеотидних послідовностей з геномної ДНК, що походить від множини осіб, щоб визначити гомологію і гетерологію між послідовностями. Загалом, вхідний набір запиту послідовностей передбачає наявність еволюційних відносин, які мають походження і походять від спільного предка. Комп'ютерні алгоритми найчастіше використовуються для виконання аналізу вирівняних послідовностей. 10 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Деякі варіанти втілення представленого винаходу описані з посиланням на блок діаграм, що ілюструють методи (наприклад, Фіг. 1), які можуть включати етапи, здійснені за допомогою комп'ютера та/або комп‟ютерних програмних продуктів. Слід розуміти, що кожен блок блоксхеми та/або операційних ілюстрацій і комбінацій блоків в блок-схеми та/або операційних ілюстрацій можуть бути реалізовані за допомогою аналога та/або цифрового обладнання, та/або інструкцій комп'ютерних програм. Ці інструкції комп'ютерних програм можуть бути забезпечені процесором універсального комп‟ютера, спеціального комп'ютера, ASIC, та/або інших програмованих апаратів для обробки даних, таких, в яких інструкції, які виконуються через процесор комп'ютера та/або інші дані для програмування апарату, створюють засоби для здійснення функцій/дій, зазначених у блок-схемах та/або операційних ілюстраціях. Відповідно, буде зрозумілим, що ці блок-схеми та операційні ілюстрації підтримують апарати, методи і комп'ютерні програмні продукти. Інше програмне забезпечення, таке як операційна система, також можуть бути включені. Далі буде зрозуміло, що функціональність декількох модулів вирівнювання послідовностей, модуля картування та/або інших модулів, описаних тут, можуть бути втілені, принаймні частково, з використанням дискретних компонентів апаратного забезпечення, однієї або декількох інтегральних мікросхем Application Specific (ASIC) та/або одного або декількох цифрових процесорів спеціального призначення та/або комп'ютерами. "Картування", як використано тут, означає створення філогенетичного дерева, приписування вузла кожному новому варіанту послідовності нуклеотидів, що спостерігається, з‟єднання цього вузла з іншим вузлом, який представляє відому послідовність, яку несе той самий індивідуум на тій же самій хромосомі або цистроні та підрахунку кількості кожного типу суб‟єкта, представленого в кожному вузлі. Дивися Фіг.4 як приклад розробки філогенетичного дерева у такий спосіб. "Філогенетичне" означає пов'язане з вивченням еволюційних зв'язків між різними групами організмів або особ у межах одного виду. До того, як генетична інформація була легко доступна, філогенез був заснований загалом на фенотипічних спостереженнях. "Філогенетичне картування", як використано тут, означає використання даних послідовностей ДНК для з‟єднання пов'язаних варіантів послідовності, що здійснюється за допомогою множини осіб з метою визначення еволюційних зв'язків та хронології розбіжностей. "Філогенетичне дерево" є результатом картування зв'язків між варіантами. "Вузол", як використано тут, означає точку даних поліморфізму на філогенетичному дереві, що представляє дійсну варіантну послідовність, яку несе щонайменше один суб‟єкт. Вузол є з‟єднанням гілки з іншим вузлом, що представляє варіантну послідовність, яку несе один і той же суб‟єкт на тій же хромосомі і в тому ж цистроні, але в різних генетичних локусах цистрона. Наявність вузла вказує на те, що принаймні один суб‟єкт несе як послідовність, що зазначена вузлом, так і послідовність, представлену сусіднім вузлом, до якого він приєднується гілкою. "Гілка", як використано тут, означає зв'язок між двома вузлами, які представляють дві різні варіантні послідовності або гаплотипи, де два варіанти розташовані на тій же хромосомі і в тому ж цистроні від певного суб'єкта. "Точка розгалуження" означає будь-який вузол, з якого більше двох гілок відгалужується, але це особливо використовується тут для позначення кореневого вузла, з якого три або більше вузлів виходять. "Кореневий вузол" представляє генетичну послідовність із загального еволюційного предка, від якого генетична дивергенція породила різноманітність близьких варіантів послідовностей, представлених з‟єднаними вузлами. "Ітеративно", як використано тут, стосується повторюваного розрахунку значень для кожної характеристики в серії. Наприклад, кожен вузол на філогенетичному дереві проаналізовано, щоб обчислити відношення числа суб'єктів, постраждалих від заявленого стану (наприклад, хвороби Альцгеймера) до контрольних не постраждалих суб'єктів; це співвідношення порівнюється із з'єднаними вузлами, щоб знайти кореляції із збільшенням або зменшенням ризику розвитку захворювання, розладу, або заявленого стану. Істотні зміни в цьому співвідношенні між одним вузлом і наступним вказує на наявність варіанту, або збільшує або зменшує ризик раннього початку хвороби. "Ітеративне вивчення генетичних варіантів" означає початок аналізу з вузлів, що представляють послідовності, що поєднують найбільшу кількість окремих суб‟єктів, і послідовно аналізують вузли, з'єднані гілками, які відгалужуються від цього вузла, які слідують другим рівнем вузлів, і так далі. Аналіз потім переміщується із загального кореня дерева до зовнішньої гілки та вузлів дерева. "Лікування", як використано тут, включає будь-який препарат, процедуру, зміну способу життя або інші коригування, що введені з метою домогтися змін в конкретному аспекті здоров'я суб'єкта (тобто спрямовані на конкретне захворювання, розлад або стан). "Ліки", як використано тут, відносяться до хімічної речовини або біологічного продукту, або 11 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поєднання хімічних речовин або біологічних продуктів, які призначають суб‟єкту для лікування або запобігання, або контролю захворювання або стану. Термін "ліки", як використано тут, є синонімом термінів "медикамент", "терапевтичне втручання", або "фармацевтичний продукт". Найчастіше медикамент затверджено урядовою установою для лікування принаймні однієї конкретної хвороби або стану. "Хвороба", "розлад" і "стан" загалом визначені в рівні техніки і зазначають наявність ознак та/або симптомів у особи або пацієнта, що за загальним визнанням є ненормальними та/або небажаними. Захворювання або стани можуть бути діагностовані і схарактеризовані за патологічними змінами. Захворювання або стани можуть бути обрані з типів захворювань, перелічених у стандартних текстах, таких як Harrison‟s Principles of Internal Medicine, 1997, або Robbins Pathologic Basis of Disease, 1998. "Мітохондріальна дисфункція", як використано тут, означає будь-яке згубне порушення мітохондрій всередині клітини або клітин. Деякі захворювання, розлади або стани, відомі в даний час в даній області, пов'язані з мітохондріальною дисфункцією, включають хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона та інші нейродегенеративні захворювання, ішемічнореперфузійне пошкодження та інфаркт, епілепсію, діабет і старіння. Багато інших захворювань, розладів і станів пов'язані з мітохондріальною дисфункцією у відомому рівні техніки. Дійсно, мітохондрія має вирішальне значення для нормального функціонування більшості типів клітин, і зниження функцій мітохондрій часто призводить до загибелі клітин. Ця мітохондріальна дисфункція є причиною пошкодження клітин і загрозою втрати продукції АТР, внаслідок порушення гомеостазу кальція і збільшення окислювального стресу. Крім того, мітохондріальне пошкодження може призвести до загибелі клітин шляхом апоптозу, викликаючи вихід цитохрому С та інших профакторів апоптозу в цитоплазму (дивися огляд Wallace, 1999; Schapira, 2006). Що стосується конкретного прикладу, наведеного в цьому документі, ізоформи ApoE 3 та ApoE 4 гіпотетично викликають мітохондріальні дисфункції в результаті взаємодії з TOMM40. Деякі варіанти TOMM40 можуть діяти синергічно з ApoE 3 ізоформами, прискорюючи мітохондріальний спад. Цей мітохондріальний механізм вважають внеском у численні складні генетичні захворювання, розлади і стани. "Суб‟єкти", як використано тут, переважно, але без обмежень, людськи суб‟єкти. Суб'єктами можуть бути чоловік або жінка, вони можуть належати до будь-якої раси або етнічної групи, в тому числі, але без обмежень, кавказької, африканської, американської, азіатської, латиноамериканської, індійської і т. д. Суб'єкти можуть бути будь-якого віку, включаючи новонароджених, новонароджених немовлят, дітей, підлітків, дорослих та літніх людей. Суб'єкти можуть також включати представників тварин, особливо ссавців, таких суб'єктів, як собаки, кішки, велику рогату худобу, коз, тварин родини конячих, дрібну рогату худобу, свиней, гризунів (наприклад, щурів і мишей), зайцеподібних, приматів (у тому числі нелюдиноподібних приматів), і т.д., підданих скринінгу для ветеринарної медицини або розробок ліків для фармацевтичних цілей. "Лікувати", "лікування" або "проводити лікування", як використано тут, відноситься до будьякого типу заходів, які надають користь пацієнту, що страждає від хвороб, включаючи поліпшення стану пацієнта (наприклад, одного або декількох симптомів), затримку початку або прогресування захворювання і т.д. "Захворювання з пізнім початком хвороби Альцгеймера" або " LOAD", як використано тут, відомо у даній області, з використанням класифікації для випадків, коли хвороба Альцгеймера починається або діагностується після 65 років. Це найбільш поширена форма хвороби Альцгеймера. 2. Методи виявлення генетичних варіантів Хоча перелік зв‟язків, похідних від повногеномного сканування корисні, він, як правило, не є достатніми для пояснення складності хвороби. Родини, патологічні шляхи і взаємодії генів можуть обумовити особливості. Варіантне картування з високою точністю може виявити складні генетичні взаємодії. Це особливо доречно тоді, коли один відомий генетичний фактор ризику, який сам по собі не повністю пояснює асоціації хвороби, розладу або заявленого стану, може представляти генетичний локус, що є відмінним кандидатом для більш детальних досліджень. Крім того, фармакогенетика, що є корисною для розробки ліків, може також бути біологічно доречною. Аналіз даних послідовностей від великого числа осіб для виявлення відмінностей в послідовності генів між особами в популяції призводить до виявлення більшої частини всіх варіантів у популяції. Вихідною інформацією послідовності, яка буде проаналізована способом за винаходом, є множина субєктів, що походить від геномної ДНК. Організм може бути будь-яким організмом, від якого є доступною множина послідовностей, але переважно людським організмом. При 12 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначені нових варіантів часто буває корисним аналізувати різні групи популяцій за ознакою раси, етнічної приналежності, статі та/або географічного походження, тому зокрема відхилення можуть відрізнятися за частотою між такими групами. Найбільш переважно, через хворобу або розлади вважається мультігенними (генетично складними захворюваннями/порушеннями) фенотипи, представлені субєктами популяції екстремів (меж діапазону) спектру. Біологічними зразками, що містять ДНК, можуть бути кров, сперма, ротовий мазок і т.д. Виділення ДНК з таких зразків добре відомо спеціалістам у даній галузі. В деяких варіантах втілення, винахід належить до аналізу даних нуклеотидної послідовності від множини суб'єктів, що мають принаймні один відомий фактор ризику для даного захворювання, розладу або стану (генетичні або інші). Нуклеотидні послідовності аналізують для отримання даних гаплотипів, і гаплотипи або генетичні варіанти потім відображають на філогенетичному дереві, щоб продемонструвати еволюцію представленої послідовності. Зпівставляючи це дерево з данними фенотипу про множину субєктів, прогнозують або діагностують можливість індивідуального визначення гаплотипів суб'єкта по філогенетичному дереву. В інших варіантах втілення винахід належить до області фармакогенетики і фармакогеноміки та використання генетичної інформації гаплотипів для передбачення сприйнятливості особи до хвороби та/або її сприйнятливість до конкретного препарату або препаратів так, щоб препарати враховували генетичні відмінності груп популяції і могли бути розроблені та/або призначені особам з відповідним генетичним профілем. Інформація щодо нуклеотидної послідовності походить з геномної ДНК. Використані дані геномної послідовності можуть бути отримані з клініки або від тварин нелюдського походження, або з культивованих клітин, або при досліджені ізольованих тканин. Організмом може бути будь-який організм, який має множину послідовностей, але переважно від людини. При визначені нових варіантів часто буває корисним дослідження різних груп популяції за ознакою раси, етнічної приналежності, статі та/або географічного походження, тому, зокрема, відхилення можуть відрізнятися за частотою між такими групами. Найбільш переважно, для хвороб або розладів, які вважаються мультігенними (генетично складними захворюваннями/порушеннями), фенотипи представлені суб‟єктами популяції, що є крайніми протилежностями. Біологічні зразки, що містять ДНК, можуть бути кров‟ю, спермою, букальним мазком і т.д. Виділення ДНК із зразків в такий спосіб добре відомо в даній галузі. Методи визначення послідовності ДНК, зокрема заявленого генетичного локусу, є також відомими в даній галузі. Автоматизований сіквенсінг в даний час є широко доступним і вимагає лише ізолювання зразка ДНК і принаймні одного праймеру, який спеціально сконструйований для визначення високо консервативної послідовності в межах або в безпосередній близькості від заявленого генетичного локусу. Відповідно до деяких варіантів втілення, визначають генетичний регіон або заявлений локус (наприклад, визначення серією прямих і зворотних праймерів ПЛР), що ретельно сіквенується з когорти людей, включаючи пацієнтів, для яких характерний осбливий розлад. Визначають консенсусну послідовність і всі спостережувані варіанти послідовності для даного генетичного локусу компілюють в список. Локуси, що отримали найбільшу кількість відмічених варіантів, представляють еволюційну дивергенцію від загального предка. Як такі, ці локуси пов'язані в cis локуси, що мають тільки один або дуже мало відмічених варіантів. Під час початкової фази дослідження, принаймні бажано, щоб популяція була розбита на групи суб‟єктів за спільним головним фенотипом, представленим подібним походженням. В іншому випадку аналіз цих даних за допомогою побудови філогенетичних дерев передбачає непомірно велику кількість суб‟єктів. 3. Вирівнювання множини послідовностей Визначення наявності особливої варіацїї або множини варіантів у гені або ділянці гену популяції може бути виконано різними способами, всі з яких пов'язані з локалізацією особливого генетичного локусу шляхом спрямування послідовностей в межах заявленого регіону, які відомі як високо консервативні. З високо консервативного локусі суміжні послідовності легко отримати за допомогою одного з багатьох методів, відомих у цій галузі. Першим кроком в аналізі паралельних послідовностей ДНК з множини субєктів є вирівнювання множини послідовностей ("MSA "). MSA, як правило, використовується для відображення вирівнювання послідовностей з гомологічних зразків з поліморфними відмінностями всередині генів або ділянок генів, щоб показати консервативні ділянки і варіанти послідовностей. MSA інформація про послідовності, отримані в заявленому локусі, може бути оброблена з використанням одного або більше різних відомих методів і програмного забезпечення, що знаходиться у вільному доступі, і є також вільно доступним з багатьох 13 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 джерел, включаючи Інтернет. Методи для аналізу вирівнювання множини послідовностей відомі в даній області і включають, наприклад, описані в патенті США 6,128,587 Sjolander; патенті США 6,291,182 Schork та ін;. і патенті США 6,401,043 Stanton та ін. 4. Філогенетичні дерева та аналіз Різноманітні методи побудови "філогенетичних дерев" є відомими в цій галузі (див., наприклад, Sanderson, 2008). Sun та ін. використовували аналіз "гаплотипний блок" для вивчення зв'язку між варіантами toll-подібних рецепторів (TLR) і раку передміхурової залози (2005), а Bardel та ін. (2005) використовували кладистичний підхід до аналізу для дослідження зв'язків між варіантами гену CARD15 і хворобою Крона. Однак, ніколи раніше не використовували генетичні локуси, пов'язані з хворобою, для вивчення зчеплення. Філогенетичні дерева, у відповідності з деякими варіантами втілення, можуть бути побудовані за топологією, в якій варіанти гаплотипів послідовності, що спостерігаються у вивчених окремих людських субєктів, формують вузли (представлення кожної послідовності, визначеної в даних) на дереві. Вузли можуть бути об‟єднані в інші вузли і спільний предок знаходиться на ділянці розгалуження, спільному корені чи кореневому вузлі дерева. Філогенетичне древо відображає еволюційний зв'язок між генетичними локусами, за даними яких проводиться аналіз (див. Sanderson, 2008; Tzeng, 2005; Seltman, 2003). Фіг.4 показує докладно філогенетичне дерево, побудоване для регіону В генетичного локусу, який показано на Фіг.3. Відправною точкою для оцінки філогенетичного дерева є, як правило, MSA (дивися вище). Велика кількість програмного забезпечення доступна для побудови філогенетичних дерев на основі даних про послідовності. Дивися, наприклад, патенти US 7127466 і US 6532467 Brocklebank та ін. Основною передумовою є те, що генетичний локус демонструє багато варіантів, представленними цими варіантами пов'язаними в cis. Поліморфізми створюють точки розгалужень (вузли) на дереві, які визначають групи споріднених послідовностей або гаплотипів. Філогенетичне дерево використовується для інформації шляхом ітеративного вивчення співвідношення постраждалих суб'єктів зі станом непостраждалих контрольних субєктів; розрахунки починаються з вузлів, в яких спостерігається найбільша кількість субєктів і продовжується до периферійних вузлів дерева, в яких спостерігається найменша кількість субєктів. Мета полягає в тому, щоб знайти точку розгалуження, гілку або вузолд, де є істотні зміни у співвідношені постраждалих суб'єктів з заявленим станом до непостраждалих контрольних суб'єктів. Такі точки галуження представляють еволюційну дивергенцію підвищеного ризику суб'єктів до субєктів пониженого ризику або навпаки. Статистичний аналіз філогенетичного дерева може бути виконаний у відповідності з методами, відомими в даній області. Один з відомих у даній галузі методів є розрахунок рівня достовірності бутстрап (див. Efron та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13429-13434 (1996)). 5. Оцінювання пацієнта Як тільки філогенетичне дерево було сформоване для конкретного генетичного локусу, певний суб'єкт може бути оцінений шляхом порівняння його ДНК послідовністі з послідовностями, які складають філогенетичне дерево. Присутність гаплотипів або варіантів послідовності відповідних регіонів дерева, що представляє суб'єктів з високою частотою заявленого стану (наприклад, більш високі коефіцієнти суб'єктів, уражених захворюванням або розладом, до неуражених контрольних субєктів) означало б, що певний суб'єкт також є з підвищеним ризиком. І навпаки, істотно нижче співвідношення свідчить про зниження ризику розвитку заявленого стану. Філогенетичні дерева також можуть бути проаналізовані на основі реактивності заявленого стану до лікування з активним агентом або методом лікування, заявленого у відповідності з деякими варіантами втілення винаходу. 6. APOE і TOMM40. Фенотипи та генотипи ApoE добре відомі в даній області. Описані створена система номенклатури, а також фенотипи і генотипи для ApoE, наприклад, Zannis та ін., 1982, що включено в якості посилання. Фенотипи та генотипи TOMM40 (субодиниця каналу зовнішньої мітохондріальної мембрани, 40kDa) також відомі. Функції TOMM40 як каналоутворюючої субодиниці транслокази знайдено в мітохондріальній мембрані, що має важливе значення для імпорту білків в мітохондрії. Дані повногеномно асоційованого сканування досліджень пацієнтів з хворобою Альцгеймера мають достовірно ідентифіковану область нерівноважного зчеплення, яка містить ген аполіпопротеїну Е (ApoE). Варіант ApoE 4 широко реплікують, верифікують як ген сприйнятливості з початковою публікації в 1993 (див., наприклад, Corder та ін). Однак дані 14 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повногеномного асоційованого сканування призвели до чудового "збігу" спостережень в дослідженнях клітинної біології, пов'язаних зі спільною локалізацією ApoE і TOMM40 у зовнішній мембрані мітохондрій. Цей інший ген, TOMM40, вперше виявили в ході дослідження моделювання нерівноважного зчеплення навколо ApoE в 1998 році. Поліморфізми були розташовані поруч з ApoE в невеликій області нерівноважного зчеплення. ApoE спільно локалізується на зовнішній мітохондріальній мембрані, про що свідчать специфічні ізоформи взаємодії, що призводять до потенційної ролі ApoE-індукованого мітохондріального апоптозу як першого кроку у прояві хвороби Альцгеймера. Біологічні дані показали, що частка мобільних мітохондрій у культурі клітин нейронів, а також швидкість, з якою вони рухаються, і відстань, яку вони проходять, є факторами, що впливають на посилення мітохондріального апоптозу. Філогенетичні дані свідчать про незалежність генетичного впливу на розвиток хвороби Альцгеймера для TOMM40. ApoE специфічно зв'язується з мітохондріями у культурі нейронів людини (Chang, 2005), і сіквенсінг цього регіону нерівноважного зчеплення у сотень пацієнтів з хворобою Альцгеймера та в контрольній групі в поєднанні з картуванням генетичного варіанту еволюції TOMM40 визначає області особливого інтересу для взаємодії ApoE -TOMM40, як показано на Фіг.3. Ці еволюційні дані надали подальшої підтримки генетичному зв'язку між ApoE і TOMM40, і припускають, що мітохондріальна дисфункція може нести відповідальність за повільну загибель нейронів, що відбувається протягом багатьох років. Вік початку поширення для хвороби Альцгеймера (див., наприклад, патент U.S. 6,027,896, Roses та ін.) може відображати успадкування тісно пов'язаних варіантів двох біохімічно взаємодіючих білків, які призводять до клінічних проявів захворювання. Як вказано в цьому документі, взаємодія між кількома варіантами гаплотипів TOMM40 і ApoE алелів робить внесок у патогенез захворювання хвороби Альцгеймера, зокрема, гаплотипів TOMM40 в зчеплені з E 3 алелем ApoE робить внесок у патогенез захворювання. Деякі варіанти гена TOMM40 розвивалися тільки цис-пов'язано з ApoE 3. (Аналогічним чином специфічні варіанти TOMM40 могли розвиватися цис-пов'язано з ApoE 4 або ApoE 2.) Таким чином, будь-який додадковий генетичний вплив варіантів TOMM40 розділяється незалежно від ApoE 4, але два варіанта білкових продуктів можуть функціонувати інтерактивно, в trans, щоб продукувати даний зазначений фенотип або ознаку. Таким чином, будь-який додатковий генетичний вплив варіантів TOMM40 розділяється незалежно від ApoE 4. Цей "збіг" сусідніх взаємодіючих генів може пояснити надзвичайно значний статистичний зв‟язок даних, встановлених при всіх повногеномних скануваннях, пов‟язаних з дослідженнями хвороби Альцгеймера. Важливо зазначити, що початково комерційно доступні платформи повногеномно асоційованого сканування не містили будьяких ApoE поліморфізмів, але були ідентифіковані з TOMM40 і ApoC1 SNP, але регіон практично завжди зазначали як "ApoE регіон". Ці дані, які поєднують генетичні хвороби і передбачувані молекулярні механізми патогенезу, можна також розглядати в контексті фармакогенетики. Через сильний генетичний ефект наслідування алеля ApoE 4, ApoE 4 був зазначений як комплекс гена сприйнятливості більше десятиліття. Відповідність повторень віку початку поширення в залежності від генотипу ApoE підтверджує роль успадкування ApoE 3 не цілком доброякісну, але нижче фактору ризику, що спостерігається при більш повільних темпах захворювання. Існують генетичні варіанти TOMM40, які знаходяться тільки на ланцюгах ДНК, що містять ApoE 3 в регіонах нерівноважного зчеплення (Roses та ін., неопубліковані дані), і тому не є в рівновазі Hardy-Weinberg, як було потрібно для SNP в повногеномних асоційованих панелях. Еволюційні зміни в послідовностях TOMM40, які є cis пов'язаними тільки з ApoE 3, відповідають підвищеному ризику хвороби Альцгеймера, пов'язаною з ApoE 3, у той час як інші варіанти TOMM40 cis, пов'язані з ApoE 3, зменшують ризик, пов'язаний з ApoE 3. Незалежний генетичний тест визначав би, чи ці TOMM40 поліморфізми пов'язані з меншим відокремленням хвороби Альцгеймера від більш пізнього віку у віці ділянок початку поширення для ApoE 3 вміщуючих генотипів [ApoE 3 / 3 або ApoE 4 / 3]. Визначення наявності або відсутності ApoE 2, 3 або 4, та/або гаплотипів TOMM40, або кодуючої ДНК (в тому числі, в деяких варіантах число алелей для кожного) у субєктів може проводитися або безпосередньо, або опосередковано, будь-яким прийнятним способом. Варіанти методів відомі фахівцям в даній галузі. Все це взагалі включає етап збору зразків біологічного матеріалу, що містить або ДНК або білок від суб‟єкта, а потім виявлення, чи має суб‟єкт заявлений гаплотип. Наприклад, виявлення етапу по відношенню до ApoE може здійснюватися шляхом збору ApoE зразка від суб‟єкта (наприклад, із спинномозкової рідини або будь-якої іншої рідини, або тканини, що містять ApoE), а потім визначення наявності або відсутності ApoE 2, 3, або 4 ізоформ в ApoE зразку (наприклад, шляхом ізоелектричного 15 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фокусування або ІФА). Визначення наявності або відсутності ДНК, що кодує ApoE та/або TOMM40 ізоформи, може здійснюватися шляхом прямого секвенування генома заявленого ДНК регіону з олігонуклеотидним зондом, що відповідає групі, яку визначають, та/або шляхом реакції ампліфікації, такої як полімеразна ланцюгова реакція або лігазна ланцюговоа реакція (продукт такої реакції ампліфікації може бути виявлено з міченим зондом олігонуклеотиду або рядом інших методів). Крім того, етап виявлення може включати етап виявлення, чи є суб‟єкт гетерозиготним або гомозиготним по гену, що кодує ApoE та/або TOMM40 гаплотип. Численні різні формати зонда олігонуклеотидного аналізу відомі, і можуть бути використані для втілення цього винаходу. Див, наприклад, U.S. Pat. No. 4,302,204 Wahl та ін.; U.S. Pat. No. 4,358,535 Falkow та ін.; U.S. Pat. No. 4,563,419 Ranki та ін.; і U.S. Pat. No. 4,994,373 Stavrianopoulos та ін. (заявники мають на увазі, що розкриття всіх посилань американських патентів, які цитується тут, включені тут шляхом посилання). У деяких варіантах втілення визначення можуть включати мультиплексну ампліфікацію ДНК (наприклад, алель-специфічну флуорісцентну ПЛР). В деяких варіантах втілення може включати виявлення гібридизації на мікроматриці (чіп, гранула тощо). У деяких варіантах втілення визначення можуть включати в себе послідовність відповідних частин гена, що містять гаплотипи, які потребують виявлення. У деяких варіантах втілення гаплотипи, що змінені сприйнятливістю до одного або більше ендонуклеазних ферментів рестрикції, можуть бути використані для виявлення. Наприклад, поліморфізм ділянки рестрикційних фрагментів (RFLP), який відноситься до стану травлення, коли різні ферменти рестрикції застосовуються до ДНК, можуть бути використані. У деяких варіантах втілення, наявність одного або більше гаплотипів може бути визначена ампліфікацією специфічних алелів. У деяких варіантах втілення наявність гаплотипів може бути визначена екстенцією праймера. У деяких варіантах втілення наявність гаплотипів може бути визначена олігонуклеотидним лігуванням. У деяких варіантах втілення наявність гаплотипів може бути визначена шляхом гібридизації з міченим зондом для виявлення. Дивися, наприклад, U.S. Patent Application Publication No. 2008/0153088 Sun та ін.; Kobler та ін., Identification of an 11T allele in the polypyrimidine tract of intron 8 of the CFTR gene, Genetics in Medicine 8(2):125-8 (2006); Costa та ін., Multiplex Allele-Specific Fluorescent PCR for Haplotyping the IVS8 (TG)m(T)n Locus in the CFTR Gene, Clin. Chem., 54:1564-1567 (2008); Johnson та ін., A Comparative Study of Five Technologically Diverse CFTR Testing Platforms, J. Mol. Diagnostics, 9(3) (2007); Pratt та ін., Development of Genomic Reference Materials for Cystic Fibrosis Genetic Testing, J. Mol. Diagnostics, 11:186-193 (2009). Ампліфікація обраної або визначеної послідовність нуклеїнових кислот може здійснюватися за допомогою будь-якого відповідного способу для ДНК, виділеної з біологічних зразків. Дивися загалом D. Kwoh and T. Kwoh, 1990. Приклади відповідних методів ампліфікації включають, але не обмежені, полімеразну ланцюгову реакцію, лігазну ланцюгову реакцію, ампліфікацію заміщенням ланцюгів (див. загалом Walker та ін., 1992a; Walker та ін., 1992b), ампліфікацію на основі транскрипції (див. Kwoh та ін ін., 1989), самопідтримуючу реплікацію послідовностей (або "3SR") (див. Guatelli та ін., 1990), Q репліказну систему (див. Lizardi та ін., 1988), ампліфікацію на основі послідовностей нуклеїнових кислот (або "NASBA") (див. Lewis, 1992), ланцюгову реакцію відновлення (або "RCR") (див. Lewis, вище), і зворотню ампліфікацію ДНК (або "BDA") (див. Lewis, вище). Полімеразна ланцюгова реакція на даний момент є кращою. Методи ампліфікації ДНК, такі як зазначено вище, можуть виконуватися з використанням зонда, пари зондів або двох пар зондів, які специфічно зв'язуються з ДНК, що кодує ApoE 4, але не зв'язуються з ДНК, що кодує ApoE 2 або ApoE 3 під дією тих самих умов гібридизації, і служать в якості праймеру або праймерів для ампліфікації ДНК ApoE 4, або його частини в реакції ампліфікації. Крім того, можна використовувати зонд, пару зондів або дві пари зондів, які специфічно зв'язуються з ДНК, що кодує ApoE 2, але не зв'язуються з ДНК, що кодує ApoE 3 або ApoE 4 при тих же умовах гібридизації, і служать в якості праймера або праймерів для ампліфікації ДНК ApoE 2 або його частини в реакції ампліфікації і можна використовувати зонд, пару зондів або дві пари зондів, які специфічно зв'язуються з ДНК, що кодує ApoE 3, але не є обов'язковими в ДНК, що кодує ApoE 2 або ApoE 4 при тих же умовах гібридизації, і служать як праймер або праймери для ампліфікації ДНК ApoE 3 або частини в реакції ампліфікації. Аналогічно, можна використовувати зонд, пару зондів, або дві пари зондів, які специфічно зв'язуються з ДНК, що кодує заявлений TOMM40 гаплотип, але не зв'язуються з іншими гаплотипом TOMM40 при тих же умовах гібридизації, і слугують в якості праймеру або праймерів для ампліфікації ДНК TOMM40 або його частини в реакції ампліфікації. Загалом, олігонуклеотидний зонд, який використовується для виявлення ДНК, що кодує ApoE та/або TOMM40 гаплотипи є олігонуклеотидним зондом, який зв'язується з ДНК, що кодує 16 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заявлений гаплотип, але не зв'язується з ДНК, що кодує інші гаплотипи при тих же умовах гібридизації. Олігонуклеотидний зонд мічений прийнятною для виявлення групою, такою, як наводиться нижче у відношенні до антитіл. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) може здійснюватися згідно з відомими методами. Див, наприклад, U.S. Pat. Nos. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; and 4,965,188. Загалом, ПЛР включає, по-перше, обробку зразка нуклеїнової кислоти (наприклад, у присутності термостабільні ДНК-полімерази) з одним олігонуклеотидним праймером для кожного ланцюга певної послідовності, для виявлення за умов гібридизації, так, що синтезують розширенний продукт кожного праймеру, який є комплементарним до кожного ланцюга нуклеїнової кислоти, з праймерами, що є комплементарними до кожного ланцюга специфічної послідовності для гібридизації так, що синтезують розширений продукту синтезу кожного праймера, коли він відділений від його комплементу, може слугувати матрицею для синтезу розширеного продукту іншого праймера, а потім обробку зразка в денатуруючих умовах, щоб відокремити розширені продукти праймера від їх матриць, якщо послідовность або послідовності будуть визначені як присутні. Ці кроки є циклічно повторюваними до одержання бажаного ступеня ампліфікації. Виявлення ампліфікованої послідовності може бути здійснено шляхом додавання до продукту реакції олігонуклеотидного зонду, здатного до гібридизації з продуктом реакції (наприклад, олігонуклеотидний зонд представленого винаходу), зонд несе мітку для виявлення, а потім виявлення мітки згідно з відомими методами, або прямою візуалізацією на гелі. Коли умови ПЛР підходять для ампліфікації всіх ApoE алельних типів, типи можуть бути виділені шляхом гібридизації з алельним специфічним зондом, по рестрикції ендонуклеазного травлення, за допомогою електрофорезу на денатуруючих градієнтних гелях, або іншими методами. Протокол PCR для визначення генотипу ApoE описаний у Wenham та ін. (1991), що включено в якості посилання. Там описані приклади ефективних праймерів для ампліфікації та ідентифікації ApoE ізоформ. Можуть бути використані праймери, специфічні для ApoE поліморфних ділянок (будь то ApoE 4, E3 або E2). У Wenham, наприклад, задіяні PCR праймери, які ампліфікують регіон з 227 пар основ ДНК, що охоплює ApoE поліморфні ділянки (112 і 158 кодони, які містять 3745 і 3883 нуклеотиди). Ампліфіковані фрагменти потім піддають рестрикції CfoI, яка забезпечує різним фрагменти рестрикції з шести можливих ApoE генотипів, які можуть бути розпізнані на гель-електрофорезі. Дивися також, Hixon та ін. (1990); Houlston та ін. (1989) Wenham та ін. (1991); and Konrula та ін. (1990) для додаткових методів, всі з яких є включені як посилання в цьому документі. Додатково до хвороби Альцгеймера є кілька інших генетично складних захворювань і розладів, для яких методи представленого винаходу забезпечують переваги в порівнянні з існуючими аналізами. Наприклад, дані генетичних досліджень множинного цукрового діабету 2 типу підтверджують думку, що дуже великі серії клінічних випадків/контролю нададуть необхідну статистичну значимість для визначення локусів повногеномного асоційованого дослідження. 7. Активні речовини, композиції та лікування Як зазначалося вище, філогенетичні дерева створені з використанням методів, що викладені тут, можуть бути також проаналізовані на основі сприйнятливості заявленого стану до лікування активним агентом або заявленим способом лікування за деякими варіантами втілення, і визначення лікування для субєкта або пацієнта може базуватися на ідентифікації певних генетичних варіантів . Авктивні речовини. Активні речовини включають такі, що відомі для лікування заявленого стану, і є включеними до активних агентів проти хвороби Альцгеймера, включаючи, але не обмежуючи, інгібітори ацетилхолінестерази, антагоністи NMDA-рецепторів, і агоніст чи модулятор рецепторів, які активуються проліфератором пероксисом (PPAR), включаючи, але не обмежуючись цими препаратами класів тіазолідіндіонів або глітазарів. Активна речовина може також бути біофармацевтичним продуктом, наприклад антитілами (наприклад, моноклональні, поліклональні, похідні або модифіковані антитіла, такі як Domain Antibodies™, Bapineuzumab і т.д.), білки злиття або терапевтичні молекули РНК. Активна речовина може бути також комбінацією будь-яких цих продуктів. Прикладами інгібіторів ацетилхолінестерази є, але без обмежень, донепезил (комерційно доступний як ARICEPT), галантамін (комерційно доступний як Razadyne), і ривастигмін (комерційно доступний як Exelon) та їх фармацевтично прийнятні солі. Додатково приклади включають, але без обмежень, описані в патентах U.S.№№ 6,303,633; 5,965,569; 5,595,883; 5,574,046 і 5,171,750 і (розкриття всіх американських патентних посилань включені в якості посилання в повному обсязі). Приклади антагоністів рецепторів NMDA включають, але без обмеження, мемантин (комерційно доступний як AKATINOL, AXURA, EBIXIA / ABIXIA, MEMOX і NAMENDA) і 17 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фармацевтично прийнятні солі. Додатково приклади включають, але без обмеження, описане в патентах США NN 6956055, 6828462, 6642267, 6432985; і 5,990126. Приклади тіазолідиндіонів включають, але без обмеження, розиглітазон (комерційно доступний як Avandia) та їх фармацевтично прийнятні солі. Додатково приклади включають, але без обмеження: 5-(4-[2-(N-метил-N-(2-бензотіазоліл)аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(Nметил-N-(2-бензотіазоліл)аміно)етокси]бензилідин)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-(2бензотіазоліл)аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-(2бензотіазоліл)аміно)етокси]бензилідін)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-(2піримідініл)аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-(2піримідініл)аміно)етокси]бензіліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-(2-(N-метил-N-[2-(4,5диметилтіазоліл)]аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(4,5диметилтіазоліл)]аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-(2тіазоліл)аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-(2тіазоліл)аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-[4-(2-(N-метил-N-(2-(4фенілтіазоліл))аміно)етокси)бензил]-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-(2-(4фенілтіазоліл))аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(4-феніл-5метілтіазоліл)]аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(4-феніл-5метілтіазоліл)]аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(4-метил-5фенілтіазоліл)]аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(4-метил-5фенілтіазоліл)]аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(4метилтіазоліл)]аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(4метилтіазоліл)]аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-[4-(2-(N-метил-N-[2-(5фенілтіазоліл)]аміно)етокси)бензил]-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(5фенілтіазоліл)]аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(4,5диметилоксазоліл)]аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-[2-(4,5диметилоксазоліл)]аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-[4-(2-(2піримідиніламіно)етокси)бензил]-2,4-тіазолідиндіон; 5-[4-(2-(2піримідиніламіно)етокси)бензиліден]-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-ацетил-N-(2піримідиніл)аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-(2-(N-(2-бензотіазоліл)-Nбензиламіно)етокси)бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-(2-(N-(2-бензотіазоліл)-Nбензиламіно)етокси)бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[3-(N-метил-N-(2бензоксазоліл)аміно)пропокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[3-(N-метил-N-(2бензоксазоліл)аміно)пропокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-(2піриділ)аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-метил-N-(2піриділ)аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[4-(N-метил-N-(2бензоксазоліл)аміно)етокси]бензиліден)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[4-(N-метил-N-(2бензоксазоліл)аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-(2бензоксазоліл)аміно)етокси]бензиліден)2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-(2бензоксазоліл)аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон; 5-(4-[2-(N-ізопропіл-N-(2бензоксазоліл)аміно)етокси]бензил)-2,4-тіазолідиндіон, та їх фармацевтично прийнятні солі. Див, наприклад, U.S. Patent No. 5,002,953. Активні агенти, описані тут, можна, як зазначалося вище, приготувати у формі їх фармацевтично прийнятних солей. Фармацевтично прийнятні солі є солі, які зберігають бажану біологічну активність вихідної сполуки і не викликають небажаних токсикологічних ефектів. Прикладами таких солей є (a) кислотно-адитивні солі, утворені з неорганічними кислотами, наприклад, соляною кислотою, бромоводневою кислотою, сірчаною кислотою, фосфорною кислотою, азотною кислотою і т.п., а також солі, утворені з органічними кислотами, такими як, наприклад, оцтова кислота, щавлева кислота, винна кислота, бурштинова кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, глюконова кислота, лимонна кислота, яблучна кислота, аскорбінова кислота, бензойна кислота, дубильні кислоти, пальмітинова кислота, альгінова кислота, поліглутамінова кислота, нафталінсульфонова кислота, метансульфокислота, птолуолсульфокислоти, нафталіндисульфонова кислота, полігалактуронова кислота, тощо; (б) солі, утворені елементарними аніонами, такі як хлор, бром і йод, і (с) солі, отримані з основами, такі як солі амонію, солі лужних металів, таких як натрій і калій, солі лужноземельних металів, таких як кальцій і магній, і солі органічних основ, таких як дициклогексіламін і N-метил-Dглюкамін. Активні речовини можуть бути призначені як проліки. "Проліки", як використано тут, належать до тих проліків сполук цього винаходу, які, в рамках результатів медичної оцінки, придатні для використання в контакті з тканинами людини і нижчих тварин без невиправданих 18 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 токсичності, подразнення, алергічної реакції і з пропорційно розумним співвідношенням ризику/користі і ефективним для їх передбаченого використання, а також цвіттеріонних форм, де це можливо, сполук винаходу. Термін "проліки" належить до сполук, які швидко перетворюються in vivo з утворенням вихідних сполук відповідно до наведених вище формул, наприклад, шляхом гідролізу в крові. Докладне обговорення приводиться в T. Higuchi та V. Stella, Prodrugs as Novel delivery Systems, том 14 від A.C.S. Symposium Series та в Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, обидва з яких є посиланнями в цьому документі. Див. також патент США № 6,680,299 Приклади включають проліки, які метаболізуються in vivo у суб‟єкта до активного препарату з активністю активних сполук, як описано тут, де проліками є естер алкоголю або групи карбонових кислот, якщо ця група представлена в сполуці; ацеталем абокеталем спиртової групи, якщо така група представлена у сполуці; основа N-Маніха або імін аміногрупи, якщо така група представлена у сполуці, або основа Шиффа, оксим, ацеталь, енольний естер, оксазолідин або тіазолідин карбонільної групи, якщо така група представлена в сполуці, так, як описано в патенті США № 6,680,324 та патенті США № 6,680,322. Композиції. Активні речовини, описані вище, можуть бути введені в фармацевтичні композиції з фармацевтичним носієм у відповідності з відомими методами. Див, наприклад, е Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9 вид. 1995). У виробництві фармацевтичного складу відповідно до винаходу, активну сполуку (включаючи їх фізіологічно прийнятні солі), зазвичай змішують з прийнятним носієм. Носій повинен, звичайно, бути прийнятним у сенсі сумісності з будь-якими іншими інгредієнтами композиції і не повинен бути шкідливим для пацієнта. Носій може бути твердим або рідким, або рідко-твердим, і переважно компонується із сполукою у вигляді композиції для одноразової дози, наприклад, таблетки, яка може містити від 0,01 або 0,5% до 95% або 99% за вагою активної сполуки. Одна або декілька активних сполук можуть бути включені у композиції за винаходом, які можуть бути отримані будь-яким з відомих фармацевтичних способів, які включають змішування компонентів з необов„язковим включенням одного або декількох додаткових інгредієнтів. Композиції за винаходом включають придатні для перорального, ректального, місцевого, букального (наприклад, під язик), вагінального, парентерального (наприклад, підшкірно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно або внутрішньовенно), зовнішнього (тобто, для шкіри і слизових оболонок, в тому числі поверхонь дихальних шляхів) і трансдермального введення, хоча найбільш оптимальний спосіб в кожному конкретному випадку буде залежати від характеру та важкості стану, що підлягає лікуванню, і, зокрема, від природи активної сполуки, що використовується. Композиції, придатні для перорального введення, можуть бути представлені в дискретних одиницях, таких як капсули, саше, таблетки, або таблетки, кожна з яких містить визначену наперед кількість активної речовини, у вигляді порошку або гранул, у вигляді розчину або суспензії у водній або неводній рідині, або, як емульсії масло-у-воді або вода-у-маслі. Такі композиції можуть бути отримані за допомогою будь-якого відповідного фармацевтичного способу, який включає в себе стадію приведення в контакт активної сполуки і відповідного носія (який може містити один або кілька додаткових інгредієнтів, як зазначалося вище). Загалом, композиції винаходу отримують рівномірним і ретельним змішуванням активної сполуки з рідким або тонкоподрібненим твердим носієм, або обома, а потім, за необхідності, формують отриману суміш. Наприклад, таблетки можуть бути отримані шляхом пресування або формування порошку або гранул, які містять активну речовину з одним або декількома допоміжними інгредієнтами. Пресовані таблетки можуть бути отримані шляхом пресування у відповідному апараті сполуки у вільносипучій формі, наприклад, у вигляді порошку або гранул, необов'язково змішаних із зв„язувальною речовиною, інертним розріджувачем та/або поверхневоактивним/диспергувальним агентом. Формованні таблетки можуть бути виготовлені способом пресування в прес-формі, у відповідному апараті, порошкоподібної сполуки, зволоженої в‟яжучою інертною рідиною. Композиції, придатні для букального (під язик) призначення, включають таблетки, що містять активну сполуку у ароматизованій основі, як правило, в сахарозі і трагакантовій камеді, і пастилки, що містять сполуку в інертній основі, такій як желатин і гліцерин або сахароза і трагакант. Композиції представленого винаходу для парентерального введення містять стерильні водні і неводні ін'єкційні розчини активної сполуки (сполук), які готуються переважно ізотонічно з кров'ю передбачуваного реціпієнта. Ці препарати можуть містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні і розчинені речовини, якими роблять композиції ізотонічними з кров'ю реціпієнта. Водні і неводні стерильні суспензії можуть включати суспензуючі агенти та 19 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 загусники. Композиції можуть бути представлені в однодозових або багатодозових контейнерах, наприклад, запаяних ампулах і флаконах, а також можуть зберігатися в сублімаційному (ліофілізованому) стані і потребують лише додавання стерильного рідкого носія, наприклад, розчину або води для ін'єкцій безпосередньо перед використанням. Екстемпоральні розчини для ін'єкцій та суспензій можуть бути отримані із стерильних порошків, гранул і таблеток в спосіб, який було описано вище. Наприклад, в одному з аспектів даний винахід стосується ін'єкційної, стабільної, стерильної композиції, що включає активну речовину (речовини), або її сіль у формі разової дози в герметичному контейнері. Сполука або сіль забезпечується у формі ліофілізату, здатного бути відтвореним відповідним фармацевтично прийнятним носієм у формі рідкої композиції, яка підходить для ін‟єкцій субєкту. Форма разової дози зазвичай містить від 10 мг до 10 г сполуки або солі. Коли сполука або сіль практично нерозчинні у воді, достатня кількість емульгатора, який є фізіологічно прийнятним, може бути використана в кількості, достатній для емульгування сполуки чи солі у водному носії. Одним з таких корисних емульгаторів є фосфатидилхолін. Композиції, придатні для місцевого застосування на шкірі, бажано застосовувати у формі мазі, крему, лосьйону, пасти, гелю, спрею, аерозолю або олії. Носії, які можуть бути використані, включають вазелін, ланолін, поліетиленгліколь, спирти, трансдермальний посилювач і комбінації з двох або кількох носіїв. Композиції, придатні для трансдермального введення, можуть бути представлені як окремі накладки, адаптовані залишатися в тісному контакті з епідермісом реціпієнта протягом тривалого проміжку часу. Композиції, придатні для трансдермального введення, можуть бути доставлені шляхом іонофорезу (див., наприклад, Pharmaceutical Research 3 (6):318 (1986)) і, як правило у формі необов'язково буферного водного розчину активної речовини. Прийнятною сполукою складу є цитрат або біс/трис буфер (рН 6) або спирт/вода і містять від 0,1 до 0,2 М активного інгредієнта. Додатково до активного агенту (агентів) фармацевтичні композиції можуть містити й інші домішки, такі як рН-регулюючі добавки. Зокрема, ефективний рН-регулятор включає кислоти, такі як соляна кислота, основи або буфери, такі як лактат натрію, ацетат натрію, фосфат натрію, цитрат натрію, борат натрію, глюконат натрію. Крім того, композиції можуть містити мікробні консерванти. Корисні мікробні консерванти включають метилпарабен, пропілпарабен і бензиловий спирт. Мікробні консерванти зазвичай застосовуються коли композицію вміщують в пробірку, призначену для багатодозових використань. Звичайно, як зазначено, фармацевтичні композиції цього винаходу можуть бути ліофілізовані, використовуючи методи, добре відомі в цій галузі. Дозування. Терапевтично ефективні дози будь-якої конкретної активної речовини, що використовується в обсязі данного винаходу, будуть дещо відрізнятися від сполуки до сполуки, і від пацієнта до пацієнта, і будуть залежати від стану пацієнта і способу доставки. Для прийому всередину може бути застосована загальна добова доза від 1, 2 або 3 мг до 30, 40 або 50 мг, яка призначається як одноразова денна доза або бути розділена на дві або три денні дози. Лікування. Генетичні варіанти, як описано тут або виявлено за допомогою методів, як тут зазначено, можуть бути використані для визначення курсу лікування постраждалого від стану пацієнта (наприклад, стан, пов'язаний з ApoE та/або TOMM40), за допомогою, наприклад, визначення того, який активний агентом та/або курс лікування призначити на основі наявності або відсутності генетичного варіанту або варіантів. Наявність або відсутність генетичних варіантів може вказувати на ефективність активної речовини та / або курсу лікування для пацієнтів, передбачити вік початку стану, вказати бажані схеми доз і т.д. Для пацієнта може бути створений генетичний профіль і консультативний профіль для визначення, чи є пацієнт в групі пацієнтів, які можуть реагувати на конкретний активний агент. Інструкції для застосування можуть пакуватися разом з активним агентом або іншим способом із зазначенням рекомендацій для лікування, часу лікування, схем доз і т.д., заснованих на наявності або відсутності генетичних варіантів. 8. Способи визначення передбачення ризику захворювання або прогнозування Щоб визначити передбачення ризику захворювань для несимптоматичних осіб або прогноз (перспективу страждання або протікання хвороби, які очікуються від звичайного перебігу захворювання або особливостей випадку) відповідно до деяких варіантів винаходу, діагностичні дані, включаючи діагностику пацієнта або історію хвороби і генетичні дані, такі як генотип пацієнта (наприклад, ApoE та/або TOMM40 генотип), можуть бути оброблені, забезпечуючи терапевтичні можливості і передбачення наслідків. Обробка може включати в себе отримання "профілю пацієнта", такого як збір анамнезу пацієнта, включаючи вік і стать, генотипування заявлених локусів (наприклад, за допомогою відповідним чином сконструйованих праймерів та 20 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовуючи RT-PCR або етап ПЛР-ампліфікації та/або фенотипування, наприклад, з використанням серологічних методів або ферментативних тестів), і статистичні або інші аналізи, які перетворюють ці необроблені дані в прогноз. Прогноз може включати прогнозування передбачення віку пацієнта на момент початку захворювання, сприйнятливості до медикаментозної терапії, часу лікування, ефективності лікування і т.д. У деяких варіантах втілення винаходу прогноз може включати використання комп'ютерної програми для аналізу даних про пацієнта і запускати статистичні перехресні перевірки з реляційними базами даних для того, щоб перетворити дані про пацієнтів або профіль у прогноз. "Профіль пацієнта" включає дані та/або матеріали, що відносяться до пацієнта, для якого виконується аналіз передбачення та/або прогнозу. Дані можуть включати інформацію про діагноз пацієнта, вік, стать, та/або генотип. Профіль пацієнта може також включати матеріали пацієнта, такі як кров, зразки сироваткового протеїну, спинномозкової рідини, або очищеної РНК або ДНК. 9. Стратифікація генотипу в клінічних дослідженнях Визначення генотипу, розглянуте тут, або, як визначається способами розглянутими тут, може бути використано при проведенні клінічних випробувань таким же чином, як інша інформація генотипу, що використовується для проведення клінічних випробувань, таких, як описано, наприклад, в патентах США №№ 6,573,049; 6,368,797 і 6,291,175. У деяких варіантах втілення, такі способи переважно стратифікують або дозволяють уточнити популяцію пацієнтів (наприклад, шляхом поділу популяції на одну або більше підгруп), так що переваги певної схеми лікування можуть бути більш акуратно виявленими, особливо у відношенні конкретних субпопуляцій пацієнтів з певними генотипами. У деяких варіантах втілення такі способи включають впровадження випробування активного агента або терапії для множини субєктів (контроль або терапія типу плацебо призначалися окремим, але схоже охарактеризованим множинам субєктів) і виявлення наявності або відсутності генотипу (наприклад, ApoE та/або TOMM40), як описано вище, в множині суб'єктів. Генотип може бути виявлений до, після або одночасно з етапом призначення тестової терапії. Вплив одного або декількох виявлених алелів на тестову терапію може бути визначено на будь-якому відповідному параметрі або потенційних результатах лікування або як наслідок, в тому числі, але не обмежуючись, ефективності описаної терапії, відсутність побічних ефектів терапії, і т.д. Клінічне випробування може бути проведене для перевірки ефективності досліджуваних сполук для лікування будь-якої кількості захворювань, для яких певний генотип був визначений асоційованим для суб'єктів з діагнозом захворювання або ризиком розвитку захворювання. Якщо субєктів генотипували після завершення клінічних випробувань, аналізи все ще можна було спрямувати на визначення відношенням між лікуванням хвороби і алелем для оцінки щодо ефективності. Альтернативно, якщо симптоматичний або асимптоматичний суб‟єкт ще не були діагностовані щодо хвороби, але було встановлено, що вони знаходяться під ризиком розвитку захворювання, можуть бути проведені клінічні дослідження, подібні описаним вище. Підкреслені біологічні механізми можуть також розглядатися при розробці терапевтичних груп. Наприклад, ApoE 4 (1-272) фрагмент зв'язується з мітохондріями, зменшує мітохондріальну клітинну динаміку і зменшується сінаптогенез більш ніж з ApoE 3 (1-272). Розиглітазон – потенційний препарат для лікування хвороби Альцгеймера, який підвищує мітогенез і сінаптогенез - протилежні ефекти ApoE звязуючого фрагменту, для ApoE 3 більше, ніж для ApoE 4. Таким чином, препарати або потенційний препарат (наприклад, розиглітазон) можуть бути обрані в залежності від основного механізму дії, який відноситься до генетичних маркерів, що використовуються для стратифікації (наприклад, ApoE 2, E 3, E 4 та/або варіантів TOMM40). Оцінка ефективності препарату, обраного для випробувань, може включати моніторинг суб‟єкта за період часу і аналіз затримки початку захворювання та інтенсивності захворювання на момент настання, а також дослідження появи симптомів , які пов'язані з хворобою. Препарат для клінічних випробувань, який усуває або затримує початок захворювання, або зменшує симптоми захворювання, може бути ефективним препаратом для застосування у пацієнтів з діагнозом захворювання або ризиком розвитку захворювання. Випробування сполук, які можуть бути використані в таких випробування, включають агенти, як описано вище, у тому числі раніше затверджені для клінічного застосування і нові сполуки, ще не схвалені для використання, або затверджені для лікування конкретного захворювання. Таким чином, в деяких варіантах втілення клінічне випробування може включати в себе оптимізацію препарату, у тому числі дози, час застосування, токсичність або сторонні ефекти, шляхи введення та ефективність лікування. 10. Набори, корисні для виявлення варіанту генотипу на заявлених локусах 21 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даним винаходом забезпечено набори для визначення можливості знаходження суб‟єкта під підвищеним ризиком розвитку захворювань, розвитку захворювань з більш раннім віком початку, та/або потенційний препарат для певного лікування, де ця хвороба пов'язана з ApoE та / або TOMM40 (наприклад, з пізнім початком хвороби Альцгеймера). Набори включають принаймні один реагент, специфічний для визначення наявності або відсутності ApoE та / або варіанту TOMM40, як описано тут, і може включати допоміжні інструкції для визначення того, чи знаходиться суб‟єкт під підвищеним ризиком розвитку хвороби. Набір може додатково включати нуклеїнові кислоти для виявлення ApoE генів (наприклад, ApoE 2, ApoE 3 та / або ApoE 4) або інструкції для способів ізоелектричного фокусування для виявлення ApoE генотипу і/або нуклеїнової кислоти для виявлення варіанту TOMM40, як описано тут. У деяких варіантах втілення, набір може необовязково включати одне або більше антитіл, які зв'язуються з ApoE 2, ApoE 3, ApoE 4, або з ізоформами TOMM40. Тестовий набір може бути упакований будь-яким прийнятним способом, як правило, з усіма елементами в один контейнер разом з надрукованими листами, потрібними для проведення випробувань. У деяких варіантах втілення комплект необов'язково може містити буфери, ферменти та реагенти для ампліфікації геномної нуклеїнової кислоти за допомогою праймера прямої ампліфікації. Набір також може включати один або декілька пристроїв для виявлення присутності або відсутності певних гаплотипів в ампліфікованих нуклеїнових кислотах. Такі пристрої можуть включати один або декілька зондів гібридизації з галотипною нуклеїновою кислотою, які можуть бути прикріплені до біо-чіпу чи мікроматричного пристрою, так, як описано у патенті США 6,355,429. Біо-чіп чи мікроматричний пристрій необов'язково має принаймні один зонд захоплення, прикріплений до поверхні, який може гібридизуватися з гаплотипною послідовністю. У переважних варіантах втілення біо-чіп чи мікроматриця містить кілька зондів, і найбільш переважно містить принаймні один зонд для гаплотипної послідовності, яка, якщо присутня, буде ампліфікованою набором фланкуючих праймерів. Наприклад, якщо п'ять пар фланкуючих праймерів використовуються для ампліфікації, пристрій буде містити хоча б один зонд гаплотипу для кожного продукту ампліфікації, або, принаймні п'ять зондів. Набір також переважно включає інструкції для використання компонентів комплекту. Цей винахід пояснюється більш докладно наступними прикладами, але без обмежень. Приклад 1: Побудова філогенетичних дерев Всі відомі дослідження повногеномного сканування демонструють надзвичайно важливе р значення по всьому локусу аполіпопротеїну C1 [ApoC1]. (Mahley та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 103: 5644-51 (2006), Coon та ін., J. Clin. Psychiatry 68: 613-8 (2007); Li та ін., Arch. Neurol. 65: 45-53 (2007)). Не менш важливим є те, що кожні серії визначені як "сприятливі" граничні важливі кандидатні гени за межами області ApoE нерівноважного зчеплення, але ці сприятливі кандидатні гени були різними в кожному дослідженні. TOMM40 знаходиться поруч з ApoC1 і у нерівноважному зчеплення з ApoE. Взаємодії між ApoE 3 або ApoE 4 різних ізоформ TOMM40, як вважають, пов'язані із збільшенням або зменшенням ризику розвитку хвороби Альцгеймера в рамках ранньго вікового діапазону. Вік початку кривої для генотипів Apo 4 / 4, 3 / 4, 3 / 3, 2 / 4, та 2 / 3 показано на Фіг. 2 з вказівкою діапазону ризику для раннього розвитку хвороби, в залежності від профілю ApoE . Тим не менш, ApoE сам по собі не є поясненням всіх даних в цих кривих вікового початку. Запропоновано різні методи для визначення поліморфного профілю ризику хвороби Альцгеймера, пов'язаного з різними алелями ApoE (див., наприклад, U.S. Application of Cox та ін., No. 20060228728; U.S. Application of Li and Grupe, No. 20080051318). В цьому документі показано філогенетичний підхід до ApoE задачі. Біологічні зразки, виділення ДНК, ампліфікація заявлених локусів. Загалом 340 суб‟єктів включали 135 випадків хвороби Альцгеймера і 99 підібраних за віком контрольних у групі А, а також 57 випадків і 49 контрольних в групі B. Всі суб‟єкти були носіями ApoE генотипів, раніше пов'язаних з підвищеним ризиком для більш ранньго початку захворювання (тобто 3/3, 3/4 або 4/4). Біологічні зразки, що містять ДНК, були взяті в усіх суб‟єктів. Геномну ДНК потім виділялили у відповідності з традиційними методами для секвенування генетичних локусів на хромосомі 19. Фіг.3 показує генетичні регіони на хромосоми 19, призначені для дослідження з використанням даних повногеномного сканування з декількох протоколів. Регіон знаходиться у GenBank з номером послідовності AF050154. Програмне забезпечення було використано для створення множинного вирівнювання послідовностей для варіантних локусів (наприклад, ClustalW2, European Bioinformatics Institute). Далі, множинні вирівнювання послідовностей були проаналізовані з використанням програмного забезпечення для розробки філогенетичних дерев (наприклад, MEGA version 2.1, Center for Evolutionary Functional Genomics, TREEVOLVE, 22 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Department of Zoology, University of Oxford, або програмне забезпечення з недорогою конструкцією, таке як PAUP, Sinauer Associates) . Статистичний аналіз може бути представлений, наприклад, аналізом генетичних даних (GDA: Програмне забезпечення для аналізу дискретних генетичних даних, Bioinformatics Research Center of North Carolina State University). Результати аналізу Регіона В показані на філогенетичному дереві Фіг. 4. Кожна частина даних на Фіг.4 представляє вивчений варіант послідовності. Ці варіанти можуть бути нуклеотидними замінами, вставками, видаленнями або мікросателітами і можуть або не можуть призвести до виявлення відмінностей в експресії гена або функції білка. Кожний вузол представляє собою варіант (або кілька варіантів), що зустрічається на більш, ніж одній хромосомі. Сусідні вузли визначають межі послідовності, які є в cis, і, отже, більш імовірно, передаються у спадок як блок у заявленому регіоні на хромосомі суб'єкта. Вузли, які передують найбільшій кількості наступних вузлів, представляють варіанти еволюційних предків, у яких з плином часу сталася генетична дивергенція. Присутність гаплотипів або варіантів послідовностей, відповідних регіонам дерева, що представляє суб'єктів з істотно більш високою частотою хвороби Альцгеймера (тобто, більш високі коефіцієнти суб'єктів, уражених хворобою до неураженої контрольної групи), могла б означати, що певний суб'єкт також знаходиться під підвищеним ризиком. І навпаки, істотно нижчі співвідношення відповідають зниженню ризику розвитку хвороби Альцгеймера. TOMM40 взаємодіє з ApoE безпосередньо в регуляції мітохондріального імпорту білків, і існуюча гіпотеза є такою, що експресія певного варіанту (варіантів) TOMM40 загострює відносно помірний ризик розвитку хвороби Альцгеймера, пов'язаний з дозозалежною наявністю ApoE 3 алелі. Такий варіант TOMM40 виявлено в межах регіону B при використанні способів за винаходом. Тестування нових лікарських препаратів на людині має величезний ризик (див. Kenter and Cohen, Lancet, 368: 1387-91 (2006)). Використання філогенетичних дерев для прогнозування індивідуальної реакції на препарат або заявлене лікування є потенціальним значним зменшенням цього ризику. Попередні дослідження показали, що розиглітазон (Avandia) може мати специфічну генетично-профільну ефективність в лікуванні хвороби Альцгеймера (див. Risner та ін., The Pharmacogenomics Journal 6, 246-254 (2006); Brodbeck та ін., Proc. Nat. Acad. Sci. 105, 1343-6 (2008)). Друга фаза клінічних досліджень показує, що пацієнти з хворобою Альцгеймера без ApoE 4 алеля мають кращу сприйнятливість до розиглітазону, ніж пацієнти, які несуть 1 або 2 ApoE 4 алелів (дані не наведено). Це підтверджує гіпотезу, що варіанти, ідентифіковані цими методами дослідження, можуть бути використані для передбачення індивідуальної сприйнятливості до лікування, що базується на генотипі. Приклад 2: Ідентифікація варіантів заявленого TOMM40 174 послідовностей (по 2 від кожного з 87 субєктів) були вирівняні при використанні програми CLUSTAL X (версія 2.0.10, Larkin та ін., Clustal W та Clustal X версія 2.0. Bioinformatics, 23:2947-2948 (2007)). Вирівнювання множинних послідовностей було використане для побудови філогенетичного дерева за допомогою алгоритму методу сусіднього зв‟язування (Saitou and Nei, The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Evol. Biol., 4:406-425 (1987)), що представлений на сайті Європейського інституту біоінформатики (EBI). В результаті філогенетичне дерево має структуру з двох основних груп (А, В) у першій розбіжності. Частоти ApoE генотипів для цих груп наведені в таблиці і показані на Фіг. 5. Зрозуміло, що група В містить галотипи суб‟єктів первинно генотипів ε3/ε3 and ε3/ ε4 ApoE і майже не містить ε4/ε4. Група А містить майже всі галотипи суб‟єктів з генотипом ε4/ ε4. Список поліморфізмів, генерованих трансформуючою платформою SNP (Polymorphic), було використано для визначення певних варіантів у гені TOMM40, у якому дані розділені на дві групи. Тест відношення вірогідності був використаний для виявлення характерних варіантів з значенням p менше 0,005. Список варіантів підсумовано в таблиці 1. У таблиці термін "видалення" використовується, коли мінорний алель є видаленням нуклеотиду, і термін "вставка" використовується, коли мінорний алель є додаванням нуклеотиду. Термін "поліморфізм видалення/вставки" використовується, коли є більше, ніж дві можливі форми, і мінорний алель не є очевидним. Наприклад, для полі-Т поліморфізму спостерігається множинне вирівнювання послідовностей. У другому стовпці таблиці міститься інформація про ідентифікацію специфічних алелів, пов'язаних з варіантом, які поділяють послідовності на дві групи. Наприклад, T>A вказує, що Т алелі послідовностей виділені в групі «А» у філогенетичному дереві. Коли зазначено два алеля, наприклад, G>B; A>A, кожен алель однозначно виділяє дані послідовності у дві групи, в той час, коли у списку зазначено один алель, це пов‟язано з переважним розділенням даних, і залишившийся алель не однозначно розділяє дані в однорідну групу замість поєднання обох 23 UA 103200 C2 груп. Таблиця 1. Варіанти TOMM40, повязані з групами філогенетичного дерева, що розподілені по генотипу ApoE. Геномна локалізація (NCBI Build 36.3) 50,092,565 50,092,587 50,093,506 50,093,609 Функція UCSC Класифікація Інтрон 6 Інтрон 6 Інтрон 6 Інтрон 6 одиничний одиничний одиничний складний T>B; C>A C>B T16,17,18>A T14,15>B 50,094,317 50,094,558 50,094,716 Інтрон 6 Інтрон 6 Інтрон 6 одиничний одиничний Вставки/видалення 50,094,733 rs10524523 ->A T12,14,15,16,17>B T21,22,26,27,28,29, 30,31,32,33,34 35,36>A 50,094,733 50,094,889 Інтрон 7 Інтрон 6 Вставка Вставки/видалення rs1160985 50,095,506 rs760136 rs1160984 rs741780 rs405697 50,096,647 (DIP3) T>B; C>A T>A A>A; G>B T>B C>B; T>A A>A ->A 50,095,252 50,095,506 50,095,698 50,095,764 50,096,271 50,096,531 50,096,647 Інтрон 6 Інтрон 6 Інтрон 6 Інтрон 6 Інтрон 8 Інтрон 9 Інтрон 9 Одиничний Одиничний Одиничний Одиничний Одиничний Одиничний Видалення 50,096,697 rs1038025 rs1038026 rs1305062 rs34215622 rs10119 rs7259620 C>A C>B; T>A G>B; A>A C>B; G>A G>B; ->A A>A G>A; A>B 50,096,697 50,096,812 50,096,902 50,097,361 50,098,378 50,098,513 50,099,628 Інтрон 9 Інтрон 9 Інтрон 9 Інтрон 9 Екзон 10 Екзон 10 невідомо одиничний одиничний одиничний Одиничний Вставка одиничний одиничний Варіант 50,092,565 50,092,587 rs8106922 rs34896370, rs55821237, rs56290633 10 T>A T>A G>B; A>A T12_C_T15, T12_C_T16, T13_C_T14, T13_C_T15, T13_C_T16>A; T14_C_T14, T14_C_T15>B rs34878901 rs35568738 rs10602329 5 Алель>група дерева Приклад 3: Дві різні форми ApoE 3: пов'язані з галотипами TOMM40, що підвищують ризик та зменшують вік початку, і ті, що знижують ризик Зв‟язок генотипу аполіпопротеїну Е (ApoE), особливо ApoE ε4 (ApoE 4), з ризиком і віком початку хвороби Альцгеймера (AD) залишається найвірогіднішим щодо генетичного зв'язку для будь-якого складного захворювання. Оцінки успадкованого ApoE 4 для пізнього початку хвороби Альцгеймера в діапазоні від 58% до 79%, та відносний популяційний ризик у зв'язку з ApoE 4 алелем складає від 20% до 70%. Ці оцінки дозволяють припустити, що інші генетичні варіанти та / або взаємодії між варіантами несуть додатковий ризик захворювань і змін віку початку поширення. 24 UA 103200 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Результати, повязані з повногеномним скануванням для хвороби Альцгеймера мають узгоджено відтворюваний надзвичайний звязок LD регіону, що містить ApoE. TOMM40 - білок транслокази на зовнішній мітохондріальній мембрані, у високому LD з ApoE, і кодує мембранні канали, через які цитоплазматичні білки і пептиди проходять для синтеза нових мітохондрій. Метою нашого дослідження було визначити додаткові гаплотипи всередині регіону LD, що збільшує вірогідність успадкування. Методи: Ми вивчили регіони LD, які містять ApoE і TOMM40, використовуючи глибоке (10X) первинне секвенування у хворих на ХА і в контрольній групі. Ми провели філогенетичний аналіз LD регіону, що покриває TOMM40 і ApoE у 66 хворих і 66 підібраних за віком контрольних пацієнтів щодо ризику і вік початку поширення. Висновок: Ми знайшли, що унікальні і різні успадковані сімейства різних варіантів TOMM40 локалізуються на тому ж геномному інтервалі, що і ApoE 3, але не на ApoE 4 геномному інтервалі, і може збільшити або зменшити вік розподіл ризику хвороби Альцгеймера. Таким чином, генетичне успадкування цих варіантів TOMM40 залежить від спадкування ApoE 4, ефективно забезпечуючи диференціації двох різних форм ApoE 3: тих, які пов'язані з TOMM40 гаплотиами, підвищуючи ризик та зменшуючи вік початку, і ті, які зменшують ризик. Ці дані підвищили точність генетичного віку початку ризику, в залежності від віку, ApoE і TOMM40 генотипів і забезпечили можливість визначення підвищеного ризику ХА протягом наступних 5-7 років, у порівнянні з низьким ризиком хвороби Альцгеймера. Приклад 4: Аналіз трьох визначених TOMM40 варіантів DIP Три з варіантів TOMM40, зазначених у цій заявці, є поліморфізмами видалення/вставки (DIP), розташованими в інтроні 6 або інтроні 9. Ці DIP визначені як rs10524523 і rs10602329 в базі даних National Center for Biotechnology Information dbSNP, і ще не описаний поліморфізм, позначений як DIP3. Ці поліморфізми розташовані на chr19: 50094889, chr19: 50094731, та chr19: 50096647, відповідно, у відповідності з NCBI build 36. Цей винахід описує ідентифікацію цих DIP з використанням філогенетичного аналізу гену TOMM40, особливо, 10 Кб фрагменту цього гена, і DIP, пов'язані з різними еволюційними групами, що визначаються філогенетичним аналізом. Цей винахід також розкриває корисність цих DIP для (1) визначення ризику здорової людини для розвитку хвороби Альцгеймера в майбутньому, і (2) для прогнозування віку початку хвороби Альцгеймера протягом терміну приблизно 8 років. Три DIP поліморфізми, схарактеризовані тут, відповідають різним подовженням DIP полі-Т повторювань в TOMM40 гені. Зв‟язок варіантів DIP полі-T з ризиком хвороби має пріоритет. Наприклад, полі-T варіант у інтроні 8 гену трансмембранного регулятора провідності (CFTR) кістозного фіброзу пов'язаний з пропуском екзона 9 і розвитком муковісцидозу (Groman та ін., Am J Hum Genet 74(1):176-9 (2004)). Тут розкривається: (1) використання нового методу – філогенетично повязаний аналіз (як описано вище) для виявлення DIP, який прогнозує ризик захворювання і/або відмінності у віці захворювання, (2) ідентичність трьох певних DIP, пов'язаних з відмінностями у віці початку AD і ризику AD, (3) використання цих поліморфізмів індивідуально, спільно або з іншими варіантами послідовності в TOMM40 або ApoE для діагностики захворювань або прогнозування, або визначення характеристик хвороби, таких як вік початку захворювання, прогноз захворювання, підтипи хвороби, тяжкості захворювання, а також для аналізу і визначення чутливості до препаратів. Філогенетичний аналіз показує розподіл rs10524523 і rs10602329 в двох різних філогенетичних гілках. Цей аналіз показує, що короткі полі-T подовження в карті цих локусів до філогенетично визначених гілок в групі B, групі, яка також включає більш високий відсоток суб‟єктів генотипу ApoE ε3/ε3 , незначну кількість (0%) ApoE ε4/ε4 субєктів і нижній показник/контрольне співвідношення (наприклад, ризик захворювання AD) (Фіг. 5). Зв'язок між подовженнями DIP і філогенетичною групою є статистично значущим (р = 27) сегреговані майже виключно в гілки, з підвищенням ризику гілки у когорті AS (P = 7,6 х 10-46, N = 210, точний критерій Фішера, двосторонній). Відношення випадок/контроль для категорій, які містять два найбільш поширених коротких подовжень (15 або 16 т залишків) було 1,46 (95% CI = 1.25 – 1.75), й співвідношення випадок/контроль для категорій довгих подовжень (28, 29, 33 і 34 Т залишків) було 2.02 (95% CI = 1.13 – 2.87). Ці дані показали тенденцію до зв‟язку між довгими rs10524523 полі-T довжинами і AD (OR = 1,38, 95% СІ = 0,80 - 2,39). Хоча були тільки тенденції до асоціації гаплотипів TOMM40 або окремих поліморфізмів LOAD для AS когорти, значущим був зв'язок між категорією полі-т довжини rs10524523 і віком початку LOAD. Це було протестоване за допомогою підтвердженої аутопсійно когорти DS суб‟єктів ApoE ε4, для якої не було даних по захворюванням. Довгі полі-Т алелі (> = 27 Т залишків) були значно пов'язані з початком захворювання у більш ранньому віці (70,5 років + / 1,2 проти 77,6 років + / - 2,1, P = 0,02, N = 34) (Фіг. 5). Цей поліморфізм, отже, істотно впливає на вік початку захворювання для осіб, які несуть ApoE ε3 алель. Дерево інших довжин полі-Т поліморфізму, розташоване в інтроні 6 (rs34896370, rs56290633 і rs10602329), також відрізняє дерева А і B, але ці поліморфізми не були пов'язані з віком початку захворювання. Крім того, не було ніякого зв'язку між гаплотипами характерних гілок SNP та віком LOAD, або для одного SNP, rs8106922, який би був в значній мірі пов'язаний з ризиком AD в дереві повногеномно асоційованих досліджень (Abraham та ін. A genome-wide association study for late-onset Alzheimer‟s disease using DNA pooling. BMC Med Genomics 1, 44 (2008); Carrasquillo та ін. Genetic variation in PCDH11X is associated with susceptibility to late-onset Alzheimer‟s disease. Nat Genet 41, 192-198 (2009); Takei та ін. Genetic association study on in and around the ApoE in late-onset Alzheimer disease in Japanese. Genomics 93, 441-448 (2009)) (дані не вказано). Ми дійшли висновку, що довгі полі-Т шляхи на rs10524523 значно корелюють з більш раннього віку початок LOAD. Довжина цього варіанту є відносно однорідною і відносно довгою на хромосомах ApoE ε4 в той час, як існують дві категорії полі-Т довжин, зв‟язаних з ApoE ε3. ApoE ε2 хромосоми, також, вірогідно, виконують заміни довжини полі-Т повторів, аналогічних хромосомам ε3, але подальше дослідження необхідне для того, щоб підтвердити попередні висновки і щоб визначити як полі-Т повтори впливають на дуже пізній вік початку захворювання для носіїв ApoE ε2. Хоч й можливо припускати, що є інші варіанти , які впливають на вік початку LOAD для осіб, що не є гомозиготні по ApoE ε4, довжина полі-Т поліморфізму в ТОММ40 інтроні 6 вдається найпотужнішим генетичним предиктором у цьому зв‟язаному регіоні, і це повинно бути з‟ясовано у перспективі. Ці дані дозволяють припустити, що АроЕ-генотип стратифікує вік початку кривих (Corder та ін. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer‟s disease in late onset families. Science 261, 921-3 (1993); Li та ін. Candidate single-nucleotide polymorphisms from a genomewide association study of Alzheimer disease. Arch Neurol 65, 45-53 (2008)) і є у дійсності набір кривих, з кожної кривої відбивається специфічна взаємодія зв‟язаних поліморфізмі у АроЕ і ТОММ40. Таким чином, ці дані додають рішучості у прогнозуванні віку початку LOAD на протязі 5-7 річного проміжку для осіб, старіших за 60 років. Дослідження для перевірки зв‟язку АроЕ генотипів і ТОММ40 гаплотипів або rs10524523 з віком початку захворювання на сьогодні планується. Це дослідження буде перспективним, розрахованим на 5 років, популяційні дослідження будуть проведені у декількох етнічних групах, і будуть комбінованувати випробування препарату для попередження або затримки початку захворювання. МЕТОДИ Дві когорти, проаналізовані в даній роботі, були з дослідницького центру Arizona Alzheimer‟s Disease Research Center (ADRC), Phoenix, Arizona і Duke Bryan ADRC, Durham, North Carolina. Всі суб‟єкти були європейського походження. Дослідження Arizona і Duke були схвалені інституціональними наглядовими комітетами й відповідне нормативне погодження було отримане від усіх задіяних. Дані віку та статі у цих випадках і контролях в кожній групі представлено в таблиці 2. Для когорти Duke вік початку захворювання визначали ретроспективно і діагноз хвороби було підтверджено аутопсійно. Зразки поміщали на 96 лунковий планшет для ПЛР довгих фрагментів і секвенували ДНК технологією Polymorphic DNA Technologies (Alameda, CA). ПЛР довгих фрагментів проводили з використанням Takara LA Taq Polymerase (Takara Mirus Bio). Реакційні суміші і умови для проведення ПЛР були такими, як рекомендовано виробником. ПЛР проводили в 50 мл об‟єму з 2.5 U LA Taq і 200-400 нг ДНК геному людини. Термоциклювання було проведено з виконанням наступних умов: 94˚C, 1 хв для 1 циклу; 94˚C, 28