Антитіло до her3 та його застосування

Реферат: Винахід належить до антитіла, яке специфічно зв'язується з людським HER3, до способів його виробництва, до фармацевтичної композиції, що містить зазначене антитіло, та до його застосування. UA 107821 C2 (12) UA 107821 C2 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіла до HER3 та їх застосування Даний винахід відноситься до антитіл, що зв'язуються з людським HER3 (анти-HER3антитіл), до способів їх виробництва, до фармацевтичних композицій, що містять зазначені антитіла, та до їх застосування. Рівень техніки Людський HER3 (ErbB-3, ERBB3, c-еrbB-3, c-erbB3, тирозин-кіназний рецептор erbB-3, SEQ ID № 17) кодує рецептор епідермального фактору росту (EGFR), член сімейства тирозинкіназних рецепторів, яке також включає HER1 (також відомий як EGFR), HER2 і HER4 (Kraus, M.H. та інш., PNAS 86 (1989) 9193-9197; Plowman, G.D. та інш., PNAS 87 (1990) 49054909; Kraus, M.H. та інш., PNAS 90 (1993) 2900-2904). Як і прототипічний рецептор епідермального фактору росту, трансмембранний рецептор HER3 складається з позаклітинного ліганд-зв'язуючого домену (ECD, extracellular ligand-binding domain), домену димеризації з ECD, трансмембранного домену, внутрішньоклітинного домену тирозинкіназного білка (TKD) і Cкінцевого фосфольованого домену. Цей пов'язаний з мембраною білок має херегулін (HRG)зв'язуючий домен HER3 у позаклітинному домені, але не має активного кіназного домену. Таким чином, він може зв'язувати цей ліганд, але не передає сигнал усередину клітини через фосфолювання білка. Проте, він формує гетеродимери з іншими членами HER-сімейства, які мають кіназну активність. Гетеродимеризація приводить до активації рецепторопосередкованого сигнального шляху та до трансфосфолювання його внутрішньоклітинного домену. Утворення димерів між членами HER-сімейства розширює можливості передачі сигналу HER3 та є засобом не тільки розподілу сигналу, але й посилення сигналу. Наприклад, гетеродимер HER2/HER3 індукує один з найбільш важливих мітогенних сигналів через шлях PI3K і AKT серед членів сімейства HER (Sliwkowski M.X., та інш., J. Biol. Chem. 269 (1994) 1466114665; Alimandi M, та інш., Oncogene. 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622). Ампліфікація цього гену та/або надекспресія його білка були виявлені при багатьох ракових захворюваннях, у тому числі при пухлинах передміхурової залози, сечового міхура та молочної залози. Були охарактеризовані транскрипційні варіанти альтернативного сплайсингу, що кодують різні ізоформи. В одній ізоформі відсутня міжмембранна область, і ця ізоформа секретується за межі клітини. Ця форма діє шляхом модуляції активності форми, зв'язаної з мембраною. Також повідомлялось про додаткові варіанти сплайсингу, але вони не були детально описані. WO 97/35885 відноситься до HER3-антитіл. WO 2003/013602 відноситься до інгібіторів HERактивності, включаючи HER-антитіла. WO 2007/077028 і WO 2008/100624 також відносяться до HER3-антитіл. Суть винаходу Винахід включає антитіло, яке зв'язується з людським HER3, яке відрізняється тим, що варіабельний домен важкого ланцюга містить CDR3H-область SEQ ID № 1, CDR2H-область SEQ ID № 2, CDR1H-область SEQ ID № 3, а варіабельний домен легкого ланцюга містить CDR3L-область SEQ ID № 4, CDR2L-область SEQ ID № 5, CDR1 L-область SEQ ID № 6 або CDR1L-область SEQ ID № 7. Крім того, винахід включає антитіло відповідно до винаходу, яке характеризується тим, що варіабельний домен важкого ланцюга VH представляє собою SEQ ID № 8; а варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 9, або варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 10, або варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 11; або її гуманізовану версію. Крім того, винахід включає антитіло, що включає варіабельний домен важкого ланцюга, що містить CDR3H-область SEQ ID № 1, CDR2H-область SEQ ID № 2, CDR1H-область SEQ ID № 3, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить CDR3L-область SEQ ID № 4, CDR2L-область SEQ ID № 5 і CDR1L-область SEQ ID № 6. Крім того, винахід включає антитіло, що включає варіабельний домен важкого ланцюга VH SEQ ID № 8 і варіабельний домен легкого ланцюга VL SEQ ID № 9 або SEQ ID № 11. Крім того, винахід включає антитіло, що включає варіабельний домен важкого ланцюга, що містить CDR3H-область SEQ ID № 1, CDR2H-область SEQ ID № 2 і CDR1H-область SEQ ID № 3, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить CDR3L-область SEQ ID № 4, CDR2Lобласть SEQ ID № 5 і CDR1L-область SEQ ID № 7. Крім того, винахід включає антитіло, що включає варіабельний домен важкого ланцюга VH SEQ ID № 8 і варіабельний домен легкого ланцюга VL SEQ ID № 10. Інший аспект винаходу забезпечує антитіло, яке зв'язується з людським HER3 і яке 1 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 складається з варіабельного домену важкого ланцюга VH, що має щонайменше 95 % ідентичності послідовностіз SEQ ID № 8, і варіабельного домену легкого ланцюга VL, що має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 або SEQ ID № 11. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що воно є моноклональним. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що воно є гуманізованим. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що воно відноситься до підкласу IgG1 або IgG4. Крім того, винахід включає фармацевтичну композицію, яка відрізняється тим, що містить антитіло відповідно до винаходу. Крім того, винахід включає антитіло відповідно до винаходу для лікування раку. Крім того, винахід включає застосування антитіла відповідно до винаходу для виготовлення лікарського препарату для лікування раку. Крім того, винахід включає спосіб лікування пацієнта, що страждає від раку, який характеризується введенням пацієнтові антитіла відповідно до винаходу. Інший аспект винаходу забезпечує нуклеїнову кислоту, що кодує важкий і легкий ланцюг анти-HER3-антитіла відповідно до винаходу. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло складається з варіабельного домену важкого ланцюга VH, що має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 8, і варіабельного домену легкого ланцюга VL, що має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 або SEQ ID № 11. Крім того, винахід включає нуклеїнову кислоту, що кодує важкий і легкий ланцюги антитіла, що зв'язується з людським HER3, яка відрізняється тим, що зазначене антитіло складається з варіабельного домену VH SEQ ID № 8 і варіабельного домену легкого ланцюга VL SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 або SEQ ID № 11; або її гуманізованої версії. Крім того, винахід включає експресійний вектор, який характеризується тим, що включає нуклеїнову кислоту відповідно до винаходу для експресії антитіла відповідно до винаходу в прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазяїні. Крім того, винахід включає прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, що містить вектор відповідно до винаходу. Крім того, винахід включає спосіб виробництва рекомбінантного антитіла відповідно до винаходу, який характеризується експресією нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу в прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазяїні та відновленням зазначеного антитіла із зазначеної клітини або клітинного культурального супернатанту. Неочікувано було встановлено, що антитіла відповідно до винаходу мають досить цінні властивості, такі як сильне гальмування росту ракових клітин, що експресують HER3, сильне гальмування HER3-опосередкованої передачі сигналу (такої як, наприклад, HER3фосфолювання та АКТ-фосфолювання), що зв'язане із проліферацією ракових клітин, високою афінністю до HER3 або чудовими фармакокінетичними властивостями (наприклад, довгим часом напівжиття і т.д.). Докладний опис винаходу Винахід включає антитіло, яке зв'язується з людським HER3, яке відрізняється тим, що варіабельний домен важкого ланцюга містить CDR3H-область SEQ ID № 1, CDR2H-область SEQ ID № 2 і CDR1H-область SEQ ID № 3, а варіабельний домен легкого ланцюга містить CDR3L-область SEQ ID № 4, CDR2L-область SEQ ID № 5, CDR1L-область SEQ ID № 6 або CDR1L-область SEQ ID № 7. Крім того, винахід включає антитіло відповідно до винаходу, яке характеризується тим, що варіабельний домен важкого ланцюга VH представляє собою SEQ ID № 8; а варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 9, або варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 10, або варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 11, або її гуманізовану версію. Крім того, винахід включає антитіло відповідно до винаходу, яке характеризується тим, що варіабельний домен важкого ланцюга VH представляє собою SEQ ID № 8; а варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 9, або варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 10, або варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 11. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що включає варіабельний домен важкого ланцюга, що містить CDR3H-область SEQ ID № 1, CDR2H-область SEQ ID № 2 і CDR1H-область SEQ ID № 3, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить CDR3L-область SEQ ID № 4, CDR2L-область SEQ ID № 5 і CDR1L-область 2 UA 107821 C2 5 10 15 20 SEQ ID № 6. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що варіабельний домен важкого ланцюга VH представляє собою SEQ ID № 8, а варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 9, або варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 11. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що включає в якості варіабельного домену важкого ланцюга CDR3H-область SEQ ID № 1, CDR2H-область SEQ ID № 2, CDR1H-область SEQ ID № 3, а варіабельний домен легкого ланцюга містить CDR3L-область SEQ ID № 4, CDR2L-область SEQ ID № 5 і CDR1L-область SEQ ID № 7. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що варіабельний домен важкого ланцюга VH представляє собою SEQ ID № 8, а варіабельний домен легкого ланцюга VL представляє собою SEQ ID № 10. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу є моноклональним. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу є гуманізованим або людським. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу відноситься до підкласу IgG1 і IgG4. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу представляє собою моноклональне гуманізоване антитіло підкласу IgG1. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що зазначене антитіло є глікозильованим із цукровим ланцюжком на Asn297, де кількість фукози в зазначеному цукровому ланцюжку становить 65 % або нижче. Винахід включає гуманізовані антитіла Mab 205.10.1, Mab 205.10.2 і Mab 205.10.3 з їх відповідними VH і VL або CDR. Антитіло Mab 205.10.1 Mab 205.10.2 Mab 205.10.3 VH SEQ ID № 8 SEQ ID № 8 SEQ ID № 8 VL SEQ ID № 9 SEQ ID № 10 SEQ ID № 11 25 Антитіло CDR3H Mab 205.10.1 SEQ ID № 1 Mab 205.10.2 SEQ ID № 1 Mab 205.10.3 SEQ ID № 1 30 35 40 45 50 CDR2H SEQ ID № 2 SEQ ID № 2 SEQ ID № 2 CDR1H CDR3L CDR2L CDR1L SEQ ID № 3 SEQ ID № 4 SEQ ID № 5 SEQ ID № 6 SEQ ID № 3 SEQ ID № 4 SEQ ID № 5 SEQ ID № 7 SEQ ID № 3 SEQ ID № 4 SEQ ID № 5 SEQ ID № 6 В одному варіанті здійснення винаходу такі антитіла містять константні області людського походження, наприклад, SEQ ID № 12-16, переважно SEQ ID № 12-13. Термін "антитіло" включає різні форми структур антитіла, у тому числі, але не обмежуючись ними, цілі антитіла та фрагменти антитіл. Антитіло відповідно до винаходу переважно представляє собою людське антитіло, гуманізоване антитіло, химерне антитіло або антитіло, одержане шляхом генної інженерії, до тих пір, поки зберігаються їх характерні властивості відповідно до винаходу. "Фрагменти антитіла" включають частину антитіла повної довжини, переважно, його варіабельну область або щонайменше антиген-зв'язуючий сайт. Приклади фрагментів антитіла включають подвійні антитіла, одноланцюгові молекули антитіл і поліспецифічні антитіла, сформовані із фрагментів антитіл. Наприклад, scFv-антитіла описані в Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Крім того, фрагменти антитіл включають одноланцюгові поліпептиди, що мають характеристики домену VH, а саме можливість поєднуватись з доменом VL, або характеристики домену VL, що зв'язує HER3, а саме можливість поєднуватись з доменом VH для формування функціонального антиген-зв'язуючого сайту та, таким чином, забезпечувати властивості антитіла відповідно до винаходу. Використовувані в даному документі терміни "моноклональне антитіло" або "композиція з моноклональним антитілом" відносяться до препарату молекул антитіла одного амінокислотного складу. Термін "химерне антитіло" відноситься до моноклонального антитіла, що містить варіабельну область, тобто зв'язуючу область, від миші та щонайменше частину константної області, одержаної з іншого джерела або виду, як правило одержаного за допомогою методик рекомбінантної ДНК. Особливо переважними є химерні антитіла, що містять мишачу варіабельну область і людську константну область. Такі мишачі/людські химерні антитіла є продуктом експресованих генів імуноглобулінів, що містять сегменти ДНК, що кодують варіабельні області мишачого імуноглобуліну, і сегменти ДНК, що кодують константні області 3 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людського імуноглобуліну. Іншими формами "химерних антитіл", що підпадають під обсяг даного винаходу, є ті, у яких клас або підклас був модифікований або змінений у порівнянні з вихідним антитілом. Такі "химерні" антитіла також називають "антитілами з перемиканням класу". Способи одержання химерних антитіл включають звичайні методики рекомбінантної ДНК і генної трансфекції, в цей час добре відомі в даній області. Див., наприклад, Morrison, S.L., та інш.., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; патенти США 5202238 і 5204244. Термін "гуманізоване антитіло" або "гуманізована версія антитіла" відноситься до антитіл, у яких були змінені каркасні області або "області, що визначають комплементарність" (CDR) так, щоб вони містили CDR імуноглобуліну іншої специфічності, відмінної від материнського імуноглобуліну. У переважному варіанті здійснення винаходу мишачий CDR з VH або VL прищеплюють каркасній області людського антитіла для одержання "гуманізованого антитіла". Див., наприклад, Riechmann, L., та інш.., Nature 332 (1988) 323-327; і Neuberger, M.S., та інш.., Nature 314 (1985) 268-270. Каркасні варіабельні області важкого та легкого ланцюгів можуть бути одержані з однієї або різних людських послідовностей антитіл. Послідовності людського антитіла можуть бути послідовностями природних людських антитіл. Каркасні варіабельні області важкого та легкого ланцюгів перераховані, наприклад, в Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology (2000) - Appendix 1P A.1P.1-A.1P.37, і доступні через IMGT, міжнародну ® інформаційну систему імуногенетики ImMunoGeneTics (http://imgt.cines.fr) або через сайт http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk. Каркасна область може бути додатково модифікована шляхом подальших мутацій. Особливо переважні CDR відповідають тим, які представляють послідовності, що розпізнають антигени, зазначені вище для химерних антитіл. Переважно така гуманізована версія химеризована з людською константною областю (див., наприклад, послідовності SEQ ID № 12-16). Термін "гуманізоване антитіло", що використовується у даному документі, включає також такі антитіла, які були модифіковані в константній області для створення властивостей відповідно до винаходу, особливо у відношенні C1q-зв'язування та/або FcR-зв'язування, наприклад, шляхом "перемикання класу", тобто шляхом зміни або мутації Fcчастин (наприклад, з IgG1 в IgG4 та/або мутація IgG1/IgG4). Термін "людське антитіло", що використовується у даному документі, включає антитіла з варіабельними та константними областями, одержаними з людських зародкових послідовностей імуноглобуліну. Людські антитіла добре відомі в даній області (van Dijk, M.A., та van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). Людські антитіла можуть також бути одержані на трансгенних тваринах (наприклад, мишах), які здатні після імунізації продукувати повний репертуар або вибірку людських антитіл під час відсутності ендогенної продукції імуноглобуліну. Переніс сукупності людських зародкових послідовностей імуноглобуліну в таку мишу, мутантну по зародковій лінії, приведе до продукції людських антитіл у відповідь на антигенну стимуляцію (див., наприклад, Jakobovits, A., та інш.., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., та інш.., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M.D., та інш.., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Людські антитіла можуть бути також одержані в бібліотеках фагового дисплею (Hoogenboom, H.R., та Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., та інш.., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Методики Cole, A., та інш.. і Boerner, P., та інш.. також доступні для виготовлення людських моноклональних антитіл (Cole, A., та інш.., Monoclonal Antibodies та Cancer Therapy, Liss, A.L., p. 77 (1985); і Boerner, P., та інш.., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Як уже було згадано стосовно гуманізованих антитіл відповідно до винаходу, термін "людське антитіло", що використовується у даному документі, включає також такі антитіла, які були модифіковані в константній області для створення властивостей відповідно до винаходу, особливо у відношенні C1q-зв'язування та/або FcR-зв'язування, наприклад, шляхом "перемикання класу", тобто шляхом зміни або мутації Fc-частин (наприклад, з IgG1 в IgG4 та/або мутації IgG1/IgG4). Термін "рекомбінантне людське антитіло", що використовується у даному документі, охоплює всі людські антитіла, які одержують, експресують, створюють або виділяють за допомогою рекомбінантних засобів, наприклад, антитіла, виділені із клітини-хазяїна, такої як клітина NS0 або СНО, або тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною для людських генів імуноглобулінів або антитіл, що експресуються за допомогою рекомбінантного експресійного вектора, трансфікованого в клітину-хазяїна. Такі рекомбінантні людські антитіла мають варіабельні та константні області в перегрупованій формі. Рекомбінантні людські антитіла відповідно до винаходу піддавали соматичному гіпермутуванню in vivo. Таким чином, амінокислотні послідовності областей VH і VL рекомбінантних антитіл є послідовностями, які, будучи одержаними з та зв'язаними з людськими зародковими послідовностями VH і VL, не можуть природно існувати в репертуарі людських зародкових антитіл in vivo. Використовувані в даному документі терміни "що зв'язується з людським HER3", або "що 4 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічно зв'язується з людським HER3", або "анти-HER3-антитіло" є взаємозамінними та відносяться до антитіла, що специфічно зв'язується з людським HER3-антигеном з афінністю -8 зв'язування, яка має значення KD 1×10 моль/л або нижче при температурі 25 °C, в одному -9 варіанті здійснення винаходу має значення KD 1×10 моль/л або нижче при температурі 25 °C. Афінність зв'язування визначають у стандартному аналізі зв'язування при температурі 25 °C, ® такому як методика поверхневого плазмонного резонансу (BIAcore , GE-Healthcare, Упсала, Швеція). Спосіб визначення значення KD афінності зв'язування описано в прикладі 2b). Таким чином, термін "антитіло, що зв'язується з людським HER3", що використовується у даному документі, відноситься до антитіла, що специфічно зв'язується з людським HER3-антигеном з -8 -8 афінністю зв'язування зі значенням KD 1×10 моль/л або нижче (переважно 1×10 моль/л - 1,0 -12 ×10 моль/л) при температурі 25 °C. Людський HER3 (ErbB-3, ERBB3, c-erbB-3, c-erbB3, тирозин-кіназний рецептор erbB-3, SEQ ID № 17) кодує рецептор епідермального фактору росту (EGFR), член сімейства тирозинкіназних рецепторів, яке також включає HER1 (також відомий як EGFR), HER2 і HER4 (Kraus, M.H. та інш., PNAS 86 (1989) 9193-9197; Plowman, G.D. та інш., PNAS 87 (1990) 49054909; Kraus, M.H. та інш., PNAS 90 (1993) 2900-2904). Як і прототипічний рецептор епідермального фактору росту, трансмембранний рецептор HER3 складається з позаклітинного ліганд-зв'язуючого домену (ECD), домену димеризації з ECD, трансмембранного домену, внутрішньоклітинного домену тирозинкіназного білка (TKD) і C-кінцевого фосфольованого домену. Цей зв'язаний з мембраною білок має херегулін (HRG)-зв'язуючий домен HER3 у позаклітинному домені, але не має активного кіназного домену. Таким чином, він може зв'язувати цей ліганд, але не передає сигнал усередину клітини через фосфолювання білка. Проте, він формує гетеродимери з іншими членами HER-сімейства, які мають кіназну активність. Гетеродимеризація приводить до активації рецептор-опосередкованого сигнального шляху та трансфосфолювання його внутрішньоклітинного домену. Утворення димерів між членами HER-сімейства розширює можливості передачі сигналу HER3 і є засобом не тільки розподілу сигналу, але й посилення сигналу. Наприклад, гетеродимер HER2/HER3 індукує один з найбільш важливих мітогенних сигналів через шлях PI3K і AKT серед членів сімейства HER (Sliwkowski M.X., та інш., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Alimandi M, та інш., Oncogene. 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622). HER3-антитіла Mab205.10.1, Mab205.10.2 і Mab205.10.3 показали конкурентне з лігандом херегуліном (HRG) зв'язування з HER3. Ампліфікація цього гену та/або надекспресія його білка були виявлені при багатьох ракових захворюваннях, у тому числі при пухлинах передміхурової залози, сечового міхура та молочної залози. Були охарактеризовані транскрипційні варіанти альтернативного сплайсингу, що кодують різні ізоформи. В однієї ізоформи відсутня міжмембранна область, і ця ізоформа секретується за межі клітини. Ця форма діє шляхом модуляції активності форми, зв'язаної з мембраною. Також повідомлялось про додаткові варіанти сплайсингу, але вони не були детально описані. Термін "епітоп" включає будь-яку поліпептидну детермінанту, здатну специфічно зв'язуватись з антитілом. У деяких варіантах здійснення винаходу епітопна детермінанта включає хімічно активні поверхневі угруповання молекул, такі як амінокислоти, цукрові бічні ланцюжки, фосфорил або сульфоніл, а в деяких варіантах здійснення винаходу може мати специфічні тривимірні структурні характеристики та/або специфічні характеристики заряду. Епітоп є областю антигену, яка зв'язується антитілом. Термін "варіабельний домен антитіла відповідно до винаходу" (варіабельний домен легкого ланцюга (VL), варіабельний домен важкого ланцюга (VH)), що використовується у даному документі, означає кожну пару доменів легкого та важкого ланцюгів, які безпосередньо беруть участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Варіабельні домени легкого та важкого ланцюгів мають однакову загальну структуру, і кожний домен містить чотири каркасні області (framework region, FR), послідовності яких у значній мірі консервативні, з'єднані трьома "гіперваріабельними областями" (або областями, що визначають комплементарність, CDR). Каркасні області приймають конформацію β-складчастості, а CDR можуть утворювати петлі, що зв'язують βскладчасту структуру. CDR у кожному ланцюзі утримуються в їхній тривимірній структурі за допомогою каркасних областей, та утворюють разом з CDR з іншого ланцюга антигензв'язуючий сайт. CDR3-області важкого та легкого ланцюга антитіла відіграють особливо важливу роль у специфічності зв'язування/афінності антитіл відповідно до винаходу та, отже, забезпечують наступний об'єкт винаходу. Термін "антигензв'язуюча частина антитіла", що використовується у даному документі, 5 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відноситься до амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв'язування антигену. Антигензв'язуюча частина антитіла містить амінокислотні залишки з "областей, що визначають комплементарність", або "CDR". Термін "антигензв'язуюча частина" антитіла винаходу включає шість областей, що визначають комплементарність (CDR), які в різному ступені сприяють афінності сайту зв'язування з антигеном. Існує три CDR варіабельного домену важкого ланцюга домену (CDRH1, CDRH2 і CDRH3) і три CDR варіабельного домену легкого ланцюга (CDRL1, CDRL2 і CDRL3). Термін "CDRH1" означає CDR1-область варіабельної області важкого ланцюга, розрахованої за Кабатом. CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 і CDRL3 означають відповідні області важкого (H) або легкого (L) ланцюгів. Довжину CDR і каркасних областей (FR) визначають шляхом порівняння із зібраною базою даних амінокислотних послідовностей, у яких ці області визначені відповідно до варіабельності серед послідовностей відповідно до Kabat, та інш…, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, штат Меріленд. (1991)). "Fc-частина" антитіла безпосередньо не бере участь у зв'язуванні антитіла з антигеном, але представляє різні ефекторні функції. "Fc-частина антитіла" є терміном, добре відомим фахівцям у даній області, і визначається на основі розщеплення антитіл папаїном. В залежності від амінокислотної послідовності константної області їх важких ланцюгів, антитіла або імуноглобуліни діляться на класи: IgA, IgD, IgE, IgG та IgM, і деякі з них можуть бути розділені на підкласи (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4, IgA1 і IgA2. Відповідно до константних областей важкого ланцюга різні класи імуноглобулінів називаються α, δ, ε, γ і μ, відповідно. Fcчастина антитіла безпосередньо бере участь в ADCC (антитіло-залежній клітинній цитотоксичності) та CDC (комплемент-залежній цитотоксичності), які засновані на активації комплементу, C1q-зв'язуванні та Fc-рецепторному зв'язуванні. Термін "комплемент-залежна цитотоксичність (CDC)» означає процес, що починається при зв'язуванні фактору комплементу C1q з Fc-частиною більшості підкласів IgG-антитіл. Зв'язування C1q з антитілом обумовлене певними білок-білковими взаємодіями в так званому сайті зв'язування. Такі сайти зв'язування відомі в цей час і описані, наприклад, Boackle, R.J., та інш.., Nature 282 (1979) 742-743, Lukas, T.J., та інш.., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., та інш.., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., та інш.., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., та інш.., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M., та інш.., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., та інш.., Immunology 86 (1995) 319324, EP 0 307 434. Такими сайтами зв'язування є, наприклад, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 і P329 (нумерація відповідно до EU індексу Кабата, див. нижче). Антитіла підкласів IgG1, IgG2 і IgG3 звичайно демонструють активацію комплементу та зв'язування C1q і C3, у той час як IgG4 не активують систему комплементу та не зв'язують C1q і C3. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу містить Fc-частину людського походження та, переважно, усі інші частини з людських константних областей. Термін "Fc-частина людського походження", що використовується у даному документі, означає Fc-частину, яка є або Fc-частиною людського антитіла підкласу IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4, наприклад, Fc-частиною людського антитіла підкласу IgG1, мутованою Fc-частиною з людського антитіла підкласу IgG1 (переважно з мутацією L234A+L235A), Fc-частиною людського антитіла підкласу IgG4, або мутованою Fc-частиною людського підкласу IgG4 (переважно з мутацією S228P). Переважними є константні області людського важкого ланцюга SEQ ID № 13 (людський підклас IgG1), SEQ ID № 14 (людський підклас IgG1 з мутаціями L234A і L235A). В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу відноситься до людського антитіла підкласу IgG1 або людського антитіла підкласу IgG3. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу відноситься до людського антитіла підкласу IgG1. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що константні ланцюги мають людське походження. Такі константні ланцюги добре відомі в цей час і описані, наприклад, Kabat, E.A., (див., наприклад, Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Наприклад, застосовувана константна область людського важкого ланцюга складається з амінокислотної послідовності SEQ ID № 13. Наприклад, застосовувана константна область людського легкого ланцюга складається з амінокислотної послідовності константної області легкого ланцюга каппа SEQ ID № 12. Термін "амінокислота", що використовується у даній заявці, означає групу природних карбокси-α-амінокислот, що включає аланін (трибуквений код: ala, однобуквений код: A), аргінін (arg, R), аспарагін (asn, N), аспарагінову кислоту (asp, D), цистеїн (cys, C), глутамін (gln, Q), глутамінову кислоту (glu, E), гліцин (gly, G), гістидин (his, H), ізолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лізин (lys, K), метіонін (met, M), фенілаланін (phe, F), пролін (pro, P), серін (ser, S), треонін (thr, 6 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) і валін (val, V). Термін "нуклеїнова кислота" або "нуклеїновокислотна молекула", що використовується у даному документі, включає молекули ДНК і молекули РНК. Нуклеїновокислотна молекула може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважною є дволанцюгова ДНК. Нуклеїнова кислота є "функціонально зв'язаною", коли вона перебуває у функціональному взаємозв'язку з іншою нуклеїнової кислотою. Наприклад, ДНК допослідовності або секреторної лідерної послідовності функціонально зв'язана із ДНК поліпептиду, якщо вона експресується як пребілок, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він розташований так, щоб полегшити трансляцію. Як правило, "функціонально зв'язаний" означає, що послідовності ДНК, будучи лінійними, є колінеарними, і у випадку секреторного лідера, суміжними та в одній рамці зчитування. Проте, енхансери не зобов'язано можуть бути суміжними. Зв'язок здійснюється шляхом лігування підходящих сайтів рестрикції. Якщо таких сайтів не існує, відповідно до звичайної практики використовуються синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери. Використовувані в даному документі вираження "клітина", "клітинна лінія" і "клітинна культура" використовуються як синоніми, і всі такі позначення включають потомство. Таким чином, слова "трансформанти" і "трансформовані клітини" включають первинну клітину-об'єкт і культури, одержані з неї, незалежно від кількості переносів. Також зрозуміло, що все потомство може не бути точно ідентичним за змістом ДНК через навмисні або випадкові мутації. Мається на увазі варіантне потомство, яке має такі ж функції або біологічну активність, як і у вихідної трансформованої клітини. Антитіло відповідно до винаходу переважно характеризується тим, що константні ланцюги мають людське походження. Такі константні ланцюги добре відомі в цей час і описані, наприклад, Kabat та інш…, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, штат Меріленд (1991). Наприклад, застосовувана константна область людського легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність константної області легкого ланцюга каппа SEQ ID № 12. Наприклад, застосовувана константна область людського важкого ланцюга включає SEQ ID № 13-16. Інший варіант здійснення винаходу представляє собою нуклеїнову кислоту, що кодує важкий і легкий ланцюги антитіла відповідно до винаходу. Антитіла відповідно до винаходу включають, крім того, такі антитіла, які мають "консервативні модифікації послідовності" (варіантні антитіла), модифікації нуклеотидної та амінокислотної послідовностей, які не впливають або змінюють зазначені вище характеристики антитіла відповідно до винаходу. Модифікації можуть бути внесені за допомогою стандартних методик, відомих у даній області, таких як сайт-спрямований мутагенез і ПЦР-опосередкований мутагенез. Консервативні амінокислотні заміни включають ті, при яких амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком з аналогічним бічним ланцюгом. Сімейства амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, є визначеними в даній області. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислими бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, передбачений замінний амінокислотний залишок у людському анти-HER3-антитілі може бути переважно замінений іншим амінокислотним залишком із сімейства з таким ж бічним ланцюгом. Таким чином, "варіантне" анти-HER3-антитіло в даному документі відноситься до молекули, амінокислотна послідовність якої відрізняється від амінокислотної послідовності "материнського" анти-HER3антитіла на десять, переважно від двох до п'яти, додавань, видалень та/або замін в одній або більше ніж одній варіабельній області материнського антитіла. Амінокислотні заміни можуть бути виконані шляхом мутагенезу на підставі молекулярного моделювання, як описано в Riechmann, L., та інш.., Nature 332 (1988) 323-327 і Queen, C., та інш.., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033. В іншому аспекті анти-HER3-антитіло відповідно до винаходу містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (VH), що має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID № 8. У деяких варіантах здійснення винаходу послідовність VH, що має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності, 7 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або видалення, в порівнянні з референсною послідовністю, але при цьому анти-HER3-антитіло, що включає цю послідовність, зберігає здатність зв'язуватись з HER3. У деяких варіантах здійснення винаходу в SEQ ID № 8 було замінено, вставлено та/або вилучено в цілому від 1 до 10 амінокислот. У деяких варіантах здійснення винаходу заміни, вставки або видалення здійснені в областях за межами CDR (тобто, в FR). Можливо, анти-HER3-антитіло включає VH-послідовність SEQ ID № 8, у тому числі посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У конкретному варіанті здійснення винаходу, VH складається з однієї, двох або трьох CDR, обраних серед: (а) CDR1H, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID № 3, (б) CDR2H, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID № 2; і (в) CDR3H, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID № 1. В іншому аспекті анти-HER3-антитіло відповідно до винаходу включає варіабельний домен легкого ланцюга (VL), що має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 або SEQ ID № 11. У деяких варіантах здійснення винаходу VL-послідовність, що має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або видалення, в порівнянні з референсною послідовністю, але анти-HER-антитіло, що включає цю послідовність, зберігає здатність зв'язуватись з HER. У деяких варіантах здійснення винаходу в SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 або SEQ ID № 11 було замінено, вставлено та/або вилучено в цілому від 1 до 10 амінокислот. У деяких варіантах здійснення винаходу, заміни, вставки або видалення здійснені в областях за межами CDR (тобто, в FR). Можливо, анти-HER3-антитіло включає VLпослідовність SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 або SEQ ID № 11, у тому числі посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У конкретному варіанті здійснення винаходу, VL складається з однієї, двох або трьох CDR, обраних серед: (а) CDR1L, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID № 6 або SEQ ID № 7; (б) CDR2L, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID № 5; і (в) CDR3L, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID № 4. В іншому аспекті запропоноване анти-HER3-антитіло, яке містить VH, як у кожному із варіантів здійснення винаходу, наведених вище, і VL, як у кожному із варіантів здійснення винаходу, наведених вище. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло містить VH- і VLпослідовності SEQ ID № 8 і SEQ ID № 10, відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації цих послідовностей; а також має одну або більше ніж одну з наступних властивостей (що визначаються відповідно до аналізів, описаних у прикладі 3 і 2): - анти-HER3-антитіло інгібує HER3-фосфолювання в пухлинних клітинах, таких як клітини MCF7, клітини FaDu або клітини Mel-Juso (в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3антитіло демонструє інгібування HER3-фосфолювання в клітинах MCF7 щонайменше на 80 % (в одному варіанті здійснення винаходу щонайменше на 90 %) у концентрації 1,0 мкг/мл; в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3-антитіло демонструє інгібування HER3фосфолювання в клітинах FaDu щонайменше на 80 % (в одному варіанті здійснення винаходу щонайменше на 90 %) у концентрації 0,1 мкг/мл; в одному варіанті здійснення винаходу антиHER3-антитіло демонструє інгібування HER3-фосфолювання в клітинах в Mel-Juso щонайменше на 60 % (в одному варіанті здійснення винаходу щонайменше на 70 %) у концентрації 0,1 мкг/мл). - анти-HER3-антитіло інгібує АКТ-фосфолювання в пухлинних клітинах, таких як клітини MelJuso (в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3-антитіло інгібує АКТ-фосфолювання в клітинах Mel-Juso зі значенням IC50 меншим 0,50 мкг/мл, в одному варіанті здійснення винаходу зі значенням IC50 меншим 0,35 мкг/мл). - анти-HER3-антитіло інгібує проліферацію пухлинних клітин, таких як клітини MDA-MB-175 (в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3-антитіло інгібує проліферацію клітин MDAMB-175 зі значенням IC50 меншим 10 мкг/мл) -9 - анти-HER3-антитіло зв'язується з HER3 зі значенням KD меншим 5,0 × 10 M, в одному -9 варіанті здійснення винаходу зі значенням KD меншим 3,0 × 10 М. - В іншому аспекті анти-HER3-антитіло відповідно до винаходу включає послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (VH), що має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID № 8, і включає варіабельний домен легкого ланцюга (VL), що має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 або SEQ ID № 11; і має одну або більше ніж одну з наступних властивостей (що визначені відповідно до аналізів, описаних у прикладі 3 і 2): - анти-HER3-антитіло інгібує HER3-фосфолювання в пухлинних клітинах, таких як клітини 8 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 MCF7, клітини FaDu або клітини Mel-Juso (в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3антитіло демонструє інгібування HER3-фосфолювання в клітинах MCF7 щонайменше на 80 % (в одному варіанті здійснення винаходу щонайменше на 90 %) у концентрації 1,0 мкг/мл; в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3-антитіло демонструє інгібування HER3фосфолювання в клітинах FaDu щонайменше на 80 % (в одному варіанті здійснення винаходу щонайменше на 90 %) у концентрації 0,1 мкг/мл; в одному варіанті здійснення винаходу антиHER3-антитіло демонструє інгібування HER3-фосфолювання в клітинах в Mel-Juso щонайменше на 60 % (в одному варіанті здійснення винаходу щонайменше на 70 %) у концентрації 0,1 мкг/мл). - анти-HER3-антитіло інгібує АКТ-фосфолювання в пухлинних клітинах, таких як клітини MelJuso (в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3-антитіло інгібує АКТ-фосфолювання в клітинах Mel-Juso зі значенням IC50 меншим 0,50 мкг/мл, в одному варіанті здійснення винаходу зі значенням IC50 щонайменше 0,35 мкг/мл). - анти-HER3-антитіло інгібує проліферацію пухлинних клітин, таких як клітини MDA-MB-175 (в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3-антитіло інгібує проліферацію клітин MDAMB-175 зі значенням IC50 меншим 10 мкг/мл) -9 - анти-HER3-антитіло зв'язується з HER3 зі значенням KD меншим 5,0 × 10 M, в одному -9 варіанті здійснення винаходу зі значенням KD меншим 3,0 × 10 М. Один із варіантів здійснення винаходу представляє собою антитіло, яке зв'язується з людським HER3 і складається з варіабельного домену важкого ланцюга VH, що має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 8, і варіабельного домену легкого ланцюга VL, що має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 або SEQ ID № 11. Один із варіантів здійснення винаходу представляє собою таке антитіло, у якому варіабельний домен легкого ланцюга VL має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 9. Один із варіантів здійснення винаходу представляє собою таке антитіло, у якому варіабельний домен легкого ланцюга VL має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 10. Один із варіантів здійснення винаходу представляє собою таке антитіло, у якому варіабельний домен легкого ланцюга VL має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 11. Один із варіантів здійснення винаходу представляє собою антитіло, яке зв'язується з людським HER3 і складається з варіабельного домену важкого ланцюга VH, що має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 8, і варіабельного домену легкого ланцюга VL, що має щонайменше 95 % ідентичності послідовності з SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 або SEQ ID № 11, і має одну або більше ніж одну з наступних властивостей (що визначені відповідно до аналізів, описаних у прикладі 3 і 2): - анти-HER3-антитіло інгібує HER3-фосфолювання в пухлинних клітинах, таких як клітини MCF7, клітини FaDu або клітини Mel-Juso (в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3антитіло демонструє інгібування HER3-фосфолювання в клітинах MCF7 щонайменше на 80 % (в одному варіанті здійснення винаходу щонайменше на 90 %) у концентрації 1,0 мкг/мл; в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3-антитіло демонструє інгібування HER3фосфолювання в клітинах FaDu щонайменше на 80 % (в одному варіанті здійснення винаходу щонайменше на 90 %) у концентрації 0,1 мкг/мл; в одному варіанті здійснення винаходу антиHER3-антитіло демонструє інгібування HER3-фосфолювання в клітинах в Mel-Juso щонайменше на 60 % (в одному варіанті здійснення винаходу щонайменше на 70 %) у концентрації 0,1 мкг/мл). - анти-HER3-антитіло інгібує АКТ-фосфолювання в пухлинних клітинах, таких як клітини MelJuso (в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3-антитіло інгібує АКТ-фосфолювання в клітинах Mel-Juso зі значенням IC50 меншим 0,50 мкг/мл, в одному варіанті здійснення винаходу зі значенням IC50 щонайменше 0,35 мкг/мл). - анти-HER3-антитіло інгібує проліферацію пухлинних клітин, таких як клітини MDA-MB-175 (в одному варіанті здійснення винаходу анти-HER3-антитіло інгібує проліферацію клітин MDAMB-175 зі значенням IC50 меншим 10 мкг/мл) -9 - анти-HER3-антитіло зв'язується з HER3 зі значенням KD меншим 5,0 × 10 M, в одному -9 варіанті здійснення винаходу зі значенням KD меншим 3,0 × 10 М. Ідентичність або гомологія у відношенні послідовності визначається тут як відсоток амінокислотних залишків у кандидатної послідовності, які ідентичні з материнською послідовністю, після вирівнювання послідовностей і введення пробілів, якщо це є необхідним, 9 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей. Ні N-кінцеві, ні C-кінцеві, ні внутрішні розширення, видалення або вставки в послідовність антитіла не повинні тлумачитись як такі, що впливають на ідентичність або гомологію послідовності. Варіант зберігає здатність зв'язуватись з варіабельним доменом людського HER3 і, переважно, має властивості, які перевершують такі ж властивості материнського антитіла. Наприклад, варіант може мати менші побічні ефекти під час лікування. Типове "материнське" антитіло включає CDR-області антитіла Mab 205.10.2 і переважно використовується для виготовлення варіанту. Переважно, материнське антитіло має людську каркасну область і, якщо вони присутні, то константні домени людського антитіла. Наприклад, материнське антитіло може бути гуманізованим або людським антитілом. Термін "антитілоззалежна клітинна цитотоксичність (ADCC)» відноситься до лізису людських клітин-мішеней антитілом відповідно до винаходу в присутності ефекторних клітин. ADCC переважно вимірюють шляхом обробки препарату HER3-експресуючих клітин антитілом відповідно до винаходу в присутності ефекторних клітин, таких як свіжовиділені МКПК, або очищені ефекторні клітини з лейкоцитної плівки, такі як моноцити або натуральні кілери (NK), або постійно зростаюча клітинна лінія NK. Опосередковані клітинами ефекторні функції моноклональних антитіл, такі як ADCC, можуть бути посилені шляхом інженерії їх олігосахаридного компоненту, як описано в Umana, P., та інш.., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 і патенті США № 6602684. Антитіла типу IgG1, найбільш часто застосовувані терапевтичні антитіла, представляють собою глікопротеїни, що мають консервативний N-зв'язаний сайт глікозилювання на Asn297 у кожному CH2-домені. Два складних двоантенних олігосахариди, приєднані до Asn297, сховані між CH2-доменами, утворюючи великі контакти з поліпептидною основою, та їх присутність має важливе значення для антитіла, для того щоб опосередковувати ефекторні функції, такі як антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (ADCC) (Lifely, M.R., та інш.., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., та інш.., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., та Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). В Umana, P., та інш.. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 і WO 99/54342 показано, що надекспресія в клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО) β(1,4)-Nацетилглюкозамінілтрансферази III ("GnTIII"), глікозилтрансферази, що каталізує формування олігосахаридів із симетричним розгалуженням, значно збільшує in vitro ADCC-активність антитіл. Зміни в складі Asn297-вуглеводу або його ліквідація також впливає на зв'язування з FcyR і C1q (Umana, P., та інш.., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., та інш.., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., та інш.., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., та інш.., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., та інш.., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., та інш.., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., та інш.., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147). Способи посилення опосередкованих клітинами ефекторних функцій моноклональних антитіл через глікотехнологію наведені, наприклад, у WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO2007/031875, Umana, P., та інш…, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 і WO 2000/061739 або, наприклад, в Niwa, R., та інш.., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., та інш., J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 і US 2005/0249722. В одному варіанті здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу є нефукозильованим, що означає, що антитіло глікозильовано (якщо воно включає Fc-частину антитіла підкласу IgG1 або IgG3) цукровим ланцюжком на Asn297, при цьому кількість фукози в зазначеному цукровому ланцюжку становить 80 % або нижче (нумерація відповідно до Кабату), наприклад, від 80 % до 1 %. В іншому варіанті здійснення винаходу кількість фукози в зазначеному цукровому ланцюжку становить 65 % або нижче, в одному варіанті здійснення винаходу від 5 % до 65 %, і в одному варіанті здійснення винаходу кількість фукози в зазначеному цукровому ланцюжку дорівнює 0 %. Такі антитіла називаються надалі "нефукозильованими антитілами" або "афукозильованими антитілами". Такі нефукозильовані антитіла демонструють підвищену ADCC, у той час як інші властивості антитіла залишаються в основному незмінними. В іншому варіанті здійснення винаходу в зазначеному цукровому ланцюжку кількість Nгліколілнейрамінової кислоти (NGNA) становить 1 % або менше, та/або кількість N-кінцевої альфа-1,3-галактози становить 1 % або менше. Цукровий ланцюжок переважно демонструє характеристики N-зв'язаних гліканів, приєднаних до Asn297 антитіла, рекомбінантно експресованого в клітині СНО. 10 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Asn297" відповідно до винаходу означає таку амінокислоту як аспарагінова кислота, розташовану приблизно в позиції 297 в FC-області. На підставі незначних змін послідовності антитіл, Asn297 також може бути розташований на кілька амінокислот (звичайно не більш ніж ±3 амінокислоти) раніше або пізніше позиції 297, тобто між позиціями 294 і 300. Термін "цукрові ланцюжки демонструють характеристики N-зв'язаних гліканів, приєднаних до Asn297 антитіла, рекомбінантно експресованого в клітині СНО" означає, що цукровий ланцюжок на Asn297 материнського антитіла повної довжини відповідно до винаходу має ту ж структуру та послідовність цукрового залишку, за винятком залишків фукози, що й у того антитіла, яке експресовано в немодифікованих клітинах СНО, наприклад, як повідомлено в WO 2006/103100. Термін "NGNA", що використовується у даній заявці, означає цукровий залишок N-гліколілнейрамінову кислоту. Глікозилювання людського IgG1 або IgG3 відбувається на Asn297 як глікозилювання серцевинного фукозильованого двоантенного складного олігосахариду, що закінчується двома залишками Gal. Людські константні області важкого ланцюга підкласів IgG1 або IgG3 докладно описані Kabat, E. A., та інш.., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, штат Меріленд. (1991), і Brueggemann, M., та інш.., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., та інш.., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Ці структури позначаються як G0-, G1- (α-1,6- або α-1,3-), або G2-глікананові залишки, в залежності від кількості кінцевих Gal-залишків (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). Тип глікозилювання Fc-частин антитіла в СНО описаний, наприклад, Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207. Антитіла, які рекомбінантно експресуються в неглікомодифікованих клітинаххазяїнах CHO, звичайно фукозильовані на Asn297 у кількості щонайменше 85 %. Модифіковані олігосахариди материнського антитіла повної довжини можуть бути гібридними або складними. Переважно олігосахариди із симетричним розгалуженням, редуковані/нефукозильовані, є гібридними. В іншому варіанті здійснення винаходу олігосахариди із симетричним розгалуженням, редуковані/нефукозильовані, є складними. Відповідно до винаходу "кількість фукози" означає кількість зазначеного цукру в цукровому ланцюжку на Asn297, зв'язану із сумою всіх глікоструктур, приєднаних до Asn297 (наприклад, складних, гібридних і високо маннозних структур), яка виміряється за допомогою масспектрометрії MALDI-TOF (наприклад, у системі LC/MS) і розраховується як середнє значення (див., наприклад, WO 2008/077546). Відносна кількість фукози представляє собою відсоток фукозомістких структур, зв'язаних з усіма глікоструктурами, виявленими в зразку, обробленому N-глікозидазою F (наприклад, складною, гібридною та оліго- і високоманнозною структурами, відповідно) на MALDI-TOF. Антитіла відповідно до винаходу переважно одержують рекомбінантними засобами. Такі способи широко відомі в даній області та включають експресію білка в прокаріотичних та еукаріотичних клітинах з наступним виділенням поліпептиду антитіла та, звичайно, очищення до фармацевтично прийнятної чистоти. Для експресії білків нуклеїнові кислоти, що кодують легкі та важкі ланцюги або їх фрагменти, вставляють в експресійні вектори за допомогою стандартних способів. Експресію здійснюють у відповідних прокаріотичних або еукаріотичних клітинаххазяїнах, таких як клітини СНО, клітини ns0, клітини SP2/0, клітини HEK293, клітини COS, дріжджові клітини або клітини E. coli, та із клітин виділяють антитіло (із супернатанту або після лізису клітин). Рекомбінантна продукція антитіл добре відома в даній області та описана, наприклад, в огляді статей Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., та інш.., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880. Антитіла можуть перебувати в цілих клітинах, у клітинному лізаті, у частково очищеному або суттєво чистому вигляді. Очищення проводять із метою усунення інших клітинних компонентів або інших забруднюючих речовин, наприклад, інших клітинних нуклеїнових кислот або білків, за допомогою стандартних методик, у тому числі колонкової хроматографії та інших добре відомих у даній області методик (див. Ausubel, F., та інш…, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Нью Йорк (1987)). Експресія в клітинах ns0 описана, наприклад, в Barnes, L.M., та інш.., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., та інш.., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Транзиентна експресія описана, наприклад, в Durocher, Y., та інш.., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Клонування варіабельних доменів описане в Orlandi, R., та інш.., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., та інш.., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., та інш.., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Переважна система транзиентної експресії (HEK293) описана Schlaeger, E.-J. Christensen, K., в Cytotechnology 30 (1999) 71-83, і Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199. Моноклональні антитіла підходять для виділення з культурального середовища шляхом звичайних процедур очищення 11 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобулінів, таких як, наприклад, за допомогою білка А-сефарози, гідроксиапатитної хроматографії, гель-електрофорезу, діалізу або афінної хроматографії. ДНК і РНК, що кодують моноклональні антитіла, можна легко виділити та секвенувати за допомогою звичайних процедур. Гібридомні клітини можуть служити джерелом таких ДНК і РНК. Після виділення ДНК може бути вставлена в експресійні вектори, якими потім трансфікують клітини-хазяї, наприклад, клітини HEK293, клітини CHO або клітини мієломи, які в протилежному випадку не виробляють імуноглобуліновий білок, для того щоб отримати синтез рекомбінантних моноклональних антитіл у клітинах-хазяїнах. Антитіла, які одержують із зазначених клітинних ліній, є переважними варіантами здійснення винаходу. Нефукозильовані антитіла переважно одержують за допомогою глікотехнології, як описано вище. Варіанти амінокислотних послідовностей анти-HER3-антитіла одержують шляхом введення відповідних нуклеотидних замін у ДНК, що кодує антитіло, або шляхом пептидного синтезу. Проте, такі зміни можуть бути виконані тільки в дуже обмеженому діапазоні, наприклад, як описано вище. Наприклад, зміни не впливають на зазначені вище характеристики антитіл, такі як IgG-ізотип та зв'язування епітопа, але можуть підвищувати вихід рекомбінантної продукції, стабільність білка або можуть полегшувати очищення. Будь-який залишок цистеїну, що не бере участь у підтримці необхідної конформації анти-HER3-антитіла, може бути замінений, як правило, на серін для поліпшення стійкості молекули до окислення та для запобігання аберрантного зшивання. З іншого боку, цистеїновий зв'язок(зв'язки) можуть бути додані в антитіло для поліпшення стабільності (особливо коли антитіло представляє собою фрагмент антитіла, такий як Fv-фрагмент). Інший тип амінокислотного варіанту антитіла змінює оригінальний профіль глікозилювання антитіла. Під "зміною" розуміється видалення одного або більше ніж одного вуглеводного угруповання, що міститься в антитілі, та/або додавання одного або більше ніж одного сайту глікозилювання, який не є присутнім в антитілі. Глікозилювання антитіл, як правило, є N-зв'язаним. Поняття "N-зв'язаний" відноситься до приєднання вуглеводного угруповання до бічного ланцюга залишку аспарагіна. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серін і аспарагін-Х-треонін, де X є будь-якою амінокислотою, крім проліну, є послідовностями розпізнавання для ферментативного приєднання вуглеводного угруповання до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, наявність кожної із цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. Додавання сайтів глікозилювання в антитіло зручно здійснювати шляхом зміни амінокислотної послідовності, так що вона буде містити одну або більше ніж одну з описаних вище трипептидних послідовностей (для Nзв'язаних сайтів глікозилювання). Нуклеїновокислотні молекули, що кодують варіанти амінокислотної послідовності антиHER3-антитіла, одержують за допомогою різних способів, відомих у даній області. Ці способи включають, але не обмежуючись ними, виділення із природного джерела (у випадку природних варіантів амінокислотної послідовності) або одержання шляхом опосередкованого олігонуклеотидом (або сайт-спрямованого) мутагенезу, ПЦР-мутагенезу та касетного мутагенезу одержаної раніше варіантної або неваріантної версії гуманізованого анти-HER3антитіла. Інший тип ковалентної модифікації антитіла включає зв'язування антитіла з одним із безлічі небілкових полімерів, наприклад, поліетиленгліколем, поліпропіленгліколем або поліоксиалкіленами, способом, викладеним у патентах США №№ 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192, 4179337. Варіабельні домени важкого та легкого ланцюга відповідно до винаходу комбіновані з послідовностями промотору, ініціації трансляції, константної області, області, що 3'-не транслюється, поліаденілювання та термінації транскрипції для формування експресійних векторних конструкцій. Експресійні конструкції з важкими та легкими ланцюгами можуть бути об'єднані в єдиний вектор, котрансфіковані, по черзі трансфіковані або окремо трансфіковані в клітини-хазяї, які потім піддають злиттю для утворення єдиної клітини, що експресує обидва ланцюги. Одним аспектом даного винаходу є фармацевтична композиція, що містить антитіло відповідно до винаходу. Іншим аспектом винаходу є застосування антитіла відповідно до винаходу для виготовлення фармацевтичної композиції. Ще одним аспектом винаходу є спосіб виготовлення фармацевтичної композиції, що містить антитіло відповідно до винаходу. В іншому аспекті даний винахід забезпечує композицію, наприклад, фармацевтичну композицію, що містить антитіло відповідно до даного винаходу, зібране разом з фармацевтичним носієм. Крім того, анти-HER3-антитіла відповідно до винаходу виявилися особливо корисними для лікування раку. Тому одним з аспектів винаходу є зазначена фармацевтична композиція для лікування раку. 12 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Іншим аспектом винаходу є антитіло відповідно до винаходу для лікування раку. Іншим аспектом винаходу є застосування антитіла відповідно до винаходу для виготовлення лікарського засобу для лікування раку. Іншим аспектом винаходу є спосіб лікування пацієнта, що страждає від раку, шляхом введення антитіла відповідно до винаходу зазначеному пацієнтові, який потребує такого лікування. "Фармацевтичний носій", що згадується в даному документі, включає будь-які та усі розчинники, дисперсні середовища, покриття, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні та затримуючі абсорбцію агенти та т.д., які є фізіологічно сумісними. Переважно, носій підходить для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спинномозкового або епідермального введення (наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії). Композиція даного винаходу може бути введена різними способами, відомими в даній області. Як буде зрозуміло фахівцеві, шлях та/або режим введення буде варіюватись залежно від бажаного результату. Для введення сполуки винаходу певним шляхом, може знадобитись покриття сполуки або одночасне введення сполуки з матеріалом, що запобігає її інактивації. Наприклад, сполука може бути введена суб'єктові у відповідному носії, наприклад, у ліпосомах або розчиннику. Фармацевтично прийнятні розчинники включають фізіологічний розчин і водні буферні розчини. Фармацевтичні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії та стерильні порошки для приготування стерильних розчинів для ін'єкцій або дисперсій безпосередньо перед застосуванням. Застосування таких середовищ та агентів для фармацевтично активних речовин є відомими в даній області. Фрази "парентеральне введення" і "вводять парентерально", що використовуються в даному документі, означають способи введення, відмінні від ентерального та місцевого застосування, як правило, шляхом ін'єкцій, та включають, але не обмежуючись ними, внутрішньовенні, внутрішньом'язові, внутрішньоартеріальні, інтратекальні, внутрішньокапсулярні, інтраорбітальні, внутрішньосерцеві, внутрішньошкірні, внутрішньочеревинні, транстрахеальні, підшкірні, субкутикулярні, внутрішньосуглобні, субкапсулярні, субарахноїдальні, спинномозкові, епідуральні та інтрастенальні ін'єкції та інфузії. Термін "рак", що використовується у даному документі, може представляти собою, наприклад, рак легені, недрібноклітинний рак легені (NSCL), бронхіолоальвеолярний рак легені, рак кістки, рак підшлункової залози, рак шкіри, рак голови або шиї, шкірну або внутріочну меланому, рак матки, рак яєчників, рак прямої кишки, рак анальної області, рак шлунку, рак товстої кишки, рак молочної залози, рак матки, карциному фаллопієвих труб, карциному ендометрія, карциному шийки матки, карциному піхви, карциному вульви, хворобу Ходжкіна, рак стравоходу, рак тонкої кишки, рак ендокринної системи, рак щитовидної залози, рак паращитовидної залози, рак надниркової залоза, саркому м'яких тканин, рак уретри, рак полового члена, рак передміхурової залози, рак сечового міхура, рак нирок або сечоводів, нирково-клітинну карциному, карциному ниркової миски, мезотеліому, гепатоцелюлярний рак, рак жовчного міхура, пухлини центральної нервової системи (ЦНС), пухлиниспинного мозку, гліому головного мозку, мультиформну гліобластому, астроцитоми, шванноми, епендімоми, медулобластоми, менінгіоми, плоскоклітинні карциноми, аденому гіпофіза, лімфому, лімфобластний лейкоз, включаючи рефрактерні версії кожного з перерахованих вище видів раку, або комбінацію одного або більше ніж одного з перерахованих вище видів раку. Переважно такий рак представляє собою рак молочної залози, рак легені, рак голови або шиї або рак підшлункової залози, переважно рак легені, рак голови або шиї або рак підшлункової залози. Переважно такий рак також характеризується експресією або надекспресією HER3, більш переважно надекспресією HER3. Ці композиції також можуть містити допоміжні речовини, такі як консерванти, змочувальні агенти, емульгатори та диспергуючі агенти. Профілактика наявності мікроорганізмів може бути забезпечена як за рахунок стерилізації, як сказано вище, так і за рахунок включення різних антибактеріальних і протигрибкових препаратів, наприклад, парабенів, хлорбутанолу, фенолу, сорбінової кислоти та т.д. Також може бути доцільним включення в композиції ізотонічних агентів, таких як цукор, хлорид натрію та т.д. Крім того, подовжену абсорбцію ін'єкційної лікарської форми можна одержати шляхом включення агентів, які затримують всмоктування, таких як моностеарат алюмінію та желатин. Незалежно від обраного шляху введення, сполуки даного винаходу, які можуть бути використані в підходящій гідратованій формі, та/або фармацевтичні композиції даного винаходу складають у фармацевтично прийнятні лікарські форми за допомогою традиційних способів, відомих фахівцям у даній області. Фактичні рівні доз активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях даного винаходу 13 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути змінені таким чином, щоб одержати кількість активного інгредієнту, ефективну для досягнення бажаного терапевтичного ефекту для конкретного пацієнта, композиції та способу введення, але при цьому не токсичну для пацієнта. Обраний рівень доз буде залежати від ряду фармакокінетичних факторів, включаючи активність конкретних використовуваних композицій даного винаходу, шлях введення, час введення, швидкість виведення конкретної застосовуваної сполуки, тривалість лікування, інші препарати, сполуки та/або матеріали, що застосовуються в комбінації з конкретними застосовуваними композиціями, вік, стать, вага, стан, загальний стан здоров'я та історія хвороби пацієнта, що підлягає лікуванню, та подібних факторів, добре відомих у медицині. Композиція повинна бути стерильною та рідкою, за умови, що вона доставляється за допомогою шприца. Крім води, переважним носієм є ізотонічний буферний сольовий розчин. Відповідна текучість може бути забезпечена, наприклад, шляхом використання покриття, такого як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру часток у випадку дисперсії та шляхом застосування поверхнево-активних речовин. У багатьох випадках у композицію переважно включають ізотонічні агенти, наприклад, цукри, багатоатомні спирти, такі як манніт або сорбіт, та хлорид натрію. Далі наведені приклади, список послідовностей та графічні матеріали, для того щоб допомогти розумінню даного винаходу, справжній обсяг якого викладений у формулі винаходу. Зрозуміло, що у викладених процедурах можуть бути здійснені зміни без відступу від суті винаходу. Опис списку послідовностей SEQ ID № 1 важкий ланцюг CDR3H, Mab 205.10 SEQ ID № 2 важкий ланцюг CDR2H, Mab 205.10 SEQ ID № 3 важкий ланцюг CDR1H, Mab 205.10 SEQ ID № 4 легкий ланцюг CDR3L, Mab 205.10 SEQ ID № 5 легкий ланцюг CDR2L, Mab 205.10 SEQ ID № 6 легкий ланцюг CDR1L (варіант 1), Mab 205.10 SEQ ID № 7 легкий ланцюг CDR1L (варіант 2), Mab 205.10 SEQ ID № 8 варіабельний домен важкого ланцюга VH, Mab 205.10 SEQ ID № 9 варіабельний домен легкого ланцюга VL, Mab 205.10.1 SEQ ID № 10 варіабельний домен легкого ланцюга VL, Mab 205.10.2 SEQ ID № 11 варіабельний домен легкого ланцюга VL, Mab 205.10.3 SEQ ID № 12 константна область людського легкого ланцюга каппа SEQ ID № 13 константна область людського важкого ланцюга, одержана з IgG1 SEQ ID № 14 константна область людського важкого ланцюга, одержана з IgG1 з мутаціями L234A і L235A SEQ ID № 15 константна область людського важкого ланцюга, одержана з IgG4 SEQ ID № 16 константна область людського важкого ланцюга, одержана з IgG4 з мутацією S228P SEQ ID № 17 людський HER3 Опис графічних матеріалів Фіг. 1A та B: Відсоток (%) інгібування анти-HER3-антитілами в різних концентраціях фосфолювання рецептора в клітинах MCF7 Фіг. 1С Відсоток (%) інгібування анти-HER3-антитілами в різних концентраціях фосфолювання рецептора в клітинах Mel-Juso Фіг. 2 Введення Mab 205 (10 мг/кг q7dx3, внутрішньобрюшинно) привело до зупинки пухлинного росту трансплантованих ксенотрансплантатів FaDu SCCHN Фіг. 3 Введення Mab 205 (10 мг/кг q7d, внутрішньобрюшинно) привело до зупинки пухлинного росту трансплантованих ксенотрансплантатів раку молочної залози MAXF449 Фіг. 4 Введення Mab 205 (25 мг/кг q7d, внутрішньобрюшинно) привело до зупинки пухлинного росту трансплантованих ксенотрансплантатів 7177 NSCLC Приклади Приклад 1 Імунізація Мишей NMRI імунізували hHER3-ECD (власним) та бустували hu-HER3-ECD. Імунну відповідь контролювали шляхом тестування зразків сироватки в HER1/2/3-ECD-ІФА. Клітини селезінки від мишей з достатніми титрами анти-HER3-імуноглобуліну заморожували для подальшої іморталізації шляхом злиття з мишачою мієломною клітинною лінією P3 × 63 Ag8.653. Проводили одне злиття та гібридомні супернатанти скринували за допомогою HER1/2/ECD-ІФА, який показував відсутність перехресної реактивності, але зв'язування з HER3-ECD, та 14 UA 107821 C2 5 були відібрані анти-HER3 селективні гібридоми. Відповідні гібридоми клонували шляхом FACSсортування окремих клітин. Клони окремих клітин з різних гібридом культивували in vitro для продукції антитіла в тканинному культуральному середовищі для характеризації. Антитіла відбирали шляхом визначення їх здатності інгібувати HER3-фосфолювання, АКТфосфолювання та проліферацію пухлинних клітин MDA-MB-175 (див. приклади нижче). З одержаних антитіл одне потім гуманізували для одержання наступних антитіл Mab 205.10.1, Mab 205.10.2 і Mab 205.10.3 з їх відповідними VH і VL або CDR. Антитіло Mab 205.10.1 Mab 205.10.2 Mab 205.10.3 VH SEQ ID № 8 SEQ ID № 8 SEQ ID № 8 VL SEQ ID № 9 SEQ ID № 10 SEQ ID № 11 Антитіло CDR3H CDR2H CDR1H CDR3L Mab 205.10.1 SEQ ID № 1 SEQ ID № 2 SEQ ID № 3 SEQ ID № 4 Mab 205.10.2 SEQ ID № 1 SEQ ID № 2 SEQ ID № 3 SEQ ID № 4 Mab 205.10.3 SEQ ID № 1 SEQ ID № 2 SEQ ID № 3 SEQ ID № 4 CDR2L SEQ ID № 5 SEQ ID № 5 SEQ ID № 5 CDR1L SEQ ID № 6 SEQ ID № 7 SEQ ID № 6 10 15 20 25 30 35 В одному варіанті здійснення винаходу такі антитіла одержували з використанням константних областей людського походження, наприклад, SEQ ID № 12-13. Приклад 2 Аналіз зв'язування а) Антигенф-специфічний ІФА на зв'язування людського HER3 ECD Розчинний людський позаклітинний домен HER3, злитий зі стрептовідин-зв'язуючим білком (SBP) захоплювали на стрептовідиновий планшет. Для визначення оптимального зв'язування антитіла з SPB-CDCP1 384-лункові полістиролові планшети (NUNC, покриті стрептовідином), що поставляються MicroCoat, Бернрід, Німеччина (ID-№ 1734776-001) покривали чистим та поетапно розведеним супернатантом HEK293 (в BSA/IMDM-буфері: 100 мг/мл BSA фракції V, Roche 10735078001, розчиненого в середовищі Дульбекко, модифікованому за способом Ісков). Використовуючи мишачу калібровану криву химерних антитіл 205, у зв'язку зі здатністю мікротитрувальних планшетів зв'язувати стрептовідин, був визначений оптимальний коефіцієнт розведення супернатанту HEK293. Для стандартного покриття HEK 293-супернатант, що містить SBP-HER3, розбавляли (між 1:15 і 1:40) та інкубували протягом ночі при температурі 28 °C (25 мкл на лунку). Для видалення SBP-HER3, що залишився незв'язаним, є необхідним застосування інтенсивного промивання мікротитрувального планшета. Антитіла відповідно до винаходу тестували або нерозведеними, або з використанням 12етапного розведення. 12,5 мкл кожного зразка на лунку інкубували протягом 90 хв при кімнатній температурі. Після інтенсивного промивання за допомогою PBS-T (0,1 % Твін-20 в PBS) додавали 25 мкл козячих антилюдських IgG-антитіл, зв'язаних з HRP (Jackson ImmunoResearch, кодовий № 109-036-098, розведення 1:10000), для людських антитіл та інкубували протягом 1 години. Після інтенсивного промивання виявляли зв'язування антитіл за допомогою таблеток ABTS (Roche Diagnostics GmbH, кат. № 1112422). Поглинання при 405 нм/492 нм вимірювали за допомогою стандартного фотометра. У таблиці показані співвідношення відносного зв'язування різних антитіл. Антитіло 45 IgG-ІФА концентрація (мкг/мл) Mab 205.10.1 Mab 205.10.2 Mab 205.10.3 40 hu_HER3-ECD- ІФА концентрація (мкг/мл) 583,1 396,4 505,4 785,0 508,0 608,4 Активність (співвідношення зв'язування з hu_HER3ECD/IgG) 0,74 0,78 0,83 б) Характеризація зв'язування анти-HER3-антитіл із фрагментом позаклітинного домену (ECD) людського HER3 за допомогою аналізів Biacore: Для вимірювання афінності, 30 мкг/мл анти-Fcг-нтитіл (цапиних, від Jackson Immuno Research) зв'язували з поверхнею сенсорного чіпу CM-5 шляхом стандартного амінного зв'язування зв'язком та хімії блокування на інструменті SPR (Biacore T100). Після кон'югації анти-HER3-антитіла вводили при температурі 25 °C зі швидкістю потоку 5 мкл/хв із наступним введенням серії розбавлень (від 0 нМ до 1000 нМ) людського HER3 ECD зі швидкістю 30 мкл/хв. 15 UA 107821 C2 Для експерименту по зв'язуванню використовували робочий буфер PBS/0,1 % BSA. Потім чіп регенерували за допомогою 60 c імпульсів розчином 10 мМ гліцин-HCl, рH 2,0. Розрахунок термодинамічних параметрів (KD, константа зв'язування з HER3) проводили з використанням моделі зв'язування Ленгмюра 1:1. 5 Антитіло Mab 205.10.1 Mab 205.10.2 Mab 205.10.3 10 15 20 25 30 Афінність зв'язування KD [M] -9 2,0 × 10 -9 1,1 × 10 -9 2,0 × 10 В аналізі конкурентного зв'язування (Biacore) Mab205.10.1, Mab205.10.2 і Mab205.10.3 продемонстрували зв'язування з тим самим епітопом. Анти-HER3-антитіла U1-7, U-53 і U1-59, описані в WO 2007/077028, та Аb № 6, описаний в WO 2008/100624, досліджували в такому аналізі та виявили зв'язування з епітопами, відмінними від антитіл Mab205.10.1, Mab205.10.2 і Mab205.10.3. Приклад 3 а) Інгібування HER3-фосфолювання в клітинах MCF7, FaDu і Mel-Juso Аналізи проводили в клітинах MCF7 і FaDu у відповідності з наступним протоколом: сіяли клітини в концентрації 500000 клітин/лунку в 6-лунковому планшеті, покритому полі-D-лізином в середовищі RPMI 1640 з 10 % FCS. Інкубували протягом 24 годин. Видаляли середовище шляхом аспірації, інкубували протягом ночі з 500 мкл/лунку RPMI 1640 з 0,5 % FCS. Додавали антитіла в 500 мкл RPMI 1640 з 0,5 % FCS. Інкубували протягом 1 години. Додавали HRG-1b (кінцева концентрація 500 нг/мл) на 10 хв. Для лізису клітин видаляли середовище та додавали 80 мкл крижаного буфера для лізису клітин Triton-X-100 та інкубували протягом 5 хвилин на льоді. Після переносу лізату в 1,5 мл реакційну пробірку та центрифугування зі швидкістю 14000 обертів у хвилину протягом 15 хв при температурі 4 °C супернатант переносили в нові реакційні пробірки. Зразки, що містять рівну кількість білка в завантажувальному буфері SDS, розділяли на SDS-PAGE та визначали за допомогою напівсухого Вестерн-блоттінгу на нітроцелюлозних мембранах. Мембрани блокували 1× NET-буфером + 0,25 % желатину протягом 1 години та виявляли pHER3 за допомогою антитіла α-фосфо-HER3/erbB3 (Tyr1289) (21D3), Cell Signaling, № 4791, і HER3 за допомогою антитіла αerbB3 (C-17), Santa Cruz, № SC-285, відповідно. Після відмивання та виявлення сигналів за допомогою POD-зв'язаного вторинного антитіла, бенди досліджували денситометрично. Були досліджені анти-HER3-антитіла Mab205.10.1, Mab205.10.2 і Mab205.10.3, а також анти-HER3-антитіла U1-7, U-53 і U1-59, описані в WO 2007/077028, та Аb № 6, описане в WO 2008/100624. Відсоток (%) інгібування анти-HER3антитілами фосфолювання рецептора на клітинах MCF7 показаний нижче та на фіг. 1А. % Інгібування HER3-фосфолювання в клітинах MCF7 35 Антитіло контроль Mab205.10.2 U1-7 U1-53 U1-59 Ab № 6 40 pHER3 % інгібування [0,1 мкг/мл] 0 62 36 54 15 13 pHER3 % інгібування [1,0 мкг/мл] 0 96 44 51 70 64 В іншому експерименті були досліджені анти-HER3-антитіло Mab205.10.2, а також антиHER3-антитіло 8B8.2D9, описане у WO 97/35885, та 1B4C3 і 2D1D12, описані у WO 2003/013602. Відсоток (%) інгібування анти-HER3-антитілами фосфолювання рецептора в клітинах MCF7 показаний нижче та на фіг. 1B. % інгібування HER3-фосфолювання в клітинах MCF7 16 UA 107821 C2 Антитіло pHER3 % інгібування [0,1 мкг/мл] Контроль Mab205.10.2 8B8.2D9 1B4C3 2D1D12 0 68 13 49 34 pHER3 % інгібування [1,0 мкг/мл] 0 91 28 46 34 Відсоток (%) інгібування анти-HER3-антитілами фосфолювання рецептора в клітинах FaDu показаний нижче. 5 % інгібування HER3-фосфолювання в клітинах FaDu Антитіло контроль Mab205.10.2 U1-59 10 15 pHER3 % інгібування [0,03 мкг/мл] 0 88 31 pHER3 % інгібування [0,10 мкг/мл] 0 93 25 pHER3 % інгібування [0,30 мкг/мл] 0 97 90 В іншому експерименті були досліджені анти-HER3-антитіло Mab205.10.2, а також антиHER3-антитіло 8B8.2D9, описане у WO 97/35885, та 1B4C3 і 2D1D12, описані у WO 2003/013602 ECD і 105.5 (від Millipore, кат. № 05-47, названий α-HER у WO 2003/013602) у клітинах Mel-Juso. Аналізи в клітинах Mel-Juso здійснювали відповідно до згаданого вище протоколу для клітин MCF7 і FaDu. Кількість клітин і об'єми середовищ були адаптовані для 12-лункових планшетів. Відсоток (%) інгібування анти-HER3-антитілами фосфолювання рецепторів у клітинах Mel-Juso показаний нижче та на фіг. 1С. % інгібування HER3-фосфолювання в клітинах Mel-Juso Антитіло Контроль Mab205.10.2 105.5 (α-HERECD) 8B8.2D9 1B4C3 2D1D12 20 25 30 35 pHER3 % інгібування [0,1 мкг/мл] 0 75,9 22,2 31,3 20,7 3,4 pHER3 % інгібування [1,0 мкг/мл] 0 78,8 19,5 20,3 17,5 39,3 б) АКТ-фосфолювання (ІФА) Аналізи проводили в клітинах MCF7 у відповідності з наступним протоколом: сіяли клітини MCF7 у концентрації 30000 клітин/лунку в 96-лунковому планшеті, покритому полі-D-лізином, у середовищі RPMI 1640 з 10 % FCS та інкубували протягом 24 годин. Видаляли середовище шляхом постукування по чистому паперовому рушникові, обережно промивали 200 мкл середовища, що не містить сироватки, інкубували протягом ночі з 100 мкл/лунку RPMI 1640 з 0,5 % FCS. Видаляли середовище, як описано вище; додавали антитіла в 100 мкл RPMI 1640 з 0,5 % FCS та інкубували протягом 1,5 годин. Додавали HRG-1b (кінцева концентрація 5 нг/мл) на 10 хв. Видаляли середовище, як описано вище. Для лізису клітин додавали 100 мкл крижаного буфера для лізису клітин і ресуспендували шляхом піпетування приблизно 5 раз. Центрифугували планшет зі швидкістю 3000 обертів у хвилину протягом 10 хв при температурі 4 °C та переносили 80 мкл супернатанту (або аліквот) у новий поліпропіленовий планшет і піддавали шоковій заморозці в рідкому азоті. Зберігали при температурі -80 °C до аналізу. Набір для аналізу AKT1,2 (phospho-Ser473) EIA Kit Assay Designs № 900-162: Зразки (розбавлення 1:10) додавали до планшета, покритого мишачим МКА, специфічним для N-кінця AKT. Інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі зі струшуванням. Промивали 5 раз, інкубували з біотинілованим анти-фосфо-AKT(Ser473) протягом 1 години при кімнатній температурі зі струшуванням. Промивали 5 раз, інкубували з кон'югатом стрептовідин-HRP на 17 UA 107821 C2 5 протязі 30 хвилин при кімнатній температурі зі струшуванням. Промивали 5 раз, інкубували з TMB протягом 30 хвилин при кімнатній температурі зі струшуванням. Зупиняли реакцію та реєстрували при 450 нм. Маb 205.10.2 продемонструвало інгібування АКТ-фосфолювання з IC50 0,06 мкг/мл. При pAKT-ІФА в клітинах Mel-Juso, що проводився, як описано для клітин MCF7, Маb 205.10.2 продемонструвало інгібування АКТ-фосфолювання з IC50 0,28 мкг/мл, усі інші аналізовані антитіла продемонстрували IC50 вище (>) 50. % інгібування АКТ-фосфолювання в клітинах Mel-Juso 10 Антитіло Mab 205.10.2 105.5 (α-HERECD) 1B4C3 2D1D12 8B8D9 15 20 25 в) Інгібування проліферації пухлинних клітин Оцінювали протипухлинну ефективність HER3-антитіл Mab205.10.1, Mab205.10.2 і Mab205.10.3 в аналізі проліферації клітин за допомогою клітин MDA-MB-175 (клітини карциноми молочної залози людини VII, каталоговий № ATCC HTB-25). 20000 клітин на лунку висівали в стерильні 96-лункові планшети для культивування тканин з культуральним клітинним середовищем DMEM/F12, що містить 10 % FCS, та інкубували при температурі 37 °C ± 1 °C з 5 % ± 1 % CO2 протягом одного дня. Клітини були повільно зростаючими із часом подвоєння приблизно 1,5 доби. Анти-HER3-антитіла додавали в серії розбавлень і потім інкубували ® протягом 6 днів. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою індикатора alamarBlue . Якщо життєздатність клітин була знижена більше ніж на 50 % у порівнянні з контролем, то значення IC50 розраховували з використанням потрійних повторів для кожної концентрації антитіла; а якщо ні, то, якщо % інгібування життєздатності клітин при найвищій концентрації був нижче 50 %, то IC50 не розраховували та указували, що IC50 [мкг/мл] вище (>) найвищої концентрації. Крім того, були досліджені анти-HER3-антитіло U1-59, описане у WO 2007/077028, і АВ № 6, описане у WO 2008/100624. антитіло Mab205.10.1 Mab205.10.2 Mab205.10.3 U1-59 Ab № 6 30 8B8.2D9 1B4C3 40 IC50 [мкг/мл] 8,0 3,8 6,8 12,4 > 60 мкг/мл В іншому експерименті були досліджені анти-HER3-антитіло 8B8.2D9, описане у WO 97/35885, і 1B4C3, описане у WO 2003/013602. Антитіло 35 IC50 [мкг/мл] 0,28 0,81 >50 >50 >50 IC50 [мкг/мл] > 100 мкг/мл (29 % інгібування при 100 мкг/мл) > 100 мкг/мл (26 % інгібування при 100 мкг/мл) Приклад 5 ADCC in vitro у пухлинних клітинах KPL4 при специфічному лізисі 1 мкг/мл Клітини-мішені KPL4 (ADCC) карциноми молочної залози, культивовані в RPMI 1640+2 мМ Lаланін-L-глутаміну + 10 % FCS), збирали за допомогою трипсину/ЕДТА (Gibco № 25300-054) в експонентній фазі росту. Після етапу промивання та оцінки кількості та життєздатності клітин, необхідну аліквоту мітили протягом 30 хвилин при температурі 37 °C у камері інкубатора з кальцеїном (Invitrogen № C3100MP; 1 флакон ресуспендували в 50 мкл ДМСО на 5 млн клітин в 5 мл середовища). Потім клітини промивали три рази середовищем AIM-V, оцінювали число та 18 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 життєздатність клітин, і число клітин доводили до 0,3 млн/мл. Тим часом, МКПК (мононуклеарні клітини периферичної крові) в якості ефекторних клітин одержували шляхом центрифугування в градієнті щільності (Histopaque-1077, Sigma № H8889) відповідно до протоколу виробника (1× етап промивання при 400 г та 2× етап промивання при 350 г по 10 хвилин кожний). Оцінювали число та життєздатність клітин, і число клітин доводили до 15 млн/мл. У круглодонні 96-лункові планшети висівали 100 мкл мічених кальцеїном клітин-мішеней, додавали 50 мкл розбавленого нефукозильованого антитіла (Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3, приготування див. нижче) і 50 мкл ефекторних клітин. У деяких експериментах ® клітини-мішені змішували з Redimune NF Liquid (ZLB Behring) у концентрації 10 мг/мл Redimune. Контролем служив спонтанний лізис, який визначали шляхом спільного культивування мішеней та ефекторних клітин без антитіл, і максимальний лізис, який визначали шляхом лізису клітин-мішеней тільки 1 % Triton X-100. Планшети інкубували протягом 4 годин при температурі 37 °C у вологій камері інкубатора. Знищення клітин-мішеней оцінювали, вимірюючи вивільнення ЛДГ (лактатдегідрогенази) з ушкоджених клітин за допомогою набору для виявлення цитотоксичності Cytotoxicity Detection kit (LDH Detection Kit, Roche № 1 644793) відповідно до інструкції виробника. якщо коротко, то 100 мкл супернатанту з кожної лунки змішували з 100 мкл субстрату з набору в прозорому плоскодонному 96-лунковому планшеті. Значення Vmax кольорової реакції субстрату визначали в ІФА при 490 нм протягом щонайменше 10 хвилин. Відсоток специфічного опосередкованого антитілом знищення розраховували в такий спосіб: ((А - SR)/(MR-SR)×100, де А представляє собою середнє значення Vmax з певною концентрацією антитіла, SR представляє собою середнє значення Vmax спонтанного вивільнення, а MR представляє собою середнє значення Vmax максимального вивільнення. У якості додаткового індикатора оцінювали збереження кальцеїну інтактними клітинамимішенями шляхом лізису збережених клітин-мішеней у боратному буфері (5 мМ борату натрію + 0,1 % Triton) і вимірювання флуоресценції кальцеїну на флуоресцентному планшетному рідері. Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3 демонстрували ADCC [KPL-4] при специфічному лізисі 1 мкг/мл приблизно 40-60 %. Нефукозильоване антитіло (Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3) одержували шляхом котрансфекції чотирма плазмідами, дві для експресії антитіла, одна для експресії гібридного поліпептиду GnTIII (експресійний вектор GNT-III) і одна для експресії маннозидази II (експресійний вектор маннозидази II апарату Гольджі) у співвідношенні 4:4:1:1, відповідно, у клітинах HEK293 або СНО. ДНК-послідовності важкого та легкого ланцюга повного антитіла субклонували в експресійні вектори для клітин ссавців (по одному для легкого та важкого ланцюгів) під контролем промотору MPSV і перед синтетичним поліА-сайтом, при цьому кожний вектор ніс послідовності EBV OriP. Антитіла одержували шляхом котрансфекції клітин HEK293-EBNA або клітин СНО експресійними векторами з важким та легким ланцюгами антитіла, використовуючи підхід трансфекції за допомогою фосфату кальцію. Експоненціально зростаючі клітини HEK293-EBNA трансфікували способом з фосфатом кальцію. Для продукції гліко-інженерного антитіла, клітини котрансфікували чотирма плазмідами, дві для експресії антитіла, одна для експресії гібридного поліпептиду GnTIII (експресійний вектор GnT-III) та одна для експресії маннозидази II (експресійний вектор маннозидази II апарату Гольджі) у співвідношенні 4:4:1:1, відповідно. Клітини вирощували як прикріплені одношарові культури в T-образних колбах з використанням культурального середовища DMEM з додаванням 10 % FCS, і трансфікували, коли їх конфлюентність становила від 50 до 80 %. Для трансфекції в колбу T150 15 мільйонів клітин висівали за 24 години до трансфекції в 25 мл культурального середовища DMEM з FCS (кінцева концентрація за об'ємом 10 %), і клітини поміщали в інкубатор з температурою 37 °C та з 5 % CO2-атмосферою на ніч. Для кожного антитіла, яке потрібно було одержати, розчин ДНК, CaCl 2 і води одержували шляхом змішування 188 мкг загальної плазмідной векторної ДНК (чотири плазміди, дві для експресії антитіла (один легкий ланцюг і один важкий ланцюг), одна для експресії гібридного поліпептиду GnTIII (експресійний вектор GnT-III) та одна для експресії маннозидази II (експресійний вектор маннозидази II апарата Гольджі) у співвідношенні 4:4:1:1, відповідно), з водою до кінцевого об'єму 938 мкл та з 938 мкл 1M розчину CaCl 2. До цього розчину додавали 1876 мкл 50 мМ HEPES, 280 мМ NaCl, 1,5 мМ розчину Na 2HPO4 із рН 7,05, негайно перемішували протягом 10 секунд і залишали при кімнатній температурі на 20 секунд. Суспензію розбавляли 46 мл DMEM з додаванням 2 % FCS і ділили на дві колби T150, заміняючи нею існуюче середовище. 19 UA 107821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Клітини інкубували при температурі 37 °C, 5 % CO2 протягом 17-20 годин, після чого середовище заміняли 25 мл DMEM, 10 % FCS. Кондиціоноване культуральне середовище збирали через 7 днів після трансфекції шляхом центрифугування протягом 15 хвилин при 210 г, розчин стерилізували шляхом фільтрації (через фільтр із розміром пор 0,22 мкм) і додавали азид натрію в кінцевій концентрації 0,01 % співвідношення маси та об'єму та зберігали при температурі 4 °C. Очищали секретовані нефукозильовані антитіла та аналізували олігосахариди, прикріплені до FC-області антитіл, наприклад, за допомогою MALDI/TOF-MS (як описано, наприклад, у WO 2008/077546). Для цього аналізу олігосахариди ферментативно вивільняли з антитіл шляхом розщеплення PNGaseF, при цьому антитіла або були іммобілізовані на мембрані PVDF, або знаходились у розчині. Одержаний в результаті розщеплення розчин, що містить вивільнені олігосахариди, або безпосередньо підготовляли для аналізу MALDI/TOF-MS, або далі розщеплювали за допомогою глікозидази EndoH перед підготовкою зразка для аналізу MALDI/TOF-MS. Аналізована кількість фукози в цукровому ланцюжку на Asn297 становила 5020 %. Приклад 6 Протипухлинна ефективність in vivo Протипухлинна ефективність in vivo антитіл Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3 може бути виявлена на моделях пухлин різного походження (наприклад, раку легенів, SCCHN (сквамозноклітинної карциноми голови та шиї), раку молочної залози та раку підшлункової залози), основаних на трансплантації клітини або фрагменту мишам SCID/beige або nude (голим). В якості прикладу наведені дані для моделі ксенотрансплантата SCCHN на FaDu (основаної на клітинній лінії), моделі раку молочної залози на MAXF449 (основаної на фрагменті) і моделі NSCLC (недрібноклітинного раку легенів) на 7177 (заснованої на фрагменті). Випробування агентів Нефукозильоване Mab205.10.2 (позначене як Mab 205 на фіг. 2, 3, 4) було надано у вигляді стокового розчину від Roche, Пенцберг, Німеччина. Буфер для антитіла включав гістидин. Перед ін'єкціями стоковий розчин антитіла розбавляли відповідним чином у буфері. Клітинні лінії та умови культивування Людські клітини FaDu HNSCC спершу були одержані з АТСС. Пухлинну клітинну лінію культивували стандартним шляхом у мінімальному есенціальному середовищі (МЕС) Ігла з 10 % ембріональної телячої сироватки, 2 мМ L-глутаміну, 1 мМ пірувату натрію та 0,1 мМ NEAA при температурі 37 °C у насиченій водними парами атмосфері з 5 % CO2. Культуральні пасажі виконували шляхом розщеплення 1× трипсином/ЕДТА кожні три дні. Фрагменти пухлини Пухлинні фрагменти спершу одержували від пацієнтів і трансплантували підшкірно голим мишам-донорам. Згодом пухлинні фрагменти серійно пасажували in vivo. Для доклінічного дослідження невеликі фрагменти пухлини одержували від мишей-донорів і поміщали підшкірно іншим голим мишам (MAXF449, 7177). Тварини Самок мишей лінії SCID/beige або nude одержували у виробника (наприклад, компанія Charles River, Зюльцфельд, Німеччина) та утримували в умовах, вільних від специфічних патогенів, із щоденними циклами 12 годин світла/12 годин темряви відповідно до керівних принципів (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол експериментального дослідження був розглянутий та схвалений місцевою владою. Після одержання тварин утримували в карантинній частині приміщення для тварин на протязі одного тижня, для того щоб вони звикли до нового середовища проживання та для спостереження за ними. Постійний моніторинг здоров'я проводили на регулярній основі. Дієтичне харчування (Provimi Kliba 3337) та воду (підкислену до значення рH 2,5-3) надавали без обмежень. Моніторинг Тварин контролювали щодня на предмет клінічних симптомів і для виявлення побічних ефектів. Для моніторингу протягом усього експерименту фіксували масу тіла тварин. Лікування тварин Лікування тварин почали після рандомізації тварин після трансплантації клітин або 3 фрагменту, коли середній розмір пухлини становив приблизно 100-150 мм . Антитіло вводили у вигляді одного агента в кількості 10-25 мг/кг внутрішньобрюшинно за схемою q7d (раз на тиждень) протягом 3-6 тижнів залежно від моделі. Відповідний носій вводили в ті ж дні. Ефективність антитіла А) Ксенотрансплантат FaDu HNSCC 20 UA 107821 C2 5 10 15 20 Мишам із ксенотрансплантатом FaDu HNSCC вводили антитіло Mab205.10.2 від дня дослідження 14 по 35. У результаті введення антитіло Mab205.10.2 показало значну протипухлинну ефективність із зупинкою пухлинного росту при підшкірному FaDuксенотрансплантаті. Інгібування росту пухлини (TGI, Tumor Growth Inhibition) було вираховано як 98 %. Введення Mab 205 (10 мг/кг, схема q7d×3, внутрішньобрюшинно) привело до зупинки пухлинного росту трансплантованих ксенотрасплантатів FaDu HNSCC (див. фіг. 2). B) Ксенотрансплантат раку молочної залози MAXF449 Мишам із ксенотрансплантатом раку молочної залози MAXF449 вводили антитіло Mab205.10.2 від дня дослідження 64 по 91. У результаті введення антитіло Mab205.10.2 показало значну протипухлинну ефективність із зупинкою пухлинного росту ксенотрансплантатів MAXF449. Інгібування росту пухлини (TGI) становило більше 100 %. Введення Mab 205 (10 мг/кг, схема q7d, внутрішньобрюшинно) привело до зупинки пухлинного росту трансплантованих ксенотрасплантатів MAXF449 (див. фіг. 3). C) Ксенотрансплантат 7177 NSCLC Мишам із ксенотрансплантатом 7177 NSCLC вводили антитіло Mab205.10.2 від дня дослідження 28 по 56. В результаті введення антитіло Mab205.10.2 показало значну протипухлинну ефективність із зупинкою пухлинного росту ксенотрансплантатів NSCLC. Інгібування росту пухлини (TGI) становило більше 100 %. Введення Mab 205 (25 мг/кг, схема q7d, внутрішньобрюшинно) привело до зупинки пухлинного росту трансплантованих ксенотрасплантатів NSCLC (див. фіг. 4). 21 UA 107821 C2 22 UA 107821 C2 23 UA 107821 C2 24 UA 107821 C2 25 UA 107821 C2 26 UA 107821 C2 27 UA 107821 C2 28