Рекомбінантний вірус мvа, ізольована еукаріотична клітина, інфікована рекомбінантним вірусом mva, спосіб продукування in vitro поліпептидів з використанням вказаної клітини, спосіб продукування in vitro вірусн

Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що походить від модифікованого вірусу коров'ячої віспи Анкара (MVA), а також містить та здатний експресувати чужорідні гени, що вбудовані до сайту природної делеції у геномі MVA; до використання таких рекомбінантних вірусів MVA для продукування поліпептидів, наприклад, антигенів або терапевтичних агентів, або вірусни х векторів для генної терапії; та до використання вказаних рекомбінантних вірусів MVA, що кодують антигени, у якості вакцин. Метою даного винаходу є отримання рекомбінантного вірусу MVA, який може бути використаний у якості ефективного та абсолютно безпечного експресійного вектору. Іншою метою даного винаходу є розробка простого, ефективного та безпечного способу продукування поліпептидів, наприклад, антигенів або терапевтичних агентів, а також отримання рекомбінантних вірусів для виготовлення вакцин, та вірусних векторів для використання у генній терапії. Ще однією метою даного винаходу є отримання експресійної системи на основі рекомбінантного вірусу MVA, що експресує РНК-полімеразу Т7; та розробка способів продукування поліпептидів, наприклад, антигенів або терапевтичних агентів, або генерування вірусних векторів для використання у генній терапії, або виготовлення вакцин на основі вказаної експресійної системи. Вірус коров'ячої віспи, що належить до роду Ортопоксвірусів родини Поксвірусів, був використаний у якості живої вакцини для імунізації людини у цілях продукування в нього імунітету проти натуральної віспи. (The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication. History of Public Health, №4, Geneva: World Health Organization, 1980). З часу підписання декларації ВОЗ (Всесвітня організація охорони здоров'я, WHO) загальна вакцинація була зупинена, за виключенням людей з високим ризиком зараження поксовірусом (наприклад, лаборантів). Пізніше віруси коров'ячої віспи були також використані для конструювання вірусних векторів, що були призначені для експресії рекомбінантних генів та для можливого їх застосування в якості живих вакцин (Mackett, М., Smith, G.L., Moss, В., 1982, P.N.A.S., USA 79, 7415-7419; Smith, G.L., Macket, M. & Moss, В., 1984, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 2, 383-407). Це дає можливість отримати ДНКпослідовності (гени), що кодують чужорідні антигени та вбудовані, за допомогою техніки рекомбінантних ДНК, до геному вірусу коров'ячої віспи. Якщо ген інтегрується в сайт вірусної ДНК, що не має вирішального значення для життєвого циклу вірусу, тоді знову рекомбінантний вірус коров'ячої віспи, що продукується, може бути інфекційним, тобто він може інфікувати чужорідні клітини, в результаті чого буде експресуватися інтегрована ДНК-послідовність (Європейські патентні заявки №№ 83286 та 110385). Отримані таким чином рекомбінантні віруси коров'ячої віспи можуть бути використані, з однієї сторони, в якості живих вакцин для профілактики інфекційних захворювань, та, з іншої сторони, в якості матеріалу для продукування гетерологічних білків в еукаріотичних клітинах. Продукування рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що експресує ген РНК-полімерази бактеріофагу Т7, дозволяє отримати експресійну систему, яка може широко використовуватися для синтезу рекомбінантних білків у клітинах ссавців (Moss, В., Elroy-Stein, О., Mi zukami, Т., Alexander, W.A., Fuerst, T.R., 1990, Nature 348, 91-92). Всі методи експресії рекомбінантного гену передбачають синтез РНК-полімерази Т7 у цитоплазмі еукаріотичних клітин. При цьому, найбільш часто використовується схема тимчасової експресії (Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. & Moss, В., [1986] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8122-8126, та заявка на патент США №7648971). Спочатку потрібний чужорідний ген вбудовують до плазміди під контроль промотору гену РНК-полімерази Т7. Потім, використовуючи стандартну техніку трансфекції, цю плазміду вводять до цитоплазми клітин, інфікованих рекомбінантним вірусом коров'ячої віспи, що продукує РНК-полімеразу Т7. Ця схема трансфекції є досить простою, оскільки вона не потребує створення нових рекомбінантних вірусів, та до того ж є дуже ефективною, оскільки вона дозволяє отримати більше 80% клітин, що експресують потрібний ген (Elroy-Stein, О. & Moss, В. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6743-6747). Перевагу "вірус коров'ячої віспи/Т7-РНК-полімераза" - гібридної системи, у порівнянні з іншими системами з тимчасовою експресією, полягає, вірогідно, в її незалежності від транспорту плазмід до ядра клітини. Раніше цю систему використовували виключно в аналітичних цілях у вірусології та мікробіології (Buonocore, L. & Rose, J.K. [1990] Nature 345, 625-628, Pattnaik, A.K. and Wertz, G.W. [1991] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1379-1383, Karshin, A., Aiyar, J., Gouin, A., Davidson, N. and Lester, H.A. [1991] FEBS Lett., 278, 229-233, Ho, B.Y., Karshin, A., Raymond, J., Branchek, Т., Lester, H.A. and Davidson, N. [1992] FEBS Lett., 301, 303-306, Buchholz, C.J., Retzler C, Homann, H.E. and Neubert, W.J. [1994] Virology, 204, 770-776). Однак у майбутньому можливі важливі зміни гібридної системи "вірус коров'ячої віспи/РНК-полімераза Т7", наприклад для продукування рекомбінантних білків або рекомбінантних вірусних частинок у цілях розробки нових терапевтичних або профілактичних методів у медицині, можуть зіштовхн утись з певними труднощами, що зумовлені продуктивною реплікацією рекомбінантного вектору, отриманого на основі вірусу коров'ячої віспи. Вірус коров'ячої віспи є інфекційним для людини, та іноді, після вакцинації, що проводилась у якості профілактичної міри по боротьбі з натуральною віспою, у вакцинованих людей спостерігались серйозні ускладнення. Найбільш повний опис випадків ускладнень після вакцинації людей приводиться у Національному звіті США, що висві тлює спостереження за вакцинацією близько 12 мільйонів людей, що була проведена з використанням вакцини, отриманої на основі штаму Нью-Йоркського місцевого департаменту о хорони здоров'я (New York City Board of Health) вірусу коров'ячої віспи (Lane, J., Ruben, F., Neff, J. and Millar, J. [1969] New Engl. J. Med., 281, 1201-1208). Тому, багатообіцяюча можливість використання вірусу коров'ячої віспи в якості вектору для виготовлення живих вакцин зіштовхується з проблемою безпеки та регламентації застосування цього вірусу. Окрім того, більшість рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, що описані у літературі були отримані на основі штаму Western Reserve вірусу коров'ячої віспи. З іншої сторони, відомо, що цей штам має високий ступінь нейровірулентності, а тому він є малопридатним для введення людині та тваринам (Morita et al., Vaccine 5, 65-70 [1987]). Ризик для здоров'я людини або тварин, пов'язаний із застосуванням вказаного вірусу в якості вектору, може бути знижений шляхом використання у високому ступені атенуйованого (послабленого) штаму вірусу коров'ячої віспи. Декілька таких штамів вірусу коров'ячої віспи були спеціально розроблені для знищення небажаних побічних ефектів, що з'являлись у результаті вакцинації проти віспи. Так, наприклад, модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (MVA) був о триманий шляхом тривалого серійного пасування штаму Анкара вірусу коров'ячої віспи (CVA) на фібробластах куриних ембріонів (див. огляд Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. and Stickl, H. [1975] Infection 3, 6-14; патент Швейцарії №568392). Вірус MVA був депонований, у відповідності з вимогами Будапештського договору, в CNCM (Інститут Пастера, Національна колекція мікроорганізмів, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) 15 грудня 1987р. під номером допуску №1-721. Модифікований вірус MVA відрізняється своїм 6 високим ступенем послабленості, тобто він має знижену вірулентність або інфекційність, зберігаючи при цьому гарну імуногенність. Вірус MVA був проаналізований для того, щоб визначити, які саме зміни є в його геномі у порівнянні з вірусом дикого типу CVA. В результаті цього аналізу були ідентифіковані шість головних делецій у генній ДНК (делеції І, II, III, IV, V та VI), всього 31000 пар основ (Meyer, Н., Sutter, G. and Ma yr A. [1991] J. Gen. Virol., 72, 1031-1038). У своєму колі хазяїв вірус, що був отриманий, чітко обмежений лише клітинами птахів. Окрім того, MVA відрізняється своєю крайньою послабленістю. Дослідження на різних тваринах показали, що вірус MVA є авірулентним навіть у тварин з послабленим імунітетом. Та ще важливіше, що штам MVA має чудові властивості, які були продемонстровані у широкомасштабних клінічних іспитах (Ma yr et al., Zbl. Bakt. Hyg. L, Abt. Org., В 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr., 99, 2386-2392 [1974]). Обстеження вище 120000 чоловік, вакцинованих вірусом MVA, показали, що у цих пацієнтів, включаючи пацієнтів з підвищеним ризиком зараження, були відсутні будь-які побічні ефекти. Було винайдено, що реплікація MVA у клітинах людини блокується на пізній стадії інфікування, що сприяє попередженню зборки зрілих інфекційних віріонів. Однак MVA здатний експресувати вірусні та рекомбінантні гени на високому рівні навіть у непермесивних клітинах, в результаті чого було запропоновано, що вірус MVA може служити в якості ефективного та безпечного вектору експресії генів (Sutter, G. and Moss, В. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10847-10851). Нещодавно були розроблені нові системи векторів на основі вірусу MVA, що має чужорідні ДНК-послідовності, які вбудовані до сайту делеції в геномі MVA або в гені ТК (Sutter, G. та Moss, В [1995] Dev. Biol. Stand. Basel, Karger, 84,195-200 та патент США №5185146). Для подальшого більш перспективного використання MVA, були проведені дослідження для розробки нових можливих шля хів введення чужорідних генів до штаму MVA вір усу коров'ячої віспи з використанням техніки рекомбінантних ДНК. Оскільки зміна геному вірусу MVA не була метою цих досліджень, то необхідно було використати цей метод, який відповідав би цим цілям. У відповідності з даним винаходом, була здійснена рекомбінація шляхом вбудовування чужорідної ДНК-послідовності до вірусної ДНК точно в сайт натуральної делеції, що є в геномі MVA. Даний винахід включає, inter alia, до свого об'єму (окремо або в комбінації): рекомбінантний вірус MVA, що містить та здатний експресувати принаймні один чужорідний ген, вбудований до сайту природної делеції в геномі MVA; вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, що містить та здатний експресувати принаймні один чужорідний ген, вбудований до сайту делеції II у геномі MVA; вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в якому чужорідний ген кодує маркер, терапевтичний агент або антигенну детермінанту; вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в якому чужорідний ген кодує антигенну детермінанту патогенного вірусу, бактерії або іншого мікроорганізма, паразиту або пухлинної клітини; вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в якому чужорідний ген кодує антигенну детермінанту Plasmodium Falciparum, мікробактерій, вірусу герпесу, вірусу грипу, вір усу гепатиту, або вірусу імунодефіциту людини; вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в якому антигенною детермінантою є nef ВІЛ або тирозиназа людини; вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, яким є MVA-LAInef або MVA-hTYR; вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в якому чужорідний ген кодує РНК-полімеразу Т7; вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, яким є MVA-pol T7; вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в якому чужорідний ген знаходиться під транскрипційним контролем раннього/пізнього промотору р7.5 вірусу коров'ячої віспи; вищевказані рекомбінантні віруси MVA, які в основному не здатні реплікуватися у клітинах людини; використання вищевказаного рекомбінантного вірусу MVA для транскрипції ДНК-послідовностей під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази Т7; еукаріотична клітина, інфікована будь-яким з вищевказаних рекомбінантних вірусів MVA; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом MVA, в якому чужорідний ген кодує РНКполімеразу Т7; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом MVA, в якому чужорідний ген кодує РНКполімеразу Т7, та містить, окрім того, один або декілька експресійних векторів, що несуть один або декілька чужорідних генів під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази Т7; використання вищевказаних клітин для продукування поліпептидів, що кодуються вказаними чужорідними генами, що передбачає: а) культивування вказаних клітин у відповідних умовах; та б) виділення поліпептидів, що кодуються вказаними чужорідними генами; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом MVA, в якому чужорідний ген кодує РНКполімеразу Т7, та, окрім того, містить експресійні вектори, що несуть вірусні гени, та/або вірусн у векторну конструкцію, кодуючу геном вірусного вектора під контролем транскрипційного промотору РНК-полімерази Т7; використання вищевказаних клітин для продукування вірусних частинок, що передбачає: а) культивування вказаних клітин у відповідних умовах; та б) виділення поліпептидів, що кодуються вказаними чужорідними генами; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом MVA, в якому чужорідний ген кодує РНКполімеразу Т7, та, окрім того, містить 10 експресійні вектори, що несуть вірусні гени, та/або вірусну векторну конструкцію, що кодується геном вірусного вектора під контролем транскрипційного промотора РНК-полімерази Т7; використання вищевказаних клітин для продукування вірусних частинок, що передбачає: а) культивування вказаних клітин у відповідних умовах; та б) виділення вірусних частинок; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом MVA, в якому чужорідний ген кодує РНКполімеразу Т7, та, окрім того, містить: а) експресійний вектор, що несе ретровірусну конструкцію, що здатна інфікува ти клітини-мішені та регулювати в цих клітинах-мішенях експресію одного або декількох чужорідних генів, присутніх у вказаній ретровірусній векторній конструкції; та б) один або декілька експресійних векторів, що несуть гени, які кодують поліпептиди, необхідні для геному вказаної ретровірусної векторної конструкції, що підлягає упаковці під транскрипційний контроль промотору РНК-полімерази Т7; використання вищевказаних клітин для продукування ретровірусних частинок, що передбачає: а) культивування вказаних клітин у відповідних умовах; та б) виділення ретровірусних частинок; вакцина, що містить вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в якому чужорідний ген кодує антигенну детермінанту, у фізіологічно придатному носії; використання вищевказаного рекомбінантного вірусу MVA, в якому чужорідний ген кодує антигенну детермінанту для отримання вакцини; використання вищевказаної вакцини для імунізації живого організму тварини, включаючи людину; використання вищевказаної вакцини, що містить MVA-L AInef, для попередження або лікування ВІЛінфекції або СНІДу; використання вищевказаної вакцини, що містить MVA-hTYR, для попередження або лікування меланоми; вакцина, що містить у якості першого компоненту вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в якому чужорідний ген кодує РНК-полімеразу Т7, у фізіологічно придатному носії; та в якості другого компоненту ДНК-послідовність, що несе антигенну детермінанту під транскрипційним контролем промотору РНКполімерази Т7, у фізіологічно придатному носії; при цьому два вказані компоненти присутні разом або окремо; використання вищевказаної вакцини для імунізації живого організму тварини, включаючи людину, що передбачає інокуляцію вказаного живого організму тварини, включаючи людину, першим та другим компонентом вакцини чи одночасно, чи з певним інтервалом часу, з використанням одного й того ж сайту інокуляції; та Термін "ген" означає ДНК-послідовність, яка кодує білок або пептид. Термін "чужорідний ген" означає ген, вбудований до ДНК-послідовності, в якій цей ген звичайно відсутній. Чужорідним геном може бути, наприклад, маркерний ген; терапевтичний ген; ген, що кодує антигенну детермінанту; або вірусний ген. Ці гени добре відомі спеціалістам. Модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (MVA), що має обмежене коло хазяїв та є у вищому ступені атенуйованим штамом вірусу коров'ячої віспи, не здатний розмножуватись у клітинах людини та в досліджених клітинних лініях більшості інших ссавців. Однак, оскільки експресія вірусного гену не порушується в непермесивних клітинах, то у відповідності з даним винаходом, рекомбінантні віруси MVA можуть бути використані в якості абсолютно безпечних та ефективних експресійних векторів. Рекомбінантні віруси MVA, що кодують антигенну детермінанту В одному з варіантів здійснення даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу MVA коров'ячої віспи, що містить ген, який кодує чужорідний антиген, переважно патогенний агент; та до вакцин, що містять вказаний вірус у фізіологічно прийнятній формі. Даний винахід також відноситься до способів отримання вказаного рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи MVA або вакцин на основі цього вірусу та до використання цих вакцин для профілактики інфекційних захворювань, викликаних вказаними патогенними агентами. У переважному варіанті даного винаходу, чужорідним геном, що вбудований до вірусу MVA, є ген, що кодує nef ВІЛ. Авторами даної заявки були сконструйовані рекомбінантні віруси MVA, які дозволяють здійснити експресію гену nef BIЛ-1 під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Регуляторний білок Nef лентивірусів приматів синтезується на ранній стадії реплікативного циклу вірусу; при цьому було показано, що цей білок грає важливу роль в реплікації вірусу з високим титром та індукуванні захворювань in vivo. Це дозволяє передбачити, що nef ВІЛ може грати вирішальну роль у патогенезі СНІДу. Молекулярні механізми, завдяки яким пеf_сприяє збільшенню інфекційності та патогенності вірусу ВІЛ, потребують додаткового дослідження. Однак очевидно, що nef є імуногенним, та nef-специфічний антиген може бути використаний у якості вакцини проти ВІЛ-інфекції та СНІДу. У відповідності з цим очевидно, що, з однієї сторони, рекомбінантний вірус MVA, що експресує ген nef ВІЛ, може бути використаний у якості профілактичної вакцини проти ВІЛ для імунізації людини, а з іншої сторони, він може бути використаний для імунотерапії ВІЛ-інфікованих пацієнтів або хворих на СНІД. Окрім того, рекомбінантний вірус MVA, що експресує ген nef ВІЛ, може бути використаний для продукування рекомбінантного білка ВІЛ. В іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу чужорідним геном, вбудованим до вірусу MVA, є ген, що кодує тирозиназу людини. Авторами даної заявки були сконструйовані рекомбінантні віруси MVA, які дозволяють здійснити експресію гену тирозинази людини під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Нещодавно тирозиназа людини була ідентифікована як меланомо-специфічний пухлинний антиген, який сприяє генеруванню протипухлинних цитолітичних Т-лімфоцитів (Brichard, V., et al., [1993] J. Exp. Med., 178, 489-495). Оскільки серед нормальних клітин, вірогідно, лише меланоцити експресують ген тирозинази, то очевидно, що тирозиназа є цінним антигеном-мішенню для імунотерапії меланоми. Тому рекомбінантний вірус MVA, що експресує ген тирозинази людини, може бути використаний для продукування у пацієнтів, що страждають меланомою, імунної відповіді, яка стимулює відторгнення пухлини або попереджуючої появи метастазів. Рекомбінантний вірус MVA, що експресує ген тирозинази людини, може бути використаний безпосередньо в якості вакцини проти меланоми, чи цей вірус може бути використаний для продукування рекомбінантного білка тирозинази, який може служити в якості антигену у вакцинних препаратах. В іншому прикладі, клітини, що взяті з пухлини пацієнта, можуть бути модифіковані in vitro з використанням у якості вектору рекомбінантного вірусу MVA, що експресує ген тирозинази людини, а потім модифіковані клітини, що експресують тирозиназу, переносять зворотно в організм пацієнта для індукування у нього протипухлинної імунної відповіді. Вакцина, отримана на основі рекомбінантного MVA, що експресує ген тирозинази людини, може бути використана або парентерально, або місцево шляхом введення безпосередньо в область пухлини. Для попередження появи метастазів або для фенотипічної зміни пухлини, наприклад зміни її розмірів, форми, консистенції, васкуляризації або інших ознак, вакцина, отримана на основі рекомбінантного вірусу MVA, що експресує ген тирозинази людини, може бути введена до, під час або після хірургічного видалення пухлини. Для виготовлення вакцин у відповідності з даним винаходом віруси коров'ячої віспи MVA готують у відповідній фізіологічно прийнятній формі. Це може бути зроблено, виходячи з досвіду о тримання MVAвакцин, призначених для противіспяної вакцинації (як описано Stickl, H. et al., [1974] Dtsch. med. Wschr., 99, 2386-2392). Для цього близько 106-108 частинок рекомбінантного MVA ліофілізують у 100мл забуференого фосфа том фізіологічного розчину (PBS) у присутності 2% пептону та 1% альбуміну людини в ампулі, переважно у скляній ампулі. Ліофілізат може містити наповнювачі (такі як маніт, декстран, цукор, гліцин, лактоза або полівінілпіролідон) або інші добавки (такі як антиоксиданти, стабілізатори т. ін.), які підходять для парентерального введення. Потім скляну ампулу герметично запаюють, та ця ампула може бути залишена на зберігання протягом декількох місяців при температурі переважно -20°С. Для вакцинації або терапії ліофілізат може бути розчинений у 0,1-0,5мл водного розчину, переважно фізіологічного розчину, та введений або парентерально, наприклад шляхом внутрішньом'язової інокуляції або локально, наприклад шляхом інокуляції у саму пухлин у або в область локалізації пухлини. Вакцини або терапевтичні засоби даного винаходу переважно вводять шляхом внутрішньом'язової ін'єкції (Mayr, A. et. al., [1978] Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. В, 167, 375-390). Спосіб, доза та схема введення можуть бути оптимізовані власне фахівцем відомими способами. Для того щоб отримати відповідну імунну відповідь проти чужорідного антигену, бажано вводити вакцину декілька разів протягом тривалого періоду часу. Використання вірусів MVA для продукування гетеро логічних поліпептидів У відповідності з даним винаходом рекомбінантні віруси коров'ячої віспи MVA можуть бути також використані для продукування гетерологічних поліпептидів в е укаріотичних клітинах. Для цього клітини інфікують рекомбінантними вірусами коров'ячої віспи. В інфікованих клітинах експресуються гени, що кодують чужорідний поліпептид, в результаті чого продукується гетерологічний поліпептид, який потім виділяють. Методи, що використовуються для продукування таких гетерологічних поліпептидів, добре відомі фахівцям (ЕР-А-206920 та ЕР-А-205939). Поліпептиди, продуковані за допомогою рекомбінантних вірусів MVA, більше підходять, виходячи з конкретних властивостей вірусів MVA, для використання у якості лікарських засобів для введення людині та тваринам. Рекомбінантні віруси MVA, що кодують РНК-полімеразу Т7, їх використання для експресії ДНКпослідовностей під контролем промотору РНК-полімерази Т7 В іншому варіанті здійснення даного винаходу авторами винаходу були сконструйовані рекомбінантні віруси MVA, що дозволяють експресувати ген РНК-полімерази бактеріофага Т7 під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Ефективність рекомбінантних вірусів MVA-pol T7 у якості експресуючих систем оцінювали за допомогою аналізу методом короткочасної трансфекції для індукування експресії рекомбінантних генів під контролем промотору РНК-полімерази Т7. Використовуючи в якості гена-репортера ген хлорамфеніколацетилтрансферази (CAT) E.coli, автори винайшли, що MVA-pol Т7-індукована експресія гену CAT є такою ж ефективною, як і експресія, індукована вірусом коров'ячої віспи/рої Т7, що походить від компетентного по відношенню до реплікації штаму WR вір усу коров'ячої віспи. Таким чином, гібридна система MVA-pol T7 даного винаходу може бути використана в якості простої, ефективної та безпечної експресійної системи для продукування поліпептидів у клітинах ссавців при відсутності вірусу коров'ячої віспи. Ця експресійна система може бути також використана в цілях генерування рекомбінантних вірусних частинок для вакцинації або генної терапії шляхом трансформації клітинних ліній, які інфіковані рекомбінантним вірусом MVA, що експресує РНК-полімеразу Т7, тобто інфікованих ДНК-конструкцією, що містить усі або деякі гени, та геном або рекомбінантний геном, які необхідні для генерування вірусних частинок, наприклад, MVA-частинок або ретровірусних частинок під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази Т7. Векторні системи на основі ретровірусів складаються з двох компонентів: 1) першим компонентом є власне ретровірусний вектор, що представляє собою модифікований ретровірус (векторну плазміду), в якому гени, що кодують вірусні білки, були замінені терапевтичними генами та маркерними генами, які необхідні для введення у клітину-мішень, оскільки така заміна генів, що кодують вірусні білки, приводить до значного пошкодження вірусу, то цей вірус може бути "врятований" за допомогою другого компоненту в системі, який доповнює відсутність вірусних білків у модифікованому ретровірусі; 2) другим компонентом є клітинна лінія, яка продукує великі кількості вірусних білків, але при цьому не має здатності продукувати компетентний по реплікації вірус. Така клітинна лінія відома як лінія клітин з дефектом упаковки та представляє собою клітинну лінію, трансфіковану однією або декількома плазмідами, що несуть гени (гени gag, роl та env, що кодують поліпептиди), які забезпечують упаковку модифікованого ретровірусного вектора. Для генерування запакованого вектору, векторну плазміду трансфікують у лінію клітин з дефектом упаковки. В цих умовах модифікований ретровірусний геном, що включає вбудовані терапевтичні та маркерні гени, транскрибується з векторної плазміди та упаковується в модифіковані ретровірусні частинки (рекомбінантні вірусні частинки). Потім цей рекомбінантний вірус використовують для інфікування клітинмішеней, у ДНК яких можуть інтегруватися геном вектора та будь-які присутні в ньому маркерні або терапевтичні гени. Клітина, що інфікована такою рекомбінантною вірусною частинкою, не може продукувати новий векторний вірус, оскільки в цих клітинах відсутні вірусні білки. Однак ДНК вектор, що несе терапевтичні та маркерні гени, інтегрується в ДНК клітини, та може експресуватися в інфікованих клітинах. У відповідності з даним винаходом, рекомбінантний вірус MVA, що експресує РНК-полімеразу Т7, може бути використаний для продукування білків, які необхідні для упаковки ретровірусних векторів. Для цього гени gag, роl, env ретровірусу (наприклад, вірус лейкоза мишей (MLV)) вміщують в один або декілька експресійних векторів (наприклад, плазмід) під транскрипційний контроль промотору РНК-полімерази Т7, разом з експресійним вектором, що несе ретровірусну векторну конструкцію, можливо під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази Т7. В WO 94/29437, WO 89/11539 та WO 96/07748 описані різні типи ретровірусних векторних конструкцій, які можуть бути упаковані з використанням системи для упаковки, яка описана вище. Окрім того, рекомбінантний вірус MVA, що експресує РНК-полімеразу Т7, може бути використаний для продукування рекомбінантних білків, неінфікованих вірусни х частинок, або інфекційних мутантних вір усних частинок у цілях виготовлення вакцин або терапевтичних засобів (Bucholz et al., Virology, 204, 770-776 [1994] та ЕР-В1-356695). Для цього вірусні гени (наприклад, гени gag-pol та env вірусу ВІЛ-1) вміщували під транскрипційний контроль промотору Т7 в експресійний вектор (наприклад, у плазміду або інший рекомбінантний вірус MVA). Потім цю конструкцію вводили до клітин, що інфіковані рекомбінантним вірусом MVA, який експресує РНК-полімеразу Т7. Гени рекомбінантного вірусу транскрибуються з високим ступенем ефективності, в результаті чого можуть бути отримані та очищені білки у великих кількостях. Окрім того, експресовані рекомбінантні вірусні білки (наприклад, env, gag BIJI-1) можуть збиратися у вірусні псевдочастинки, які реплікуються та відділяються від клітини, після чого вони можуть бути виділені з середовища з тканинною культурою. В іншому варіанті здійснення винаходу, вір усні білки (наприклад, вірусів ВІЛ, SIV та вірусу кору), що експресуються MVA-pol T7 системою, можуть спасати додатково введений мутантний вірус (який походить, наприклад від ВІЛ, SIV, вірусу кору) шля хом подолання дефекту інтеграції; а також інфікування, декапсидація, реплікація нуклеїнової кислоти, експресія вірусного гена, збирання, баддінг або інша стадія розмноження вірусу дозволяють виконувати продукування і очищення вищезгаданого мутантного вірусу. Вірус MVA-pol T7 може бути також використано разом з ДНК-послідовностями, що несуть ген потрібного антигена (наприклад, ген ВІЛ, nef, tat, роl, gag, env або інші гени), необхідний для імунізації. Спочатку кодуючу послідовність даного антигена (наприклад ВІЛ, HCV, HPV, HSV, вір усу кору, вірусу грипу або ін.) клонують під контролем промотора РНК-полімерази Т7 переважно в плазмідний вектор, а отриману ДНКконструкцію ампліфікують та очищують з використанням стандартних лабораторних процедур. Потім векторну ДНК інокулюють одночасно або з деяким інтервалом часу разом з MVA-pol T7. В місці інокуляції потрібний рекомбінантний ген піддається тимчасовій експресії в клітинах, які містять векторну ДНК і MVApol T7, і відповідний антиген презентується імунній системі хазяїна, стимулюючи антиген-специфічну імунну відповідь. Ця схема, що передбачає використання вектора MVA-pol T7, що не реплікується, на основі вірусу коров'ячої віспи, є багатообіцяючим новим способом вакцинації нуклеїновою кислотою, що забезпечує ефективну часову експресію даного антигена, але при цьому дозволяє уникнути потенціального ризику конститутивної експресії гена. Рекомбінантні віруси MVA, що походять від вірусу коров'ячої віспи, можуть бути отримані, як описано нижче. ДНК-конструкцію, яка містить ДНК-послідовність, що кодує чужорідний поліпептид, іфланковану MVAДНК послідовностями, суміжними з природною делецією, наприклад делецією II в геномі MVA, вводять в клітини, інфіковані вірусом MVA, в результаті чого відбувається гомологічна рекомбінація. Після введення ДНК-конструкції в еукаріотичні клітини і після рекомбінації із заміною вірусної ДНК на чужорідну ДНК, рекомбінантний вірус коров'ячої віспи може бути виділено відомими способами, переважно за допомогою маркера (пор. Nakano et al., Proc. Natl. Acag. Sc. USA,79,1593-1596 [1982], Franke et al., Mol. Ctll. Biol., 1918-1924 [1985], Chakrabarti et al., Mol. Ctll. Biol., 3403-3409 [1985], Fathi et al., Virologi 95-105 [1996]). ДНК-конструкція, що вводиться, може бути лінійною або кільцевою. Більш бажаною є кільцева ДНК, зокрема - плазміда. ДНК-конструкція містить послідовності, що фланкують лівий і правий краї природної делеції, наприклад делеції II в геномі MVA (Altenburger W., Suter С.Р., Altenburger J. [1989] Arch. Virol., 105, 15-27). Чужорідну ДНК-послідовність вбудовують між послідовностями, що фланкують природну делецію. Такою чужорідною ДНК-послідовністю може бути ген, що кодує терапевтичний поліпептид, наприклад, t-PA або інтерферон, або антигенну детермінанту патогенного агенту. Такими патогенними агентами можуть бути віруси, бактерії і паразити, які можуть викликати захворювання, а також пухлинні клітини, які безконтрольно розмножуються в організмі і можуть приводити до утворення і зростання пухлини. Приклади таких патогенних агентів описані Davis B.D. et al. (Microbiology, 3rd ed., Harper International Edition). Більш бажаними антигенами патогенних агентів є віруси імунодефіциту людини (наприклад, ВІЛ-1 і ВІЛ-2), мікобактерії, що викликають туберкульоз, паразит Plasmodium falciparum і клітини меланоми. Для експресії ДНК-послідовності або гена потрібна присутність регуляторних послідовностей, які необхідні для транскрипції генів, що присутні на ДНК-послідовності. Такі регуляторні послідовності (що називаються промоторами) добре відомі спеціалістам, та прикладом таких послідовностей може служити промотор гену вірусу коров'ячої віспи, що кодує поліпептид 11кДа (описано в ЕР-А-198328), і промотор гена, що кодує 7,5кДа (описано в ЕР-А-110385). ДНК-конструкцію може бути введено в MVA-ін фіковані клітини шляхом трансфекції, наприклад шляхом преципітації фосфатом кальцію (Graham et al., Virol., 52, 456-467 [1973]; Wigler et al., Cell, 777-785 [1979]); шляхом електропорації (Neumann et al., EMBO J., 1, 841-845, [1982]); шляхом мікроін'єкції (Graesmann et al., Meth. En zymology, 101, 482-492 [1983]); шляхом використання ліпосом (Straubinger et al., Methodas in Enzymology, 101, 512-527 [1983]); за допомогою сферопластів (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2163-2167 [1980]), або якимось іншими відомими методами. При цьому більш бажаним методом трансфекції є осаджування фосфатом кальцію. Для кращого розуміння суті цього винаходу нижче наводяться докладні приклади його втілення. Однак ці приклади не повинні розглядатися як деяке обмеження об'єму винаходу. Опис креслень Фіг.1: Схематична карта генома MVA і плазміди для інсерції чужорідної ДНК шляхом гомологічної рекомбінації: HindllІ-рестрикційні сайти в геномі MVA вказані зверху. Вказана також Hindlll-Hindlll Nфрагмент (900 п.о.), який перекриває область делеції II в геномі MVA. ДНК-послідовності MVA, що примикають до делеції II (край 1 (flank 1)) та край 2 (flank 2)) були ампліфіковані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR) та використані для конструювання інсерційної плазміди pUC II LZ. Фіг.2: pUC II LZ P7.5: плазмідний вектор MVA, що призначений для інсерції в делецію II та містить експресуючий P11-LacZ-кластер та ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, для експресії потрібних генів, які можуть бути клоновані у Smal-сайт плазміди. Фіг.3: pUC II LZdel P7.5: MVA-плазмідний вектор для інсерції чужорідних генів в сайт делеції II у геномі MVA, що містить експресійний Р11-LacZ-кластер, що самоделетуючий, та ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи для експресії потрібних генів, які можуть бути клоновані в Sma1/Not1-сайт клонування плазміди. Фіг.4: Конструювання рекомбінантного вірусу MVA-pol T7: схематичні карти геному MVA (рестрикційні HindllІ-сайти ендонуклеази) та векторна плазміда pUC II LZ T7pol, за допомогою якої здійснюють інсерцію ген РНК-полімерази Т7 в сайт делеції II в HindllІ-фрагменті N геному MVA. Фіг.5: Саузерн-блот-аналіз ДНК вірусу MVA-pol 17. Фіг.6: Метаболічне мічення білків з використанням [35S] метіоніну. Аналіз за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН. Шля х 1: MVA-pol T7; шля х 3: клітини CV-1. Фіг.7: САТ-аналіз: клітини CV-1 трансфікували плазмідою, що містить ген CAT під контролем промотору РНК-полімерази Т7б та інфікували вірусом MVA-T/pol або WR-polT7. Лізати тестували на С АТ-активність "С" означає хлорамфенікол, та 1-АсС та 3-АсС означають моно- та триацетильовані форми хлорамфеніколу. САТ-активність виражали як процент ацетильованого продукта, утвореного за 60 хвилин. Фіг.8: Конструювання MVA-LAІnef: схематичні карти геному MVA (рестрикційні HindllІ-сайти ендонуклеази) та векторної плазміди pUC II LZdel р7.5-LAInef, за допомогою якої здійснюють інсерцію гену nef ВІЛ-1 LAI в сайт делеції II в HindllІ-фрагмент N геному MVA. Фіг.9: Конструювання MVA-hTYR: схематичні карти геному MVA (рестрикційні HindllІ-сайти ендонуклеази) та векторної плазміди pUC II LZdel P7.5-TYR, за допомогою якої здійснюють інсерцію гену тирозинкінази в сайт делеції II в HindllІ-фрагмеші N геному MVA. Приклади 1. Культивування та очистка вірусів 1.1. Культивування вірусу MVA Вірус MVA є у високому ступені ослабленим вірусом коров'ячої віспи, отриманим від штаму вірусу коров'ячої віспи Анкара (CVA) в результаті довготривалого серійного пасування на культурі первинних фібробластів курячого ембріону (CEF). Із загальним оглядом історії продукування, властивостей та використання штаму MVA можна ознайомитись у коротких публікаціях Ma yr et al., in Infection, 3, 6-14 [1975]. Завдяки атенуації в CEF, в цій пташиній клітині-хазяїні вірус MVA реплікується з високим титром. Однак у клітинах ссавця ріст MVA сильно обмежений, та звичайне утворення бляшек під дією вірусу не виявляється. Тому вірус MVA був культивований на клітинах CEF. У цілях отримання клітин CEF 11-денні ембріони виділяли з інкубованих курячих яєць, кінцівки видаляли, та ембріони подрібнювали та дисоціювали в розчині, що містить 0,25% трипсину, за температури 37°С протягом 20 хвилин. Отриману клітинну суспензію фільтрували та клітини осаджували шляхом центрифугування при 2000об/хв. у центрифузі Sorvall RC-3B за кімнатної температури протягом 5 хвилин, а потім ресуспендували в 10 об'ємах середовища А (середовище Ігла (DMEM), що отримується, наприклад, від Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany), після чого знову осаджували шляхом центрифугування при 2000об/хв. у центрифузі Sorvall RC-3B за кімнатної температури протягом 5 хвилин. Після центрифугування клітинний осад переносили в середовище А, що містить 10% фетальну сироватку теляти (FCS), пеніцилін (100 одиниць/мл), стрептоміцин (100мг/мл) та 2мМ глутамін, у результаті чого отримували клітинну суспензію, що містить 500000 клітин/мл. Клітини CEF, отримані у такий самий спосіб, наносили шляхом розпилення на чашки для культивування клітин. Ці клітини культивували в середовищі А в інкубаторі з СО2 за 37°С протягом 1-2 днів залежно від потрібної щільності клітин та використовували для інфікування або відразу, або після одного клітинного пересіву. Детальний опис отримання первинних культур може бути знайдено в роботі R.I. Freshney, "Culture of animal cell", Alan R. Liss Verlag New York 1983. Chapter II, стор. 99. Віруси MVA інфікували наступним чином. Клітини CEF культивували в 175см 2 флаконах для культивування клітин. При 90-100% суцільності середовище видаляли, та клітини інкубували протягом однієї години з суспензією вірусу MVA (0,01 одиниць інфекції (ME) на клітину, 0,02мл/см 2) в середовищі А. Потім додавали додатково кількість середовища А (0,2мл/см 2) та флакони інкубували за температури 37°С протягом 2-3 днів (доки 90% клітин не починали проявляти цитопатогенний ефект). Неочищений вірусний вихідний матеріал був отриманий шляхом зскрібання клітинних моношарів у середовищі та осадження клітинного матеріалу шляхом центрифугування при 3000об/хв. у центрифузі Sorvall RC-3B за температури 4°С протягом п'яти хвилин. Неочищений вірусний препарат зберігали за температури -20°С перед подальшою обробкою (наприклад, очисткою вірусу). 1.2. Очистка вірусів Для того щоб отримати по можливості чистий вірусний препарат, який не містить компонентів, специфічних для цієї хазяйської клітини, проводили стадії очистки способом, аналогічним описаному Joklik (Virology, 18, 9-18 [1962]). Неочищений вірусний вихідний матеріал витримували за температури -20°С, а потім відтаювали та один раз суспендували в PBS (10-20-кратний об'єм осаду), після чого суспензію центрифугували, як описано вище. Щойно отриманий осад суспендували в десяти об'ємах буфер у Трис 1 (10мМ Трис-НСІ, рН=9,0), та суспензію швидко обробляли ультразвуком (Labsonic L., B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany; 2x10 секунд при 60Ват та при кімнатній температурі) в цілях подальшого дезінтегрування клітинного дебрису та вивільнення вірусних часток з клітинного матеріалу. Ядра клітин та більшу частину клітинного дебрісу видаляли шляхом швидкого центрифугування суспензії (роторна центрифуга Sorvall GSA від DuPont Co., D-6353 Bad Nauheim, FRG; 3 хвилини при 3000об/хв. та температурі 10°С). Осад знову один раз суспендували в буфері Трис 1, обробляли ультразвуком та центрифугували, як описано вище. Зібрані супернатанти, що містять вільні вірусні частки, об'єднували та покривали градієнтом 10мл 30% сахарози в 10мМ Трис-НСІ з рН=9,0, а потім центрифугували в центрифузі Beckman SW 27/SW 28 при 13500об/хв. протягом 80 хвилин за температури 4°С. Потім супернатант відкидали, а осад, що містить вірусні частки, розчиняли в 10мл 1мМ Трис-НСІ з рН=9,0, гомогенізували шляхом швидкої обробки ультразвуком (2x10 секунд за кімнатної температури з використанням пристрою, описаного вище) та наносили на градієнт 20-40% сахарози (сахароза в 1мл Трис-НСІ, рН=9,0) для подальшої очистки. Градієнт центрифугували в роторній центрифузі Beckmann SW41 при 13000об/хв. протягом 50 хвилин за температури 4°С. Після центрифугування дискретні смуги, що містять вірусні частки, збирали шляхом піпетування після зменшення об'єму вищевказаної смуги. Отриманий розчин сахарози розводили трьома об'ємами PBS та вірусні частки знову осаджували шля хом центрифугування (Beckmann SW27/28, 60 хвилин при 13500об/хв., температура 4°С). Осад, який складався головним чином з чистих вір усних часток, ресуспендували в PBS та врівноважували до середніх концентрацій вірусу, що складає в середньому 15x109МЕ/мл. Розчин очищеного вірусного вихідного матеріалу зберігали при -80°С та використовували або відразу, або розводили фосфатно-буферним фізіологічним розчином для проведення подальших експериментів. 1.3 Клонування вірусу MVA Для генерування гомогенних вихідних вірусних препаратів вірус MVA, отриманий від Prof. Anton Mayr, клонували шляхом лімітуючого розведення протягом трьох подальших пересівів у клітини CEF, культивовані на 96-лункових планшетах для культивування тканини. Клон F6 MVA відбирали та ампліфікували в CEF з отриманням маточних розчинів вірусу, які служать у якості вихідного матеріалу для генерування рекомбінантних вірусів MVA, описаних у даній патентній заявці, а також для генерування рекомбінантних вірусів MVA, описаних раніше (Sutter, G. та Mose, В., [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851; Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. та Moss, В., [1994], Vaccine 12, 1032-1040; Hirsch, V., Fuerst, Т., Sutter, G., Carroll, M., Yang, L., Golgstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B. and Lifson, J., [1986] J. Virol., 70 3741-3752). 2. Конструювання та характеризація рекомбінантних вірусів MVA 2.1. Конструювання векторних плазмід У цілях генерування рекомбінантих вірусів MVA були сконструйовані нові векторні плазміди. Вбудовування чужорідних генів у геном MVA здійснювали точно в сайт природної делеції II в геномі MVA. Послідовності MVA-ДНК, фланкуючи сайт 2500 п.о.-делеції у HindllІ-фрагменті N геномі MVA (Altenburger, W. Suter, С.Р. та Altenburger, J. [1989], J. Arch. Virol., 105, 15-27), були ампліфіковані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та клоновані в сайт множинного клонування плазміди pUC18. Праймерами для лівого 600 п.о.-ДНК-краю є: 5'-CAG CAG GGT АСС СТС АТС GTA CAG GAC GTT СТС-3' та 5'-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG АТТ АТТ ТТТ ААС ААА АТА АС А-3' (сайти для рестриктуючи х ферментів Крnl та Smal підкреслені). Праймерами для правого 550 п.о.-ДНК-краю є: 5'-CAG C AG CTG C AG GAA TC A TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3' та 5'-CAG C AG GC A TGC CGA CGA АСА AGG AAC TGT AGC AGA-3' (сайти для рестриктуючи х ферментів Pstl та SphI підкреслені). Між цими краями MVA ДНК, вставленій в pUC18, вбудовували ген lacZ Escherichia coli під контролем пізнього промотору Р11 вірусу коров'ячої віспи (отриманого шляхом гідролізу ферментом plll LZ, Slitter, С. and Moss, В. [1992] PNAS USA 89, 10847-10851) з використанням BamHI-сайта, в результаті чого отримували інсерційний MVA-вектор pUCII LZ (Фіг.1). Після цього 289 п.о.-фрагмент, що містить ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи разом з Smalсайтом для клонування (отриманим шляхом рестрикції ферментами EcoRl та Xbal з плазмідного вектору pSC11 [Chakrabarti та ін., 1985, Molecular та Cellular Biology 5, 3403-3409]), вставляли Smal-сайт pUCII з отриманням MVA-вектора pUCII LZ P7.5 (Фіг.2). Для конструювання векторної плазміди, яка дозволяє виділяти рекомбінантні віруси MVA шляхом часового синтезу репортерного ферменту-b-галактозидази, 330 п.о.-ДНК-фрагмент від 3'-кінця відкритої рамки зчитування LacZ. Е. coli ампліфікували за допомогою PCR (праймери 5'-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC СТТ ACT GCC GCC-3' та 5'-GGG GGG CTG C AG ATG GTA GCG ACC GGC GCT C AG-3') та клонували в Sall та Рstl-сайти pCU II LZ P7.5 з отриманням MVAвектору pUC II LZdel P7.5 (Фіг.3). З використанням Smal-сайту, ця векторна плазміда може бути використана для вставки ДНК-послідовностей, кодуючих чужорідний ген під транскрипційним контролем промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, в геном MVA. Після цього потрібний рекомбінантний вірус виділяли шляхом скринінгу на експресію b-галактозидазної активності та подальше його культивування призводило до самоделеції знову сконструйованого P11-LacZ-експресуючого кластера в результаті гомологічної рекомбінації. 2.2. Конструювання та характеризація рекомбінантного вірусу MVA-polT7 3,1 kbp-ДНК-фрагмент, що містить повний ген РНК-полімерази бактеріофагу Т7 під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, вирізали ферментом EcoRI з плазміди pTF7-3 (Fruest, T.P., Niles, E.G., Studier, F.W. and Moss, В., [1986], P>N>A>S> USA, 83, 8122-8126), модифікували шляхом інкубування ДНК-полімерази фрагментом Кленова для продукування тупих кінців та клонували в унікальний Smal-сайт рестрикції LZ pUCII з утворенням плазмідного вектору переносу pUCII-LZ-pol T7 (Фіг.4). В якості транскрипційного регулятору для експресії гену РНК-полімерази Т7 був вибраний ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи (наприклад, Р11) ця промоторна система дозволяє експресувати рекомбінантні гени безпосередньо після інфікування клітин-мішеней. LZ-pol Т7-плазміда pUCII, яка забезпечує введення чужорідних генів у сайт делеції II геному MVA, була використана для генерування вірусу MVA-pol T7. Клітини CEF інфікували вірусом MVA при множинності інфекції ТСID50=0,05 на клітину та трансфікували ДНК плаз-LZ-pol Т7-плазміди pUCII, як описано раніше (Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. та Moss, В., [1994], Vaccine 12, 1032-1040). Рекомбінантний вірус MVA, експресуючий РНК-полімеразу Т7 та сумісно експресуючий b-галактозидазу (P7.5-pol T7 MVA), відбирали в результаті проведення п'яти послідовних циклів очистки методом бляшек у клітинах CEF, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-b-D-галактозидом (300мкг/мл). Рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів CEF, та ДНК аналізували за допомогою PCR для підтвердження генетичної однорідності вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК MVA-pol T7 продемонстрував стабільну інтеграцію рекомбінантних генів у сайт делеції II в геномі MVA (Фіг.5). Для спостереження за експресією РНК-полімерази Т7 шляхом рекомбінантного MVA-pol T7 були проаналізовані мічені [35S] метіоніном поліпептиди від вірус-інфікованої культури тканини. Моношари клітинної лінії нирок мавпи CV-1, культивовані в 12-лункових планшетах, інфікували вірусом при множинності інфекції ТСID50=20 на клітину. Через 3-5 годин після інфікування середовище видаляли, та культури один раз промивали 1мл середовища, що не містить метіоніну. В кожну лунку додавали 0,2мл середовища, що не містить метіоніну, разом з 50мкКи [35S] метіоніном та середовище інкубували протягом 30 хвилин за 37°С. Цитоплазматичні екстракти інфікованих клітин отримували шляхом інкубування кожної лунки в 0,2мл 0,5% буферу для лізису Nonidet P-40 протягом 10 хвилин при 37°С, та зразки аналізували шляхом електрофорезу в П ААГ з ДСН. Метаболічне мічення клітин CV-1 вірусом MVA-pol T7 виявило синтез двох додаткових поліпептидів (і) білку розміром біля 116000Да, що представляє собою сумісно експресовану b-галактозидазу Е. соIі, яка дозволяє проводити скринінг на рекомбінантний вірус; та (іі) білка з очікуваним розміром 98000Да, що відповідає РНК-полімеразі бактеріофагу Т7 (Фіг.6). При цьому було відмічено, що MVA-T7pol продукує велику кількість b-галактозидази. Експерименти з in vivo-міченням продемонстрували дуже високий рівень експресії Р11-LacZ-ген-вмісній конструкції, введеній у геном MVA в сайт делеції 11, що свідчить про те, що рекомбінантні гени у векторному вірусі MVA можуть бути експресовані з великою ефективністю в тому випадку, якщо вони вбудовані саме в цій локус геному MVA. Ефективність рекомбінантних вірусів MVA-pol T7 як експресуючих систем у порівнянні з рекомбінантним WR-T7pol вірусом vTF7-3 (Fuerst та ін., 1986) оцінювали шляхом ко-трасфекції ДНК плазмідного вектору, що походить від pTMl (Moss, В., Elroy-Stein, О., Mizukami, Т., Alexander, W.A., & Fuerst T.R. [1990] Nature, 348, 91-92), та містить ген (клонований у Ncol- та ВаmHI-сайти множинного клонування рТМ1) хлорамфеніколацетилтрансферази (CAT) E. coli під контролем промотору РНК-полімерази Т7 (РТ7). Трансфіковані та інфіковані клітини CV-1 суспендували в 0,2мл 0,25М Трис-НСІ (рН=7,5). Після трьох циклів заморожування-відтаювання лізати освітлювали шляхом центрифугування, а потім визначали вміст білка в супернатантах, та зразки, що містять 0,5; 0,25; 0,1мкг повного білку, аналізували на ферментну активність методом, описаним Mackett, М., Smith, G.L. & Moss, В., [1984], J. Virol., 49, 857-864. Після авторадіографії кількість мічених плям оцінювали з використанням візуалізуючої аналітичної системи Fuji. Отримані результати проілюстрували, що шля хом використання у високому ступені атенуйованого вектору MVA на основі вірусу коров'ячої віспи може бути отримана система "вірус коров'ячої віспи-РНК-полімераза Т7", яка являється такою ж ефективною, як і при використанні досить компетентного по реплікації рекомбінанта на основі вірусу коров'ячої віспи (Фіг.7). 2.3. Конструювання та характеризація рекомбінантного вірусу MVA-L AInef 648 п.о.-ДНК-фрагмент, що містить повний ген nef LAI BIЛ-1, отримували за допомогою PCR з плазмідною ДНК (pTG1166, люб'язно наданою М.-Р. Kieny, Transgene S.A., Strasbourg; для PCR використовували наступні праймери: 5'-CAG C AG GGA ТСС ATG GGT GGC AAG TGG ТСА ААА AGT AGT-3' та 5'-CAG C AG GGA ТСС ATG ТС А GC A GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'), гідролізували рестриктуючою ендонуклеазою ВаmHI, модифікували шляхом інкубування з ДНК-полімеразою Кленова для "затупіння кінців", та клонували в Smal-сжт pUC II LZ-del P7.5, в результаті чого отримували вектор pUC II LZdel P7.5LAInef (Фіг.8). Ця плазміда може бути використана для конструювання рекомбінантного вірусу MVA, який експресує ген nef ВІЛ-1-LAI під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Клітини CEF, інфіковані вірусом MVA при множинності зараження TCID50=0,05 (TCID - середня цитопатогенна доза) на клітину, трансфікували ДНК плазміди pUC II LZdel-P7.5-LAInef, як описано раніше (Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J., & Moss, B. [1994] Vaccine, 12, 1032-1040). Рекомбінантні віруси MVA, що містять ген nef та сумісно маркерний ген LacZ E. coli, що сумісно експресується з часовою регуляцією, відбирали шляхом проведення послідовних циклів очистки методом бляшек у клітинах CEF, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-b-D-галактозидом (300мкг/мл). Після цього рекомбінантні віруси, що містять ген nef та мають делетований маркерний ген LacZ, виділяли шляхом проведення ще трьох додаткових послідовних циклів очистки методом бляшек, здійснюючи скринінг на непофарбовані фокуси вірусу у клітинах CEF у присутності 5-бром-4-хлор-3-індоліл-b-D-галактозида (300мкг/мл). Потім рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів, та MVA-L AInef-вір усну ДНК аналізували за допомогою PCR для того, щоб упевнитись у генетичній гомогенності вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну стабільність MVA-LAInef та явно продемонстрував інтеграцію гену nef та делецію маркерного гену LacZ Е. соIі в сайті делеції 11 у вірусному геномі. Ефективна експресія рекомбінантного білку Nef була підтверджена за допомогою Вестерн-блот-аналізу білок-продукуючи х лізатів клітин CEF, інфікованих вірусом MVA-L AInef з використанням мишачих mАВ проти Nef ВІЛ-1 (люб'язно наданих K. Krohn та використаних як описано Ovod, V., Lagerstedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R., Tahtinen, M., Jung, G., & Krohn, K. [1992] AIDS, 6, 25-34. 2.4. Конструювання та характеризація рекомбінантного вірусу MVA-hTYR 1,9 п.о.-ДНК-фрагмент, що містить повний ген, кодуючий тирозиназу людини [кДНК-клон тирозинази 123.В2 виділяли з клітинної лінії меланоми SK29-MEL пацієнта SK29 (AV), GenBank № допуску UO1873; Brichard, V., Van Pel, A., Wölfel, Т., Wölfel, C, De Plaen, E., Lethe, В., Coulie, P. та Boon, B. (1993), J. Exp. Med., 178, 489-495] отримували з плазміди pcDNAI/Amp-Tyr (Wölfel, Т., Van Pel, A., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, В., Me yer zum Büschenfelde, К., та Boon, T. (1994) Eur. J. ImmunoL, 24, 759-764) шляхом гідролізу ферментом EcoRl, а потім модифікували шляхом інкубування з ДНК-полімеразою Кленова для "затуплення кінців" та клонували у Smal-сайтpUC II LZdel P7.5, в результаті чого отримували вектор pUC II LZdel P7.5TYR (Фіг.9). Ця плазміда може бути використана для конструювання рекомбінантного вірусу MVA, який експресує ген тирозинази людини під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Клітини CEF, інфіковані вірусом MVA при множинності зараження ТСID50=О,5 на клітину, трансфікували ДНК плазміди pUC II LZdel P7.5-TYR, як описано в літературі (Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J., & Moss, В., [1994] Vaccine 12, 1032-1040). Рекомбінантний вірус MVA, стабільно експресуючий ген тирозинази людини та сумісно експресуючий, з часовою регулюцією, ген LacZ Е соIі, відбирали шляхом проведення послідовних циклів методом бляшек у клітинах CEF, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-b-Dгалактозидом (300мкг/мл). Після цього рекомбінантні віруси, які експресують ген, що кодує тирозиназу людини та має делетований маркерний ген LacZ, виділяли шляхом проведення ще трьох додаткових послідовних циклів очистки методом бляшек, здійснюючи скринінг на непофарбовані фокуси вірусу в клітинах CEF у присутності 5-бром-4-хлор-3-індоліл-b-D-галактозида (300мкг/мл). Потім рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів CEF, та MVA-hTYR-вірусн у ДНК аналізували за допомогою PCR для того, щоб упевнитися в генетичній гомогенності вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну стабільність MVA-hTYR та явно продемонстрував інтеграцію рекомбінантного гену тирозинази та делецію маркерного гену LacZ E coli в сайт делеції II у вірусному геномі. Ефективна експресія рекомбінантної тирозинази людини була підтверджена за допомогою Вестернблот-аналізу білок-продукуючих лізатів клітин CEF, інфікованих вірусом MVA-hTYR з використанням кролячих поліклональних антитіл (люб'язно наданих V. Hearing, та використаних, як описано, Jimenez., М., Kameyama, К., Maloy, L., Tomita, Y., & Hearing, V. [1988] P.N.A.S. USA 85, 3830-3834) або мишачих моноклональних антитіл (люб'язно представлених L. Old та використаних, як описано, Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, К. & Old, L. [1995] P.N.A.S. USA 92, 8125-8129], направлених проти тирозинази. 3.0 Конструювання вектору інсерції для делеції сайту VI MVA Для отримання послідовностей, придатних для рекомбінації у геномі поксвірусу, фрагмент ДНК, отриманий від модифікованого вірусу коров'ячої віспи Анкара (CVA) (депонованого згідно з Будапештським Договором під номером допуску V94012707 в Європейській колекції культур клітин тваринного походження, Великобританія), було ампліфіковано відповідною полімеразною ланцюговою реакцією (PCR) за використання наступних олігонуклеотидних праймерів: A24R_1;5' - CCGAAGCTTAATGAACGCC AGAGG - 3'SeqID №10 A27L_1c;5' - AGGCTCGAGTAAGAGCGGCTATGAT - 3'SeqID №11 Олігонуклеотидні праймери включають, ближче до 5' кінця й підкреслені, послідовність розпізнавання для рестрикційних ензимів Hindlll (SeqID №10) або Xhol (SeqID №11) для субклонування отриманого продукту ампліфікації в клонуючий вектор. Відповідно окремо ампліфікована послідовність (SeqID №9) із молекулярною вагою 1,7 п.о. була субклонована Sall/Hindlll у клонуючу плазміду pUC19 (GecBank Accession №Х02514). Отримана плазміда була позначена pSWl (Фіг.10). Субклонована вставка була потім вбудована в послідовність, і ця послідовність була порівняна з іншими відомими послідовностями з вірусних штамів коров'ячої віспи Копенгагена, WR і MVA. Було виявлено, що вказана послідовність містить частини послідовності області MVA-ATI. Ген ATI більшості ортопоксвірусів формує щільну цитоплазматичну матрицю, що вбудовує розвинуті віріони, так звані тільця включень, які можуть бути виявлені шляхом розгляду інфікованих клітин за допомогою оптичного мікроскопу. Запропонована функція ATI полягає в забезпеченні більшої стабільності й подовженого розповсюдження інфекційних вірусних частинок у загальному середовищі. Серед ортопоксвірусів є декілька представників, включаючи вірус ектромелії, поксвірус корови, і поксвірус єнота, які виробляють цей типовий білок вбудовування з розміром від 130 до 160кДа. Втім інші представники роду ортопоксвірусу, як-от: вірус коров'ячої віспи Western Reserve (WR), вірус коров'ячої віспи Копенгагена або MVA, не створюють таких тілець включень. Це є результатом делецій послідовності або мутацій із зсувом рамок, що призводять до втрати кодуючої послідовності й мають наслідком усічений ATI-гомологічний орган. Наприклад вірус коров'ячої віспи WR експресує 94кДа ATI-гомологічний орган, тоді як MVA і штам вірусу коров'ячої віспи Копенгагена не експресує подібний АТІ-гомологічний орган. З метою подальшого конструювання векторів вбудовування використовували сайт розпізнавання рестрикційного ензиму EcoRI для розділення ампліфікованої послідовності на два сегменти. Ці сегменти служать як фланкуючі області (фланк 1, фланк 2), що вони ініціюють гомологічну рекомбінацію з поксвірусним геномом. Між цими фланкуючими областями були вбудовані послідовності промотору вірусу коров'ячої віспи - наприклад, промотор 7,5 (7,5) та/ або синтетичний промотор (sP), - а також багаточисельні клонуючі сайти для вбудовування діючих гетерологічних генів. Отримані плазміди позначають pSW-7 5-sP, pSW-7,5, pSW-sP. Додатково між фланкуючими областями, як згадано вище, вбудовували експресуючий кластер, що містить ген кола хазяїв вірусу коров'ячої віспи, K1L, об'єднаний із геном злиття EGFP (виділеним з плазміди pEGFP, Clonetech, GenBank, номер допуску №U76561) і природним промотором K1L. Цей експресійний кластер особливо корисний для ефективного відбору та виділення рекомбінантних вірусів. Отримана плазміда позначається pSWklgfp. Генерування рекомбінантного вірусу Для генерування рекомбінантних вірусів використовують 6-лункові планшети для культивування тканини з клітинними моношарами, що мають близько 80% злиття. Для відтворення рекомбінантного MVA використовують пермесивні клітини, як-от: фібробласти курячого ембріону. Для відтворення рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи штаму WR використовують клітини африканської зеленої мавпи (Vero). По-перше, середовище клітинної культури відкидають і клітини вкривають вільним від сироватки середовищем, яке містить поксвірус дикого типу за кратності інфекції (МОI) 0,01 (наприклад, інокулят 5x103 IU (інфекційних одиниць) в 1мл середовища для однієї лунки з 5х105 клітинами). Цю суміш інкубують протягом 1 години за 37°С в 5% СО2-атмосфері. Потім інокулят видаляють і клітини двічі промивають за допомогою 2мл OptiMEM на кожну лунку. Пізніше моношар клітини вкривають Ліпофектіном/плазмідою ДНК-мікс (в цілому об'єм: 1мл), виготовлений згідно із вказівкою виробника (GIBCO BRL) за використання 15mg плазміди ДНК pSWk11gfp. Суміш інкубували протягом 5-12 годин за 37°С у 5% СО2-атмосфері. По тому Ліпофектин/плазміду ДНК-мікс видаляють, а також клітини вкривають 1,5мл свіжого середовища із доданими 10% FCS. Після 48 годин після інфекції моношар клітини від'єднується клітинним соскаблювачем і клітини, й середовище переносять у 2мл-мікроцентрифуговані трубки. Продукти трансфекції зберігаються за температури від -20°С до -80°С. Після трансфекції плазміди pSWk11gfp у поксвірусні інфекційні клітини ген K1L кола хазяїв, злитий з геном EGFP, були точно рекомбіновані в сайт поксвірусного геному, гомологічного до фланкуючих областей у векторній плазміді. Для виділення рекомбінантних вірусів MVA з не-рекомбінатних вірусів MVA, клітину кола хазяїв, а саме кролячої нирки (RK)13, інфікували вірусним матеріалом, отриманим з трансфекційного експерименту, як було вказано вище. Попередня робота показала, що MVA ін фікування клітин кроля RK13 призводить до раннього блокування вірусної реплікації, що відрізняється послабленим синтезом проміжної вірусної РНК та вірусною РНК з недостатньою реплікацією. Втім це непродуктивне інфікування MVA клітин RK13 могло компенсуватися сумісною експресією гену K1L кола хазяїв вірусу коров'ячої віспи (Sutter et al., 1994b). Відповідно інокуляція вірусного матеріалу, отриманого після вказаних експериментів трансфекції, в культури RK13 призвела до високого вибіркового вирощування тільки рекомбінантних вірусів, які сумісно експресують ген K1L. Після п'яти послідовних пасажів вирощування клітин RK13 на 65-лункових або 96лункових планшетах для культивування тканини вірус MVA-K1LGFP був виділений. Відсутність нерекомбінантного MVA була продемонстрована за допомогою PCR. Додатково експресія злитого гена EGFP уможливила пряме спостереження за інфікуванням рекомбінантним вірусом за допомогою флюоресценсії GFP. Пряме спостереження також використовують для ідентифікації й пізнішого виділення рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи штаму WR, які не є чуттєвими стосовно селекції K1L. Перелік послідовностей (1) Загальна інформація: (і) Заявник: (A) Назва: GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und Gesundehiet GmbH (B) Вулиця: Ingolstaeder Landstr. 1, Neunerberg (C) Місто: Oberschleissheim (E) Країна: Німеччина (F) Поштовий індекс: 85764 (ii) Назва винаходу: Рекомбінантний вірус MVA та його використання (ііі) Кількість послідовностей: 8 (iv) Тип комп'ютерного зчитування: (A) Тип носія: гнучкий диск (B) Комп'ютер: PC сумісний з IBM (C) Операційна система: PC-DOS/MS-DOS (D) Програмне забезпечення: Patentln Release # 1,0 Version # 1,30 (ЕРО) (vi) Данні попередньої заявки: (A) Номер заявки: DK 0782/95 (B) Дата подання: 04 липня 1995p. (2) Данні послідовності SEQ ID №1: (і) Характеристика послідовності: (A) До вжина: 33 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис.="ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №1: CAGC AGGGTA CCCTCATCGT AC AGGACGTT СТС (2) Данні послідовності SEQ ID №2: (і) Характеристика послідовності: (A) До вжина: 42 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.="ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №2: CAGC AGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT ААС ААААТАА СА (2) Данні послідовності SEQ ID №3: (і) Характеристика послідовності: (A) До вжина: 36 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.="ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №3: CAGC AGCTGC AGGAATC ATC C ATTCCACTG AATAGC (2) Данні послідовності SEQ ID №4: (і) Характеристика послідовності: (A) До вжина: 36 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.="ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №4: CAGC AGGC AT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGC AGA (2) Данні послідовності SEQ ID №5: (і) Характеристика послідовності: (A) До вжина: 33 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис.="ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №5: CAGC AGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GCC (2) Данні послідовності SEQ ID №6: (і) Характеристика послідовності: (A) До вжина: 33 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.="ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №6: GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT C AG (2) Данні послідовності SEQ ID №7: (і) Характеристика послідовності: (A) До вжина: 39 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.="ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №7: CAGC AGGGAT CC ATGGGTGG C AAGTGGTCA AAAAGTAGT (2) Данні послідовності SEQ ID №8: (і) Характеристика послідовності: (A) До вжина: 39 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.="ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №8: CAGC AGGC AT CCATGTC AGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG Послідовність SEQ ID №9 1736 ДНК Модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара 9 Послідовність SEQ ID №10 24 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: олігонуклеотидний праймер 10 ccgaagctta atgaacgcca gagg Послідовність SEQ ID №11 25 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: олігонуклеотидний праймер 11 aggctcgagt aagagcggct atgat