Мінімальна плазмідна система для генерування інфекційних мінус-ланцюгових рнк вірусів з клонованої вірусної кднк, клітина-хазяїн, яка включає плазмідну систему, спосіб продукування інфекційного мінус-ланцюговог

1. Мінімальна плазмідна система для генерування інфекційних мінус-ланцюгових РНК вірусів з клонованої вірусної кДНК, що включає набір плазмід, де кожна плазміда включає вірусну кДНК, що відповідає вірусному геномному сегменту, інсерційованому між промотором РНК-полімерази І (pol І) і термінаторною послідовністю, які здатні спрямовувати синтез вРНК, яка у свою чергу, інсерційована між промотором РНК-полімерази II (pol II) та сигналом поліаденілювання, які здатні спрямовувати синтез мРНК, причому зазначена плазмідна система є кДНК-двонаправленою транскрипційною системою. 2. Плазмідна система за п. 1, у якій вказана термінаторна послідовність являє собою термінаторну послідовність РНК-полімерази І (pol І). 3. Плазмідна система за п. 1, у якій вказана термінаторна послідовність являє собою послідовність рибозиму. 4. Плазмідна система за будь-яким з пп. 1-3, у якій вРНК включає 3’ кінець. 5. Плазмідна система за будь-яким з пп. 1-4, у якій РНК вірус являє собою ортоміксовірус. 6. Плазмідна система за п. 5, у якій ортоміксовірус являє собою вірус грипу А. 7. Плазмідна система за п. 5, у якій ортоміксовірус являє собою вірус грипу В. 8. Плазмідна система за будь-яким з пп. 5-7, у якій вірусний геномний сегмент кодує протеїн, вибраний з групи, що складається з протеїну вірусного полімеразного комплексу, М-протеїну та NS UA (21) 2002108499 (22) 27.04.2001 (24) 10.10.2008 (86) PCT/US01/13656, 27.04.2001 (31) 60/200,679 (32) 28.04.2000 (33) US (46) 10.10.2008, Бюл.№ 19, 2008 р. (72) ХОФФМАНН ЕРІК (73) СТ. ДЖУД ЧІЛДРЕНЗ РЕСЕРЧ ХОСПІТАЛ (56) HOFFMANN ERICH ET AL: "Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids." JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 81, no. 12, December 2000 (2000-12), pages 28432847 NEUMANN GABRIELE ET AL: "Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs." PROCEEDINGS OF THE NATION AL AC ADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES, vol. 96, no. 16, 3 August 1999 (1999-08-03), pages 9345-9350. PALESE P ET AL: "NEGATIVE-STR AND RNA VIRUSES: GENETIC ENGINEERING AND APPLIC ATIONS" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL AC ADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 93, 1 October 1996 (199610-01), pages 11350-11354. HOFFMANN E ET AL: "Characterization of the influenza A virus gene pool in avian species in southern China: was H6N1 a derivative or a precursor of H5N1?" JOURNAL OF VIR OLOGY. UNITED STATES JUL 2000, vol. 74, no. 14, July 2000 (200007), pages 6309-6315 WO A1 9103552, 21.03.1991. US A 3992522, 16.11.1976. 2 (19) 1 3 84254 4 протеїну, де вказаний вірусний геномний сегмент (a) культивування клітини-хазяїна, що включає походить зі штаму, добре адаптованого для вироплазмідну систему за будь-яким з пп. 1-10 для щування у клітинній культурі, або з атенуйованого генерування зазначеного вірусу, та штаму, або обох. (b) очистку зазначеного вірусу, продукованого за9. Плазмідна система за будь-яким з пп. 5-7, у якій значеною клітиною-хазяїном. вірусний геномний сегмент включає ген гемаглю19. Спосіб за п. 18, у якому РНК вірус вирощують у тиніну (HA) або нейрамімідази (NA), або обох, клітинній культурі. причому вказані гени належать до патогенного 20. Спосіб за п. 18, у якому РНК вірус вирощують у вірусу грипу. яйцях. 10. Плазмідна система за п. 6, що включає плазмі21. Спосіб за будь-яким з пп. 17-20, у якому РНК ду, вибрану з групи, до якої входять: плазміда, яка вірус являє собою ортоміксовірус. містить ген РВ2, плазміда, яка містить ген РВ1, 22. Спосіб за п. 21, у якому ортоміксовірус являє плазміда, яка містить ген РА, плазміда, яка містить собою вірус грипу А. ген НА, плазміда, яка містить ген NP, плазміда, яка 23. Спосіб за п. 21, у якому ортоміксовірус являє містить ген NA, плазміда, яка містить ген M, та собою вірус грипу В. плазміда, яка містить ген NS. 24. Спосіб за будь-яким з пп. 12-23, у якому зазна11. Клітина-хазяїн, яка включає плазмідну систему чена клітина-хазяїн вибрана з групи, що включає: за будь-яким з пп. 1-10. клітину нирки собаки Madin-Darby (MDCK), клітину 12. Спосіб продукування інфекційного мінусVERO, клітину CV1, клітину COS-1, клітину COS-7 ланцюгового РНК вірусу, який включає культивута клітину BHK-1. вання клітини-хазяїна за п. 11 за умов, що дозво25. Спосіб за п. 24, у якому клітина-хазяїн являє ляють продукування вірусних протеїнів та вРНК. собою клітину VERO. 13. Спосіб за п. 12, у якому РНК вір ус є патоген26. Спосіб за будь-яким з пп. 12-15, 17-22 та 24-25, ним. у якому принаймні одна плазміда з плазмідної сис14. Спосіб за п. 12 або 13, у якому РНК вірус являє теми включає вірусний геномний сегмент штаму собою ортоміксовірус. грипу A/PR/8/34. 15. Спосіб за п. 14, у якому ортоміксовірус являє 27. Спосіб за будь-яким з пп. 12-15, 17-22 та 24-25, собою вірус грипу А. у якому принаймні одна плазміда з плазмідної сис16. Спосіб за п. 14, у якому ортоміксовірус являє теми включає вірусний геномний сегмент штаму собою вірус грипу В. грипу A/Ann Arbor/6/60. 17. Спосіб одержання атенуйованого мінус28. Спосіб за будь-яким з пп. 12-14, 16-21 та 23-25, ланцюгового РНК вірусу, де спосіб включає: у якому принаймні одна плазміда з плазмідної сис(a) видозміну одного або декількох вірусних генотеми включає вірусний геномний сегмент штаму мних сегментів у плазмідній системі за будь-яким з грипу B/Ann Arbor/1/66. пп. 1-10, та 29. Спосіб щеплення суб’єкта від інфекції мінус(b) визначення того, чи є атен уйованим мінусланцюгового РНК вірусу, де спосіб включає ввеланцюговий РНК вірус, продукований плазмідною дення композиції, що містить мінус-ланцюговий системою при введенні в придатну клітину-хазяїна. РНК вірус, генерований плазмідною системою за 18. Спосіб продукування інфекційного мінусбудь-яким з пп. 1-10. ланцюгового РНК вірусу для використання у вак30. Спосіб за п. 29, у якому зазначений мінусцинах, де спосіб включає: ланцюговий РНК вірус являє собою вірус грипу. Ця заявка претендує на переваги [тимчасової заявки США №60/200679, поданої 28 квітня 2000p.], яка цілком включена сюди за посиланням. Дослідження, що привели до цього винаходу, були підтримані грантами на проведення досліджень в галузі суспільної охороні здоров'я АІ95357, АІ29680, АІ29559 та Al29680 від Національного інституту алергії та інфекційних хвороб. Отже, уряд Сполучених Штатів має певні права на цей винахід. Даний винахід стосується розробки системи, основаної на мінімальній плазміді, для генерування інфекційних РНК-вірусів, краще вірусів грипу, з клонованої ДНК. Зокрема, ця багатоплазмідна роl l-pol Il система сприяє генеруванню як рекомбінантних, так і реасортативних вірусів. У кращих варіантах втілення винахід включає восьмиплазмідну роl l-pol Il систему для генерування вірусів грипу. Він може бути також застосований при виділенні інших РНК-вірусів цілком з клонованої кДНК. Життєвий цикл РНК-вірусів Геноми РНК-вірусів мають різні конфігурації, включаючи мономолекулярну чи сегментовану; однониткову з (+)- чи (-)- полярністю або двониткову. Однак, віруси мають дві істотні спільні ознаки: (1) геномні РНК повинні ефективно копіюватись у формі, яка може бути ефективно використана для збирання частинок вірусного потомства, і (2) повинні синтезуватись мРНК, які можуть бути ефективно трансльовані у вірусні протеїни. Загалом, РНК-віруси (за винятком ретровірусів) кодують та/або несуть у собі РНК-залежну РНК-полімеразу для каталізу синтезу нової геномної РНК (для збирання у потомство) та мРНК (для трансляції у вірусні протеїни). Оскільки еукаріотні клітини-хазяї типово не містять механізмів для реплікації РНКматриці або для трансляції поліпептидів з "мінус"ланцюгової чи дволанцюгової РНК-матриці, віруси, що містять ці нуклеїнові кислоти у сво їх геномах, повинні нести у вірусній частинці протеїн РНК 5 84254 6 полімерази. З цієї причини депротеїнізовані молевказує на те, що для боротьби з хворобою потрібкули РНК "мінус"-ланцюгових та дволанцюгових ний контроль за цими вірусами та розробка удоРНК-вірусів (без асоційованої РНК-полімерази) є сконалених антивірусотерапій та вакцин. Швиднеінфекційними. На відміну від них, депротеїнізокість виникнення нових штамів вимагає контролю вана РНК з геному "плюс"-ланцюгового РНК-вірусу та розширення можливостей сучасної технологи є звичайно інфекційною, тому що кодовані вірусні щодо продукування достатньої кількості вакцини протеїни придатні для трансляції клітинними мепроти нового ідентифікованого патогенного штаму ханізмами хазяїна. для попередження епідемії чи пандемії. Для передачі вірусу геномна вірусна РНК поДля вірусу грипу А зворотно-генетичні системи винна бути спакована у вірусні частинки. Деякі дозволили маніпулювати вірусним геномом капсиди РНК-вірусів оточені ліпідними мембрана[Palese et аl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, ми з інфікованих клітин-хазяїв, а інші мають зовні93:11354; Neumann and Kawaoka, Adv. Virus Res., шню оболонку з вірусного протеїну без ліпідного 1999, 53:265]. На відміну від "плюс"-ланцюгових бішару. Незважаючи на ці розбіжності між вірусвірусів (наприклад, поліовірусу), "мінус"-кодуючі ними капсидами, процеси збирання потомства вірусні РНК (вРНК) вірусів грипу А є неінфекційнивірусних частинок та взаємодії протеїн/протеїн, що ми. Лише молекули вРНК, що мають капсиди з відбуваються під час збирання, є подібними. Віручотирьох протеїнів вірусного полімеразного комсні протеїни загалом класифікують на структурні плексу (РВ1, РВ2, PA, NP) здатними ініціювати та неструктурні протеїни. Загалом, неструктурні цикл вірусної реплікації та транскрипції. Після пропротеїни беруть участь у геномній реплікації, регуникнення рибонуклеопротеїнів (РНП) до клітинного люванні транскрипції та пакуванні. Структурні проядра асоційовані протеїни починають транскриптеїни загалом виконують три типи функцій, вклюцію (-)-вРНК у мРНК та "плюс"-кодуючі комплеменчаючи: (1) зв'язування з геномною РНК тарні РНК - (+)-кРНК. Ці кРНК служать матрицями (наприклад, нуклеокапсидний протеїн вірусу грипу для синтезу вРНК. Першою зворотно-генетичною А), (2) утворення містків між спакованою РНК та системою, розробленою для вірусу грипу А, був зовнішніми протеїнами (наприклад, матричний спосіб РНК-трансфекції [Luytjes et al., Cell, 1989, протеїн) та (3) зв'язування із зовнішнім вірусним 59:1107; Enami etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, шаром (наприклад, поверхневі протеїни, такі як 1990, 87:3802]. Після транскрипції вірусоподібної гемаглютинін). Збирання у вірусні частинки забезвРНК РНК-полімеразою Т7 та реконституції молепечує ефективне перенесення РНК-геному з одної кул вірусного рибонуклеопротеїну (вРНК) генетичклітини-хазяїна до іншої в одному хазяїні чи між но змінені сегменти РНП були введені до еукаріорізними організмами-хазяями. тичних клітин шляхом трансфекції. Інфікування Вірус грипу вірусом-помічником грипу призвело до генеруванВірус грипу A (Orthomyxoviridae) є РНК-вірусом ня вірусів, які містили ген, що походив з клоноваз "мінус"-кодуючим ланцюгом та сегментованим ної кДНК. Однак присутність вірусу-помічника в геномом. Геномні РНК містять одну чи кілька відтрансфекції РНК та ДНК сильно обмежує практичкритих рамок зчитування, до 5'- та 3'-кінців яких не значення цих способів, оскільки для видалення приєднані некодуючі послідовності [Desselberger et вірусу-помічника потрібна система суворого добоal., Gene, 1980, 8:315]. Вірусні РНК у віріонах та ру. інфікованих клітинах асоційовані з вірусним нуклеРозробка РНК полімераза І (pol І) - керованого опротеїном (NP) та полімеразними протеїнами синтезу молекул вРНК in vivo дозволила здійсню(РВ1, РВ2 і PA) з утворенням рибонуклеопротеїновати внутрішньоклітинне продукування РНКвих (РНП) комплексів (RNP) [Hsu et al., Proc. Natl. комплексів [Neumann and Hobom, Virology, 1994, Acad. Sci. USA, 1987, 84:8140]. Генетичний склад 202:477]. В цій системі, вірусоподібну кДНК вставцього вірусу дозволяє йому розвиватися шляхом ляли поміж промоторною та термінальною послірекомбінації генних сегментів з різних штамів; ця довностями pol І [Zobel et al., Nucl. Acids Res., рекомбінація створює нові варіанти, для яких но1993, 21:3607]. На відміну від транскриптів мРНК, воінфікований організм не має анамнестичної імусинтезованих РНК-полімеразою Il (pol II), pol Інної реакції. Відомо, що з 15 гемаглютинінів (НА) генеровані РНК позбавлені як 5'-кепа, так і 3'та 9 нейроамінідаз (NA) субтипів грипу, що циркуполі(А) кінця. Функціональні вРНП молекули молюють у морських птахів, три - H1N1, H2N2 та жуть бути генеровані шляхом інфікування вірусомH3N2 - викликали пандемії у людей [Webster et al., помічником або котрансфекції плазмідами експреMicrobiol. Rev., 1992, 56:152]. Немає свідчень того, сії протеїнів, що кодують РВ1, РВ2, PA чи NP що свині можуть виступати в ролі проміжного хазя[Neumann and Hobom, supra; Flick ef al., RNA, 1996, їна ("змішувальна посудина") для генерування 2:1046; Pleschka et al., J. Virol., 1996, 70:4188; Zhou нових штамів, що є патогенними для людини ef al., Virology, 1998, 246:83]. [Scholtissek et аl., Virology, 1985,147:287]. Спалах Недавні дослідження продемонстрували, що грипу A H5N1 у Гонконгу у 1997р показав, що виплазміда-керована експресія усіх восьми вРНК з сокопатогенні віруси грипу А можуть також перепромотору pol І та коекспресія протеїнів полімерадаватися людям безпосередньо від птахів [Claas зного комплексу приводить до утворення інфекet al., Lancet, 1998, 351:472; Suarez et al., J Virol., ційного вірусу грипу A [Neumann et al., Proc. Natl. 1998, 72:6678; Subbarao et al., Science, Acad. Sci. USA, 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Virol., 1998,279:393; Shortridge, Vaccine, 1999, 17 (Suppl. 1999, 73:9679]. Оскільки генерування вірусу грипу 1): S26-S29]. Потенціал вірусів грипу А до генеруА, кероване виключно плазмідами, не потребує вання нових патогенних штамів з величезної кільінфікування вірусом-помічником, система добору кості циркулюючих штамів у природних басейнах не потрібна, тому можна маніпулювати всіма ген 7 84254 8 ними сегментами без технічних обмежень. В сиспи, виділені з VP4, позначаються як типи P. На темі, розробленій [Neumann ef al. (supra)], вісім сьогодні у людей було знайдено щонайменше 10 кДНК вставляли між промоторною послідовністю серотипів G та щонайменше 7 серотипів P. Оскільpol І людини (407п.н.) та термінальною послідовніки гени VP4 та VP7 сегрегують окремо, нові ротастю миші (174п.н.). Експресією чотирьох протеїнів віруси генеруються шляхом реасортменту. У СпоРНП-комплексів керував промотор цитомегаловілучених Штата х найпоширенішими є серотипи Р1русу людини. Трансфекція 12 плазмід до 106 кліР4 та G1-G4; інші комбінації були описані у таких тин 293Т привела до виходу вір усу більше 103 країнах як Індія та Єгипет. Перша ліцензована робляшкоутворюючих одиниць (pfu); цю ефективтавірусна вакцина людини, вакцина резусність можна було збільшити до 5x107 pfu при ротавірусу, була виготовлена для продукування трансфекції 17 плазмід. [Fodor et al. (supra)] розсеротип-специфічного захисту від чотирьох звиробили систему, в якій вісім кДНК вставляли між чайних серотипів G1-G4. Однак, використання цієї промоторною послідовністю pol І людини (250п.н.) вакцини було заборонене внаслідок зв'язку між та геномною рибозимною послідовністю вірусу вакцинацією та підвищеним рівнем кишкової негепатиту дельта для забезпечення точного 3'-кінця прохідності у осіб, які пройшли вакцинацію. Отже, вРНК. Для експресії генів полімеразного комплексу існує потреба у продукуванні ротавірусної вакцини, використовували плазміди, що містять головний що представляє всі G- та P-субтипи і не має небапізній промотор аденовірусу типу 2. Після трансжаних побічних ефектів. Даний винахід пропонує фекції 12 плазмід експресії до клітин Vero з 10 6 вектори (краще плазміди), способи та клітинитрансфікованих клітин було виділено усього лише хазяї, які можуть бути використані для генеруванодну чи дві ін фекційні вірусні частинки. ня ротавірусів виключно з клонованої кДНК. Однак система, що не містить вірусуБуло визначено тринадцять первинних генних помічника, описана [Neumann ef аl. (supra)], яка продуктів. Щоб запобігти плутанині та сприяти включала промотори pol І та pol Il з кДНК вірусу порівнянню з протеїнами інших родів Reoviridae з грипу на різних плазмідах, потребувала конструюаналогічними функціями, використовували таку вання та котрансфекції щонайменше 12 плазмід номенклатуру: згідно з міграцією під час аналізу для виділення вірусу і 17 плазмід для ефективного способом SDS-PAGE, починаючи з найбільшого виходу вір усу. Трансфекція клітин такою великою протеїну, структурним протеїнам був наданий кількістю плазмід може обмежувати використання префікс "VP", а неструктурним протеїнам - префікс цієї системи клітинними лініями, які мають високу "NSP", з наведенням функції кожного протеїну у ефективність трансфекції Можливість виділення дужках. Наприклад, скорочення VP1(PoI) вказує на вірусу з різних типів клітин може підвищити вихід те, що найбільший протеїн у вірусних частинках є вірусу шля хом посилення реплікації вірусу грипу А РНК-залежною РНК полімеразою. Сім структурних в цих клітинах та розширення кола клітин, придатпротеїнів збираються у вірусні частинки, які вклюних для продукування вакцин [Govorkova et al., J. чають три шари структури: (1) внутрішня вірусна Virol., 1996, 70:5519]. серцевина, що містить геном dsRNA, має три асоТаким чином, у фахівців існує потреба в ефекційовані з нею протеїни, два з яких - (VP1(PoI) та тивнішому генеруванні рекомбінантних вірусів гриVP3(Cap)) є безпосередньо асоційованими з генопу. Крім того, у фахівців також існує потреба в мом, у той час як третій (VP2(T2)) утворює оболоефективному генеруванні реасортативних вірусів нку серцевини, (2) середня протеїнова оболонка для продукування вакцин у відповідь на новий ідевіріону складається з 780 молекул VP6(T13), зінтифікований вірусний штам. Даний винахід задобраних у 260 тримерних блоків, і (3) VP4 та VP7 вольняє ці та інші потреби фахівців шляхом ствоутворюють зовнішню оболонку. Протеїн вістря VP4 рення систем, в яких синтез сегментів "мінус"містить трипсиновий сайт розщеплення, який є ланцюга РНК вірусного геному (вРНК) та вір усної важливим для розщеплення на VP5 та VP8, примРНК відбувається з одної матриці, тим самим чому таке розщеплення підвищує ефективність. зменшуючи до мінімуму кількість плазмід, потрібНамагалися ввести до віріонів дві форми VP7, виних для генерування вірусу і дозволяючи проведілені з різних внутрішньорамкових рамок зчитудення ефективного та передбачуваного реасортвання - VP7(1) та VP7(2). менту. Набагато менше відомо про функції шести неВіруси Reoviridae структурних протеїнів. Аналогічно РНК-вірусам, Віруси сімейства Reoviridae, включаючи віруси очікується, що неструктурні протеїни відіграють роду Rotavirus, мають дволанцюговий сегментоваважливу роль у реплікації, транскрипції і трансляний РНК-геном. Ротавірус людини є найпоширеніції вірусних РНК та їх упаковці. Дійсно, на основі шим вірусним агентом тяжкої дитячої діареї у Споаналізів температура-чутливи х вірусів у сегменті 8, лучених Штата х, спричинюючи приблизно 50000 висун уто гіпотезу про те, що NSP2(ViP) безпосегоспіталізацій та від 20 до 50 смертей за рік при редньо відіграє певну роль у вірусній реплікації. розрахункових втратах більше 1 мільярда доларів. Вважається, що NSP3 зв'язується з консервативУ країнах, що розвиваються, ротавірус за оцінками ними послідовностями з 3'-кінця вірусних РНК та з відповідає за третину всіх асоційованих з діареєю клітинним кеп-зв'язуючим протеїном elF4G, тим госпіталізацій і спричинює щорічно приблизно самим здійснюючи специфічну підвищувальну ре850000 смертей. гуляцію трансляції ротавірусних мРНК, які мають Існує подвійна система опису серотипів рота5'-кеп структури, але не мають 3'-поліА-кінців. вірусу за реакцією нейтралізації, яка викликається NSP1; мабуть, є неістотним, але можливо, що він двома вірусними протеїнами (VP) - VP7 та VP4. відіграє активну роль у ротавірусній реплікації в Серотипи VP7 позначаються як типи G, а серотиклітинній культурі. NSP4, як вважається, бере 9 84254 10 участь у вірусному морфогенезі. Два неструктурні ми характеристиками передбачуваного патогеннопротеїни - NSP5 та NSP6 - кодуються двома різго штаму. На жаль, коінфікування двома вірусами ними рамками зчитування із сегменту 11, але їх грипу, що містять вісім сегментів, призводить до функція у життєвому циклі вірусу невідома. генерування теоретично 28=256 різних вірусів поЦикл реплікації завершується за 10-12 годин томства. Для одержання вірусу з високими показпри 37°С Сучасні дані дають змогу припустити, що никами росту та потрібними антигенами глікопровіруси можуть потрапляти до клітин шляхом рецетеїну потрібний метод селекції для усунення птор-медійованого ендоцитозу, але може існувати відповідних генних сегментів з батьківського лабоальтернативний механізм проникнення до клітини. раторного штаму з високими показниками росту. Після проникнення до клітини-хазяїна зовнішня Процедура селекції для одержання вірусу з відповірусна оболонка вивільняє транскрипційновідними глікопротеїнами та верифікація генної активну частинку у дво х оболонках до цитоплазми сукупності є тр удомісткою задачею, що потребує інфікованої клітини. Віріон-асоційовані ферменти багато часу. Хоч система РНП-трансфекції [Luytjes продукують 5'-кеповані неполіаденільовані мРНК, et al., Cell, 1989, 59:1107] зменшує кількість вірусів які є непроцесованими транскриптами "мінус"потомства, потреба у надійному способі селекції ланцюга кожного сегмента геному віріону. Вірусні залишається актуальною. мРНК, утворені з кожного сегмента, виконують дві Живі вакцини атенуйованих вірусів грипу, що функції: по-перше, вони транслюються з генерувводяться інтраназально, індукують місцевий, муванням вірусних протеїнів, кодованих сегментом, і козальний, клітинно-медійований та гуморальний по-друге, вірусні мРНК є також матрицями для імунітет. Адаптовані холодом (са) реасортативні реплікації геному. Збирання сегментів геному від(CR) віруси, що містять шість внутрішніх генів жибувається шляхом добору різних вірусних мРНК, вого атенуйованого грипу A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) потрібних для утворення прекорової Rl. Після збичи B/Ann Arbor/1/66, та гемаглютинін (НА) і нейрорання 11 мРНК відбувається синтез "мінус"амінідазу (NA) сучасних вір усів грипу дикого типу ланцюга, який проходить у "коровій Rl" та є, мабуть, надійно атенуйованими. Ця вакцина VP6(T13)-RI, які є присутніми у "віроплазмах", виможе бути ефективною для дітей та молоді. Однак явлених у цитоплазмі інфікованої клітини. Наступні вона може бути надто атенуйованою для стимустадії морфогенезу віріонів потомства є унікальлювання ідеальної імунної відповіді у людей похиними для ротавірусів і зв'язані з пупкуванням дволого віку, які складають найбільшу груп у з 20000шарової частинки до ендоплазматичного ретику40000 осіб у США, що вмирають кожного року вналуму в результаті процесу, у якому бере участь слідок інфекції грипу. Хоч послідовності внутрішніх NSP4. Це призводить до тимчасового утворення генів са-вірусів були описані, внесок кожного сегоболонки частинки, яка втрачається під час кінцемента до атенуйованого фенотипу все ще не вивих стадій дозрівання, на яких додається зовнішня значений. Ця інформація може бути одержана оболонка віріону з VP4 та VP7. лише шляхом послідовного введення до вірусу Сегментований геном, геномна структура з виспецифічних визначених атенувальних мутацій. соким степенем впорядкованості та складний цикл Хоч метод РНП-трансфекції дозволяє введення реплікації є великими проблемами розробки звомутації до геному грипу, потреба у системі селекції ротно-генетичної системи для генерування ротавіта те хнічні складнощі реконституції вірусни х РНП русів. Однак даний винахід може бути використаin vitro обмежують її використання для маніпуляцій ний для простого та зручного генерування з внутрішніми генами. ротавірусів. Таким чином, у фа хівців існує потреба у розВакцини грипу робці рекомбінантних вакцин грипу, які дозволяВакцини грипу, ліцензовані нині установами ють уникнути використання вірусу-помічника, добохорони здоров'я до використання у Сполучених ре ростуть у культурі (яйцях чи клітинній культурі), Штатах та Європі, є інактивованими вакцинами дозволяють надійно розробляти реасортативні грипу. Віруси, що представляють епідеміологічно віруси, що можуть бути розмножені для розробки важливі штами грипу А та грипу В, вирощують у нової вакцини і забезпечують систематичну мутакурячих яйцях з ембріонами і вірусні частинки згоцію для розробки живих атенуйованих вірусних дом очищають та інактивують хімічними засобами. штамів для інтраназальної вакцинації. Даний виКожний рік Всесвітня організація охорони здоров'я нахід спрямований на задоволення цих та інших обирає субтипи, вірогідність циркуляції яких є найпотреб рівня техніки. більшою: зараз це два штами грипу A-(H1N1) тa У даному винаході переважно запропоновано (H3N2), і штам В. плазміду експресії, що включає промоторну та Для продукування безпечної та ефективної ватермінальну послідовності РНК полімерази І (pol I), кцини важливо, щоб обрані штами вакцин були які вставлені між промотором РНК полімерази Il тісно споріднені зі штамами, що циркулюють, тим (pol II) та сигналом поліаденілювання. Плазміда самим забезпечуючи здатність антитіл у вакциноекспресії названа тут системою pol І-роІ II, систеваного населення нейтралізувати антигенетично мою подвійного промотора експресії чи плазмідою подібний вірус. Однак не всі віруси, тісна спорідподвійного промотора експреси. Така плазміда неність яких була встановлена, є придатними для оптимально містить сегмент вірусного гена РНКпродукування вакцини, оскільки вони погано росвірусу, вставлений між промотором pol І та сигнатуть в яйцях. Тому бажано спробувати генерува ти лом термінації. Краще, якщо РНК-вірус є вірусом реасортативний вірус з високими показниками грипу (наприклад, вірусом грипу А чи грипу В). росту для поєднання високого виходу вірусу лабоВинахід включає дві системи на основі плазмід раторного штаму (A/PR/8/34) (H1N1) з антигеннидля генерування інфекційних РНК-вірусів з клоно 11 84254 12 ваних генів чи кДНК. В одній системі (двонаправздатністю викликати захисний імунітет у популяцілена система) ген чи кДНК розташований між верях осіб похилого віку та інших, що несприйнятливі хнім промотором pol Il та нижнім промотором pol І. до сучасних атенуйованих вакцин. Транскрипція гена чи кДНК з промотора pol Il проФігура 1. Схематичне зображення системи дукує кеповану "плюс"-кодуючу вірусн у мРНК, а транскрипції pol l-pol Il для синтезу вРНК та мРНК. транскрипція з промотора pol І продукує "мінус"кДНК кожного з восьми сегментів вірусу грипу кодуючу некеповану вРНК. В інши х системах (одвставляють між промотором pol І (pIh) та термінаноспрямованих системах) ген чи кДНК розташоватором pol І (tl). Ця одиниця транскрипції pol І граний нижче промотора pol І та pol II. Промотор pol Il ничить з боків з промотором pol Il (PIICMV) цитомепродукує кеповану "плюс"-кодуючу вірусн у мРНК, а галовірусу людини та сигналом поліаденілювання промотор pol І продукує некеповану "плюс"(аIIBGH) гена, що кодує бичачий гормон росту. Після кодуючу вірусн у кРНК. трансфекції восьми плазмід експресії синтезують Мінімальна система на основі плазміди за видва типи молекул. 3 промотора pol І людини клінаходом дозволяє генерувати інфекційні РНКтинна pol І синтезує "мінус"-кодуючу вРНК. Синтевіруси з клонованої вірусної кДНК. Така система зована вРНК містить некодуючу ділянку (NCR) з 5'включає набір плазмід, у якому кожна плазміда та 3'-кінців. Транскрипція за допомогою pol Il дає включає один автономний вірусний геномний сегмРНК з 5'-кеп-структурами та 3'-поліА-кінцем; ці мент РНК-вірусу. В кожній плазміді вірусна кДНК, мРНК транслюються у вірусні протеїни. ATG вірусщо відповідає автономному вірусному геномному ної кДНК є першим ATG нижче сайту початку сегменту, вставлена між промоторною та термінатранскрипції pol II. льною послідовностями РНК полімерази І (pol І), Фігура 2. Система восьми плазмід pol l-pol Il тим самим приводячи до експресії вРНК, яка у для генерування вірусу грипу А. Вісім плазмід екссвою чергу вставляється між промотором РНК пресії, що містять вісім вірусних кДНК, вставлених полімерази Il (pol II) та сигналом поліаденілюванміж промотором pol І людини та промотором pol Il ня, тим самим призводячи до експресії вірусної (див. Фігуру 1), трансфікують до еукаріотних клімРНК. Отже, ця система використовує технологію тин. Оскільки кожна плазміда містить два різних двонаправленої плазміди і дозволяє здійснювати промотора, клітинні pol І та pol Il обидві будуть ефективний реасортмент з метою одержання РНКтранскрибувати плазмідну матрицю, гадано у різвірусів, що відповідають сучасним патогенним них ядерних компартментах, що приводить до сиштамам, які циркулюють, наприклад, для генів нтезу вірусних мРНК та вРНК. Після синтезу прогрипу NA та Н А у фоновому штамі, добре адаптотеїнів вірусного полімеразного комплексу (РВ1, ваному для вирощування у клітинній культурі чи з РВ2, PA, NP) ініціюється цикл вірусної реплікації. атенуйованого штаму, або обом. Краще, якщо віЗрештою, збирання усіх вірусних молекул безпорус є вірусом грипу А чи вірусом грипу В. середньо (pol ІІ-транскрипція) чи опосередковано Винахід пропонує клітини-хазяї, що включають (pol І-транскрипція та вірусна реплікація), що утвосистему на основі плазміди для генерування інферюються за механізмами клітинної транскрипції та кційних віріонів та способи продукування віріони трансляції, приводить до взаємодії усіх синтезоваРНК-вірусу, що включають культивування клітининих молекул (вРНП та структурні протеїни НА, NA, хазяїна за умов, які дозволяють продукування віМ1, М2, NS2/NEP) з генеруванням інфекційного русних протеїнів та вРНК. вірусу грипу А. Система на основі плазміди, клітини-хазяї та Фігури 3 А та 3Б. Схематичне зображення споспосіб продукування віріонів є особливо придатсобу, розробленого для конструювання та трансними для виготовлення вакцини, специфічної до фекції восьми плазмід експресії з метою виділення РНК-вірусу. Такі способи включають очищення A/Teal/HK/W312/97 (H6N1). А. Вір усну РНК екстравіріонів. Очи щені віріони можуть бути інактивовані гували з вірусних частинок. Проводили полімеразабо атенуйовані. Вакцини за винаходом можуть ну ланцюгову реакцію із зворотною транскриптабути використані для вакцинації проти РНКзою (RT-PCR) з використанням праймерів, що вірусної інфекції. Наприклад, захисна доза вакцимістять сегмент-специфічні нуклеотиди та посліни, що включає інактивовані віріони, може бути довності для ендонуклеаз рестрикції BsmBI чи Bsal введена шляхом внутрішньом'язової ін'єкції. За типу IIs. Вісім вірусних фрагментів PCR гідролізуіншим варіантом, захисна доза вакцини, що вклюють BsmBI чи Bsal та вставляють до pHW2000 чає атенуйовані віріони, може бути введена особі (лінеаризованого за допомогою BsmBI). Ця інсерінтраназально. ція приводить до одержання восьми експресійних Винахід далі пропонує віріони реасортативноконструктів, у яких вірусні кДНК точно злиті з прого вірусу та композиції вакцин, що містять такі вірімотором та термінатором pol І (для сегмента РВ2 они, включаючи інактивовані та атенуйовані віріоу чорних прямокутниках показані вірусні термінани. льні послідовності AGC...ACT). B. Вісім плазмід За іншим кращим варіантом втілення, винахід експресії з промотором pol І та промотором pol Il пропонує спосіб генерування атенуйованого РНКмістять по одній копії кожного з восьми сегментів вірусу. Цей спосіб включає проведення мутації вірусних кДНК. Відкриті рамки зчитування для 10 одного чи кількох вірусних генів у системі на основі вірусних протеїнів граничать з боків із сегментплазміди, з подальшим визначенням того, чи атеспецифічними некодуючими ділянками (сірі прямонуйовані інфекційні РНК-віруси, продуковані сискутники). Оскільки використаний промотор pol І темою. Такі атенуйовані віруси можуть бути виколюдини виявляє високу активність у клітинних ліристані для розробки інтраназальних вакцин, ніях, що по ходять від людини чи споріднених вивключаючи інтраназальні вакцини з підвищеною дів, клітини 293Т людини культивували спільно зі 13 84254 14 стандартною клітинною лінією, що використовусередовищі плазміда містить ген бета-лактамази ється для грипу A (MDCK-клітини). Тоді віруси, (bІа) продуковані у клітинах 293Т після трансфекції моФігури 7А та 7Б. Система подвійного промотожуть інфікувати MDCK-клітини та реплікувати. ра для генерування інфекційних РНК-вірусів. ОскіФігури 4А та 4Б. Характеризація виділених вільки РНК-віруси функціонують як клітинні паразирусів методом RT-PCR. ти, вони повинні оптимізувати стратегію А. Екстрагували РНК з вірусних частинок після використання клітин-хазяїв для експресії своєї двох пасажів надосадової рідини трансфікованих генетичної інформації. Всі РНК-віруси повинні синклітин (див. Таблиці 1 та 2) на MDCK-клітинах. тезувати мРНК, придатні до трансляції у протеїни. Проводили RT-PCR з використанням праймерів, Загалом, синтезовані протеїни потрібні для репліспецифічних щодо генного сегмента NS та вРНК, кації, транскрипції та продукування нових вірусних екстрагованої з віріонів. Використані NS-праймери частинок потомства. Для ефективної реплікації не були штам-специфічними і, таким чином, догеномних РНК треба виготовити РНК-транскрипти зволяли ампліфікацію будь-якого NS-сегмента з точними 5'- та 3'-кінцями. грипу А. Продукти реакції піддавали електрофореДана система включає зовнішню та внутрішню зу на 2% агарозному гелі. Для того, щоб впевнитиодиниці транскрипції. Внутрішня одиниця трансся у тому, що ампліфіковані фрагменти ДНК похокрипції включає промотор (р(+РНК) чи р(-РНК)), дили з вРНК, а не з плазмідної ДНК, перенесеної з краще, промотор pol І. кДНК РНК-вірусів складатрансфікованих клітин, одну реакцію проводили ються з однієї чи кількох відкритих рамок зчитубез додання зворотної транскриптази (-). Смуги 1 вання (ORF), які граничать з некодуючими ділянта 2, рекомбінантні А/ТеаІ/НK/W/312/97 (Таблиця ками (NCR). Краще, якщо між вірусною кДНК та 1); смуги 3 та 4, М-реасортмент (Таблиця 2); смуги промотором не розташовано ніяких послідовнос5 та 6, NS-реасортмент (Таблиця 2); смуги 7 та 8, тей. Відсутність проміжних послідовностей є сутрекомбінантний вірус A/WSN/33 (Таблиця 1); смуги тєвою, тому що 5'- та 3'-кінці геномної вРНК зви9 та 10, квадрупольний реасортмент (Таблиця 2). чайно містять послідовності, що розпізнаються В. Гідроліз за допомогою Nco\ фрагментів, показавірусними протеїнами, потрібними для транскрипних на А. Ідентичність фрагментів NS була також ції та реплікації; додаткові невірусні послідовності верифікована секвенуванням ампліфікованого типово заважають ефективному розпізнаванню та продукту (не показано). реплікації вРНК вірусними протеїнами. Відсутність Фігура 5. Односпрямована система транскрипроміжних послідовностей дозволяє ефективне пції РНК pol І-роІ II. В односпрямованій системі використання транскрибованих (-)-ланцюга РНК транскрипції pol l-pol Il вірусну кДНК вставляють у (А) чи (+)-ланцюга РНК (В) протеїнами вірусної "плюс"-кодуючій орієнтації між промотором pol І полімерази. Зовнішня одиниця транскрипції має людини (рIh) та термінальною послідовністю (tl). Ця промотор (р(мРНК)), краще, промотор pol II, який одиниця транскрипції pol І у цілому граничить з керує транскрипцією мРНК з кДНК; мРНК включає боків з промотором pol Il (pIICMV: безпосередній 5'-послідовності (наприклад, метил-G-кепи) та 3'ранній промотор цитомегаловірусу людини) та послідовності (наприклад, полі-А термінальні ділясайтом поліаденілювання гена, що кодує бичачий нки), потрібні для ініціації трансляції та продукугормон росту (allbgh). Після трансфекції очікується вання вірусних протеїнів. Оскільки процес транссинтез двох типів транскриптів РНК. "Плюс"ляції є толерантним до додаткових послідовностей смислова кРНК з трифосфатною групою з її 5'між промотором, зовнішньою одиницею транскрикінця, синтезована pol І, та "плюс"-смислова мРНК, пції та вірусною кДНК, то присутність проміжних синтезована pol II, з 5'-кеп-структурою та полі(А)послідовностей з внутрішньої одиниці транскрипції термінальною ділянкою з її 3'-кінця. Обидва елесуттєво не заважає трансляції мРНК. менти мРНК є потрібними для ефективної трансЦя система може бути модифікована та удоляції. сконалена для РНК-вірусів, що відрізняються від Фігура 6. Клон уючий вектор pHW11 з pol І та вірусу грипу, шляхом використання різних промоpol Il промоторами, розташованими тандемом. торів у внутрішній одиниці трансляції (наприклад, Плазміда містить 225п.н. промотор pol І РНК люpol II, pol III, Т3, SP6, Т7 чи будь-який інший промодини (рIh) та 33п.н. мишачий термінатор (tl). Послітор для ДНК-залежної РНК-полімерази) і термінадовності промотора pol І та термінатора граничать льних елементів чи рибозимів для внутрішньокліз боків з промотором РНК полімерази Il (pIICMV) тинного синтезу вірусної РНК з точними 5'- та 3'цитомегаловірусу людини та сигналом поліаденікінцями (обговорюється далі). Для генерування лювання (allBGH) гена, що кодує бичачий гормон вірусної РНК з точними кінцями можуть бути викоросту. Для вставлення вірусної кДНК між промотористані молоткоподібні (Hammerhead) рибозими чи ром pol І та термінатором були введені два сайти рибозим вірусу гепатиту дельта (HDV) [Schnell et рестрикції BsmBI (позначені підкреслюванням). al., EMBO J., 1994, 13:4195; Pleschka et al., J. Virol., Гідроліз вектора за допомогою BsmBI створив 1996, 70:4188; Herald, J. etal., J. Virol., 2000, 74(14): фрагмент вектора з липкими, але некомплемента6394-400]. рними виступаючими кінцями. Конструкція цього Зовнішня одиниця трансляції може включати вектора дозволяє здійснити точне злиття вірусної промотор pol І чи III, промотор Т7 РНК-полімерази, кДНК у "плюс"-смисловій орієнтації стосовно попромотор Т3 РНК-полімерази, промотор SP6 РНКслідовностей промотору pol І та термінатора. Для полімерази або будь-який інший промотор для розмноження у Е.соIі плазміда має сайт початку ДНК-залежної РНК-полімерази. Якщо промотор у реплікації (оrі), а для селекції в ампіцилінвмісному внутрішній одиниці трансляції керує синтезом транскрипту, у якому відсутній метил-G-кеп, то 15 84254 16 внутрішній сайт входження рибосом (Internal руються інфекційні віруси, що містять (+)-РНК Ribosome Entry Site, IRES) може бути розташоваразом з вірусними структурними протеїнами. ний з 5'-кінця кодуючої послідовності кДНК для Фігура 9. Система pol l-pol Il для генерування сприяння ініціації трансляції (обговорюється далі). вірусу парагрипу людини III. Даний винахід може Слід відзначити, що вектор pHW2000 має бути використаний для продукування вірусу парагпромотор Т7 між CMV-промотором та сайтом террипу III, який включає "мінус"-ланцюговий мономомінації. Транскрипти pol Il синтезуються у ядрі, тоді лекулярний РНК-геном. Вірусна кДНК може бути як транскрипти Т7 синтезуються у цитоплазмі клівставлена до системи pol l-pol Il у смисловій чи тин, що експресують РНк-полімеразу Т7. Отже, антисмисловій орієнтації. На Фігурі представлена транскрипти, що походять від кількох різних проодноспрямована система. Промотор pol І керує моторів у зовнішній одиниці транскрипції, можуть синтезом кРНК, а промотор pol Il керує синтезом бути продуковані з утворенням різних мРНК. ТамРНК. За цим варіантом втілення, промотор pol Il ким чином, плазміди експресії, одержані з продукує поліцистронну мРНК, з якої перша відpHW2000, дозволяють здійснювати швидку оцінку крита рамка зчитування ефективно транслюється оптимальності використання промоторів pol Il чи у н уклеокапсидний протеїн (NP). Цей протеїн є Т7 або їх комбінації для синтезу РНК вірусів з потрібним для реплікації. Готують плазміди, що "плюс"-ланцюгом, що мають внутрішній сайт вхокодують L- та Р-протеїн, що також є суттєвими для дження рибосом (IRES). реплікації та транскрипції (але не транслюються Фігура 8. Система подвійного промотора для ефективно з поліцистронної мРНК), які котрансфігенерування (+)-ланцюгових РНК-вірусів. Даний кують на окремих плазмідах експресії. У порівнянні винахід може бути також адаптований для продуіз зворотно-генетичною системою, розробленою кування вірусів, що включають "плюс"-ланцюговий [Durbin, А.Р. et al., Virology, 1997, 235(2):323-332], одномолекулярний геном, таких як вірус гепатиту система pol l-pol Il має кілька переваг. Завдяки C. За цим варіантом втілення, кДНК, що включає експресії NP з тієї самої кДНК, ця мінімальна плагеном вірусу гепатиту C (приблизно 9500 нуклеозмідна система потребує конструювання та тидів) вста вляють у конструкт, що дозволяє ефектрансфекції лише трьох плазмід замість чотирьох тивну внутрішньоклітинну транскрипцію кДНК у для генерування вірусу парагрипу III цілком з кломРНК та непроцесовану "мінус"-РНК (двоспрямонованої кДНК. На відміну від зворотно-генетичних ваний підхід) чи мРНКта непроцесовану "плюс"систем, основаних на транскрипції in vivo з Т7РНК (односпрямований підхід). кДНК складається промотора, система pol l-pol Il повністю керується з однієї відкритої рамки зчитування (ORF), яка граеукаріотними ДНК-залежними РНК-полімеразами, ничить з боків з некодуючими ділянками (NCR). Ha які присутні у кожній клітині. Крім того, інфікування фігурі показана плазміда експресії, що містить вірусом коров'ячої віспи, який керує експресією Т7 двоспрямовану систему. Непроцесовану кДНК РНК-полімерази, потребує використання клітин, вставляють між промоторною pol І (рІ) та термінащо є пермісивними для вірусу коров'ячої віспи льною послідовностями (tI), що приводить до син(клітини HeLa чи їх похідні, такі як клітини Нер-2), тезу після трансфекції непроцесованої (-)але не оптимальні для росту вірусу парагрипу люланцюгової РНК. дини, тим самим обмежуючи корисність цього підВнутрішня одиниця транскрипції граничить з ходу для генерування інфекційного вірусу. Тяжкі боків із зовнішньою одиницею транскрипції, що цитопатичні ефекти вірусу коров'ячої віспи та вимає промотор (р(мРНК)) для проведення синтезу моги безпеки, потрібні при використанні інфекціймРНК Краще, цей промотор є промотором pol II. них агентів, є небажаними ознаками цієї системи. Однак, якщо синтезована РНК має внутрішній сайт Використання системи pol l-pol Il усуває потребу у входження рибосом (IRES), то промотор pol Il моінфікуванні вірусом та дозволяє використовувати же бути заміщений на промотори pol І, pol III, SP6, клітини LLC-MK2 для трансфекції та вирощування Т7 чи ТЗ (використання промоторів Т3 чи Т7 повірусу парагрипу III людини, тим самим створюючи требує експресії протеїнів Т3- чи Т7-полімерази технологію генерування атенуйованих вірусів у шляхом котрансфекції плазміди, що кодує полімебільш простий та безпечний спосіб. рази, або використання стабільної клітинної лінії, Фігура 10. Система на основі плазміди для гещо експресує полімерази). На 3'-кінці зовнішньої нерування ротавірусу з клонованої сДНК. Ця сисодиниці транскрипції використовують полі Атема може бути використана для генерування вісигнал або вставлену полі А послідовність для русів з сегментованими дволанцюговими РНКзабезпечення поліА-термінальної ділянки у синтегеномами (наприклад, ротавірус). Вона може бути зованій мРНК. застосована, наприклад, до вірусів, що є членами Одержана мРНК транслюється у великий посімейства Reoviridae (10,11,12 сегментів dsРНК) чи ліпротеїновий прекурсор, який розщеплюється коBirnaviridae (2 сегменти dsРНК). Досі для вірусів та післятрансляційно з утворенням індивідуальних сімейства Reoviridae не існувало зворотноструктурних та неструктурних вірусних протеїнів. генетичних систем. Ця Фігура ілюструє, як з викоНеструктурні протеїни NS5a та NS5b, які є ристанням даного винаходу можуть бути генеропротеїнами РНК-залежної РНК-полімерази, виковані ротавіруси, що мають 11 сегментів dsРНК, ристовують (-)-РНК, синтезовану внутрішньою але аналогічні системи можуть бути використані одиницею транскрипції як матрицю для ініціації для членів родів Orbivirus (10 сегментів dsРНК) чи циклу вірусної реплікації/транскрипції. Таким чиOrthoreoviruses (12 сегментів dsРНК). ном, продукується (+)-РНК/мРНК, яка використоНаведений далі опис ілюструє генерування вується для трансляції у протеїн. Зрештою, генеротавірусу A/SA11 цілком з клонованої кДНК. Були визначені усі 11 сегментів дволанцюгового РНК 17 84254 18 геному ротавірусу мавп. dsРНК у геномі мають тині-хазяїні або шляхом використання різних продовжину від 3302п.н. до 663п.н., а розмір повного моторів для синтезу мРНК, використання двох геному становить 18550п.н. Сегменти геному проплазмід для одного сегмента навряд чи буде ненумеровані 1-11 у порідку підвищення рухомості, обхідним для більшості генів. Оскільки (+)-РНК визначеної шляхом аналізу за методом PAGE синтезується з (-)-РНК, внутрішньоклітинна екс(електрофорез на поліакриламідному гелі). Сегмепресія (-)-РНК та протешу може привести до гененти мають повністю спаровані основи, і "плюс"рування компетентних одиниць реплікації, які просмисловий ланцюг містить структур у 5'дукують вірусну мРНК. Таким чином, система термінального кепа (m7GpppGmGPy), але не має подвійного промотора дозволяє створити мінімасигналу поліаденілювання поблизу його 3'-кінця. льну плазмідну систему, яка включає значно менВсі геномні сегменти мають короткі консервативні шу кількість плазмід порівняно з 22, що були б 5'- та 3'-термінальні послідовності з 10необхідними, якби плазміди для експресії РНК та нуклеотидною консенсусною послідовністю на 5'протеїну знаходились на окремих плазмідах. Гекінці та 8-нуклеотидною консенсусною послідовнінерування ротавірусу може бути здійснене у спостю на 3'-кінці. З внутрішнього боку ці термінальні сіб, аналогічний до того, що використовується для ділянки в кожному гені безпосередньо граничать з продукування вірусу грипу А. другою консервативною ділянкою розміром щоФігури 11А-Г. Реплікація та синтез мРНК генонайменше 30-40 нуклеотидів, які є сегментмів РНК-вірусу. специфічними. 5'-нетрансльовані ділянки (NTRs) (A) Здійснюють синтез мРНК протеїнами вірузмінюються за довжиною, але всі є меншими за 50 сної полімерази шляхом інфікування (-)нуклеотидів і в усіх сегментах після NTRs за перланцюговими вірусами: одна чи дві мРНК для сегшим AUG йде щонайменше одна довга відкрита ментованих РНК-вірусів або численні мРНК для рамка зчитування. Сегменти 9 та 11 кодують два вірусів з мономолекулярними геномами. Механізпротеїни. 3'-NTRs відрізняються за довжиною в ми антитермінації приводять до синтезу непроцеінтервалі від 17 nts (сегмент 1) до 182 nts (сегмент сованих (+)-ланцюгів, які можуть бути скопійовані у 10). (-)-геномну РНК. Ротавірусна кДНК клонується в систему з по(Б) Сегментовані геноми амбісмислових РНКдвійним промотором, краще, систему pol І-роІ II. вірусів копіюються з утворенням однієї мРНК; друПісля трансфекції одержаних плазмід до придатга РНК синтезується з комплементу. них клітин-хазяїнів продукуються вірусні РНК та (B) У клітинах, інфікованих дволанцюговими протеїни, які приводять до утворення інфекційного РНК-вірусами, мРНК, що синтезовані першими, ротавірусу. Краще, для продукування ротавірусу можуть бути трансльовані у протеїн або викорисвикористовується односпрямована система транстовуватись як матриці для синтезу (-)-ланцюгів, з крипції. Використання цього підходу приводить до утворенням дволанцюгової геномної РНК. внутрішньоклітинного синтезу 11 (+)-РНК молекул (Г) Для (+)-ланцюгових вірусів геномна РНК є ротавірусного геному, які мають трифосфати на також мРНК і копіюється у (-)-ланцюгову РНК, що своїх 5'-кінцях. Експресія вірусоподібної мРНК може бути скопійована у (+)-геномну РНК. мРНК приводить до експресії вірусних протеїнів. Вірусдеяких (+)-РНК вірусів не містять поліА термінальний протеїн \/Р3(кеп), який виявляє гуанілілтрансної ділянки. У деяких сімействах продукується одферазну та метилтрансферазну активність, катана чи кілька субгеномних РНК. лізує приєднання 5'-кеп-структур до усіх 11 Життєвий цикл усіх РНК-вірусів включає синротавірусних (+)-РНК [Chen D., et al., Virology, тез РНК та збирання вірусних частинок після син1999, 265:120-130]. Дійсно, раніше було показано, тезу протеїну; ці функції утворюють концептуальну що очищений \/Р4(кеп), що є аналогом ротавірусоснову зворотно-генетичних систем за даним виного \/Р3(кеп) вірусу катаральної лихоманки овець находом, які можуть бути використані для проду(BTV), може приєднувати кеп-структури до вірусокування РНК-вірусів з клонованої кДНК. Даний виподібної (+)-РНК in vitro [Ramadevi N., et al., Proc. нахід спрощує та удосконалює існуючі на даний Natl. Acad. Sci. USA., 1998, 95(23): 13537-42]. Очічас зворотно-генетичні системи шляхом створення кується, що транскрипція in vivo кДНК та внутрішсистеми подвійного промотору для продукування ньоклітинна експресія протеїну VP3(Ken) приво"мінус"-ланцюгових сегментованих вірусів (напридить до генерування кепованих РНК для всіх 11 клад, грипу А, грипу В, Bunya viridae), несегменторотавірусних геномних сегментів. Ці мРНК трансваних "мінус"-ланцюгових РНК-вір усів (наприклад, люються у вірусні протеїни або спаковуються у Paramyxo viridae, Mononegavirales), дволанцюгових передкор-RI. Після формування частинок РНК-вірусів (наприклад, Reoviridae, Bimaviridae) та VP6(T13)-RI "плюс"-смислова мРНК використову"плюс"-ланцюгових РНК-вірусів (наприклад, ється як матриця для синтезу (-)-РНК. Зрештою, Flaviviridae, Picomavihdae, Coronaviridae, приєднання VP4 та VP7 в ході морфогенезу приTogaviridae). Оскільки система за даним винаховодить до утворення інфекційних віріонів потомстдом використовує єдин у вір усну кДНК для синтезу ва. як протеїну, так і геномної РНК, ця система зменОскільки ефективне ініціювання реплікації та шує кількість плазмід, потрібних для продукування морфогенез можуть бути залежними від оптимавірусу, і дозволяє швидко та дешево розробляти льної концентрації кожного з вірусних протеїнів, вакцини. може бути бажаним генерувати окремі плазміди Якщо вірус, що має сегментований РНК-геном, для синтезу РНК та експресії протеїнів. Однак, має бути продукований з використанням даного оскільки рівень експресії протеїнів може бути опвинаходу, то вірусна кДНК, що відповідає кожному тимізований шляхом змін у кількості плазмід у клігену у цільовому геномі, вставляється до плазміди 19 84254 20 експресії за винаходом. Винахід включає систему чає неінфекційну геномну РНК, типово потребує експресії, основану на двоспрямованій плазміді, та додаткового введення інших вірусних протеїнів, які систему експресії на основі односпрямованої плазвичайно переносяться у вірусній частинці разом з зміди, у яких кДНК вставлена між послідовностями геномом. Наприклад, вірус парагрипу III несе РНКпромотора РНК-полімерази І (pol І) та термінатора залежну РНК-полімеразу, присутність якої є необ(внутрішня одиниця транскрипції). Ця одиниця хідною у новоінфікованій клітині для ініціювання транскрипції pol І у цілому граничить з промотором реплікації вірусної геномної РНК та транскрипції РНК-полімерази Il (pol II) та сайтом поліаденілювірусних мРНК; у відсутності полімерази геномна вання (зовнішня одиниця транскрипції). У односпРНК парагрипу III є неінфекційною. За варіантами рямованій системі, промотори pol І та pol Il розтавтілення даного винаходу, у яких генеруються вішовані вище кДНК і продукують "плюс"-смислову руси, що включають інфекційні несегментовані некеповану кРНК (починаючи з промотора pol І) та геномні РНК, просте введення плазміди подвійної "плюс"-смислову кеповану мРНК (починаючи з експресії за винаходом, яка несе нуклеїнові кислопромотора pol II). Промотор pol I1 термінальна поти, що включають вірусний геном, до придатної слідовність pol I, промотор pol Il та сигнал поліадеклітини-хазяїна є достатнім для спричинення гененілювання в односпрямованій системі можуть бути рування повних вірусів. За варіантами втілення, у названі такими, що мають "орієнтацію зверху яких генеруються віруси, що включають неінфеквниз". У двоспрямованій системі, промотори pol І ційну несегментовану геномну РНК, може знадота pol Il находяться з протилежних боків кДНК, битися також введення до клітини-хазяїна додатпричому верхній промотор pol Il продукує "плюс"кових плазмід експресії поряд з плазмідою смислову кеповану мРНК, а нижній промотор pol І подвійної експресії, що несе вірусний геном. Дода"мінус"-смислову некеповану вірусну РНК (вРНК). ткова плазміда має експресувати протеїн(и), поЦі системи pol l-pol Il починають з ініціювання трібний для ініціювання життєвого циклу вірусу, транскрипції двох клітинних ферментів РНКякий звичайно потрапляє до клітини-хазяїна при полімерази зі своїх власних промоторів, гадано, у інфікуванні (наприклад, РНК-залежні РНКрізних компартментах ядра. Послідовності промополімерази). тора pol І та термінатора pol І у двоспрямованій За варіантами втілення, у яких продукується системі можуть бути позначені як такі, що мають пікорнавірус, що включає інфекційний несегменто"орієнтацію знизу уверх", тоді як промотор pol Il та ваний РНК-геном, кДНК, що включає повний віруссигнал поліаденілювання у двоспрямованій систений геном, вставляється до плазміди з подвійним мі можуть бути названі такими, що мають "орієнпромотором експресії за винаходом. Верхній протацію зверху вниз". мотор у зовнішній одиниці транскрипції, краще, Якщо цільовий вірус включає "плюс"промотор pol II, керує продукуванням "плюс"ланцюговий сегментований РНК-геном, то промоланцюгової мРНК, що включає повний вірусний тор pol І краще розташований вище кДНК у внутгеном -поліпротеїн транслюється з мРНК і окремі рішній одиниці транскрипції (односпрямована сиспротеїни відщеплюються вивільняються з поліпротема). За цим варіантом втілення, генерується теїну (наприклад, за допомогою протеази у полі"плюс"-ланцюгова РНК для прямого включення до протеїні). Оскільки вірусний геном включає "плюс"нових вірусів. Однак, до обсягу винаходу входять ланцюгову РНК, другий верхній промотор у внутваріанти втілення, у яких цільові віруси, що вклюрішній одиниці транскрипції (односпрямована сисчають "мінус"-ланцюгові сегментовані РНК-геноми, тема), краще, pol І, керує продукуванням "плюс"продукуються з використанням односпрямованої ланцюгової копії геному. Якщо вірусний геном системи. включає "мінус"-ланцюгову РНК, то другий нижній Якщо цільовий вірус включає "мінус"промотор у вн утрішній одиниці транскрипції (дволанцюговий сегментований РНК-геном, то промоспрямована система), краще, pol І, буде керувати тор pol І краще розташований нижче кДНК у вн утпродукуванням мінус"-ланцюгової копії геному. До рішній одиниці транскрипції (двоспрямована сисобсягу винаходу входять варіанти втілення, у яких тема). За цим варіантом втілення, генерується продукуються "мінус"-ланцюгові несегментовані "мінус"-ланцюгова РНК для прямого включення до РНК-віруси з використанням односпрямованої сиснових вірусів. До обсягу даного винаходу входять теми. Аналогічно, до обсягу винаходу входять ваваріанти втілення, у яких цільові віруси включають ріанти втілення, у яких "плюс"-ланцюгові несегме"плюс"-ланцюгові сегментовані РНК-геноми, що нтовані РНК-віруси продукуються з використанням продукуються за допомогою двоспрямованої сисдвоспрямованої системи. теми. Віруси, що включають неінфекційні несегменДаний винахід може бути також використаний товані РНК-геноми, у яких поліпротеїн не продукудля продукування вірусів, які включають інфекційється, також можуть бути генеровані за даним виний чи неінфекційний несегментовані РНК-геноми находом. Наприклад, система за даним винаходом (одноланцюгові чи дволанцюгові). Загалом, просте може бути використана для продукування вірусів введення інфекційної вірусної геномної РНК до rhabdoviridae чи вірусів paramyxoviridae, краще, клітини-хазяїна є достатнім для того, щоб спричивірусу парагрипу III, життєвий цикл якого звичайно нити ініціювання життєвого циклу вірусу усередині включає продукування численних моноцистронних клітини з подальшим продукуванням цілих вірусів. мРНК з геномної "мінус'Чпанцюгової РНК за допоНаприклад, просте введення пікорнавірусної геномогою створеної вірусом РНК-залежної РНКмної ДНК до клітини-хазяїна є достатнім для того, полімерази; окремі протеїни експресуються з мощоб спричинити генерування повних пікорнавіруноцистронних мРНК. В цих варіантах втілення, сів. Ініціювання життєвого циклу вірусу, що вклюзовнішня одиниця транскрипції, що включає про 21 84254 22 мотор, краще, промотор pol II, керує продукуванВиділення двох вірусів грипу А з мінімальної ням "плюс"-ланцюгової поліцистронної копії віруссистеми на основі плазмід - A/WSN/33 (H1N1) та ного геному, з якої, загалом, транслюється лише А/TеаІ/НК/W312/97 (H6N1) - підтвердило корисперший ген (NP). Додатково, внутрішня одиниця ність цієї системи. Виділення фенотипово невідмітрансляції, що включає промотор, краще, промотного штаму A/PR/8/34 (H1N1), який є стандартом тор pol І, керує експресією копії РНК геному для для продукування інактивованої вакцини грипу А, включення до нових вірусів. Оскільки вірусний гепідтвердило корисність цієї системи для розробки ном парагрипу III включає "мінус"-ланцюгову РНК, вакцин. Через сімдесят дві години після трансфекпромотор внутрішньої одиниці трансляції краще ції восьми плазмід експресії до співкультивованих розташований нижче кДНК (двоспрямована систеклітин 293Т та MDCK вихід вірусу у надосадовій ма). Якщо вірусний геном включає "плюс"рідині трансфікованих клітин складав від 2x105 до ланцюгову РНК, промотор внутрішньої одиниці 2x107 інфекційних вір усів на мл. Ця восьмиплазмітранскрипції краще розташований вище кДНК (оддна система була також використана для генеруноспрямована система). До обсягу винаходу вховання одинично та квадрупольно-реасортативних дять варіанти втілення, у яких віруси, що включавірусів з А/TеаІ/НК/W312/97 (H6N1) та A/WSN/33 ють "плюс"-ланцюговий РНК-геном, продукуються (H1N1), а також для генерування вірусів A/WSN/33 з використанням двоспрямованої системи, та ваз тандемно-орієнтованої системи (яка продукує ріанти втілення, у яких віруси, що включають "мікРНК та мРНК). нус"-ланцюговий РНК-геном, продукуються з викоОскільки система pol l-pol Il сприяє конструюристанням односпрямованої системи Для вірусної ванню та одержання як рекомбінантних, так і реатранскрипції та реплікації потрібні додаткові віруссортативних вірусів грипу А, вона є також застосоні протеїни (що відрізняються від протеїнів, ексвною для одержання інших РНК-вірусів цілком з пресованих з поліцистронної мРНК) (L та P), і ці клонованої кДНК. Хоч у даному винаході краще протеїни вводяться окремо на окремих плазмідах використовується кДНК, може бути використаний експресії. будь-який інший тип нуклеїнових кислот, що кодує Винахід може також включати варіанти втіленвірусний ген, який має бути експресований, при ня, у яких генеруються віруси, що включають двозбереженні суттєви х елементів винаходу. Наприланцюгові сегментовані РНК-геноми. В цих варіанклад, можуть бути використані PCR-ампліфіковані тах втілення, плазміда, що включає кожний ген з продукти чи рестрикційні фрагменти, що включацільового вірусного геному, вставляється до плазють вірусні гени. Крім того, гени, що експресуютьміди експресії з подвійним промотором за винахося у системі на основі плазмід за винаходом, модом. Плазміда може бути односпрямованою плазжуть бути злиті з чи помічені іншими генами, мідою або двоспрямованою плазмідою. Промотор такими як мітки для очищення/детектування (нау зовнішній одиниці транскрипції, краще, промотор приклад, глутатіон-S-трансфераза, полігістидин, pol II, керує експресією мРНК-транскрипта кожного зелений флуоресцентний протеїн, мітки тус та гена, що транслюється у кодований протеїн Промітки FLAG). Даний винахід також передбачає вамотор у внутрішній одиниці трансляції, краще, ріанти втілення, в яких у плазмідах за даним винапромотор pol I, керує транскрипцією "плюс"ходом використовуються часткові генні послідовланцюга (односпрямована система) або "мінус"ності. ланцюга (двоспрямована система). Згодом, перНаведена далі таблиця містить необмежуваший продукований ланцюг може виступати в ролі льний перелік "мінус"-ланцюгових РНК-вірусів, які матриці для продукування комплементарного ланможуть бути продуковані з використанням даного цюга за допомогою вірусної РНК-полімерази. Двовинаходу: ланцюговий РНК-продукт, що утворюється, включається до нових вірусів. Порядок Mononegavirales Mononegavirales Mononegavirales Mononegavirales Mononegavirales Mononegavirales Сімейство Підсімєйство Рід Bomaviridae Bomavirus Filoviridae Ебола-подібний вірус Filoviridae Марбург-подібний вірус Paramyxo viridae Paramyxo virinae Respirovirus Paramyxo viiidae Paramyxo virinae Morbillivirus Paramyxo viridae Paramyxo virinae Rubulavirus Mononegavirales Paramyxo viiidae Pneumovirinae Pneumovirus Mononegavirales Paramyxo viridae Pneumovirinae Metapneumo-virus Mononegavirales Rhabdoviridae Vesiculovirus Mononegavirales Rhabdoviridae Lyssavirus Mononegavirales Rhabdoviridae Ephemerovirus Mononegavirales Rhabdoviridae Novirhabdovirus Типовий вид Вірус хвороби Борна Вірус Ебола Вірус Марбург Вірус парагрипу людини І Вірус кору Вірус свинки Респіраторносинцитіальний вірус людини Вірус ринотрахеїту індички Вірус везикулярного стоматиту Індіана Вірус сказу Вірус бичачої ефемерної лихоманки Вірус інфекційного некрозу кровотворної тканини 23 84254 Mononegavirales Rhabdoviridae Cytorhabdovirus Mononegavirales Rhabdoviridae Nucleorhabdo-virus Mononegavirales Mononegavirales Mononegavirales Mononegavirales Mononegavirales Mononegavirales Ortnomyxo viridae Ortncmyxo viiidae Orthomyxo viiidae Orthomyxo viridae Bunyaviridae Bunyaviridae Influenzavirus A Ihfluenzavirus B Influenzavirus C Thogotovirus Bunyavirus Hantavirus Mononegavirales Bunyaviridae Nairovirus Mononegavirales Bunyaviridae Phlebovirus Mononegavirales Bunyaviridae Tospovirus Mononegavirales Bunyaviridae Tenuiviras Mononegavirales Bunyaviridae Opliiovirus Mononegavirales Arenaviridae Arenaviras Mononegavirales Arenaviridae Deltavirus Даний винахід далі частково оснований на створенні двоспрямованого транскрипційного конструкту, який містить вірусну кДНК, що кодує РВ2, РВ1, PA, НА, NP, N A, M чи NS, які граничать з боків з промотором РНК-полімерази І (pol І) для синтезу вРНК та промотором РНК-полімерази Il (pol II) для синтезу вірусної мРНК. Придатність цього підходу підтверджена генерування вірусу після трансфекції конструкту pol І/роІ ІІ-промоторРВ1 разом з вРНК- та протеїн-експресивними конструктами для решти семі сегментів. Оскільки цей підхід зменшує кількість плазмід, потрібних для генерування вірусу, він також зменшує обсяг робіт, потрібних для клонування, підвищує ефективність генерування вірусу і поширює використання зворотно-генетичних систем на клітинні системи, для яких неможливо здійснити ефективну котрансфекцію 17 плазмід. Сюди входить також односпрямований транскрипційний конструкт, який включає промотори pol І та pol II, розташовані вище кодуючої послідовності вірусної кДНК. Обидва промотори знаходяться у звичайній орієнтації зверху униз по відношенню до гена. Хоч двоспрямована система продукує ви щий титр вірусу грипу А, односпрямована система є придатною для інших видів застосування (наприклад, продукування інших "мінус"-ланцюгових вірусних штамів). Промотор, термінатор чи сигнал поліаденілювання розташований "вище" гена, якщо він знаходиться у проксимальному положенні до початку гена (наприклад, першого кодону) і дистальному до кінця гена (наприклад, термінального кодону). Промотор, термінатор чи сигнал поліаденілювання розташований "нижче" гена, якщо він знаходиться у проксимальному положенні до кінця гена і дистальному - до початку гена. Промотори у плазмідах за винаходом, що є функціонально асоційованими з геном, орієнтовані у такий спосіб, щоб промотувати транскрипцію смислового чи антисмислового ланцюга гена. У тому значенні, що використовується у даному винаході, "плазміда експресії" є ДНК-вектором, 24 Вірус некротичної жовтяниці салату Вірус жовтої карликовості картоплі Вірус грипу А Вірус грипу В Вірус грипу C Вірус Thogoto Вірус Bunyamwera Вірус Hantaan Вірус хвороби Найробі овець Вірус сицилійської флеботомної лихоманки Вірус плямистого в'янення томату Вірус смугастості рису Вірус псорозису цитрусових Вірус лімфоцитарного хоріоменінгіту Вірус гепатиту дельта що включає "вн утрішню одиницю транскрипції" та "зовнішню одиницю транскрипції". Як обговорювалося вище, плазміди експресії можуть бути використані для генерування будь-якого типу РНКвірусу, краще, "плюс"- чи "мінус"-ланцюгових РНКвірусів, РНК-вірусів з сегментованим чи несегментованим геномом або дволанцюгових РНК-вірусів. Зовнішня одиниця транскрипції включає промотор, краще промотор pol II, який керує транскрипцією, з вірусної кДНК, мРНК, що придатна для трансляції. Зовнішня одиниця транскрипції може включати промотор Т7 РНК-полімерази, промотор Т3 РНКполімерази, промотор SP6 РНК-полімерази або будь-який промотор чи комбінацію генетичних елементів, здатних керувати експресією придатного до трансляції РНК-продукту. Наприклад, зовнішня одиниця трансляції може включати промотор pol І чи pol II, якщо вірусна кДНК, що має бути експресована з плазміди, є зміненою методами генної інженерії так, щоб вона включала сигнал поліаденілювання на 3'-кінці транскрибованої РНК. Це може бути здійснене шляхом вставки нитки з А нуклеотидів на 3'-кінці кодуючої послідовності кДНК безпосередньо перед стоп-кодоном. Крім того, вірусна кДНК може бути змінена методами генної інженерії так, щоб вона включала внутрішній сайт входження рибосом (Internal Ribosomal Entry Site, IRES) на 5'-кінці кДНК для сприяння ініціації трансляції з транскрибованої РНК. "Внутрішня одиниця транскрипції" у плазмідах експресії за винаходом розташована усередині зовнішньої одиниці транскрипції і включає промотор, краще, промотор pol І, який може керувати транскрипцією вірусної кДНК, яка може бути реплікована вірусними механізмами та включена до нових вірусів. Краще, промотор у внутрішній одиниці транскрипції транскрибує РНК, яка не має надлишкових невірусних чужорідних послідовностей на 5'- та 3'кінцях, краще, шляхом точного злиття вірусної кДНК з послідовностями промотора pol І та термінатора. Однак, винахід включає варіанти втілення, у яких внутрішня одиниця транскрипції включає 25 84254 26 промотор, який здійснює продукування РНКOrthomyxo viridae, і оптимально, має сегментоватранскриптів, що включають 5'- та 3'-додаткові ний геном. Члени вірусного сімейства невірусні послідовності (наприклад, промотори pol Orthomyxo virdae включають, без обмеження, віруII, промотори pol III, промотор Т7 РНК-полімерази, си грипу А, грипу В, грипу C, тоготовірус промотори Т3 РНК-полімерази або промотори SP6 (Thogotovirus), віруси кору та свинки РНК-полімерази). В цих варіантах втілення, додат(Paramyxo virus) або вірус сказу (Rhabdovirus). кові послідовності можуть бути включені до плаз""Плюс"-ланцюговий РНК-вірус" є вірусом, міди експресії, яка забезпечує, щоб РНК, продукоякий включає "плюс"-ланцюговий РНК-геном. Привана з внутрішньої одиниці транскрипції, не клади "плюс"-ланцюгових РНК-вірусів включають включала надлишкових невірусних послідовносполіовірус (Picornavirus), тогавіруси та флавівірутей. Наприклад, плазміда експресії може бути зміси. Геномна РНК цих вірусів має таку саме смиснена ) методами генної інженерії так, щоб вона лову орієнтацію, як мРНК і може функціонувати як включала рибозимні послідовності на кінцях мРНК. Ці віруси можуть включати сегментований транскриптів, продукованих внутрішньою одиничи несегментований геном. цею транскрипцією, причому рибозимні ділянки "Дволанцюгові РНК-віруси" включають дволатранскрибованої РНК розщеплюють транскрипт у нцюговий РНК-геном. Дволанцюговими РНКтакий спосіб, щоб утворювалися 5'- та 3'вірусами є реовіруси. термінальні послідовності РНК, аналогічні до тих, Вірусний геном може бути також сегментоващо існують у вірусній РНК. Крім того, плазміди ним чи несегментованим (мономолекулярним). експресії можуть бути змінені методами генної Сегментований геном включає дві чи більше нукінженерії так, щоб вони включали термінальні полеїнових кислот, кожна з яких кодує один чи кілька слідовності, які спричинюють термінацію трансвірусних генів. Краще, якщо сегментований геном крипції на кінці кодуючої послідовності вірусної включає окрему нуклеїнову кислоту для кожного кДНК, тим самим запобігаючи включенню надлишвірусного гена. Ортоміксовіруси (віруси грипу А, В кових нетрансльованих послідовностей до 3'-кінця чи C), буніавіруси та аренавіруси включають сегтранскрибованої РНК. Краще, "плазміда експресії" ментовані РНК-геноми. Несегментований геном є ДНК-вектором, який використовує систему pol Івключає єдину н уклеїнову кислоту, яка містить роІ II. Отже, така плазміда включає послідовності кожен вірусний ген. Віруси Mononegavirales, рабпромотора РНК-полімерази І (pol І) та термінатора довіруси, віруси Flavi viridae, віруси Picornaviridae, pol І, вставлені між промотором РНК-полімерази Il віруси Togaviridae та праміксовіруси включають (pol II) та сигналом поліаденілювання. У двоспрянесегментований РНК-геном. мованій системі, промотор РНК-полімерази І керує Дволанцюгові РНК можуть бути скорочено поекспресією геномною "мінус"-смисловою некепозначені як "dsРНК". Одноланцюгові РНК можуть ваною РНК (далі позначена "вРНК") кДНК, яка бути скорочено позначені як "ssРНК". "Мінус"вставляється у "антисмисловій" орієнтації між одноланцюгові РНК можуть бути скорочено познапромотором та термінатором. Промотор РНКчені як "-ssРНК". "Плюс"-одноланцюгові РНК мополімерази Il керує експресією матричної РНК; жуть бути скорочено позначені як "+ssРНК". сегмент кДНК вірусного гена, вставлений у "смис"Сегмент вірусного гена" є, краще, клонованою ловій" орієнтації між промотором pol Il та сигналом кДНК, що відповідає молекулі геномної РНК з геполіаденілювання, приводить до експресії "плюс"ному РНК-вірусу. Цей термін може також включати смислової кепованої вірусної мРНК. В односпрябудь-який ген чи сегмент гена (наприклад, продукт мованій системі, вірусна кДНК вставлена нижче PCR чи рестрикційний фрагмент), що включає ген, промоторів pol І та pol Il у смисловій орієнтації. який походить з РНК-вірусу. Промотор pol Il керує експресією "плюс"-смислової "Мінімальна система на основі плазмід" є сискепованої вірусної мРНК, а промотор pol І керує темою, що містить плазміду експресії, яку було експресією "плюс"-смислової некепованої вірусної визначено вище, що включає кожний автономний кРНК. вірусний геномний сегмент РНК-вірусу. Таким чиПлазміда може включати "по суті цілком" іншу ном, загальна кількість плазмід, що містять вірусні основну плазміду, якщо присутні всі гени та функгеномні послідовності, не перевищуватиме загальціональні некодуючі ділянки основної плазміди. ної кількості генних сегментів РНК-вірусу, що викоНаприклад, плазміда, сконструйована шляхом ристовується як джерело. Винахід включає варіанпростого видалення ділянки полілінкера та інсерції ти втілення, у яких інші плазмщи, що не містять чужорідного гена, включає по суті цілком основну вірусних послідовностей, можуть бути котрансфеплазміду. ковані до клітин-хазяїнів. Це забезпечує значні ""Мінус"-ланцюговий РНК-вірус" є вірусом, у переваги завдяки обмеженню загальної кількості якому вірусний геном включає "мінус"-ланцюгову плазмід, потрібної для встановлення системи у РНК. "Мінус"-ланцюгова РНК є комплементарною клітині-хазяїні, усуненню потреби у вірусідо мРНК і, загалом, для трансляції протеїнів має помічнику, усуненню необхідності процесу селекції бути скопійована у комплементарну "плюс"та створенню можливості ефективного генеруванланцюгову мРНК. Типово, ці віруси спаковують ня реасортативних вірусів. РНК-залежну РНК-полімеразу для продукування Деякі вірусні гени у мінімальній системі на осмРНК після інфікування клітини-хазяїна. Сімейства нові плазмід за винаходом можуть походити з ві"мінус"-ланцюгових РНК-вірусів включають, без русного штаму, добре адаптованого для вирощуобмеження, Orthomyxo viridae, Arenaviridae та вання у клітинній культурі, такого як штами Bunyaviridae Краще, якщо вірусний геном походить PR/8/34 (H1N1) чи WSN/33 (H1N1), або з атенуйоз вірусу, який є членом вірусного сімейства ваного вірусу, такого як A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) 27 84254 28 чи, для грипу В/Аnn Axbor/1/66. Краще, якщо атетіла до молекули шляхом кон'югації антигенної нуйований штам також є добре адаптованим для ділянки з поліпептидом-носієм для імунізації. Мовирощування у клітинній культурі. Зокрема, для лекула, яка є антигенною, не повинна бути сама грипу А, кращі сегменти вірусного гена у системі по собі імуногенною, тобто, здатною викликати на основі плазміди кодують вірусні протеїни поліімунну реакцію без носія. меразного комплексу, М-протеїни та/або NSТермін "патогенний вірусний штам" використопротеїни зі штаму, добре адаптованого для вировується тут для посилання на будь-який вірусний щування у клітинній культурі, або з атенуйованого штам, здатний спричинювати хворобу; краще, віштаму, чи з обох. Ці протеїни у цьому документі рус внесений у поточний перелік ймовірно циркуназиваються "вірусними внутрішніми протеїнами" люючих вірусів Всесвітньої організації охорони або вірусними "не-глікопротеїнами". здоров'я (WHO), Центрів з боротьби та профілакГеном вірусу грипу А типово кодує 10 різних тики хвороб (CDC) або іншої державної установи протеїнів: РВ2, який вважається транскриптазою, охорони здоров'я. Такі віруси можуть включати РВ1, який вважається транскриптазою, PA, який членів сімейства вірусу гепатиту, сімейства реовівважається транскриптазою, НА, який вважається русів, сімейства ортоміксовірусів, сімейства парагемаглютиніном, NP, який вважається РНКміксовірусів, сімейства filoviridae, сімейства зв'язуючим нуклеопротеїном, NA, який вважається bornaviridae, сімейства bunyaviridae, сімейства нейрамінідазою, М1/М2, які вважаються матричarenaviridae, сімейства coronaviridae, сімейства ним протеїном та інтегральним мембранним прополіовірусів чи сімейства рабдовірусів. Винахід теїном, відповідно, та NS1/NS2, які вважаються краще передбачає для вставлення у систему на неструктурними протеїнами, що можуть впливати основі плазміди гени первинних антигенів з таких на РНК-процесинг та транспорт. Вважається, що штамів, у яких решта вірусних генів мають бажані РВ1, РВ2, NP та PA є частиною транскрипційного характеристики культивування та/або атенуації, полімеразного комплексу вірусу грипу. тим самим забезпечуючи продукування значної Термін "клітинна культура", що використовукількості вірусу з належними антигенними харакється в даному описі, краще стосується комерційтеристиками для продукування вакцини. Наприно прийнятного способу розмноження вірусу для клад, гени параміксовірусу, вірусу парагрипу люпродукування вакцини, наприклад, курячі яйця з дини 3 (нуклеокапсидний ген, ген фосфопротеїну, ембріонами, а також клітинної культури in vitro у матричний ген, ген злиття, ген протеїну гемаглюклітині-хазяїні [див. Furminger, У книзі: Nicholson, тиніну-нейрамінідази та великий ген) можуть бути Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, зручно поміщені у плазміди за винаходом для Chapter 24, pp.324-332, особливо, pp.328-329]. продукування віріонів вірусу парагрипу 3. Аналогічно, система на основі плазміди вклюТаким чином, кращий "реасортативний" вірус чає генні сегменти антигенів, потрібних для продуза винаходом є вірусом, у якому генні сегменти, кування захисної імунної реакції. "Захисна імунна що кодують антигенні протеїни з патогенного штареакція" включає гуморальний (антитіла) чи кліму вірусу, поєднані з генними сегментами, що котинний компоненти, чи обидва, що е фективно дують вірусний полімеразний комплекс чи інші знищують вірюни та інфіковані клітини у імунізовааналогічні гени (наприклад, неглікопротеїнові гени, ної (вакцинованої) особи. Таким чином, захисна включаючи M-гени та NS-гени) з вірусів адаптоваімунна реакція може запобігти чи усун ути інфекцію них для вирощування у культурі (або атенуйоваРНК-вірусу, наприклад, вірусу грипу. Краще, антиних вірусів). Таким чином, реасортативний вірус гени є "поверхневими антигенами", тобто, експренесе бажані антигенні характеристики у фенотипі, суються на поверхні віріону або поверхні інфіковащо дозволяє ефективне продукування у клітиніних клітин. Ще краще, поверхневі антигени є хазяїні, як описано вище. Такий реасортативний глікопротеїнами. Для грипу, первинними глікопровірус є бажаним "вірусним насінням" для продукутеїновими антигенами є гемаглютинін (НА чи H) та вання віріонів для виготовлення вакцини [див. нейрамінідаза (NA чи N). Funninger, supra]. У тому значенні, що використовується тут, теТермін "клітина-хазяїн" позначає будь-яку клірмін "імуногенний" значить, що поліпептид є здаттину будь-якого організму, яку відбирають, модиним викликати гуморальну чи клітинну імунну реафікують, трансформують, вирощують чи викорискцію, краще, обидві. Імуногенний продукт є також товують або обробляють у будь-який спосіб для антигенним. Імуногенна композиція є композицією, продукування клітиною рекомбінантних РНКяка викликає гуморальну чи клітинну імунну реаквіріонів, краще, "мінус'Чпанцюгових сегментованих цію або обидві разом при введенні тварині. МолеРНК-віріонів. Приклади клітин-хазяїнів включають, кула є антигенною, якщо вона здатна специфічно без обмеження, клітини Медін-Дербі собачої нирки взаємодіяти з антиген-розпізнавальною молеку(MDCK), клітини VERO, клітини CV1, клітини COSлою імунної системи, такою як імуноглобулін (ан1 та COS-7 і клітини ВНК-1, які наведено як необтитіло) або рецептор антигену Т-клітини. Антигенмежувальні приклади. В конкретному варіанті втіний поліпептид містить епітоп, що складається лення кращим для продукування віріонів є транзищонайменше з приблизно п'яти, краще, щонайметорне співкультивування. Співкультивування нше з приблизно 10 амінокислот. Антигенна діляндозволяє ефективно здійснити трансфекцію рецика поліпептиду, яка тут також називається епітоптивної клітини, такої як клітина 293Т, з наступним пом, може бути такою ділянкою, що є інфікуванням пермісивної клітини для вирощуванімунодомінантною для розпізнавання антитілом чи ня вірусів, такої як клітина MDCK. рецептором Т-клітини, або вона може бути ділянТермін "віріони РНК-вірусу" стосується вірускою, що використовується для генерування антиних частинок, які одразу ж після продукування є 29 84254 30 повністю інфекційними, з клітин-хазяїнів, трансфінками чи їх частинами) або до інших генів, розтакованих чи котрансфікованих системою на основі шованих ви ще чи нижче від гена, що міститься у плазмід за винаходом. Така система продукує ізольованій молекулі нуклеїнової кислоти, коли вРНК та вірусні протеїни (шляхом трансляції вірувона знаходиться у хромосомі. За ще іншим варіасної мРНК), приводячи до збирання інфекційних нтом втілення, у ізольованій нуклеїновій кислоті вірусних частинок (віріонів). відсутній один чи кілька інтронів. Ізольовані молеУ тому значенні, що використовується тут, кули нуклеїнової кислоти включають послідовнос"РНК-вірусоспецифічна вакцина" позначає компоті, які вставляють до плазмід, космід, штучних зицію, яка може викликати захисний імунітет до хромосом і т.п., наприклад, коли вони утворюють РНК-вірусу при введенні суб'єкту. Термін "вакцина" частину химерного конструкту рекомбінантної нукстосується композиції, що містить вірус, інактиволеїнової кислоти. Так, у конкретному варіанті втіваний вірус, атенуйований вірус, розщеплений лення, рекомбінантна нуклеїнова кислота є ізовірус або вірусний протеїн, наприклад, поверхнельованою нуклеїновою кислотою Ізольований вий антиген, який може бути використаний для протеїн може бути асоційований з іншими протеївикликання захисного імунітету у реципієнта [див. нами чи нуклеїновими кислотами чи з обома зразу, Furminger, supra]. Слід відзначити, що для того, з якими він асоціює у клітині, або з клітинними щоб бути ефективною, вакцина за винаходом момембранами, якщо він є мембранно-асоційованим же викликати імунітет у частини населення, оскільпротеїном. Ізольована органела, клітина чи тканики деякі особи можуть виявитися нездатними вина видаляється з анатомічного положення, у якому робити стійку чи захисну імунн у реакцію або, у вона знаходиться в організмі. Ізольований матерідеяких випадках, жодної імунної реакції. Ця нездаал може бути очищений, але це необов'язково. тність може бути спричинена генетичними особлиТермін "очищений" у тому значенні, що виковостями особи або станом імунодефіциту (набутористовується тут, стосується матеріалу, який був го чи вродженого) чи імунопригнічення (наприклад, ізольований за умов, що зменшують чи усувають лікування імунодепресивними лікарськими засоприсутність неспоріднених матеріалів, наприклад, бами для запобігання відторгнення органу чи для домішок, включаючи нативні матеріали, з яких був пригнічення аутоімунного стану) Ефективність моодержаний даний матеріал. Наприклад, краще, же бути визначена на тваринних моделях. щоб очищений віріон по суті не містив клітин"Захисна доза" вакцини позначає її кількість, хазяїв чи компонентів культури, включаючи ткасамої чи у поєднанні з ад'ювантом, яка ефективно нинну культуру чи протеїни яйця, неспецифічні викликає захисну імунну реакцію у особипатогени тощо. У тому значенні, що використовуреципієнта. Захист може також залежати від шляється тут, термін "по суті чистий" використовується ху введення, наприклад, внутрішньом'язового функціонально, у контексті аналітичних випробу(який є кращим для інактивованої вакцини) чи інвань матеріалу. Краще, якщо очищений матеріал, траназального (який є кращим для атенуйованої що по суті на містить забруднень, є чистим щовакцини). найменше на 50%; ще краще, чистим щонайменТермін "суб'єкт" використовується тут для поше на 90%, і найкраще, чистим щонайменше на силання на тварину, яка підтримує РНК-вірусну 99%. Ступінь чистоти можна оцінити за допомогою інфекцію, включаючи, без обмеження, водоплавну хроматографії, гель-електрофорезу, імуноаналізу, птицю, курей, свиней та людей. Зокрема, термін аналізу складу, біологічного аналізу та інших спостосується людини. собів, відомих фа хівцям. "Ад'ювант" позначає молекулу чи композицію, Способи очищення добре відомі фахівцям. Віяка потенціює імунну реакцію на імуноген. Ад'юрусні частинки можуть бути очищені шляхом ультвант є "прийнятним для використання людиною", рафільтрації чи ультрацентрифугування, краще якщо він є фармацевтично прийнятним, як визнабезперервним центрифугуванням [див. Furminger, чено нижче. Приклади ад'ювантів наведені нижче. supra]. Можливе використання інших способів У тому значенні, що використовується тут, теочищення, що передбачені цим документом. Очирмін "ізольований" означає, що матеріал, про який щений матеріал може містити менш ніж приблизно йде мова, є видаленим з його нативного середо50%, краще менш ніж приблизно 75%, найкраще, вища, наприклад, клітини. Таким чином, ізольоваменш ніж приблизно 90% клітинних компонентів, ний біологічний матеріал може бути звільнений від середовища, протеїнів чи інших небажаних комподеяких чи усі х клітинних компонентів, тобто, комнентів чи домішок (в залежності від контексту), з понентів клітин, у яких нативний матеріал знахоякими він був спочатку асоційований. Термін "по диться у природних умовах (наприклад, цитоплазсуті чистий" вказує на найвищий ступінь чистоти, матичний чи мембранний компонент). Ма теріал що може бути досягнутий з використанням звивважається ізольованим, якщо він знаходиться у чайних методик очищення, відомих фа хівцям. формі клітинного екстракту чи надосадової рідини. В конкретному варіанті втілення терміни "блиУ випадку молекул нуклеїнової кислоти, ізольовазько" чи "приблизно" означають відхилення знана нуклеїнова кислота включає продукт PCR, ізочення в межах 20%, краще в межах 10%, і найльовану мРНК, кДНК або рестрикційний фрагмент. краще в межах 5% від вказаної величини чи За іншим варіантом втілення, ізольована нуклеїінтервалу. За іншим варіантом, при використанні у нова кислота є краще вирізаною з хромосоми, у біології логарифмічних показників, термін "близьякій вона може знаходитися, і ще краще, більше не ко" може означати відхилення в межах порядку з'єднана чи не знаходиться у проксимальному повеличини від вказаного значення, краще, в межах ложенні до некодуючих ділянок (але може бути половини порядку величини значення з'єднана зі своїми нативними регуляторними діляГенетична інженерія систем на основі плазмід 31 84254 32 Згідно з даним винаходом можуть бути виковані багатьма способами, відомими фахівцям. Неристані звичайні методики молекулярної біології, обмежувальні приклади таких модифікацій вклюмікробіології та рекомбінантної ДНК, доступні фачають метилювання, "кепи", такі як 5'-7-метилхівцям. Такі методики повністю описані у літератуС(5')ррр(5')N-кепи, заміщення одного чи кількох з рі. [Див., наприклад, Sambrook, Fritsch & Maniatis, природних нуклеотидів на аналоги та інтернуклеоMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Second тидні модифікації. Полінуклеотиди можуть містити Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, один чи кілька додаткових ковалентно-зв'язаних Cold Spring Harbor, New York (тут та надалі фрагментів, таких як, наприклад, протеїни (напри"Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical клад, нуклеази, токсини, антитіла, сигнальні пепApproach, Volumes I and Il (D.N. Glover ed., 1985); тиди, полі-L-лізин і т.д.), інтеркалятори (наприклад, Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); акридин, псорален і т.д.), комплексони (наприклад, Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. метали, радіоактивні метали, ферум, окисні метаHiggins eds., (1985)]; Transcription And Translation ли тощо) та алкілатори. Полінуклеотиди можуть [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., (1984)]; Animal бути дериватизовані шляхом утворення метил- чи Cell Culture [R.X. Freshney ed., (1986)]; Immobilized етилфосфотриефірного або алкілфосфорамідатCells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A ного зв'язку. Крім того, полінуклеотиди тут можуть Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. бути також модифіковані за допомогою мітки, здаAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular тної забезпечувати вимірюваний сигнал, безпосеBiology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)]. редньо чи опосередковано. Приклади міток вклюЦі звичайні методики стосуються приготування чають радіоізотопи, флуоресцентні молекули, систем pol l-pol Il плазмід, ізоляції клонів кДНК себіотин і т.п. гментів вірусного гена, інсерції таких ДНК у плаз"Кодуюча послідовність" чи послідовність, що міди ат трансфекції клітин плазмідою чи системою "кодує" продукт експресії, така як поліпептид, є на основі плазмід за винаходом. Зокрема, звичайні нуклеотидною послідовністю, що в результаті ексметодики сайт-спрямованого мутагенезу чи генної пресії приводить до продукування цього поліпепмодифікації дозволяють модифікацію РНКтиду, тобто нуклеотидна послідовність кодує амівірусних, краще "мінус'Чпанцюгових сегментованокислотну послідовність цього поліпептиду. них РНК-вірусних генів для одержання атенуйоваКодуюча послідовність протеїну може включати ного вірусу, як описано нижче; або вірусних протестартовий кодон (звичайно ATG) та стоп-кодон. їнів, що включають нові епітопи, наприклад, у Термін "ген", який також називається "структунейрамінідазній стеблинці; або для створення дерним геном", позначає ДНК-послідовність, яка кофектних вір усів. дує чи відповідає певній послідовності амінокис"Ампліфікація" ДНК в тому значенні, що виколот, яка включає цілком чи частково один чи кілька ристовується тут, позначає використання полімеполіпептидів, і може включати чи не включати реразної ланцюгової реакції (PCR) для збільшення гуляторні ДНК-послідовності, такі як промоторні кількості окремої ДНК-послідовності у суміші ДНКпослідовності, що визначають, наприклад, умови, послідовностей. [Опис PCR див. у Saiki et al., за якими відбувається експресія гена. Science, 1988,239:487]. Крім того, даний винахід дозволяє викорис"Молекула нуклеїнової кислоти" стосується тання різних мутантів, послідовністьфосфое фірної полімерної форми рибонуклеозидів консервативних варіантів та функціонально консе(аденозину, гуанозину, уридину чи цитидину, "РНКрвативних варіантів сегментів РНК вірусного гена, молекули") або дезоксирибонуклеозидів (дезоксикраще, "мінус"-ланцюгових сегментів РНК вірусноаденозину, дезоксигуанозину, дезокситимідину чи го гена, за умови, що всі такі варіанти зберігають дезоксицитидину; "ДНК-молекули") або будь-яких потрібну імунозахисну дію. Дійсно, винахід зручно їх фосфое фірних аналогів, таких як фосфоротіоадозволяє використовувати мутагенез для розробки ти та тіоефіри, чи у одноланцюговій формі, чи у атенуйованих вірусни х штамів у систематичний вигляді дволанцюгової спіралі. "Молекула рекомспосіб. бінантної ДНК" є молекулою ДНК, яку було піддано Термін "мутант" та "мутація" позначають будьмолекулярно-біологічним маніпуляціям. які виявлювані зміни у генетичному матеріалі, на"Полінуклеотид" чи "нуклеотидна послідовприклад, ДНК, або будь-який процес, механізм чи ність" є рядом нуклеотидних основ (які також нарезультат такої зміни. Це включає генні мутації, у зиваються "нуклеотидами") у ДНК та РНК, і познаяких змінюється структура (наприклад, ДНКчає будь-який ланцюг з двох чи більше послідовність) гена, будь-який ген чи ДНК, що нуклеотидів. Нуклеотидна послідовність типово утворюються в результаті будь-якого процесу мунесе генетичну інформацію, включаючи інформатації, та будь-який продукт експресії (наприклад, цію, що використовується клітинними механізмами протеїн), що експресується модифікованим геном для виробництва протеїнів. чи ДНК-послідовністю. Термін "варіант" також моПолінуклеотиди тут можуть граничити з боків з же бути використаний для позначення модифікогетерологічними послідовностями, включаючи ваного чи зміненого гена, ДНК-послідовності, фепромотори, внутрішні сайти входження рибосом рменту, клітини, тобто, будь-якого виду мутантів. [IRES; Ghattas, et аI., МоI. Cell. Biol., 11:5848-5859, Мутації можуть бути здійснені за методом випад1991] та інші послідовності рибосома-зв'язуючих кового мутагенезу або сайт-спрямованим мутагесайтів, енхансери, елементи відповіді, супресори, незом, включаючи модифікацію послідовності на сигнальні послідовності, послідовності поліаденіоснові методу PCR. Як було вказано вище і як облювання, інтрони, 5'- та 3'-некодуючі ділянки і т п. говорюється детально далі, мутагенез одного чи Нуклеїнові кислоти можуть бути також модифікокількох індивідуальних генних сегментів РНК 33 84254 34 вірусу (наприклад, "мінус"-ланцюгового сегменто(наприклад, легкий ланцюг міозину і т.д.) [Reeck, et ваного РНК-вірусу) дозволяє здійснювати розробку al., Cell, 50:667, 1987]. Такі протеїни (та гени, що їх атенуйованих вірусів, а також визначати механізм кодують) мають гомологію послідовностей, яка атенуації. Крім того, система на основі плазмід за визначається через подібність їх послідовностей, винаходом долає недоліки попередніх спроб розчи у формі показників процентної подібності, чи у робки атенуйованих вірусів шля хом мутагенезу, присутності специфічних залишків чи мотивів. такі як обмеження системи ефективної селекції Відповідно, термін "подібність послідовностей" [див. Bilsel and Kawaoka, У книзі: Nicholson, в усіх його граматичних формах стосується ступеWebster and May (eds.), Textbook of Influenza, ня ідентичності чи відповідності між послідовносChapter 32, pp.422-434, особливо, pp.423-425]. тями нуклеїнових кислот чи амінокислот протеїнів, "Послідовність-консервативними варіантами" які можуть мати чи не мати спільне еволюційне полінуклеотидної послідовності є такі, у яких зміна походження [див. Reeck, et aI., supra]. Однак, у одного чи кількох нуклеотидів у визначеній позиції загальному користуванні та в даній заявці термін кодону не спричинює альтерації амінокислоти, що "гомологічний", якщо він модифікований прислівкодується у цій позиції. Алельні варіанти можуть ником, таким як "високо", може стосуватися подіббути послідовність-консервативними варіантами. ності послідовностей і може бути зв'язаним чи не "Функція-консервативними варіантами" є такі, зв'язаним із спільним еволюційним походженням. у яких певний амінокислотний залишок у протеїні В конкретному варіанті втілення, дві ДНКчи ферменті був заміщений без зміни загальної послідовності є "по суті гомологічними" чи "по суті конформації та функції поліпептиду, включаючи, подібними", якщо на протязі визначеної довжини без обмеження, заміщення амінокислоти на таку, ДНК-послідовності збігається достатня кількість що має аналогічні властивості (такі як, наприклад, нуклеотидів для того, щоб відрізнити ці послідовполярність, потенціал водневих зв'язків, кислотності від інших, при визначенні за допомогою алність, основність, гідрофобність, ароматичність і горитмів порівняння послідовностей, таких як т.п.). Деякі алельні варіації приводять до одержанBLAST, FASTA, DN A Strider та інши х, у яких параня функціонально-консервативних варіантів, так метри обираються таким чином, щоб одержати що заміщення амінокислоти не має різкого впливу найбільший збіг між досліджуваними послідовносна функцію протеїну. Аналогічно, гомологічні протями по всій довжині еталонної послідовності. Потеїни можуть бути функціональнослідовності, які є по суті гомологічними, можуть консервативними варіантами. Амінокислоти з анабути іденти фіковані шляхом порівняння послідовлогічними властивостями добре відомі фахівцям. ностей з використанням стандартного програмного Наприклад, аргінін, гістидин та лізин є гідрофільнозабезпечення, що використовується в банках даосновними амінокислотами і можуть бути взаємоних послідовностей, або шляхом проведення ексзамінними. Аналогічно, ізолейцин, що є гідрофобперименту методом Саузерн-гібридизації, наприною амінокислотою, може бути заміщений на лейклад, за суворих умов, визначених для цієї цин, метіонін чи валін. Очікується, що такі зміни не конкретної системи. Такі суворі умови є відомими будуть впливати чи матимуть незначний вплив на для фахівців в цій області і можуть бути знайдені у уявн у молекулярну вагу чи ізоелектричну точку [книзі Current Protocols in Molecular Biology, John протеїну чи поліпептиду. Амінокислоти, крім тих, Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]. Необмежущо вказані як консервативні, можуть відрізнятися у вальним прикладом суворих умов гібридизації є протеїні чи ферменті, так що процент подібності гібридизація у 6´ хлориді натрію/цитраті натрію протеїну чи амінокислотної послідовності між (SSC) при приблизно 45°C з подальшим одним чи будь-якими двома протеїнами з аналогічною функількома промиваннями у 0,2´SSC, 0,1% ДСН при кцією може змінюватись і становити, наприклад, 50°С, краще при 55°С, і ще краще при 60°С або від 70% до 99% при визначенні за методикою су65°С. міщення, такою як кластерний метод (Cluster Аналогічно, в конкретному варіанті втілення, Method), у якій подібність визначається на основі дві амінокислотні послідовності є "по суті гомологіалгоритму MEGALIGN. "Функція-консервативний чними" чи "по суті подібними", якщо на протязі варіант" також включає поліпептид чи фермент, певної довжини достатня кількість амінокислот є який має амінокислотну ідентичність щонайменше ідентичною чи подібною (функціонально ідентич60% при визначенні за алгоритмами BLAST чи ною) для того, щоб диференціювати ці послідовFASTA, у яких параметри обираються таким чиності від інших послідовностей. Краще, якщо подіном, щоб одержати найбільший збіг досліджуваних бні чи гомологічні послідовності ідентифікують послідовностей по всій довжині еталонної послішляхом порівняльного аналізу первинної структудовності, краще щонайменше 75%, ще краще щори з використанням, наприклад, програми накланайменше 85%, і найкраще щонайменше 90%, і дання GCG (Genetics Computer Group, Program який має такі самі або по суті аналогічні властивоManual for the GCG Package, Version 7, Madison, сті чи функції, як і нативний чи батьківський протеWisconsin) або будь-якої іншої з описаних вище їн чи фермент, з яким він порівнюється. програм (BLAST, FASTA і т.д.). Наведені далі поВ тому значенні, що використовується тут, тесилання, що стосуються алгоритму BLAST, вклюрмін "гомологічний" в усі х його граматичних форчені сюди за посиланням: [АЛГОРИТМИ BL AST: мах та варіантах написання стосується співвідноAltschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & шення між протеїнами, що мають "спільне Lipman, D.J., J. МоI. Biol., 215:403-410, 1990; Gish, еволюційне походження", включаючи протеїни з W. & States, D.J., Nature Genet., 3:266-272, 1993; суперсімейств (наприклад, суперсімейство імуноMadden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J., Meth глобулінів) та гомологічні протеїни від різних видів Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul, S.F., 35 84254 36 Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., довгому термінальному повторі вірусу саркоми Miller, W. & Lipman, D.J., Nucleic Acids Res., Рауса [Yamamoto, et al., Cell, 22:787-797, 1980]; 25:3389-3402, 1997; Zhang, J. & Madden, T.L., промотор тимідинкінази герпесу [Wagner, et al., Genome Res., 7:649-656, 1997; Wootton, J.C. & Proc. NatL Acad. Sci. U.S.A., 78:1441-1445, 1981]; Federhen, S., Comput. Chem., 17:149-163, 1993; регуляторні послідовності гена металотіонеїну Hancock, J.M. & Armstrong, J.S., Comput. Appl. [Brinster, et al., Nature, 296:39-42, 1982]; промотори Biosci., 10:67-70, 1994; СИСТЕМИ КІЛЬКІСНИХ Т7 РНК-полімерази; промотори Т3 РНКПОКАЗНИКІВ ПОРІВНЯННЯ ПЕРВИННОЇ СТРУКполімерази; промотори SP6 РНК-полімерази та ТУРИ: Dayhoff, М.О., Schwartz, R.M. & Orcutt, B.C. інші промотори, що будуть ефективними в потріб(1978) "A model of evolutionary change in proteins." ній клітині-хазяїні. Промотори pol І для експресії In "Atlas of Protein Sequence and Structure", vol.5, некепованої РНК є поширеними в усіх еукаріотах і suppl.3., M.O.Dayhoff (ed.), pp.345-352, Natl. включають РНК полімеразу І людини [див. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, Molecular Cell Biology, Darnell et al. 1986, pp.311, R.M. & Dayhoff, M.O. (1978) "Matrices for detecting 365-6]. В даному винаході можуть бути також виdistant relationships." In "Atlas of Protein Sequence користані промотори РНК полімерази III. and Structure", vol.5, suppl.3., M.O.Dayhoff (ed.), Кодуюча послідовність знаходиться "під керуpp.353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, ванням", "функціонально асоційована з" або "опеDC; Altschul, S.F., J. MoI. Biol., 219:555-565, 1991; ративно асоційована з" транскрипційними та States, DJ., Gish, W., Altschul, S.F., Methods, 3:66трансляційними контрольними послідовностями 70, 1991; Henikoff, S. & Henikoff, J.G., Proc. Natl. (наприклад, промотором pol І чи pol II) у клітині, Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992; Altschul, якщо РНК-полімераза транскрибує кодуючу посліS.F., J. MoI. Evol., 36:290-300, 1993; СТАТИСТИКА довність у РНК, наприклад, мРНКчи вРНК. АН АЛІТИЧНОГО ПОРІВНЯЙ ПЕРВИННОЇ СТРУКТермін "експресувати" та "експресія" позначаТУРИ: Karlin, S. & Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. ють створення можливості для чи спричинення Sci. USA, 87:2264-2268, 1990; Karlin, S. & Altschul, виявлення інформації у гені чи ДНК-послідовності, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, наприклад, продукування РНК (включаючи кРНК, 1993; Dembo, A., Karlin, S. & Zeitouni, O., Ann. вРНК та вірусн у мРНК) або протеїну шляхом актиProb., 22:2022-2039, 1994 та Altschul, S.F. (1997) вації клітинних функцій, потрібних для транскрипції "Evaluating the statistical significance of multiple та трансляції відповідного гена чи ДНКdistinct local alignments." In "Theoretical and послідовності. ДНК-послідовність експресується у Computational Methods in Genome Research" (S. клітині чи клітиною з утворенням "продукту ексSuhai, ed.), pp.1-14, Plenum, New York]. пресії", такого як протеїн. Можна сказати також, "Промоторна послідовність" є регуляторною що власне продукт експресії, наприклад, утворюділянкою ДНК, здатною зв'язувати РНК-полімеразу ваний протеїн, "експресується" клітиною. у клітини та ініціювати транскрипцію послідовності. Термін "трансфекція" означає введення чужоВ цілях визначення за даним винаходом, промоторідної нуклеїнової кислоти до клітини таким чином, рна послідовність, що розташована вище кДНК, щоб клітина-хазяїн експресувала введений ген чи зв'язана з її 3'-кінця із сайтом ініціації транскрипції і послідовність для продукування бажаного поліпепростягнута уверх (в напрямку до 5'-кінця), вклюптиду, закодованого введеним геном чи послідовчаючи мінімальну кількість основ чи елементів, ністю. Введений ген чи послідовність можуть бути потрібну для ініціації транскрипції на рівні, визнатакож названі "клонованим" чи "чужорідним" геном чуваному вище фонового. Промоторна послідовчи послідовністю, можуть включати регуляторні чи ність, що розташована нижче кДНК (для експресуконтрольні послідовності, такі як стартові, столові, вання (-)-РНК) є зв'язаною з її 5'-кінця із сайтом промоторні, сигнальні, секретуючі чи інші послідоініціації транскрипції і простягнута униз (в напрямвності, що використовуються генними механізмаку до 3'-кінця), включаючи мінімальну кількість ми клітини. Ген чи послідовність можуть включати основ чи елементів, потрібну для ініціації транснефункціональні послідовності чи послідовності з крипції на рівні, визначуваному вище фонового. невідомими функціями. Клітина-хазяїн, яка одерДвоспрямована система за винаходом включає як жала і експресує введену ДНК чи РНК, була верхні, так і нижні промотори, односпрямована "трансфікована" і є "трансформантом" чи "клоном". система включає лише верхні промотори. У межах ДНК чи РНК, введені до клітини-хазяїна, можуть промоторної послідовності знаходиться сайт ініціпоходити з будь-якого джерела, включаючи клітиації транскрипції (який зручно визначити шляхом ни від такого саме роду чи виду як клітина-хазяїн картування за допомогою нуклеази S1), а також або клітини від інших родів чи видів. протеїн-зв'язуючі домени (консенсусні послідовноТерміни "вектор", "клонуючий вектор" та "екссті), що відповідають за зв'язування РНКпресійний вектор" позначають носій, за допомогою полімерази. якого ДНК чи РНК-послідовність (наприклад, чужоВ даному винаході може бути використаний рідний ген) може бути введена до клітини-хазяїна будь-який відомий промотор за умови збереження з метою трансформування хазяїна та промотуваністотних елементів винаходу. Наприклад, промоня експресії (наприклад, транскрипції та транслятори pol II, що можуть бути використані для керуції) введеної послідовності. Кращими векторами за вання експресією гена, включають, без обмеженвинаходом є плазміди. ня, промотор цитомегаловірусу (C MV) [патенти Вектори типово включають ДНК агента, що США №№ 5385839 та 5168062], ділянку раннього переноситься, до якого вставлена чужорідна ДНК. промотора SV40 [Benoist and Chambon, Nature, Звичайний шлях вставлення одного сегмента ДНК 290:304-310, 1981]; промотор, що знаходиться в 3'до іншого сегмента ДНК включає використання 37 84254 38 ферментів, що називаються рестрикційними ферВакцини ментами, які розщеплюють ДНК у специфічних Як було відзначено вище, даний винахід просайтах (специфічні групи нуклеотидів), що називапонує ефективну та економічну стратегію продукуються рестрикційними сайтами. "Касета" стосуєтьвання вакцин для лікування чи профілактики РНКся кодуючої послідовності ДНК чи сегмента ДНК, вірусних інфекцій, краще "мінус"-ланцюгових РНКщо кодує продукт експресії, який може бути вставвірусних ін фекцій. Мінімальна система на основі лений до вектора у визначених рестрикційних сайплазмід за винаходом усуває необхідність селекції тах. Рестрикційні сайти касети сконструйовані у і забезпечує щільний контроль реасортментних такий спосіб, щоб забезпечити вставку касети до вірусів. Для продукування інактивованої вакцини належної рамки зчитування. Загалом, чужорідна грипу шість плазмід, що містять неглікопротеїнові ДНК вставляється до одного чи кількох рестриксегменти (наприклад, РВ1, РВ2, PA, NP, M та NS) ційних сайтів векторної ДНК, а потім переноситься зі штаму, який дає високий вихід (наприклад, вектором до клітини-хазяїна разом з векторною PR/8/34 (H1N1)) можуть бути котрансфековані з ДНК. Сегмент чи послідовність ДНК, який має двома експресійними плазмідами, що містять НА вставлену чи додану ДНК, таку як експресійний та NA кДНК рекомендованого субтипу вакцини. вектор, може також називатися "ДНК-конструктом". Оскільки вірус-помічник є непотрібним, вірус, що Звичайним типом вектора є "плазміда", яка загагенерується, є вірусом грипу з бажаним сузір'ям лом є самостійною молекулою дволанцюгової генів. Аналогічний підхід може бути використаний ДНК, звичайно бактеріального походження, що для продукування будь-якого різновиду інактивоможе легко приймати додаткову (чужорідну) ДНК і ваного реасортативного РНК-вірусу для викорисможе бути легко введена до придатної клітинитання у вакцині. Експресійні плазміди, що містять хазяїна. Плазмідний вектор часто містить кодуючу сегменти вірусного гена для цільового вірусу (наДНК та промоторну ДНК і має один чи кілька рестприклад, неглікопротеїнові сегменти) можуть бути рикційних сайтів, придатних для вставлення чужокотрансфековані з іншими експресійними плазмірідної ДНК. Кодуюча ДНК є ДНК-послідовністю, що дами, які кодують протеїни, що відповідають викодує певну амінокислотну послідовність для певзначеному інфекційному вірусному субтипу (наного протеїну чи ферменту. Промоторна ДНК є приклад, вірусному субтипу, який зараз циркулює у ДНК-послідовністю, яка ініціює, регулює чи іншим популяції). Вірус, продукований у відповідності з способом медіює чи контролює експресію кодуювинаходом, може бути використаний у традиційчої ДНК. Промоторна ДНК та кодуюча ДНК можуть ному чи новому підході до вакцинації [див. Bilsel походити з одного гена чи з різних генів і можуть and Kawaoka, У книзі: Nicholson, Webster and May бути з одного чи з різних організмів. Рекомбінантні (eds.); Textbook of Influenza, Chapter 32, pp.422клонуючі вектори часто включатимуть одну чи кі434], особливо, для розробки живих атенуйованих лька систем реплікації для клонування чи експревакцин (обговорюється детальніше нижче). Зокресії, один чи кілька маркерів для селекції у хазяїні, ма, даний винахід долає недоліки сучасної технонаприклад, стійкості до антибіотика, та одну чи логії стосовно розробки реасортативних вірусів з кілька експресійних касет. обмеженим спектром хазяїнів чи непередбачуваТермін "система експресії" позначає клітинуною атенуацією (id.). хазяїна та сумісну за певних умов, наприклад, для Багато зусиль було вкладено у розробку вакекспресії протеїну, кодовану чужорідну ДНК, яка цин грипу [див. Wood and Williams, In: Nicholson, переноситься вектором і введена до клітиниWebstern and May (eds.), Textbook of Influenza, хазяїна. Chapter 23, pp.317-323]. Хоч значна частина цього Термін "гетерологічний" стосується комбінації розділу стосується вакцин грипу, даний винахід елементів, яка не зустрічається у природі. Наприохоплює всі РНК-вірусні вакцини, краще, "мінус"клад, гетерологічна ДНК стосується ДНК, яка за ланцюгові сегментовані РНК-вірусні вакцини, осозвичайних умов відсутня у клітині або в хромособливо, вакцини Orihomyxo viridae. мальному сайті клітини. Краще, якщо гетерологічЗараз доступні три типи інактивованих вакцин на ДНК включає ген, який є чужорідним для клітигрипу: вакцини цільного вірусу, продукту розщепни. Гетерологічний елемент регулювання експресії лення і поверхневих антигенів [див. Wood, In: є таким елементом, який оперативно асоційований Nicholson, Webster and May (eds.), Te xtbook of з іншим геном, відмінним від того, з яким він є опеInfluenza, Chapter 25, pp.333-345]. Оскільки даний ративно асоційованим за природних умов. В конвинахід дозволяє здійснити швидку розробку батексті даного винаходу ген, який кодує поліпептид, жаного реасортативного вірусу з прийнятними хащо включає послідовність з бібліотеки послідовнорактеристиками росту у к ультурі, він зручно ствостей, є гетерологічним до векторної ДНК, у яку він рює для виробника вакцини можливість вставлений для клонування чи експресії, і гетерогенерувати достатню кількість вакцини для задологічним до клітини-хазяїна, що містить такий векволення потреб суспільної охорони здоров'я та тор, у якій він експресується. забезпечити стандартизацію, що є важливою виЯк було відзначено вище, винахід дозволяє могою, яку зараз часто послабляють внаслідок генерувати реасортативні віруси з використанням необхідності продукування клінічних кількостей гетерологічних вірусних генів. Крім введення генів вакцини, звичайно потягом періоду 8-9 місяців вірусних антигенів до генетичного матеріалу віру[Wood, supra, p.333]. сного штаму, адаптованого для доброго вирощуБезпечність вакцини також має велике знавання у культурі, винахід дозволяє здійснювати чення [див. Wiselka, In: Nicholson, Webster and May міжвидовий реасортмент, наприклад, антиген гри(eds.), Textbook of Influenza, Chapter 26, pp.346пу В у матеріалі грипу А. 357]. Оскільки вакцини за винаходом дозволяють 39 84254 40 здійснювати продукування у визначених системах вигляді протеїнів або шляхом експресії вектором, клітинних культур, вони не містять неспецифічних що кодує експресію цієї молекули. патогенів, бактерій та алергічних протеїнів, що Використання дендроподібних клітин як мішеможуть бути присутніми у комерційних вакцинах, ней. Вакцинація може бути здійснена шляхом виякі виготовляються у яйцях із зародками. користання дендритних клітин як мішеней З вакцинами (наприклад, вакцинами грипу) [Steinman, J. Lab. Clin. Med., 128:531, 1996; можуть бути використані ад'юванти [Wood and Steinman, Exp. Hematol., 24:859, 1996; Taite et al., Williams, supra]. Термін "ад'ювант" стосується споLeukemia, 13:653, 1999; Avigan, Blood Rev., 13:51, луки чи суміші, що посилює імунну відповідь на 1999; DiNicola et al., Cytokines Cell Mol. Then, антиген. Ад'ювант може виступати в ролі тканин4:265, 1998]. Дендроподібні клітини відіграють ного депо, яке повільно вивільняє антиген, а також ключову роль в активації Т-клітина-залежного імуяк активатор лімфоїдної системи, який неспецифінітету. Проліферуючі дендроподібні клітини мочно підсилює імунну відповідь [Hood, et al., жуть бути використані для захоплення протеїнів Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Ciimmings: антигенів в імуногенній формі in situ для подальMenlo Park, California, p.384]. Часто первинне прошої презентації цих антигенів у формі, що може вокаційне зараження самим лише антигеном, без розпізнаватися та стимулювати Т-клітини [див., ад'юванта, не викликає гуморальної чи клітинної наприклад, Steinman, Exper. Hematol., 24:859-862, імунної реакції. Ад'юванти включають, без обме1996; lnaba, etal., J. Exp. Med.,188:2163-73, 1998 та ження, повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'юпатент CШA №5851756]. Для стимулювання ex вант Фрейнда, сапонін, мінеральні гелі, такі як гідvi vo дендроподібні клітини поміщають до чашок роксид алюмінію, поверхнево-активні речовини, для культивування і експонують (в імпульсному такі як лізолецитин, багатоатомні спирти Pluronic, режимі) віріонами в достатній кількості та протягом поліаніони, пептиди, масляні чи вуглеводневі емудостатнього періоду часу для того, щоб вірусні льсії і потенційно корисні ад'юванти людини, такі антигени зв'язалися із дендроподібними клітинаяк BCG (bacille Calmette-Guerin) та Coiynebacterium ми. Клітини, що пройшли імпульсну обробку, моparvum. Прикладом кращого синтетичного ад'юважуть бути потім знову трансплантовані особі, що нта є QS-21. За іншим варіантом, або додатково проходить курс лікування, наприклад, шляхом внудо нього, як ад'юванти для підвищення імунної трішньовенної ін'єкції. Краще, якщо використовувідповіді на вакцину можуть бути використані імують аутологічні дендроподібні клітини, тобто денностимулювальні протеїни, як описано далі. Крадроподібні клітини, одержані від особи, що ще, якщо ад'ювант є фармацевтично прийнятним. проходить курс лікування, хоч може існувати можТермін "фармацевтично прийнятний" стосуливість використання ГКС-клас II-сумісних денється молекулярних фрагментів та композицій, які дроподібних клітин, які можуть бути одержані від є фізіологічно стерпними і типово не продукують сумісного за типом донора чи шляхом генної інжеалергічних чи аналогічних небажаних реакцій, танерії дендроподібних клітин, для експресії бажаких як шлункові розлади, запаморочення тощо при них ГКС-молекул (і, краще, пригнічення експресії введенні людині. Краще, якщо в тому значенні, що небажаних ГКС-молекул) використовується тут, термін "фармацевтично Краще, якщо дендроподібні клітини специфічприйнятний" позначає дозволений регулятивним но мітять in vivo для поглинання вірусів чи вірусних органом федерального уряду чи уряду штату, або субодиниць. Для мічення дендроподібних клітин in вказаний у Фармакопеї США чи іншій загальновиvi vo існують різні стратегії шля хом використання знаній фармакопеї для використання для тварин, рецепторів, які медіюють презентацію антигенів, зокрема, людей Термін "носій" стосується розрітаких як DEC-205 [Swiggard et al., Cell. Immunol., джувача, ад'юванта, ексципієнта чи розчинника, з 165:302-11, 1995; Steinman, Exp. Hematol., 24:859, яким сполука вводиться. Як носії, зокрема, для 1996] та Fc-рецептори розчинів для ін'єкцій, краще використовуються Інактивовані вакцини стерильна вода чи водний розчин, сольові розчини Інактивовані вірусні вакцини набули широкого та водні розчини декстрози і гліцерину. Придатні визнання у вакцинації проти РНК-вірусної інфекції фармацевтичні носії описані у [книзі "Remington's (наприклад, грипу) [див. Nichol, In: Nicholson, Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin]. Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Ефективність вакцинації може бути підвищена Chapter 27, pp.358-372]. Для приготування інактишляхом суп утного введення з вакциною, особливо вованого вірусу, трансфікований вірус вирощують з векторною вакциною, імуностимулювальної моу клітинній культурі чи в яйцях із зародком. Вірус лекули [Salgaller and Lodge, J. Surg. Oncol., 1998, може бути інактивований обробкою формальдегі68:122], такої як імуностимулювальний, імунопотедом, бета-пропіолактоном, ефіром, ефіром з повенціювальний чи прозапальний цитокін, лімфокін рхнево-активною речовиною (такою як Твін-80), або хемокін Наприклад, можуть бути використані цетилтриметиламоній бромідом (ЦТАБ) та Тритон цитокіни чи цитокінові гени, такі як інтерлейкін IL-1, N101, дезоксихолатом натрію та три(нIL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-I3, гранулоцит-макрофаг бутил)фосфатом [Furminger, supra; Wood and (ОМ)-колонієстимулюючий фактор (CSF) та інші Williams, supra]. Інактивація може відбутися після колонієстимулюючі фактори, запальний фактор чи до просвітління алантоїсної рідини (з вірусів, макрофагів, ліганд Flt3 [Lyman, Curr. Opin. продукованих у яйцях); віріони виділяють та очиHematol., 5:192,1998], а також деякі ключові кощають центрифугуванням [Furminger, supra, див. стимулюючі молекули чи їхні гени (наприклад, cтop.326]. Для оцінки дієвості вакцини може бути В7.1, В7.2). Доставка цих імуностимулюючих мопроведено тестування способом простої радіальлекул може здійснюватись системно чи місцево у ної імунодифузії (SRD) [Schild et al., Bull. World 41 84254 42 Health Organ., 1975, 52:43-50 та 223-31; Mostow et користання імунопотенціювального мембранного al., J. Clin. Microbiol., 1975, 2:531]. Доза, потрібна носія [WO 98/0558]. Ім уногенність імуногенів, що для викликання задовільної імунної відповіді, була вводяться орально, може бути посилена шляхом стандартизована і становить 15мкг НА/штам/дозу. використання червоних кров'яних клітин (rbc) чи Інактивована вакцина може бути введена внутрі"тіней" rbc [патент США №5643577], або шляхом шньом'язово шляхом ін'єкції. використання антигену катаральної лихоманки Живі атенуйовані вакцини грипу овець [патент США №5690938]. Були розроблені атенуйовані адаптовані хоПриклади лодом живі РНК-вірусні вакцини (вакцини грипу) Даний винахід буде зрозумілішим при поси[див. Keitel and Piedra, In: Nicholson, Webster and ланні на наступні приклади, що ілюструють винаMa y (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 28, хід, не обмежуючи його. pp.373-390; Ghendon, In: Nicholson, Webster and Приклад 1: "Амбісмисловий" підхід до генеруMa y (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 29, вання вірусу грипу А: синтез вРНК та мРНК з однієї pp.391-399]. Здатність генерувати вірус грипу цілматриці ком з восьми плазмід дозволяє регулювати атенуЯк перша стадія у зменшенні кількості плазмід, ацію вакцинного штаму і здійснювати розробку цей Приклад описує конструювання та трансфеквакцинного штаму, оптимально пристосованого до цію плазмід, що містять в одній плазміді промотобудь-якої цільової популяції [див. Bilsel and ри як pol І, так і pol II, і є свідченням того, що ця Kawaoka, supra]. Оскільки штами грипу A/Ann система дозволяє експресію вРНК та протеїну з Arbor/6/60 (H2N2) або грипу B/Ann Arbor/1/66 викооднієї матриці. Цей Приклад був опублікований ристовуються зараз для виготовлення живих ате[Hoffmann et al., Virology, 2000, 267:310]. нуйованих вакцин, то можна вставити кожну з шеМатеріали та методи сти кДНК внутрішніх генів (РВ2, РВ1, PA, NP, M, Клонування плазмід. Все клонування та PCRNS) грипу у плазміду, таку як pHW2000. Дві плазреакції здійснювали у відповідності до стандартміди, що містять глікопротеїни НА та NA відповідних протоколів. Стисло кажучи, експресійні плазного штаму грипу, будуть сконструйовані та котраміди для генів полімеразного комплексу A/WSN/33 нсфековані з шістьма базовими плазмідами, що були виготовлені з pcDNA3 (Invitrogen), що містить кодують неглікозильовані протеїни грипу. безпосередній ранній промотор цитомегаловірусу Очікується, що генетична модифікація кодуюлюдини (CMV) та полі(А) сайт гена, що кодує бичої чи некодуючої ділянки внутрішніх генів підвичачий гормон росту (BGH). Вірусні кДНК були вищує безпечність, інфекційність, імуногенність та готовлені з плазмід pWNP143, pWSNPA3, захисну ефективність вакцини, а також дозволяє pWSNPB2-14, pGW-PB1 з одержанням експресійрозробку атенуйованого вірусу. них конструктів pHW25-NP, pHW23-PA, pHW21Маніпулювання геном НА також може підвиPB2, pHW22-PB1. pHW12 було одержано шляхом щити безпечність штаму вакцини. Наприклад, вивставлення послідовностей промотора pol І та далення основних амінокислот, що знаходяться у термінатора людини між промотором pol Il та позв'язуючому пептиді Н5 чи Н7 глікопротеїнів висоліА-сайтом. Плазміду pHW52 було одержано з копатогенних вірусі в грипу А птиць може підвищиpHW12 спочатку шляхом вставлення олігонуклеоти безпечність вакцини. тидів, що містять некодуючу ділянку РВ1 з приєдМукозальная вакцинація. Стратегії мукозальнаними сайтами HindUl and XhoI, а потім вставної вакцинації є особливо ефективними для багалення до цих сайтів РВ1-кодуючої ділянки з тьох патогенних вірусів, оскільки інфікування часто pHW22-PB1. Плазміду pHW82-PB1 було одержано відбувається крізь слизову оболонку. Вона містить з pHW52-PB1 шляхом делеції послідовностей дендритоподібні клітини, які є важливими мішеняпромотора CMV. Кодуюча ділянка посиленого земи для EBNA-1 вакцин та імунотерапії. Таким чиленого флуоресцентного протеїну (EGFP) у репорном, передбачаються стратегії мукозальної вакцитерному конструкті pHW72-EGFP була одержана нації для інактивованих та атенуйованих вірусних після PCR-ампліфкації з використанням pEGFP-N1 вакцин. Хоч доставка до слизової оболонки може (Clontech) як матриці та вставлення кДНК після бути здійснена місцевим застосуванням вакцини, SacIІ/ХhоІ-гідролізу до плазміди pHW72, що місдля доставки імуногенних протеїнів до неї викоритить промотор pol І людини та мишачий термінастовувалися різні стратегії. тор і некодуючу ділянку М-сегмента, відокремлену В конкретному варіанті втілення вакцина може сайтами Sacll/Xhol. pHW127-M та pHW128-NS були бути введена у суміші з/або у вигляді кон'югата чи сконструйовані шляхом RT-PCR ампліфікації вірухимерного злитого протеїну з холерним токсином, сної РНК з праймерами, що містять сегменттаким як холерний токсин В чи химера холерного специфічні послідовності та сайти BsmBI для токсину А/В [Hajishengallis, J. Immunol., 154:4322вставлення до гідролізованого BsmBI вектора 32, 1995; Jobling and Holmes, Infect, lmmun., рНН21 [E. Hoffinann, Ph.D. Thesis 1997, Justus 60:4915-24, 1992]. Були описані мукозальні вакциLiebig University, Giessen, Germany; Neumann etal., ни, основані на використанні субодиниці холерного Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96:9345]. Констоксину В [Lebens and Holmgren, Dev. Biol. Stand., труювання плазмід pPoll-WSN-PB1; pPoll-WSN82:215-27, 1994]. В іншому варіанті втілення для PB2, pPoll-WSN-PA, pPoll-WSN-NP, pPoll-WSN-HA, мукозальної вакцинації може бути приготовлена pPoll-WSN-NA, pEWSN-НАта pCAGGS-WN A15 суміш з термолабільним ентеротоксином (LT). було описано в інших джерелах [Neumann et аl., Інші стратегії мукозальної імунізації включають supra]. інкапсулювання вірусу у мікрокапсулах [патенти Клітинна культура та трансфекція. Клітини США №5075109, №5820883 та №5853763] та виМедін-Дербі собачої нирки (MDCK) утримували в 43 84254 44 модифікованому середовищі Ігла (MEM), яке містранскрипції генів вірусу грипу. Той факт, що елетить 10% сироватки плоду корови (FBS), клітини менти термінальних послідовностей є високо кон293Т нирки ембріону людини культивували у сесервативними, вказує на те, що транскрибовані редовищі Ігла, модифікованому за Дульбекко штучні РНК повинні мати послідовності, які не від(DMEM), яке містить 10% FBS TranslT LT-I різняються від тих, що знаходяться на 5'-та 3'(Panvera, Madison, Wisconsin) використовували кінцях [Luo et al., J. Virol., 1991, 65:2861; Flick et al., згідно з інструкціями виробника для трансфекції RNA, 1996, 2:1046]. Був сконструйований клонуючий вектор pHW12, який дозволяє вставлення по1´106 клітин 293Т. Різну кількість плазмід (Таблиця трібних послідовностей між промотором pol І та 1) змішували з TranslT LT-1 (2мкг TranslT LT-1 на термінатором за допомогою ендонуклеази рестри1мкг ДНК), інкубували при кімнатній температурі кції BsmBI. Одиниця транскрипції pol І граничить з протягом 45 хвилин і додавали до клітин. Через промотором pol Il цитомегаловірусу (CMV) сигнашість годин ДНК-трансфекційну суміш заміщали на Opti-MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland), що лом поліаденілювання з гена, що кодує бичачий гормон росту. CMV-промотор, полі(А)-сайт та містить 0,3% бичачого сироваткового альбуміну остов плазміди узяті з клонуючого вектора (BSA) та 0,01% FBS. Через сорок вісім годин після pcDNA3. трансфекції надосадову рідину, що містить вірус, Експресія протешу РВ1 у pol l/pol Il двоспрятитрували у клітинах MDCK. Виділення РНК та RT-PCR. Вірусну РНК видімованій системі транскрипції. Для випробування одноплазмідної pol l/pol Il системи транскрипції, ляли з вірусних частинок за допомогою RNeasy-Kit кДНК гена РВ1 вірусу A/WSN/33 вставляли до кло(Qiagen, Valencia, California) згідно з інструкціями нуючого вектора pHW12, одержуючи плазміду виробника. Для характеризації рекомбінантних pHW52-PB1. Сайти рестрикції Hindlll та Xho\lбули вірусів грипу використовували набір Access RTPCR (Promega, Madison, Wisconsin) згідно з протовставлені до 5'- та 3'-некодуючих ділянок цього гена. Ці генетичні мітки були включені для того, колом, що надається. В експериментах RT-PCR щоб забезпечити розпізнавання генерованого ревикористовували такі праймери: Seq-PB1#1: 5'комбінантного вірусу методом RT-PCR. ОчікувалоAGG ATG GGA TTC CTC AAG G-3' (SEQ ID NO:1); ся, що клітини людини, трансфіковані цією плазміSeq-PB1#2: 5'-GCT ATG GTT TCC AGA GCC CG-3' (SEQ ID NO:2); Bm-PB1-1: 5'-TAT TCG TCT C AG дою, вироблятимуть два типи РНК: РВ1-вРНК, синтезовану клітинним pol І, та мРНК з 5'-кеп струGGA GCG AAA GC A GGC A-3' (SEQ ID NO:3); Bmктурою, синтезовану pol II. Трансляція мРНК повиPBI-2341R: 5'-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA нна приводити до синтезу PB1-протеїну. AAC AAG GC A TTT-3' (SEQ ID NO:4). ЕксперименДля того, щоб визначити, чи продукується ти RT-PCR здійснювали з використанням пристрою РТС-200 DNA (MJ Research, Watertown, протеїн РВ1 цим конструктом, автор дослідив реплікацію та транскрипцію штучної вРНК шляхом Massachusetts). Програма ампліфікації починалася конструювання експресійних плазмід pHW21-PB2, з одного циклу при 48°С протягом 45хв. (синтез pHW23-PA та pHW25-NP, які містять кДНК, що першого ланцюга кДНК) та одного циклу при 94°С кодує протеїни РВ2, PA та NP A/WSN/33 під контпротягом 2хв. (інактивація AMV-зворотної транскриптази та денатурація кДНК). За цими циклами ролем CMV-промотора. Для in vivo синтезу штучної вРНК було сконструйовано репортерну плазмійшли 40 циклів при 94°С протягом 20с, 52°C проду pHW72-EGFP, що містить кДНК EGFP, яка тягом 30 с та 72°C протягом 3с (PCR ампліфікаграничить з некодуючою ділянкою М-сегмента та ція); програма закінчувалася одним циклом при промотором pol І людини і мишачою термінальною 72°С протягом 5хв. Продукти PCR аналізували методом електрофорезу на агарозному гелі та послідовністю. П'ять плазмід (2мкг pHW21-PB2, 2мкг pHW52-PB1 (конструкт з pol l/pol Il промотосеквенували з праймером Seq-PB1#1 чи Seqрами), 2мкг PHW23-PA, 2мкг pHW25-NP та 1мкг PB1#2. pHW72-EGFP) були трансфіковані до клітин 293Т. Потокова цитометрія Через сорок вісім годин Через 24 та 48 годин після трансфекції клітини після трансфекції клітини 293Т промивали фізіологічним розчином з фосфатним буфером (PBS), аналізували методом флуоресцентної мікроскопії. Після 24 годин спостерігалися флуоресцентні кліцентрифугували та ресуспендували у PBS плюс тини. Цей результат показує, що протягом 24 го5% FBS. Аналіз методом потокової цитометрії дин синтезуються протеїни полімерази у концентпроводили з використанням потокового цитометра рації, достатній для того, щоб дозволити FACS Calibur (Becton Dickinson), і дані аналізували з використанням пакета прикладних програм розпізнавання вірус грипу-специфічних кінців EGFP-вРНК. Ці протеїни синтезують мРНК, яка CellQuest. Для аналізу експресії EGFP використотранслюється у EGFP. вували довжину хвилі емісії 530нм (FL10 для досяДля оцінки ефективності цієї системи провегнення більшої чутливості детектування EGFPдено потоковий цитометричний аналіз для підрамедійованої флуоресценції. Результати та обговорення хунку кількості флуоресцентних клітин. Через сорок вісім годин після трансфекції п'яти плазмід Конструювання та характеристики клонуючого 18,72% клітинної популяції виявляли флуоресценвектора pHW12, який містить два еукаріотичні цію. Якщо не додавали плазміду pHW52-PB1, то промотори. Віруси грипу А є сегментованими віруспостерігався лише фоновий рівень флуоресцентсами, що містять молекули РНК з "мінуc"смисловою полярністю. Під час циклу реплікації них клітин (0,06%); цей результат узгоджується з даними попередніх досліджень, які показують, що розпізнавання 5'- та 3'-структур восьми сегментів всі чотири РНП-комплексні протеїни є необхідними РНК протеїнами рибонуклеопротеїнового комплекдля ампліфікації вРНК [Huang et al., J. Virol., 1990, су (РВ2, РВ1, PA, NP) приводить до реплікації та 45 84254 46 64:5669]. Ці результати вказують на те, що РВ1вності розпізнавання pol І-специфічних факторів кДНК транскрипція та кінцева концентрація РВ1 транскрипції та термінації [Beckmann et al., протеїну разом з іншими РНП-комплексними проScience, 1995, 270:1506; Bell et al., Science, 1988, теїнами є достатньою для ініціації процесу вірусної 241:1192; Kuhn et al., EMBO J., 1994, 13.416], ці транскрипції/реплікації. ДНК-зв'язуючі протеїни, мабуть, не інгібують pol ІІГенерування рекомбінантного вірусу грипу А. медійовану транскрипцію. Ці результати узгоджуДля генерування інфекційного вірусу грипу А неються з даними про те, що pol І-специфічні ДНКобхідно, щоб плазміда pHW52-PB1 забезпечувала зв'язуючі протеїни є більш поширеними в ядерці, одержання не лише РВ1 мРНК та протеїну, але яке є компартментом, де відбувається клітинна також достатню кількість РВ1-вРНК, яка може бути рДНК-транскрипція [Evers et al., EMBO J., 1995, спакована у вірусне потомство. Для решти семі 14:1248]. Ці результати вказують на те, що після вРНК використовували плазміди, які містять кДНК трансфекції до клітини pol І/роІ II-промоторного непроцесованих РНК вірусу A/WSN/33, що граниконструкта деякі плазміди доставляються до ядечать з промотором pol І людини та мишачим террця, де відбувається pol І-медійована транскрипмінатором. Трансфекція цих плазмід повинна приція, а деякі затримуються у ядрі, де вони трансводити до синтезу усіх восьми вірусних РНК, які крибуються РНК полімеразою II. реплікуються та транскрибуються полімеразними Оскільки репортерний конструкт pHW52-PB1 протеїнами з утворенням нових вРНК. Після синмістив додаткові послідовності, які не належать тезу стр уктурних протеїнів ці РНП будуть спаковувірусу грипу (сайти рестрикції), у некодуючій діляватися у нові вірусні частинки. нці перед стартовим кодоном та після стоп-кодону, Клітини 293т трансфікували різною кількістю нам було цікаво, чи будуть ці послідовності стабіплазміди pHW52-PB1 (0, 2, 4мкг) разом з плазмільно підтримуватись у вірусному РВ1 РНКдами pPoll-WSN-PB2, pPoll-WSN-PA, pPoll-WSNсегменті Тому ми виділили вРНК після другого HA, pPoll-WSN-NP, pPoll-WSN-NA, pHW127-M, переміщення трансфікованого вірусу на клітинах pHW128-NS (пo 1мкг кожної). Плазміди експресії MDCK та здійснили аналіз методом PCR із зворопротеїну pHW21-PB2 (1мкг), pHW23-PA (0,1мкг), тною транскриптазою. Ампліфікація вРНК РВ1pHW25-NP (1мкг), pEWSN-HA (1мкг), and pCAGGSспецифічними праймерами привела до генеруванWNA15 (1мкг) були котрансфіковані. Плазміди ня кДНК-фрагментів очікуваного розміру. При виекспресії гемаглютиніну (НА) та нейрамінідази користанні тих самих вірусної РНК та праймерів, (NA) були включені для підвищення виходу вірусу, але без додання зворотної транскриптази ніякого що трансфікується. продукту ампліфікації одержано не було, що вкаЧерез сорок вісім годин після трансфекції назує на те, що кДНК походить від вірусної РНК, а не досадову рідину первинних трансфікованих клітин від плазмідної ДНК, перенесеної з надосадовою 293Т переносили до клітин MDCK. В усі х експерирідиною трансфікованих клітин. ментах з трансфекції, у яких додавали плазміду Секвенування продуктів PCR виявило, що моpHW52-PB1, через 24 години спостерігали віруслекула РНК містить обидві послідовності сайтів індукований цитопатичний ефект. Цитопатичний рестрикції. Результати показують, що система ефект не спостерігався, якщо до реакції трансфетранскрипції pol l/pol Il дозволяє одержувати інфекції не було включено РВ1-експресуючої плазміди. кційний рекомбінантний вірус і що вірус з чужорідТитр вірусу визначали шляхом титрування надоними послідовностями у некодуючій ділянці гена садової рідини з трансфікованих клітин на клітинах РВ1 є життєздатним. Цей модифікований сегмент MDCK; було знайдено, що надосадова рідина місРВ1, як і раніше, реплікується, транскрибується та спаковується у вір усні частинки. Раніше, була змітить 2´104-2´105pfu/мл. Цей результат показує, що нена некодуюча ділянка сегментів вірусу грипу А після трансфікування PB1-pol l/pol II-промоторної за допомогою РНП-трансфекційної системи. Шляплазміди (разом з експресійними плазмідами) РВ1 хом заміни некодуючої ділянки гена NA на відповівРНК та РВ1 протеїни синтезуються у клітинній дну послідовність NS-сегмента грипу В були одерлінії 293Т людини у рівнях, достатніх для генерування інфекційних вірусів грипу А. В експерименжані трансфектантні віруси грипу [Muster et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 1991, 88:5177; тах з котрансфекції з використанням плазмід, що Bergmann and Muster, J. Gen. Virol., 1995, 76:3211]. містить РВ1-кДНК, розділену на дві плазміди Цей тип вірусу з химерним сегментом NA виявив (pHW82-РВ1 та pHW22-PB1), було одержане знаатенуйований фенотип у мишей і захищав мишей, чення титру вір усу 2´104pfu/мл; аналогічний ексінокульованих нелетальною дозою, від інфікуванперимент з використанням плазмід з послідовносня вірусною інфекцією грипу дикого типу. Ці ретями РВ1 дикого типу (pPol I-WSN-PB1 та pHW22зультати показують, що генетичні зміни некодуюP61) дали титр вірусу 3´106pfu/мл. чої ділянки сегмента РНК можуть змінити На відміну від конструкту експресії з промотобіологічні властивості трансфікованого вірусу. В ром pol II, що використовувався у попередніх доцій роботі уперше повідомляється про те, що до слідженнях [Neumann et al., Proc. Natl. Acad. ScL некодуючої ділянки сегмента РВ1 можуть бути USA, 1999, 96:9345], автор використовує плазміду вставлені послідовності не тільки вірусу грипу. pHW52-PB1, що містить послідовності, виділені з За допомогою системи транскрипції pol l/pol Il одиниці транскрипції pol І, які вставлені між CMVтепер можливо систематично модифікувати ці промотором та сайтом поліаденілювання. Експреелементи послідовності у некодуючій ділянці сегсіярепортерного гена EGFP демонструє, що загамента РВ1 та оцінювати, чи приведуть ці генетичні льна експресія РВ1-протеїну в цій системі є достаманіпуляції до змін у біологічних властивостях тньою для утворення комплексів EGFP-RNP. Хоч рекомбінантних вірусів. Дійсно, нижчий вихід віруділянка промотор pol І/термінатор містить послідо 47 84254 48 сів змутованим сегментом PB1 у порівнянні з вірумент-специфічні послідовності на З'-кінці та послісом дикого типу вказує на те, що вставлені послідовності рестрикційних сайтів SsmBI чи BsaI на 5'довності негативно впливають на ріст вірусу. кінці. Після гідролізу продуктів PCR за допомогою Хоч розроблена нещодавно система на основі BsmBl чи BsaI, фрагменти були клоновані до векплазмід [Neumann et al., supra] є високоефективтора pHW2000 (Фігура 3А). Послідовності прайменою за показником генерування вірусу грипу, вона рів, використаних для ампліфікації геному потребує клонування 14-17 плазмід. В цих досліA/teaI/HK/W312/97 (H6N1), наведені далі. Праймедженнях зменшено кількість плазмід до 13, потрібри наведені зліва направо, що відповідає 5'- та 3'них для ефективного виділення вірусу грипу штакінцям. Грип А-специфічні нуклеотиди підкремлені. му A/WSN/33. Зменшення кількості плазмід, яке NS: досягається за цим підходом, обіцяє підвищити Bm-NS#1: ефективність трансфекції для інших клітинних ліTATTCGTCTC AGGGAGC AAAAGC AGGGTG (SEQ ній, крім клітин 293Т, тим самим дозволяючи здійID NO:5) снювати доставку генів у клітинних лініях, у яких Bm-NS#2: важко досягти ефективної доставки 14 плазмід. ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAAC AAGGGTGTTT [Fodor et al. (J. Virol., 1999, 73:9679)] змогли виді(SEQ ID NO:6) лити вірус грипу після трансфікування 12 плазмід, M: але вихід вірусу в ци х дослідженнях становив лиBm-M#1: ше 1-2 інфекційні вірусні частинки на 106 трансфіTATTCGTCTC AGGGAGC AAAAGC AGGTAG (SEQ кованих клітин Vero. DD NO:7) Приклад 2: Конструювання рекомбінантних віBm-M#2: русів грипу А з мінімальної системи на основі плаATATCGTCTCGTATTAGTAGAAAC AAGGTAGTTTT змід TT (SEQ ID NO:8) Цей приклад описує використання системи NA: трансфекції на основі плазмід для виділення віруBm-NAI-1: су грипу А цілком з клонованої кДНК. На відміну TATTCGTCTC AGGGAGC AAAAGC AGGAGTTTAAC від відомих систем на основі плазмід, ця система ATG (SEQ ID NO:9) генерування вірусу грипу А використовує конструBm-NA-1413R: ювання та трансфекцію лише восьми експресійних ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAAC AAGGAGTTTTT плазмід, кожна з яких містить одну копію окремої (SEQ ID NO:10) вірусної кДНК, що відповідає сегменту вірусного НА: гена. Ця зворотно-генетична система зменшує Вт-Н6-1: кількість плазмід, потрібних для виділення вірусів TATTCGTCTC AGGGAGC AAAAGC AGGGGAAAATG грипу А і дозволяє передбачувано та ефективно (SEQ ID NO:11) генерувати реасортативні віруси. Bm-NS#2: Матеріали та методи ATATCGTGTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT Клонування плазмід. Плазміду pHW2000 (Фігу(SEQ ID NO:12) ра 3А) виготовляли з pHW12 (Приклад 1). Клоную(примітка: НА та NS-сегмент мають ідентичну чий вектор pHW2000 містить послідовності 225п.н. послідовність в цій частині некодуючої ділянки) промотора pol І людини та 33п.н. мишачого терміNP: натора, розділені двома сайтами BsmBl Елементи Ba-NP-1: промотора pol І та термінатора граничать з усічеTATTGGTCTC AGGGAGCGAAAGC AGGGTA (SEQ ним безпосереднім раннім промотором цитомегаID NO:13) ловірусу людини (починаючи приблизно на 350 Ba-NP1565R: п.н. вище сайту початку транскрипції, як це зробATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATT лено у pcDNA3, In vitrogen, Carlsband, California) та (SEQ ID NO:14) з сигналом поліаденілювання гена, що кодує бичаPA: чий гормон росту. Вісім плазмід, які містять кДНК Bm-PA1-1: вірусу A/WSN/33 (H1N1) (pHW181-PB2, pHW182TATTCGTCTC AGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATC РВ1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, C (SEQ ID NO:15) pHW186-NA, pHW187-M та pHW188-NS) були скоBm-PA1-2231R: нструйовані шляхом вставлення фрагментів ApalATATCGTCTCGTATTAGTAGAAAC AAGGTACTTTT Sall (з віруною кДНК та послідовностями промотоT (SEQ ID NO:16) ра pol І та термінатора) плазмід pPoll-WSN-PB2, РВ1: pPoll-WSN-PB1, pPoll-WSN-PA, pPoll-WSN-NP, Bm-PB1а-1: pPoll-WSN-HA, pPoU-WSN-NA [Neumann et al., TATTCGTCTC AGGGAGCGAAAGCAGGC AAACC Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96:9345], pHW127(SEQ ID NO:17) M та pHW128-NS (Приклад 1) до Apal-Sall векторBm-PB1-2341R: ного фрагмента pHW2000. Вісім плазмід, що місATATCGTCTCGTATTAGTAGAAAC AAGGC ATTT тять кДНК А/TеаІ/НК/W312/97 (H6N1) (pHW241(SEQ ID NO:18) PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW244-HA, PB2: pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M та pHW248Ba-PB2-1: NS) були сконструйовані шляхом ампліфікації віTATTGGTCTC AGGGAGCGAAAGC AGGTC AATTAT русної РНК способом полімеразної ланцюгової ATTC (SEQ ID NO:19) реакції із зворотною транскриптазою (RT-PCR). Праймери, використані в реакції PCR, містять сег 49 84254 50 Ba-PB2-2341R: Bm-NS#1. Послідовність матричної ДНК визначаATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTT лася у Центрі біотехнологій Дитячої дослідницької T (SEQ ID NO:20) лікарні св.Іуди (Center for Biotechnology, St.Jude RT-реакцію проводили з праймером 5'Children's Research Hospital) з використанням гоAGC AAAAGCaGG-3' (SEQ ID N0:21). Для того, щоб тового до використання набору реактивів для циквпевнитися, що вірусні кДНК, одержані ампліфікалічного секвенування методом барвник-термінатор цією методом RT-PCR, не містять небажаних муdRhodamine з ДНК-полімеразою FS AmpliTaqÒ тацій в експресійних плазмідах, вставлені кДНК (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, inc. [PE/ABI], секвенували. Foster City, CA) і синтетичними олігонуклеотидами. Віруси та клітинна культура. Віруси грипу Зразки піддавали електрофорезу, детектуванню A/WSN/33 (H1N1) та А/ТеаІ/НK/W312/97 (H6N1) та аналізу на секвенаторах РЕ/АВІ моделі 373, розмножували в яйцях у віці 10 днів. Клітини Мемоделі 373 Stretch чи моделі 377 DNA. дін-Дербі собачої нирки (MDCK) утримували в моРезультати дифікованому середовищі Ігла (MEM), яке містить Створення системи pol l-pol Il для генерування 10% FBS. Клітини нирки ембріону людини 293Т A/WSN/33 (H1N1). Оскільки геном вірусу грипу А культивували у Opti-MEM I (Life Technologies, містить вісім сегментів, було зроблене припущенGaithersburg, Maryland), що містить 5% FBS. Для ня, що вста влення всіх восьми кДНК грипу А між експериментів з трансфекції були використані шепромотором pol І та промотором pol Il має привесстилункові планшети з культурами тканин. За день ти до транскрипції восьми вРНК, усі з вірусними до трансфекції клітини 293Т та MDCK на стадії РНК, та синтезу всіх 10 вірусних протеїнів (Фігура суцільного росту у колбі на 75см 2 триптизували і 1). Тоді після збирання всіх вірусних рибонуклеоп10% кожної клітиної лінії розмішували у 18мл ротеїнів зі структурними протеїнами буде утворюOptiMEM I; 3мл цієї клітинної суспензії висівали в ватись інфекційних вірус грипу А (Фігура 2). одну лунку шестилункового планшета. Спільні Для того, щоб перевірити, чи може бути одеркультури клітин MDCK та 293Т 0,2-1´106 клітин на жаний інфекційний вірус грипу А з використанням лунку кожної) використовували для експериментів цієї системи двоспрямованої транскрипції кДНК, з трансфекції. Для трансфікування клітин викорисбули сконструйовані вісім експресійних плазмід товували TranslT LT-1 (Panvera, Madison, (pHW181-PB2, pHW182-PB1, pHW183-PA, Wisconsin) згідно з інструкціями виробника. Стисло pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M кажучи, 2мкл TranslT LT-1 на 1мкг ДНК перемішута pHW188-NS), які містять вісім кДНК A/WSN/33 вали, інкубували при кімнатній температурі протя(H1N1). Вісім плазмід (1мкг кожної плазміди) (Табгом 45хв. і додавали до клітин. Через шість годин лиця 1) були котрансфіковані до тимчасово співкуДНК-трансфекційну суміш заміщали на Opti-MEM I. льтивованих клітин 293T-MDCK. Обидві клітинні Через тридцять годин після трансфекції до клітин лінії співкультивували в одній лунці клітинної кульдодавали 1мл Opti-MEM I, що містить ТРСКтури за день до трансфекції для забезпечення трипсин; це додавання призводило до кінцевої умов для високої ефективності ДНК-трансфекції концентрації TPCK-трипсину 0,5мкг/мл у надоса(клітини 293T) та для ефективної реплікації (клітидовій рідині клітин. Вірусний титр надосадової ріни MDCK) вірусів грипу А. Через 48 та 72 години дини клітин визначали шляхом титрування надоклітини MDCK виявляли вірус-індукований цитопасадової рідини на клітинах MDCK. тичний ефект, але після трансфекції семі плазмід Виділення РНК та and RT-PCR. Вірусну РНК без РВ1-експресійного конструкта ніякого цитопавиділяли з вірусних частинок за допомогою тичного ефекта не спостерігалося (Таблиця 1). RNeasy-Kit (Qiagen, Valencia, California), який виВірусний титр надосадової рідини визначали для користовували згідно з інструкцією виробника. Для різних моментів часу після трансфекції шляхом характеризації рекомбінантних вірусів грипу викотитрування на клітинах MDCK. Через двадцять ристовували набір Access RT-PCR kit (Promega, чотири години після трансфекції надосадова рідиMadison, Wisconsin) згідно з наданим протоколом. на з клітин містила 1´103 вірусів на мл; через 72 В експериментах RT-PCR використовували такі години після трансфекції було генеровано 2´107 праймери: Bm-NS#l (5'-TAT TCG TCT C AG GGA інфекційних вірусів на мл (Таблиця 1). Виділені GCA AAA GC A GGG TG-3; SEQ ID NO:5) та Bmвіруси пасирували два рази на клітинах MDCK. NS#2 (5'-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC Для того, щоб впевнитись у тому, що генерований AAG GGT GTT ТТ-3; SEQ ID NO:12). Експерименти вірус є потрібним A/WSN-вірусом, продукували RT-PCR здійснювали з використанням приладу методом RT-PCR кДНК гена NS (Фігура 4А, смужка РТС-200 DNA (MJ Research, Watertown, 8). Генерування двох фрагментів після гідролізу Massachusetts). Програма ампліфікації починалася ендонуклеазою рестрикції Ncol (Фігура 4Б, смужка з 1 циклу при 48°C протягом 45хв. та 1 циклу при 8) та секвенування ампліфікованого фрагмента 94°С протягом 2хв. За цими циклами йшли 40 цикпідтвердили, що одержаний вірус дійсно був балів при 94°С протягом 20с, 52°С протягом 3с та жаним вірусом A/WSN. Ці результати показують, 72°C протягом 40с; програма закінчувалася одним що синтез вРНК та мРНК з восьми матриць під циклом при 72°С протягом 5хв. Продукти PCR керуванням pol І та pol Il приводить до генерувананалізували методом електрофорезу на агарозня інфекційного вірусу грипу А. ному гелі і секвенували за допомогою праймера 51 84254 52 Таблиця 1 Набори плазмід, використані для одержання вірусів A/WSN/33 (H1N1) та A/TeaI/HK/W312/97 (H6N1) Сегмент 1 2 3 4 5 6 7 8 t=24год. t=48год. t=72год. A/WSN/33(H1N1) pHW181-PB2 PHW181-PB2 PHW182-PB1 pHW183-PA PHW183-PA PHW184-HA PHW184-HA pHW185-NP PHW185-NP pHW186-NA PHW186-NA pHW187-M pHW187-M pHW188-NS PHW188-NS Вірусний титр§ 0 1´103 0 2´106* 0 2´107* A/Teal/HK7W312/97 (H6N1) PHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW242-PB1 pHW243-PA pHW243-PA pHW244-HA pHW244-HA pHW245-NP pHW245-NP pHW246-NA pHW246-NA pHW247-M pHW247-M pHW248-NS pHW248-NS 0 0 0 0 2´103 2´105* § Числа показують кількість інфекційних вірусни х частинок на мл надосадової рідини трансфікованих клітин, визначену через 24год., 48год. та 72год. після трансфекції * У співкультивованих клітин MDCK спостерігався і цитопатичний эфект. Одержання A/Teal/HK/IV312/97 (H6N1) шляхом котрансфікування восьми плазмід. Вірус грипу A/WSN/33 (H1N1), який походить від штаму пандемії грипу людини 1918p. хGoto and Kawaoka, Proc. Acad. Sci. USA, 1998, 95:10224; Reid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96:1651ї, був пасирований у мишачому мозку і добре адаптований для вирощування у клітинній культурі. Для оцінки ефективності системи з восьми плазмід для генерування вірусу з клонованої кДНК, яка не була попередньо адаптована для вирощування у клітинній культурі, зробили спробу генерування вірусу А/ТеаІ/НK/W312/97 (H6N1) з самої лише клонованої кДНК. Цей вірус H6N1 був ізольований з мертвого чирка під час спалаху H5N1 у Гонконзі в 1997р. Генетичний аналіз цього вірусу показав, що він має сім сегментів при нуклеотидній гомології з патогенними штамами вірусу H5N1 більш ніж 97%. З інфікованої алантоїсної рідини була екстрагована РНК, і ампліфіковані способом RT-PCR кДНК були вставлені до pHW2000; ця вставка привела до одержання восьми експресійних плазмід (Фігура 3). Через сімдесят дві години після трансфекції pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW244HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M та pHW248-NS (1мкг кожної) до співкультивованих клітин 293T-MDCK у клітин MDCK спостерігався вірус-індукований цитопатичний ефект (Таблиця 1). Вихід вірусу становив 2´105 інфекційних вірусів на мл надосадової рідини трансфікованих клітин. Як показано на Фігурі 4 (А та В, смужка 2), ідентичність одержаного вірусу була підтверджена шляхом характеризації сегмента NS. Ці результати показують, що ця плазмідна система потребує клонування лише восьми кДНК до одного плазмідного вектора, і що трансфекція восьми експресійних плазмід дозволяє одержани вірус грипу A1 який має антигенність вірусу, що не був адаптований до вирощування у клітинах ссавців. Одержання реасортативних вірусів грипу А. Було перевірено придатність восьмиплазмідної системи для генерування реасортативних вірусів. Оскільки ця система трансфекції ДНК не потребує ніякої системи селекції, виділення реасортативних вірусів має забезпечуватись відповідною комбінацією експресійних плазмід у реакціях трансфекції. Сім експресійних плазмід, що містять кДНК A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) були котрансфіковані з однією експресійною плазмідою, що містила кДНК A/WSN/33 (H1N1) (Таблиця 2). Був одержаний високий вихід реасортативних вірусів, які містили сім сегментів вірусу чирка та M-сегмент чи NS-сегмент вірусу WSN. Нижчі виходи вірусу були одержані для NA- та НА-реасортативних вірусів (Таблиця 2). Оскільки при використанні восьмиплазмідної системи одержували певні реасортативні віруси, наступним кроком було визначення того, чи може бути одержаний вірус при використанні численних сегментів, одержаних від одного вірусу. Для цього, чотири експресійні плазміди, що містили кДНК генів РНП-комплексу вірусу H6N1 (pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA та pHW245-NP) були трансфіковані разом з плазмідами pHW184-HA, pHW186-NA, pHW187-M та pHW188-NS, що містили кДНК вірусу WSN (Таблиця 2). Було одержано 4´106 вірусів на мл клітиної надосадової рідини. Як показано на Фігурі 4 (смужка 10), ампліфікований NS-сегмент квадрупольного реасортативного вірусу розщеплювався за допомогою Л/соІ; таким чином, сегмент NS походить з вірусу WSN. Ці результати показують, що восьмиплазмідна система трансфекції дозволяє одержувати синглетні та квадрупольні реасортативні віруси. 53 84254 54 Таблиця 2 Генерування реасортативних вірусів грипу А з A/Teal/HK/W312 (H6N1) та A/WSN/33 (H1N1) шляхом котрансфікування восьми плазмід сегмент* 1 2 3 4 5 6 7 8 вірусний титр§ НА PHW241-PB2 PHW242-PB1 PHW243-PA PHW245-NP PHW184-HA PHW246-NA PHW247-M PHW248-NS 2´102 NA pHW241-PB2 pHW242-PB1 pHW243-PA pHW245-NP pHW244-HA pHW186-NA pHW247-M pHW248-NS 2´103 M pHW241-PB2 pHW242-PB1 pHW243-PA pHW245-NP pHW244-HA pHW246-NA pHW187-M pHW248-NS 2´105 NS pHW241-PB2 pHW242-PB1 pHW243-PA pHW245-NP pHW244-HA pHW246-NA pHW247-M pHW188-NS 2´107 HA-NA-M-NS pHW241-PB2 pHW242-PB1 pHW243-PA pHW245-NP pHW184-HA pHW186-NA pHW187-M pHW188-NS 4´106 * плазміни, що містять кДНK A/WSN/33 (H1N1), виділені жирним шрифтом § Числа показують кількість інфекційних вірусних частинок на мл надосадової рідин трансфікованих клітин, визначену через 72год. після трансфекції Обговорення Можливість одержання вірусу грипу А після трансфікування восьми експресійних плазмід, що містять кДНК А/TеаІ/НK/W312/97 (H6N1) або A/WSN/33 (H1N1) підтверджує, що система транскрипції pol l-pol Il створює достатню кількість вРНК та вірусних протеїнів для утворення інфекціного вірусу грипу А. Синтезовані два типи мРНК, що відрізняються своїми некодуючими ділянками (Фігура 1). Тип мРНК, який кодує всі вірусні протеїни, транскрибується безпосередньо pol II. Крім послідовностей вірусу грипу, ці мРНК у некодуючих ділянках (NCR) містять послідовності з ділянок промотора pol І та мишачого термінатора. Важливо, що розроблена система експресії pol l-pol Il містить лише 33п.н. мишачих термінальних послідовностей. Попередні дослідження з використанням репортерних генів хлорамфеніколацетилтрансферази (CAT) та зеленого флуоресцентного протеїну (GFP) показали, що послідовності у 174п.н.-термінальній ділянці знижували pol ІІмедійовану експресію протеїну [Hoffinann, E., Ph.D. Thesis 1997, Justus Liebig University, Giessen, Germany]. Др угий тип мРНК генерується після ініціації процесу вірусної реплікації та транскрипції (Фігура 2). Ця мРНК синтезується протеїнами вірусної полімерази і містить 5-кеп структур у, яка утворюється з клітинних РНК шляхом захоплювання кепа, що передує некодуючим послідовностям вірусу грипу. Стр уктурні протеїни, трансльовані з обох мРНК, асоціюють з РНП-комплексами з утворенням нових вірусних частинок. Після пупкування трансфіктантних вірусів, генеровані вірусні частинки можуть згодом реплікуватись у клітинах 293Т та у співкультивованих клітинах MDCK. На відміну від підходів, описаних вище у розділі "Відомий рівень техніки", спосіб за даним винаходом використовує вісім кДНК у восьми плазмідах, які містять 225п.н. промоторні послідовності pol І та 33п.н. термінальних послідовностей. У системі pol l-pol Il усі 10 вірусних протеїнів експресуються з усіченого безпосередньо раннього промотора цитомегаловірусу людини. Той факт, що експресія усіх структурних протеїнів з використан ням 17-плазмідної системи [Neumann et аI., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1999, 96:9345] та 8-плазмідної системи (ці дослідження) давала більшу ефективність виходу вір усу, ніж котрансфікування плазмід, що експресують протеїни РНП-комплексу [Neumann et al., supra; Fodor et al., J. Virol., 1999, 73:9679] підтверджує думку про те, що генерування інфекційного вірусу грипу А посилюється за рахунок надання протеїнів НА, NA, М1, М2 та NS2 одразу ж після трансфекції. Цикл вірусної реплікації включає комплексну взаємодію вірусних протеїнів один з одним та з клітинними факторами [Ludwig et al., Virol. Immunol., 1999, 12:175]. Так, для генерування інфекційного вірусу керований плазмідою синтез вірусних молекул повинен забезпечувати оптимальні концентрації вірусних протеїнів для ініціації циклу реплікації та утворення вірусоподібних частинок. Хоч восьмиплазмідна система виявилася ефективною, може існувати можливість додаткового збільшення продукування вірусу. Було показано, що частка трансфікованих плазмід, що експресують протеїни РНП-комплексу, та експресія протеїну М1 впливають на транскриптазну активність [Pleschka et al., J. Virol., 1996, 70:4188; Perez and Donis, Virology, 1998, 249:52]. Ефективність утворення вірусоподібних частинок залежить також від концентрації структурних вірусних протеїнів [Mena et al., J. Virol., 1996, 70:5016; GomezPuertas et al., J. Gen. Virol., 1999, 80:1635; Neumann et al., J. Virol., 2000, 74:547]. Ефективність генерування інфекційного вірусу з використанням системи pol l-pol Il може бути тому додатково підвищена шляхом варіювання концентрації плазмід, що використовуються у реакції трансфекції, або шляхом використання експресійних плазмід з різними промоторами pol II. Оскільки ефективність розщіплення, медійованого клітинними факторами, вливає на здатність вірусу грипу А до реплікації [Lau and Scholtissek, Virology, 1995, 212:225], використання інших клітинних ліній, ніж 293Т, може підвищити вихід вір усу для деяких штамів грипу А. Високий вихід вірусу при квадрупольному реасортменті (Таблиця 2) узгоджується 55 84254 56 з результатами, за якими швидка реплікація кодує два продукти: NS1 транслюється з повної A/WSN/33 (H1N1) у культурі клітин медіюється РНК, a NS2 транслюється з розщепленої мРНК. сегментами НА, N A та M [Goto and Kawaoka, Proc. Для конструювання експресійних плазмід, що Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95:10224; Schulman and містять кДНК грипу В, використовується та сама Palese, J. Virol., 1977, 24:170; Yesuda et al., J. Virol., стратегія, що була описана для генерування вірусу 1994, 68:8141]. грипу A A/teaI/HK/W312/97 (H6N1). Спочатку ізоГенерування життєздатних реасортантів (Таблюють РНК з вірусних частинок, одержаних з інфілиця 2) з вірусу H6N1 птахів та вірусу H1N1 людикованої алантоїсної рідини, наприклад, B/Lee/40. ни вказує на те, що вір ус H6N1 може включати Ha основі консервативних послідовностей некодугенні сегменти з віддалено спорідненого вірусу. ючого регіону були виготовлені праймери для RTГенетичний аналіз дає змогу припустити, що патоPCR, які використовувались для синтезу кДНК. На генні віруси H5N1 були генеровані шляхом реасо5'-кінці ці праймери містять послідовності для енртменту [Xu et al., Virology, 1999, 26115]. Сегменти донуклеаз рестрикції BsmBI чи Bsal. Гідроліз проН5М1-подібного гена були знайдені у субтипах дуктів PCR за допомогою BsmBI чи Bsal дозволяє H6N1 та H9N2 [Guan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. здійснювати вставлення до клонуючого вектора USA, 1999, 96:9363], що вказує на те, що ці вір уси pHW2000 (або pHW11), лінеаризованого за допоможуть бути прекурсорами патогенних вірусів могою BsmBI. Щоб впевнитися у тому, що кДНК у H5N1. Випадки реасортменту, що можуть створити плазмідах не мають небажаних мутацій внаслідок нові патогенні віруси грипу ймовірно будуть відбупомилок, зроблених полімеразою в процесі PCR, ватися у майбутньому. Однак здатність генерувати конструкти треба секвенувати. та маніпулювати цими вірусами з використанням Котрансфікування співкультивованих клітин спрощеного методу, розробленого у цих дослі293T-MDCK (або клітин COS-1-MDCK) та додання дженнях, допоможе дослідникам краще зрозуміти трипсину приводить до генерування інфекційного біологічні властивості цих нових вірусів та розровірусу грипу В. Надосадові рідини трансфікованих бити ефективні вакцини для захисту населення від клітин потім пасерують на нові клітини MDCK. них. Тривалість періоду часу між появою нового Одержаний вірусний титр може бути визначений патогенного штаму та виготовленням вакцини є стандартними способами, наприклад, методами критичною змінною ефективності програми вакцианалізу НА та аналізу бляшкоутворення. Провенації. Можливість генерувати віруси шля хом клодення RT-PCR із специфічними праймерами до нування усього лише восьми зменшує час, потрібкожного генного сегмента дозволяє здійснювати ний для генерування потенційних вакцинампліфікацію РНК з рекомбінантного вірусу грипу кандидатів та поліпшує існуючі зворотно-генетичні В. Секвенування продуктів підтверджує, що генесистеми за рахунок спрощення створення вірусу рований вірус є дійсно потрібним вірусом грипу В. та зниження загальної вартості продукування вакПриклад 4: Восьмиплазмідна система виготоцини. влення еталонного штаму вірусу грипу А Концепція вставлення вірусної кДНК між проДля визначення комерційної придатності цієї мотором pol І та промотором pol Il до еукаріотичсистеми на основі плазмід для продукування вакних клітин для одержання вірусу є також застосовцин, ми генерували еталонний штам A/PR/8/34 ною до генерування інших членів сімейства (H1N1), який зараз використовується для продукуOrthomyxo viridae. Для вірусу грипу В ця стратегія вання інактивованої вакцини, цілком з клонованих вимагатиме конструювання та котрансфекції вокДНК, як описано у Прикладі 2. Вихід вірусу, висьми плазмід, для грипу C - семі, а для тоготовірузначений методом HA-аналізу після пасивування су (Thogotovirus) - шести. Транскрипція in vivo 5'рекомбінованого вірусу у яйцях, був таким саме кепованих мРНК, а також вРНК з однієї кДНКвисоким, як і вихід батьківського вірусу дикого тиматриці може також спростити системи на основі пу. Ці результати підтверджують, що генерований плазмід для інших РНК-вірусів, або навіть сприяти рекомбінантний вірус має таку саме здатність до створенню систем pol l-pol Il для вірусів з інших росту, як і батьківський вірус, вирощений на яйцях, сімейств (наприклад, Arenaviridae, Bunyaviridae). і вказують на те, що восьмиплазмідний спосіб Приклад 3: Система РНК pol l/pol Il для генетрансфікування має потенціал до удосконалення рування вірусу грипу В цілком з клонованої кДНК методів, які зараз використовуються для продукуВіруси грипу А та В містять кожний по вісім севання вірусів для вакцин. гментів одноланцюгової РНК з негативною полярМатеріали та методи ністю [див. огляд Lamb and Krug, Віруси та трансфекція. Вірус грипу A/PR/8/34 "Orthomyxo viridae: The viruses and their replication"; (H1N1) був одержаний з репозитарію Дитячої доin Fields (Ed.), Virology, p.1353-1395]. На відміну від слідної лікарні св.Іуди (St. Jude Childrens's грипу А, вісім сегментів грипу В кодують 11 протеїResearch Hospital) і розмножувався у к урячих яйнів. Три найбільші гени кодують компоненти РНКцях із зародками у віці 10 днів. Клітини Медінполімерази РВ1, РВ2 та PA; сегмент 4 кодує гемаДербі собачої нирки (MDCK) утримували у MEM, глютинін. Сегмент 5 кодує нуклеопротеїн, який є що містить 10% FBS. Клітини нирки людини 293Т основним структурним компонентом, асоційованим та клітини Vero культивували у Opti-MEM I (Life з вірусною РНК, сегмент 6 кодує нейрамінідазу Technologies, Gaithefsburg, MD), що містить 5% (NA) та протеїн NB. Обидва протеїни - NB та NA сироватки плоду корови (FBS). Для експериментів транслюються з перекривних рамок зчитування з трансфекції використовували шестилункові чашбіцистронної мРНК Сегмент 7 грипу В також кодує ки для тканинних культур. Для експериментів з два протеїни: ВМ1 та ВМ2 Найменший сегмент трансфекції використовували слівкультивовані клітини MDCK та 293Т (0,21´106 кожної з клітин на 57 84254 58 лунку). Для трансфікування клітин використовувадвох транскрипційних одиниць дозволяє синтез ли TranslT LT-1 (Panvera, Madison, Wl) згідно з ін"мінус"-смислової вірусної РНК та "плюс"струкціями виробника. Стисло, змішували 2мкл смислової мРНК з однієї вірусної матриці кДНК. Ця TranslT LT-1 з 1мг ДНК, інкубували при кімнатній система pol l-pol Il починає з ініціювання транскритемпературі протягом 45хв. і додавали до клітин. пції двох клітинних ферментів РНК-полімерази з їх Через шість годин ДНК-трансфекційну суміш замівласних промоторів, гадано, в різних компартменщали на Opti-MEM I. Через двадцять чотири годитах ядра (див. Фігуру 1). Трансфекція восьми плани після трансфекції до клітин додавали 1мл Optiзмід до клітин 293Т приводить до взаємодії всіх MEM I, що містить ТРСК-трипсин; це додавання молекул, утворених механізмами клітинної та віруприводило до кінцевої концентрації ТРСКсної транскрипції та трансляції, і зрештою, до гетрипсину 0,5мкг/мл у надосадовій рідині клітин. нерування інфекційного вірусу грипу А. Ця система Вірусний титр визначали шляхом пасивування виявилася дуже ефективною для утворення вірунадосадової рідини клітин на клітинах MDCK месів грипу A/WSN/33 (H1N1) та АЯеаІ/НКЛА/312/97 тодом аналізу бляшкоутворення. (H6N1) (Приклад 2). RT-PCR та конструювання плазмід. ЕкстрагуОскільки поточним еталонним штамом для вали вірусн у РНК з 200мкл вірус-вмісної алантоїспродукування інактивованої вірусної вакцини є ної рідини яйця із зародком за допомогою набору A/PR/8/34 (H1N1), ми спробували генерувати цей Qiagen RNeasy Kit. Використовували двостадійну вірус цілком з клонованої кДНК. кДНК, які предстаRT-PCR для ампліфікації кожного з сегментів вірувляють вісім РНК-сегментів, були клоновані до сного гена. Стисло, РНК транскрибували у кДНК за вектора pHW2000. Плазміди, що утворилися допомогою AMV зворотної транскриптази (Roche (pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, Diagnostics, Germany) у відповідності до наданого pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M протоколу, і потім кДНК ампліфікували за допомота pHW198-NS) бути трансфіковані до співкультигою системи Expand High Fidelity PCR system вованих клітин 293T-MDCK чи Vero-MDCK. Через (Roche Diagnostics, Germany). Програма ампліфісімдесят дві години після трансфікування визнакації починалася з 1 циклу при 94°C протягом 2хв., чали вірусний титр шляхом титрування на клітинах за яким йшли 3 циклів при 94°С протягом 20с, MDCK. Надосадова рідина співкультивованих клі54°С протягом 30с, 72°С протягом 2хв.; програма тин Vero-MDCK містив 1´104pfu, а надосадова різакінчувалася одним циклом при 72°C протягом дина співкультивованих клітин 293T-MDCK містив 5хв. Використані праймери містили послідовності 2´106pfu на мл. Вищий вихід у клітинах 293Tдля Bsal чи SsmBI для того, щоб забезпечити точMDCK, найвірогідніше, спричинений вищою ефекне вставлення гідролізованих PCR-фрагментів до тивністю трансфекції клітин 293Т у порівнянні з клонуючого вектора pHW2000 (див. Приклад 2). клітинами Vero. Ці результати показують, що воДля клонування генів НА, NP, NA, M, NS PCRсьмиплазмідна система дозволяє генерування фрагменти були гідролізовані за допомогою BsmBl A/PR/8/34 (H1N1) з клонованої кДНК. чи Bsal та ліговані в один клонуючий вектор Для порівняння показників росту вір усу дикого pHW2000. Для клонування Р-генів два (РВ2, PA) типу та генерованого рекомбінантного вірусу іночи три (РВ1) фрагменти ізолювали, гідролізували кулювали курячі яйця з ембріонами вірусом дикого та лігували у pHW2000-BsmBI. Щоб впевнитись в типу чи рекомбінантним вірусом. Алантоїсну рідитому, що гени не містять небажаних мутацій, одену збирали через 48 годин після інфікування. Вихід ржані в результаті PCR фрагменти секвенували. вірусу визначали методом аналізу на НА. Хоч знаВісім плазмід, що містили непроцесовану кДНК чення HA-титр у для окремих яєць відрізнялися, ми A/PR/8/34 (H1N1), були позначені як pHW191-PB2, знайшли, що обидва віруси мали НА-титр від 5120 pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195до 10240 гемаглютинуючих одиниць, що свідчить NP, pHW196-NA, pHW 197-М та pHW198-NS. Випро те, що обидва віруси є ізолятами з високим значення послідовності матричної ДНК проводив виходом. Таким чином, рекомбінантний вірус, геЦентр біотехнологій Дитячої дослідної лікарні нерований шляхом ДНК-трансфекції, мав такий св.Іуди з використанням родаміну чи готови х до саме фенотип здорової культури, як і батьківський застосування наборів реагентів dRhodamine для ізолят. циклічного секвенування методом барвникОбговорення термінатор з ДНК-полімеразою AmpliTaqÒ DNA Восьмиплазмідна система за винаходом униpolymerase FS (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, кає використання окремих плазмід для експресії Inc. [PE/ABIj, Foster City, C A) та синтетичними оліпротеїну (див. розділ Відомий рівень техніки), тим гонуклеотидами. Зразки піддавали електрофоресамим спрощуючи спосіб генерування вірусу грипу зу, детектуванню та аналізу на секвенаторах А цілком з клонованої кДНК. Продукування вакцин РЕ/АВІ модель 373, модель 373 Stretch чи модель включає генерування вірусу, який використовуєтьmodel 377 DNA. ся як вірусне насіння для продукування вірусної Результати вакцини в яйцях або в клітинній культурі. ЕфектиДля забезпечення можливості внутрішньоклівність програми вакцинації залежить від вибору тинного синтезу вірусоподібних вРНК та мРНК ми субтип у, який тісно співпадає з циркулюючими створили систему експресії pol l-pol Il (див. Припатогенними штамами для стимулювання високого клад 2). В цій системі вірусну кДНК вставляли між титру специфічних антитіл у вакцинованій популяпослідовностями промотору РНК-полімерази І люції, забезпечуючи ефективний захист. Шість оснодини (pol І) та термінатора. Ця одиниця транскривних плазмід A/PR/8/34 (pHW191-PB2, pHW192пції pol І у цілому граничить з промотором РНКРВ1, pHW193-PA, pHW195-NP, pHW197-M та полімерази Il (pol II) та полі(А)-сайтом. Орієнтація pHW198-NS), які кодують внутрішні гени грипу А, 59 84254 60 можуть бути тепер використані для котрансфекції Результаті, що наводяться в цьому Прикладі, з плазмідами, що кодують глікопротеїни НА та NA були опубліковані [див. Hoffinann and Webster, J. поточного циркулюючого штаму. Можливість маніGen. Virol., 2000, 81:2843]. пулювання кожним генним сегментом дозволить Для генерування "мінус"-смислового РНКнам також визначити, який генний сегмент (сегмевірусу як матрицю можна використовувати "мінус"нти) є важливим для одержання високого виходу смислову вРНК або "плюс"-смислову кРНК. Для при вирощуванні реасортативних вірусів у яйцях, а зменшення кількості плазмід, необхідних для одетакож у клітинній культурі. ржання вірусу, припустили, що може існувати моТой факт, що вдалося генерувати два лаборажливість синтезу клітинними РНК pol І та pol Il торні штами вірусу грипу (A/WSN/33 (H1N1) та кРНК та мРНК з однієї матриці. Тому ми спробуваA/PR/8/34 (H1N1)) і один польовий ізолят ли розробити односпрямовану pol l-pol Il транскри(A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)) шляхом котрансфікупційну систему (Фігура 5). Вірусну кДНК вставлявання лише восьми плазмід дає змогу припустити, ють у "плюс"-смисловій орієнтації між що ця система є застосовною для розробки живих послідовностями промотора РНК pol І та термінаатенуйованих вакцин грипу. Живі вакцини атенутора. Вся ця pol І транскрипційна одиниця вставйованого вірусу грипу, введені інтраназально, інляється у "плюс'-смисловій орієнтації між промодукують місцевий, мукозальний, клітиннотором РНК pol Il та сайтом поліаденілювання медійований та гуморальний імунітет. Адаптовані (Фігура 5). На відміну від "мінус"-смислової вРНК холодом (са) реасортативні (CR) віруси, що міста "плюс"-смислової мРНК, які генерувалися в натять шість вн утрішніх генів живого атенуйованого шій двоспрямованій транскрипційній системі (Фігугрипу A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) і гемаглютинін (НА) ра 1), очікувалося, що будуть синтезуватися два та нейрамінідазу (NA) сучасних вірусів грипу дикотипи "плюс"-смисловх РНК. В нуклеоплазмі з прого типу є, по-видимому, надійно атенуйованими. мотора pol Il повинна транскрибуватися мРНК з 5'Було показано, що ця вакцина є ефективною для кепованою структурою. Цей транскрипт повинен дітей та дорослої молоді [Keitel & Piedra, In: транслюватися у протеїн. У ядерці очікується синTextbook of Influenza, Nicholson et al., eds. 1998, тез клітинним pol І непроцесованої "плюс"373-390]. Однак, вона може бути занадто атенуйосмислової кРНК вірусу грипу з трифосфатною грувана для того, щоб стимулювати ідеальну імунну пою на 5'-кінці (Фіг.5). Був сконструйований клонувідповідь у людей похилого віку, які складають ючий вектор pHW11, який може бути використаний велику групу з 20000-40000 осіб, що вмирають у для вставлення довільних фрагментів кДНК (ФігуСША кожного року в результаті інфекції грипу. ра 6). Ця плазміда містить промотор pol Il (безпоВнесок кожного сегменту до атенуйованого феносередній ранній промотор цитомегаловірусу лютипу досі не дуже добре визначений [Keitel & дини) та промотор pol І людини, які знаходяться Piedra, supra]. Ця інформація може бути одержана вище термінальної послідовності pol І та полі(А)лише шляхом поступового введення до вірусу сайта. специфічних визначених атенуюючих мутацій. Для того, щоб перевірити, чи може кеп інфекОскільки детальний аналіз потребує проведення ційного вірусу грипу А бути генерований шляхом випробувань великої кількості використовуваних синтезу кРНК та мРНК з однієї матриці, ми сконствірусів, конструювання та трансфекція лише восьруювали вісім плазмід. Плазміди pHW171-PB2, ми плазмід спрощує цю задачу і зменшує час та pHW172-PB1, pHW173-PA, pHW174-HA, pHW175витрати, потрібні для досягнення цієї мети. NP, pHW176-NA, pHW177-M та pHW178-NS місПриклад 5: Односпрямована транскрипційна тять кДНК, що представляють вісім генних сегменсистема на основі РНК-полімерази І-полімерази Il тів штаму A/WSN/33 (H1N1) грипу А. Всі ці кДНК для генерування вірусу А з восьми плазмід мають "плюс"-смислову орієнтацію по відношенню Наведені вище приклади описують систему до промоторів pol І та pol II. Вісім плазмід (1 мкг для генерування вірусу шля хом котрансфікування кожної плазміди) були трансфіковані до клітин лише восьми плазмід, з яких експресуються "мі293Т чи COS-1, які культивували спільно з клітинус"-смислова вРНК та "плюс"-смислова мРНК [ця нами MDCK чи без них, як описано у Прикладі 2. робота була згодом опублікована; див Hoffmann et Вихід вірусу у надосадовій рідині трансфіковаal., 2000, Proceedings of the National Academy of них клітин в різний час визначався методом аналіSciences, USA 97, 6108-6113]. Цей Приклад описує зу бляшкоутворення після пасивування на клітинах створення іншої транскрипційної системи для ексMDCK. Через сорок вісім годин після трансфікупресії вірусоподібних РНК, яка забезпечує внутрівання було продуковано 2-5´103 інфекційних віріошньоклітинний синтез некепованої "плюс"нів (Таблиця 3). Через сімдесят дві години після смислової кРНК та 5'-кепованої мРНК з однієї маттрансфекції надосадова рідина містила риці. Котрансфікування восьми плазмід з танде4´104pfu/мл при трансфікуванні 293Т або мом промоторів РНК pol І-роІ II, що містять кДНК 2´104pfu/мл при трансфікуванні клітин COS-1. ВиA/WSN/33 (H1N1), привело до генерування інфекхід вір усу через 72 год. може бути підвищений ційного вірусу грипу А, хоч і з меншим виходом шляхом співкультивування клітин 293Т чи клітин вірусу, ніж у двоспрямованій системі. Наш підхід COS-1 з клітинами MDCK (Таблиця 3). до продукування вРНК та мРНК або кРНК та мРНК Генерування вірусу доказує, що після трансфівнутрішньоклітинно з мінімального набору плазмід кування восьми плазмід РНК pol І синтезує вісім є корисним для створення чи оптимізації зворотнонекепованих "плюс"-смислових кРНК. Чотири віругенетичних систем інших РНК-вірусів. сні полімеразні протеїни, трансльовані з транскриптів, синтезованих клітинною РНК pol II, зв'язуються з голими вірусоподібними кРНК з утворенням