Нейтралізуюче антитіло, що має специфічність до людського il-6

1. Гуманізоване нейтралізуюче антитіло, що має специфічність до людського IL-6 і має важкий ланцюг, який містить послідовність представлену тут під номером SEQ ID NO:11 і легкий ланцюг, який містить послідовність представлену тут під номером SEQ ID NO: 13. 2. Нейтралізуюче антитіло, що має специфічність до людського IL-6 за п. 1, яке має важкий ланцюг, який містить послідовність, представлену тут під 2 (19) 1 3 96141 4 або пов’язаного зі зростанням рівня інтерлейкіну IL-6. 13. Фармацевтична композиція за пп. 10 або 11 для застосування в лікуванні або профілактиці патологічного розладу, опосередкованого інтерлейкіном IL-6 або пов’язаного зі зростанням рівня інтерлейкіну IL-6. Даний винахід стосується молекул антитіл, які володіють специфічністю до антигенних детермінант інтерлейкіну IL-6. Винаходом пропонуються також процеси виготовлення таких молекул та їх терапевтичне застосування. Інтерлейкін IL-6 є плейотропним багатофункціональним цитокіном, який продукується клітинами різноманітних типів. Спочатку його називали фактором диференціації В-клітин (BSF-2), який індукував кінцеве визрівання В-клітин у клітини, що продукують антитіла (Ніrаnо et al., 1986 Nature 324, 73-76). Було показано, що IL-6 відіграє центральну роль в імунній регуляції, запаленні, гематопоезі та онкогенезі. В імунній системі IL-6 індукує продукування антитіл В-клітин, збільшуючи кількість поліклонального імуноглобуліну. Він також індукує експресію рецепторів інтерлейкіну-2 (IL-2) на Тклітинах (Nomo et al., 1987, Immunol, letters, 15, 3, 249-253) та ініціює продукування IL-2 в активованих Т-клітинах, викликаючи як ріст, так і диференціацію цитотоксичних Т-клітин (Okada et al., 1988 J Immunol, 141, 5, 1543-1549). Відомо також, що IL-6 визначає диференціацію моноцитів на макрофаги (Chomarat Ρ et al., 2000 Nature Immunol., 6, 510514). Функція інтерлейкіну IL-6 не обмежується імунною реакцією, оскільки він бере участь в гематопоезі, тромбопоезі, утворенні остеокластів, викликанні гострої фази імунної реакції печінки, результатом якої є підняття рівня С-реактивного білка (CRP: С-reactive protein) і сироваткового амілоїду A (SAA: serum amyloid А). Відомо, що він є фактором росту для епідермальних кератиноцитів, ниркових мезангіальних клітин, клітин мієломи і плазмоцитоми (Grossman et al., 1989 Frot Natl Acad Sci.; 86, (16) 6367-6371: Horii et al., 1989, J Immunol, 143, 12, 3949-3955; Kawano et al., 1988, Nature 332, 6159, 83-85). IL-6 виробляється клітинами найрізноманітніших типів, в тому числі моноцитами і макрофагами, фібробластами, епідермальними кератиноцитами, судинними ендотеліальними клітинами, нирковими мезангіальними клітинами, гліальними клітинами, кондроцитами, Т- і В-клітинами та деякими пухлинними клітинами (Akira et al., 1990, FASEB J., 4, 11, 28602867). За винятком пухлинних клітин, які конститутивно виробляють IL-6, нормальні клітини не синтезують IL-6, якщо вони відповідним чином не стимулюються. IL-6 є глікопротеїном - молекулою, що складається із 184 амінокислот і має молекулярну масу від 21 до 28 кДа залежно від посттрансляційних модифікацій. У клітинах деяких типів знаходять альтернативні спласійнг-варіанти цього інтерлейкіну (Kishimoto et al., 1995, Blood, 86, 4, 1243-1254). IL-6-рецепторний (IL-6R) комплекс складається із двох функціонально різних мембранних білків - IL6-специфічного зв'язуючого 80 кДа ланцюга (gр80) і 130 кДа ланцюга сигнальної трансдукції (gр130). Хоча IL-6 не може безпосередньо зв'язуватися з gр130, він може зв'язуватися з IL-6R, створюючи високоафінний потрійний комплекс ІL-6/IL-6R/gρ 130. IL-6R зв'язує IL-6 з низькою афінністю, проте IL-6R не має внутрішньоклітинного домену передачі сигналів, у зв'язку з чим це зшивання само по собі не веде до клітинної активації. Так само синтез IL-6R на поверхні клітини не означає, що ця клітина є відповідальною за стимуляцію IL-6. Протеолітичне розщеплення веде до вивільнення розчинного IL-6R (slL-6R; sgpSO), який може зв'язуватися з IL-6, що циркулює у кровообігу, і збільшувати час напівжиття IL-6. Для того, щоб активувати клітину, інтерлейкін IL-6 спочатку зв'язується або зі зв'язаним з клітиною IL-6R або з розчинним sIL-6R. Після цього гетеродимерний комплекс IL-6/IL-6R зв'язується з поверхневоклітинним глікопротеїном gp130. Утворюваний у результаті потрійний гетерокомплекс зв'язується з іншим IL-6/IL-6R/gp130, і внаслідок цього виникає сигнальна трансдукція (Bravo and Heath 2000, EMBO J., 19, (11), 2399-2411; Boulanger et al., 2003, Science, 300, 5628, 2101-2104). Таким чином, внесок у клітинну активацію роблять як клітиннозв'язаний, так і розчинний IL-6R. Передача сигналів IL-6 через клітинно-зв'язаний IL-6R отримала назву цис-сигналізування, а клітинна активація через розчинний IL-6R зветься транссигналізуванням. Клітини, що експресують gр130, але не експресують 1L-6R, можуть стимулюватися інтерлейкіном IL-6 через розчинний рецептор sIL6R. Відомо, що нейтралізуючі мишачі антитіла проти людського IL-6 здатні перешкоджати зв'язуванню людського IL-6 з IL-6R (сайт 1) або з gр130 (сайти 2 і 3) (Kаlаі et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249, 690-700; Brakenhoff et al., 1990, Journal of Immunology, 145, 561-568; Wendling et al., 1993, Journal of Rheumatology, 29, 259-262). У патенті США № 5,856,135 описані переформовані людські антитіла проти людського IL-6, які блокують зв'язування IL-6 з IL-6R. Ці антитіла були виведені із мишачого моноклонального антитіла SK2, у котрому ділянки визначення комплементарності (CDR: complementarity determining regions) із варіабельної ділянки мишачого антитіла SK2 трансплантуються у варіабельні ділянки людського антитіла. Відомими є також нейтралізуючі людські антитіла проти IL-6 (Hansen et a!., Eur. J. Immunol, 1995, 25, 348-354). У заявці WO 2004039826 було описане придатне до застосування в терапії сайт I-химерне мишаче/людське антитіло проти IL-6. 5 На стадії клінічних випробувань у лікуванні ревматоїдного артриту перебуває гуманізоване моноклональне антитіло проти людського IL-6 рецептора (Kishimoto, 2005, Annu Rev Immunol. 23:1-21). Повідомлялося також, що таке саме антитіло виявило свою ефективність на фазі II досліджень з лікування хвороби Крона (Crohn). Ефективними виявилися також антитіла як проти IL-6, так і проти IL-6R у люпус-подібній хворобі мишей NZB/W F1 (Fink et al., 1994 J. Clin. Invest. 94, 585; Mihara et al., 1998, Clin. Exp. Immunol. 112, 397). Нейтралізуюче антитіло проти мишачого рецептора IL-6 пригнічує коліт в адоптивній моделі передачі хвороби (Yamamoto et al., 2000 Journal of Immunology, 164, 4878; Atreya et al., 2000 Nature Med 6, 583). В останньому з цих досліджень була продемонстрована також ефективність антитіла проти рецептора на IL-10 нокаутній мишачій моделі коліту і на TNBS-моделі запалення кишок. Авторами даного винаходу було ідентифіковане високоафінне нейтралізуюче антитіло проти IL6, яке є особливо ефективним in vivo і, зокрема, в описаній тут моделі in vivo. Загальноприйнятим є нумерувати залишки у варіабельних доменах антитіл за номенклатурою, розробленою Кеботом (Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA) (далі "Kabat et al. (supra)"). Ця номенклатура, за винятком деяких обмовлених випадків, використовується і в даному описі. Позначення залишків за Кеботом не завжди прямо відповідає лінійній нумерації амінокислотних залишків. Фактична лінійна амінокислотна послідовність може містити менше чи більше амінокислот, ніж строга нумерація за номенклатурою Кебота, що відповідає тому чи іншому скороченню або вставці у структурний інгредієнт (чи то в каркас чи то в ділянку визначення комплементарності (CDR)) базової структури варіабельного домену. Правильна нумерація залишків за номенклатурою Кебота може для даного антитіла встановлюватися шляхом зіставляння залишків гомології в послідовності антитіла зі "стандартною" послідовністю, нумерованою за Кеботом. Згідно з номенклатурою Кебота CDR-ділянки варіабельного домену важкого ланцюга розташовані на залишках 31-35 (CDR-H1), залишках 50-65 (CDR-H2) і залишках 95-102 (CDR-H3). Але в системі нумерації Чотія (Chothia, С. and Lesk, A.M. J. Моl. Biol., 196, 901-917 (1987)) петля, еквівалентна ділянці CDR-H1, простягається від залишку 26 до залишку 32. Таким чином, в нумерації, що об'єднує в собі номенклатуру Кебота з топологічним визначенням петель за Чотія, ділянка CDR-H1 у використовуваному тут позначенні включає у себе залишки 26-35. За номенклатурою Кебота CDR-ділянки варіабельного домену легкого ланцюга розташовані на залишках 24-34 (CDR-L1), залишках 50-56 (CDRL2) і залишках 89-97 (CDR-L3). Використовуваний тут термін "нейтралізуюче антитіло" означає антитіло, здатне нейтралізувати активаційну біологічну активність IL-6, наприклад, 96141 6 шляхом блокування сайта 3 зв'язування IL-6 з gр130-рецептором. Антитіла для застосування в даному винаході можуть отримуватися за допомогою будь-якого підходящого процесу, відомого в даній галузі. Поліпептид IL-6 та клітини, що цей поліпептид синтезують, можуть використовуватися для продукування антитіл, які специфічно розпізнають IL-6. Поліпептидом IL-6 може бути "зрілий" поліпептид або його біологічно активний фрагмент чи похідна. Кращим серед них зрілий IL-6 поліпептид. IL-6 поліпептиди можуть отримуватися за допомогою добре відомих процесів зі сконструйованих методами генної інженерії клітин-хазяїнів, які містять системи експресії, або шляхом відновлення їх із природних біологічних джерел. У даному описі значення терміну "поліпептиди" включає у себе пептиди, поліпептиди і білки і, таким чином, якщо не зазначено іншого, передбачає їхню взаємозамінність. У деяких випадках поліпептид IL-6 може бути частиною більшого білка, наприклад, злитого з міткою афінності. У разі потреби імунізації тварини, антитіла проти IL-6-поліпептиду можуть продукуватися шляхом уведення цих поліпептидів тварині, у кращому варіанті - відмінній від людини, за допомогою добре відомих стандартних методик, описаних, наприклад, у довіднику (Handbook of Experimental Immunology, D. Μ. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Підходящими для такої імунізації в загальному випадку є більшість теплокровних тварин, наприклад, кролі, миші, щури, вівці, велика рогата худоба, свині. При цьому кращими серед них є миші, кролі, свині та щури. Підходящими для застосування в даному винаході є як цілі моноклональні, гуманізовані, повністю людські або химерні та інші антитіла, так і їхні функціонально активні фрагменти чи похідні. Моноклональні антитіла можна готувати за допомогою будь-якого відомого методу, включаючи, наприклад, метод гібридом (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), метод триом, метод людських В-клітинних гібридом (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) і метод EBV-гібридом (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985). Антитіла для застосування в даному винаході можна створювати також за допомогою методів антитіл із поодиноких лімфоцитів шляхом клонування та експресії кДНК варіабельних ділянок імуноглобулінів із поодиноких лімфоцитів, добраних для продукування специфічних антитіл, наприклад, за допомогою методів, описаних у (Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15)7843-78481; WO 92/02551; WO 2004/051268 та Міжнародній патентній заявці WO 2004/106377). Гуманізовані антитіла (включаючи CDRтрансплантовані антитіла) являють собою генеровані відмінними від людини видами молекули, які мають одну чи більше ділянок визначення комплементарності (CDR: complementarity determining regions) від відмінних від людини видів та каркасні ділянки від людських молекул імуноглобуліну, див., наприклад, (Патент США № 5,585,089; заявка WO91/09967). Цілком зрозуміло, що у таких анти 7 тіл може бути потрібним перетворювати на CDRділянках тільки залишки визначення специфічності, а не всю CDR-ділянку, див., наприклад, (Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Гуманізовані антитіла в разі потреби можуть, крім того, містити один чи більше каркасних залишків, що походять із відмінних від людини видів, із котрих були виведені CDR-ділянки. Химерними є антитіла, кодовані імуноглобуліновими генами, сконструйованими методами генної інженерії таким чином, що їхні гени легкого і важкого ланцюгів складаються із сегментів імуноглобулінових генів, які належать до різних видів. Антитіла для застосування в даному винаході можуть створюватися також за допомогою різноманітних, відомих у даній галузі методів відображення фагів, включаючи методи, описані в роботах (Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50; Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958; Persic et al., Gene, 1997 187 9-18; Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57:191280, а також у заявках №№ WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 і патентах США №№ 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743, 5,969,108). Повністю людськими є антитіла, у котрих усі варіабельні ділянки і константні ділянки (у разі їх наявності) як важкого, так і легкого ланцюгів, є людського походження або практично ідентичними послідовностям людського походження, але не обов'язково від одного антитіла. Так, повністю людськими є, наприклад, антитіла, вироблені згаданими вище методами відображення фагів, та антитіла, вироблені мишами, у котрих гени варіабельної і константної частин мишачого імуноглобуліну були замінені на їхні людські еквіваленти, як описано, наприклад, у патентах (ЕР0546073 В1, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, EP 0438474 B1, EP 0463151 B1). Одним із варіантів здійснення винаходу є нейтралізуюче антитіло, яке володіє специфічністю до людського IL-6, має важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить: принаймні одну із таких CDR-ділянок: CDR-ділянку, що має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:5, для CDR-H1; CDR-ділянку, що має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:6, для CDR-H2; і CDR-ділянку, що має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:7, для CDR-H3. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і містить важкий ланцюг, у котрому принаймні дві із ділянок CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 варіабельного домену важкого ланцюга вибирають серед: послідовності, представленої тут як SEQ ID NO:5, для CDR-H1; послідовності, представленої тут як SEQ ID NO:6, для CDR-H2; і послідовності, представленої тут як SEQ ID NO:7, для CDR-H3. Наприклад, антитіло може 96141 8 містити важкий ланцюг, у котрому CDR-Н1 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:5, a CDR-H2 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:6. В альтернативному варіанті антитіло може містити важкий ланцюг, у котрому CDR-H1 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:5, a CDR-H3 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:7. Або ж антитіло може містити важкий ланцюг, у котрому CDR-H2 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:6, a CDR-H3 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:7. Цілком зрозуміло, що вищезазначеним охоплюються також усі можливі переставлення. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і містить важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:5, для CDR-H1, послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:6, для CDR-Н2, і послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:7, для CDR-H3. В одному з варіантів здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і містить легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить принаймні одну із таких CDRділянок: CDR-ділянку, яка має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:8, для CDR-L1; CDR-ділянку, яка має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:9, для CDR-L2; і CDR-ділянку, яка має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:10, для CDR-L3. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і містить легкий ланцюг, у котрому принаймні дві із ділянок CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 варіабельного домену легкого ланцюга вибирають серед: послідовності, представленої тут як SEQ ID NO:8, для CDR-L1; послідовності, представленої тут як SEQ ID NO:9, для CDR-L2; і послідовності, представленої тут як SEQ ID NO:10, для CDR-L3. Наприклад, антитіло може містити легкий ланцюг, у котрому CDR-L1 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:8, a CDR-L2 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:9. В альтернативному варіанті антитіло може містити легкий ланцюг, у котрому CDR-L1 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:8, a CDR-L3 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:10. Або ж антитіло може містити легкий ланцюг, у котрому CDR-L2 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:9, a CDR-L3 має послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:10. Цілком зрозуміло, що вищезазначеним охоплюються також усі можливі переставлення. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і містить легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен містить: 9 послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:8 для CDR.-L1; послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:9, для CDR-L2; і послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:10, для CDR-L3. Цілком зрозуміло, що винаходом передбачена також можливість уведення амінокислотних заміщень, добавок і/або делецій, які можуть зроблені на CDR-ділянках без суттєвого змінювання здатності даного антитіла зв'язуватися з IL-6 і нейтралізувати IL-6-активність. Вплив будь-яких амінокислотних заміщень, добавок і/або делецій може бути легко оцінений фахівцем у даній галузі, наприклад, за допомогою методів, описаних нижче у Прикладах і застосовуваних для визначення IL-6зв'язування та нейтралізації. Так, в одному з прикладів даним винаходом пропонується антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і містить одну чи більше CDR-ділянки, вибрані серед CDRH-1 (SEQ ID NO:5), CDRH-2 (SEQ ID NO:6), CDRH-3 (SEQ ID NO:7), CDRL-1 (SEQ ID NO:8), CDRL-2 (SEQ ID NO:9) і CDRL-3 (SEQ ID NO:10), у котрих одна і більше амінокислот на одній і більше CDR-ділянках були заміщені іншою амінокислотою або амінокислотами. Молекули антитіл згідно з даним винаходом у кращому варіанті містять, відповідно, комплементарний легкий ланцюг або комплементарний важкий ланцюг. Таким чином, в одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить: важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:5, для CDR-H1, послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:6, для CDR-H2 і послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:7, для CDR-H3; і легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:8, для CDR-L1, послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:9, для CDR-L2, і послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:10, для CDR-L3. В одному з прикладів здійснення даного винаходу пропонується антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і містить: важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:5, для CDR-H1, послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:6 для CDRH-2, і послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:7 для CDRH-3; і легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:8, для CDR-L1, послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:9, для CDR-L2, і послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:10, для CDR-L3, у котрому одна чи більше амінокислот на одній чи більше CDRділянках були заміщені іншою амінокислотою або амінокислотами. В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга 96141 10 містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID N0;2. В іншому варіанті здійснення винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:2. В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:2. Використовуваний тут термін "ідентичність" означає, що в будь-якому конкретному положенні в послідовностях, що зіставляються, амінокислотні залишки в цих послідовностях є ідентичними один одному. Використовуваний тут термін "подібність" означає, що в будь-якому конкретному положенні в послідовностях, що зіставляються, амінокислотні залишки в цих послідовностях є подібного типу. Наприклад, лейцин може бути заміщений на ізолейцин або валін. Серед інших амінокислот, які можуть заміщуватися одна на одну, можна назвати, наприклад: - фенілаланін, тирозин і триптофан (амінокислоти, що мають ароматичні бічні ланцюги); - лізин, аргінін і гістидин (амінокислоти, що мають основні бічні ланцюги); - аспартат і глутамат (амінокислоти, що мають кислотні бічні ланцюги); - аспарагін і глутамін (амінокислоти, що мають амідні бічні ланцюги); і - цистеїн і метіонін (амінокислоти, що мають сірковмісні бічні ланцюги). Ступені ідентичності та подібності можуть бути легко обчислені (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., Μ Stockton Press, New York, 1991). В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:4. В іншому варіанті здійснення винаходу запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:4. В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:4. 11 В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:2, і легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:4. В іншому варіанті здійснення винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:2, а варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:4. У кращому варіанті запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:2, і легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:4. В одному з варіантів здійснення винаходу запропонованим антитілом є щурине антитіло, в котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:2, а варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:4. Це щурине антитіло в даному описі позначається скорочено 132Е09 або зветься донорним антитілом. Повні нуклеотидна й амінокислотна послідовності варіабельного домену важкого ланцюга щуриного антитіла 132Е09 представлені тут під номерами відповідно SEQ ID NO:1 і 2. Повні нуклеотидна й амінокислотна послідовності варіабельного домену легкого ланцюга щуриного антитіла 132Е09 представлені тут під номерами відповідно SEQ ID NO:3 і 4. CDRділянки, представлені послідовностями SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9 і 10, виведені із щуриного антитіла 132Е09. В одному з варіантів антитілом згідно з даним винаходом є CDR-трансплантоване антитіло. Використовуваний тут термін "CDR-трансплантоване антитіло" означає антитіло, в котрому важкий і/або легкий ланцюг містить одну чи більше CDRділянок (включаючи, в разі потреби, одну чи більше модифікованих CDR-ділянок) із донорного (наприклад, щуриного антитіло), трансплантованого в каркас варіабельної ділянки важкого і/або легкого ланцюга акцепторного антитіла (наприклад, людського). Загальний огляд з даного питання можна знайти в роботі (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). У кращому варіанті одну чи більше CDR-ділянок отримують із щуриного антитіла 132Е09 (SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9 і 10). В одному з варіантів здійснення винаходу в каркас людського антитіла переносять не всю намічену для перенесення CDR-ділянку, а лише 96141 12 один чи більше залишків визначення специфічності на будь-якій із CDR-ділянок, описаних вище, див., наприклад, (Kashmiri et аl., 2005, Methods, 36, 25-34). В одному з варіантів здійснення винаходу в каркас людського антитіла переносять лише залишки визначення специфічності з однієї чи більше із описаних вище CDR-ділянок. В іншому варіанті здійснення винаходу в каркас людського антитіла переносять лише залишки визначення специфічності з усіх описаних вище CDR-ділянок. При трансплантації CDR-ділянок або залишків визначення специфічності може використовуватися будь-яка підходяща послідовність акцепторного каркасу варіабельної ділянки, що відповідає класу і типу донорного антитіла, із котрого виводяться дані CDR-ділянки, включаючи каркасні ділянки від щурів, мишей, приматів і людей. У кращому варіанті CDR-трансплантоване антитіло згідно з даним винаходом має принаймні один варіабельний домен, який містить людські акцепторні каркасні ділянки, а також одну чи більше CDR-ділянок, виведених із донорного антитіла, як описано вище. Таким чином, винаходом пропонується нейтралізуюче CDR-трансплантоване антитіло, в котрому варіабельний домен містить людські акцепторні каркасні ділянки і відмінні від людських, у кращому варіанті - мишачі, донорні CDR-ділянки. Підходящими для використання в даному винаході людськими каркасними длянками можуть бути, наприклад, KOL, NEWM, RBI, EU, TUR, ТЕІ, LAY і РОМ (Kabat et al., supra). Зокрема, наприклад, KOL і NEWM можуть використовуватися для важкого ланцюга, REI може використовуватися для легкого ланцюга, a EU, LAY і РОМ можуть використовуватися як для важкого, так і для легкого ланцюга. В альтернативному варіанті можуть використовуватися послідовності людської ембріональної лінії; такі послідовності є доступними за адресою: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/ У CDR-трансплантованому антитілі згідно з даним винаходом акцепторні важкий і легкий ланцюги не є обов'язковим виводити із одного і того ж антитіла і в разі потреби можуть містити складні ланцюги, які мають каркасні ділянки, виведені із різних ланцюгів. Кращою каркасною ділянкою для важкого ланцюга CDR-трансплантованого антитіла згідно з даним винаходом є ділянка, виведена із послідовності 1-4 3-72 людської підгрупи VH3 разом з JH4 (показана на Фіг. 2; послідовності SEQ ID NO:19 і 20). Таким чином, даним винаходом пропонується нейтралізуюче CDR-трансплантоване антитіло, яке містить щонайменше одну відмінну від людської донорну CDR-ділянку, в котрій каркасна ділянка важкого ланцюга виведена із послідовності 1-4 3-72 людської підгрупи разом з JH4. Послідовністю людської JH4 є така: (YFDY)WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:20). Мотив YFDY є частиною ланцюга CDRH3 і не є частиною каркасу 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591). Донорною послідовністю є послідовність 132Е09 VH (SEQ ID NO:2), показана на Фіг. 2, де донорні CDR-ділянки (SEQ ID NO:5, 6 і 7) підкреслені. У кращому варіанті каркасну ділянку для легкого ланцюга CDR-трансплантованого антитіла 13 згідно з даним винаходом виводять із показаної на Фіг. 2 (SEQ IDNO:21 і 22) послідовності 2-1-(1) 012 разом з JK2 підгрупи VK1 людської ембріональної лінії. Таким чином, винаходом пропонується нейтралізуюче CDR-трансплантоване антитіло, яке містить щонайменше одну відмінну від людської донорну CDR-ділянку, в котрій каркасна ділянка легкого ланцюга виведена із послідовності VK1 21-(1) 012 людської підгрупи разом з JK2. Послідовністю JK2 є: (YT)FGQGTKLEIKR (SEQ ID NO:22). Мотив YT є частиною CDR-L3, але не є частиною каркасу 4 (Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257,1516-1522). Донорною є послідовність 132E09 VL (SEQ ID NO:4), показана на Фіг. 2, a донорні CDR-ділянки (SEQ ID NO:8, 9 і 10) підкреслені. Крім того, в CDR-трансплантованому антитілі згідно з даним винаходом каркасним ділянкам не обов'язково мати точно таку саму послідовність, що і в акцепторного антитіла. Наприклад, рідкісні залишки можуть бути замінені на більш звичні залишки, що часто зустрічаються в акцепторних ланцюгах даного класу або типу. В альтернативних варіантах певні залишки на акцепторних каркасних ділянках можуть замінюватися таким чином, щоб вони відповідали залишку, який займає таке саме положення в донорному антитілі (Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Такі заміни не повинні перевищувати мінімального рівня, необхідного для відновлення афінності донорного антитіла. Методика добору залишків на акцепторних каркасних ділянках, які може бути потрібним замінити, описана в заявці WO 91/09967. У кращому варіанті CDR-трансплантованої молекули антитіла згідно з даним винаходом якщо акцепторний важкий ланцюг має людську \/Н3послідовність 1-4 3-72 разом з JH4, то акцепторні каркасні ділянки важкого ланцюга містять, окрім однієї чи більше донорних CDR-ділянок, також донорний залишок щонайменше в положенні 49 за номенклатурою Кебота (Kabat et al., (supra)). Таким чином, винаходом пропонується CDRтрансплантоване антитіло, в котрому принаймні залишок у положенні 49 варіабельного домену важкого ланцюга є донорного походження. У кращому варіанті CDR-трансплантованої молекули антитіла згідно з даним винаходом якщо акцепторний легкий ланцюг має людську VK1послідовність 2-1-(1) 012 разом з JK2, то на акцепторних каркасних ділянках легкого ланцюга донорні залишки не використовуються, і лише одна чи більше донорних CDR-ділянок переносяться. Донорними залишками є залишки від донорного антитіла, тобто від антитіла, із якого були виведені CDR-ділянки; отже, у випадку даного винаходу первинним джерелом донорних залишків є щурине антитіло 132Е09. Таким чином, даним винаходом пропонується антитіло, в котрому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить послідовність gН13 (Фіг. 2; SEQ ID NO:11). В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, предста 96141 14 вленою тут під номером SEQ ID NO:11. У кращому варіанті запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% або 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:11. Крім того, винаходом пропонується антитіло, в котрому варіабельна ділянка легкого ланцюга містить послідовність gL10 (Фіг. 2; SEQ ID NO:13). В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:13. У кращому варіанті запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:13. У кращому варіанті CDR-трансплантоване антитіло згідно з даним винаходом містить важкий ланцюг, який містить послідовність gH13 (SEQ ID NO:11), і легкий ланцюг, який містить послідовність gL10 (SEQ ID NO:13). В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:11, а варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:13. У кращому варіанті запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, у котрому варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:11, і легкий ланцюг, у котрому варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:13. Молекули антитіл згідно з даним винаходом можуть містити повну молекулу антитіла, яка має важкий і легкий ланцюги повної довжини, або його фрагмент, і можуть бути, наприклад, Fab, модифікованими Fab, Fab', F(ab')2, Fv, однодоменними антитілами, scFv, дво-, три- або чотиривалентними антитілами, Bis-scFv, подвійними, потрійними, четверними антитілами та епітоп-зв'язуючими фрагментами будь-якого з цих варіантів антитіл, див., наприклад, (Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Процеси створення і виготовлення цих фрагментів антитіл є добре відомими в даній галузі, див., наприклад, (Verma et аl., 1998, Journal of Immunological Methods, 216,165-181). Підходящими для застосування в даному винаході фрагментами антитіл можуть бути також фрагменти Fab і 15 Fab', описані в Міжнародних патентних заявках WO 2005/003169, WO 2005/003170 і WO 2005/003171. Багатовалентні антитіла можуть бути мультиспецифічними або ж моноспецифічними, див., наприклад, (WO 92/22853 і WO 05/113605). Домени константних ділянок молекули антитіла згідно з даним винаходом у разі їх наявності можуть вибиратися з урахуванням запропонованої функції молекули антитіла і, зокрема, ефекторних функцій, які можуть потребуватися. Домени константних ділянок можуть бути, наприклад, доменами людських IgA, IgD, IgE, IgG або ІgМ. Зокрема, використовуватися можуть домени константних ділянок людського IgG і особливо ізотипів lgG1 та lgG3, коли молекула антитіла призначається для терапевтичного застосування і потребуються ефекторні функції антитіла. В альтернативному варіанті можуть використовуватися ізотипи lgG2 та lgG4, коли молекула антитіла призначається для терапевтичних цілей, а ефекторні функції антитіла не є потрібними, наприклад, для простого блокування IL-6 активності. Цілком зрозуміло, що можуть використовуватися також варіанти послідовностей цих доменів константних ділянок. Так, можуть використовуватися, наприклад, молекули IgG, у котрих серии в положенні 241 був замінений на пролін, як описано в (Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108). Константний домен lgG4, який містить таку заміну є особливо підходящим. Для фахівця в даній галузі цілком зрозуміло, що антитіла можуть піддаватися різноманітним посттрансляційним модифікаціям. Тип і розміри цих модифікацій часто залежать від лінії клітини-хазяїна, використовуваної для синтезу антитіла, а також від умов культивування. Такими модифікаціями можуть бути, наприклад, варіації у глікозилюванні, окислюванні метіоніну, утворенні дикетопіперизину, ізомеризації аспартату і деамідуванні аспарагіну. Часто модифікація полягає в утраті основного залишку на карбоксильному кінці (тобто лізину або аргініну) внаслідок дії карбоксипептидаз, як описано в роботі (Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134,1995). Таким чином, С-кінцевий лізин важкого ланцюга антитіла з послідовністю SEQ ID NO:16 може бути відсутнім. В одному з кращих варіантів здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і має константну ділянку важкого ланцюга, яка містить константну ділянку людського lgG4, на котрій серии у положенні 241 є заміщеним на пролін, як описано в (Angal et al., supra). Таким чином, винаходом пропонується антитіло, в котрому важкий ланцюг містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:16, або складається з неї. У кращому варіанті константною ділянкою легкого ланцюга є сKарра. В одному з варіантів здійснення винаходу пропонується антитіло, в котрому важкий ланцюг містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:16, або складається з неї, а легкий ланцюг містить послідовність, представлену тут під номером SEQ lD NO:18, або складається з неї. В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, де 96141 16 цей важкий ланцюг містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:16. У кращому варіанті запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, де цей важкий ланцюг містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:16. В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, де цей легкий ланцюг містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:18. У кращому варіанті запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, де цей легкий ланцюг містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:18. В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, у котрому важкий ланцюг містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:16, а легкий ланцюг містить послідовність, яка має принаймні 60% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:18. У кращому варіанті запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, де цей важкий ланцюг містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQ ID NO:16, і легкий ланцюг, де цей легкий ланцюг містить послідовність, яка має принаймні 70%, 80%, 90%, 95% чи 98% ідентичність або подібність з послідовністю, представленою тут під номером SEQIDNO: 18. Даним винаходом пропонується також специфічна ділянка або епітоп людського IL-6, що зв'язується із запропонованим антитілом і, зокрема, антитілом, котре містить будь-яку із таких ділянок: CDR-H1 (SEQ ID NO:5), CDR-H2 (SEQ ID NO:6), CDR-H3 (SEQ ID NO:7), CDR-L1 (SEQ ID NO:8), CDR-L2 (SEQ ID NO:9) або CDR-L3 (SEQ ID NO:10), і котрим може бути, наприклад, антитіло 132Е09 або антитіла, що містять послідовність gH13 (SEQ ID NO:11) варіабельної ділянки важкого ланцюга і/або послідовність gL10 (SEQ IDNO:13) варіабельної ділянки легкого ланцюга. Ця специфічна ділянка або епітоп людського поліпептиду IL-6 може ідентифікуватися за допомогою будь-якого підходящого методу картування епітопів, відомого в даній галузі, в комбінації з будь-яким антитілом, запропонованим даним винаходом. Одним з таких методів є скринінг пептидів різної довжини, які одержуються із IL-6 для зв'язування з антитілом за даним винаходом і містять найменший фрагмент, здатний специфічно зв'язуватися з антитілом, оскільки він містить послідовність епітопу, який розпізнається цим антитілом. Пептиди IL-6 можуть одержуватися шляхом синтезу або шляхом протеолітичного гідролізу IL6-поліпептиду. Ідентифікацію пептидів, які зв'язуються з антитілом, можна здійснювати, наприклад, 17 за допомогою мас-спектрометричного аналізу. Іншим підходящим для цього інструментом є ЯМР спектроскопія, за допомогою якої можна ідентифікувати епітоп, зв'язаний з антитілом за даним винаходом, як описано в Прикладах нижче. Будучи ідентифікованим, даний епітопний фрагмент, який зв'язується з антитілом за даним винаходом, може в разі потреби використовуватися як імуноген для одержання додаткових нейтралізуючих антитіл, що зв'язуються з таким самим епітопом. В одному з прикладів здійснення даного винаходу епітоп людського IL-6, що зв'язується запропонованим антитілом, містить щонайменше амінокислотні залишки S47, С50, Е93, R104, F105, Е106, Т149, K150, А153, Q156, Q159 і S169 людського IL6 (нумерація залишків за системою Буланже (Boulanger et al., Science, 300, 2101-2104). В одному з прикладів здійснення винаходу епітоп людського IL-6, що зв'язується запропонованим антитілом, містить амінокислотні залишки S47, С50, Е93, R104, F105, Е106, Т149, K150, А153, Q156, Q159 і S169 та принаймні один із залишків, вибраних серед C44, S53, A58, V96, Q152, Q154, N155, W157, T163, L165 і Е172. В одному з прикладів здійснення винаходу епітоп людського IL-6, що зв'язується запропонованим антитілом, містить амінокислотні залишки С44, S47, С50, S53, А58, Е93, V96, R104, F105, Е106, Т149, K150, Q152, А153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, Т163, L165, S169 і Е172. В одному з варіантів здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і зв'язується з епітопом зрілого людського IL-6, який містить амінокислотні залишки S47, С50, Е93, R104, F105, Е106, Т149, K150, А153, Q156, Q159 і S169. В одному з варіантів здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і зв'язується з епітопом зрілого людського IL-6, який містить амінокислотні залишки S47, С50, Е93, R104, F105, Е106, Т149, K150, А153, Q156, Q159 і S169 та принаймні один із залишків, вибраних серед С44, S53, А58, V96, Q152, Q154, N155, W157, Т163, L165 і Е172. В одному з варіантів здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і зв'язується з епітопом зрілого людського IL-6, який містить амінокислотні залишки С44, S47, С50, S53, А58, Е93, V96, R104, F105, Е106, Т149, K150, Q152, А153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, Т163, L165, S169 і Е172. Цілком зрозуміло, що перелічені вище залишки можуть позначатися також, виходячи із нумерації амінокислот непроцесованого попередника інтерлейкіну IL-6 (номер доступу: Swiss Prot Accession number P05231). Таким чином, перелічені вище залишки, нумеровані в системі Буланже (Boulanger et al., supra) С44, S47, С50, S53, А58, Е93, V96, R104, F105, Е106, Т149, K150, Q152, А153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, Т163, L165, S169 і Е172, приймають такі позначення: С72, S75, С78, S81, А86, Е121, V124, R132, F133, Е134, 96141 18 Т177, K178, Q180, А181, Q182, N183, Q184, W185, Q187, Т191, L193, S197 і Е200 відповідно. У кращому варіанті антитіло згідно з винаходом блокує зв'язування рецептора gр130 з сайтом 3 людського IL-6. У нейтралізації IL-6-активності можуть так само використовуватися антитіла, які перехресно блокують зв'язування антитіл згідно з даним винаходом з IL-6. Таким чином, даним винаходом пропонується також нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і перехресно блокує зв'язування будь-якого із описаних вище антитіл з людським IL-6 і/або є перехресно блокованим від зв'язування IL-6 будь-яким із цих антитіл. В одному з варіантів здійснення винаходу таке антитіло зв'язується з тим самим епітопом, що й антитіло, описано вище. В іншому варіанті здійснення винаходу нейтралізуюче антитіло, що перехресно блокує, зв'язується з епітопом, який межує і/або перекривається з епітопом, зв'язаним антитілом, описаним вище. Можливим є також варіант здійснення винаходу, в якому нейтралізуюче антитіло, що перехресно блокує, не зв'язується з тим самим епітопом, що антитіло за даним винаходом або з епітопом, який межує і/або перекривається зі згаданим епітопом. Антитіла, що перехресно блокують, можуть бути ідентифіковані за допомогою будь-якого підходящого методу, відомого в даній галузі, і зокрема, наприклад, за допомогою конкурентного твердофазного імуноферментного аналізу ELISA або ВІАсоrе, де зв'язування антитіла, що перехресно блокує, з людським IL-6 запобігає зв'язуванню антитіла за даним винаходом і навпаки. В одному з варіантів здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і перехресно блокує зв'язування антитіла 132Е09 або антитіла, важкий ланцюг якого містить послідовність gH13 (SEQ ID NO:11), чи антитіла, легкий ланцюг якого містить послідовність gL10 (SEQ ID NO:13), антитіла, що містить будь-яку із ділянок CDR-H1 (SEQ ID NO:5), CDR-H2 (SEQ ID NO:6), CDR-H3 (SEQ ID NO:7), CDR-L1 (SEQ ID NO:8), CDR-L2 (SEQ ID NO:9) або CDR-L3 (SEQ ID NO:10), з людським IL6. В одному з варіантів здійснення винаходу запропоновані антитіла, що перехресно блокують, інгібують зв'язування 132Е09 або антитіла, важкий ланцюг якого містить послідовність gH13 (SEQ ID NO:11), чи антитіла, легкий ланцюг якого містить послідовність gL10 (SEQ ID NO:13), чи антитіла, що містить будь-яку із ділянок CDR-H1 (SEQ ID NO:5), CDR-H2 (SEQ ID NO:6), CDR-H3 (SEQ ID NO:7), CDR-L1 (SEQ ID NO:8), CDR-L2 (SEQ ID NO:9) або CDR-L3 (SEQ ID NO:10), з людським IL6 принаймні на 80%, принаймні на 85%, принаймні на 90% або принаймні на 95%. В альтернативному варіанті або в додаток до вищезазначеного нейтралізуючі антитіла згідно з цим аспектом даного винаходу можуть бути перехресно блоковані від зв'язування з людським IL-6 будь-яким із антитіл згідно з даним винаходом. Таким чином, винаходом пропонуються також нейтралізуюча молекула антитіла, що володіє специфічністю до людського IL-6 і перехресно блокуєть 19 ся від зв'язування з людським IL-6 антитілом 132Е09 або антитілои, важкий ланцюг якого містить послідовність gH13 (SEQ ID NO:11), чи антитілом, легкий ланцюг якого містить послідовність gL10 (SEQ ID NO:13), чи антитілом, яке містить будь-яку із ділянок CDR-H1 (SEQ ID NO:5), CDRH2 (SEQ ID NO:6), CDR-H3 (SEQ ID NO:7), CDR-L1 (SEQ ID NO:8), CDR-L2 (SEQ ID NO:9) або CDR-L3 (SEQ ID NO:10). В одному з варіантів здійснення винаходу нейтралізуючі антитіла згідно з цим аспектом даного винаходу інгібуються від зв'язуваня з людським IL-6 антитілом 132Е09 або антитілом, важкий ланцюг якого містить послідовність gH13 (SEQ ID NO:11), чи антитілом легкий ланцюг якого містить послідовність gL10 (SEQ ID NO:13), чи антитілом, яке містить будь-яку із ділянок CDR-H1 (SEQ ID NO:5), CDR-H2 (SEQ ID NO:6), CDR-H3 (SEQ ID NO:7), CDR-L1 (SEQ ID NO:8), CDR-L2 (SEQ ID NO:9) або CDR-L3 (SEQ ID NO:10) принаймні на 80%, принаймні на 85%, принаймні на 90%, принаймні на 95%. Молекули антитіл згідно з даним винаходом у кращому варіанті мають високу, переважним чином пікомолярну, афінність зв'язування до людського IL-6. Цю афінність можна виміряти за допомогою будь-якого підходящого методу, відомого в даній галузі, і в тому числі за допомогою методу ВІАсоrе, як описано в розглянутих нижче прикладах. Афінність зв'язування виміряють переважно, використовуючи рекомбінантний людський IL-6 як описано в розглянутих нижче прикладах. Молекула антитіла згідно з даним винаходом у кращому варіанті має афінність зв'язування до людського IL-6 менше 500 пМ. У ще кращому варіанті молекула антитіла згідно з даним винаходом має афінність зв'язування до людського IL-6 менше 50 пМ. Таким чином,в одному з варіантів здійснення винаходу молекула антитіла згідно з даним винаходом має афінність зв'язування в інтервалі приблизно від 1 до 500 пМ. В одному з варіантів здійснення винаходу молекула антитіла згідно з даним винаходом має афінність зв'язування в інтервалі приблизно від 1 до 50 пМ. У кращому варіанті молекула антитіла згідно з даним винаходом має афінність зв'язування до людського IL-6 в інтервалі приблизно від 1 до 20 пМ. В одному з варіантів здійснення винаходу запропоноване антитіло має афінність зв'язування до людського IL-6 в інтервалі приблизно від 8 до 12 пМ. Цілком зрозуміло, що афінність антитіла, запропонованого даним винаходом, можна змінювати за допомогою будь-якого підходящого методу, відомого в даній галузі. Таким чином, даний винахід стосується також варіантів запропонованих молекул антитіл, які володіють поліпшеною афінністю до людського IL-6. Такі варіанти можуть отримуватися за допомогою різноманітних методів дозрівання афінності, включаючи мутацію CDR-ділянок (Yang et al., J. Моl. ВіоІ., 254, 392-403,1995), перетасовування ланцюгів (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), використання ген-мутаторних штамів виду Е. coli (Low et al., J. Моl. ВіоІ., 250, 359-368, 1996), перетасовування ДНК (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), відображання фагів (Thompson et al., J. Моl. ВіоІ., 256, 77-88, 1996) і 96141 20 статевих полімеразно-ланцюгових реакцій PCR (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Усі ці методи дозрівання афінності розглядаються в роботі Вогана (Vaughan et al., supra). У випробуваннях in vitro та in vivo молекули антитіл згідно з даним винаходом у кращому варіанті нейтралізують IL-6-активність, як описано у Прикладах, розглянутих нижче. В одному з варіантів здійснення винаходу ці антитіла зв'язуються із сайтом З людського IL-6. В одному з варіантів здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і є здатним інгібувати активність 0,038 нМ людського IL-6 на 50% при концентрації 100 пМ, де цю інгібіторну активність виміряють за IL-6-індукованою проліферацією клітин Т1165. В одному з варіантів здійснення винаходу концентрація антитіла, що інгібує IL-6 на 50% складає менше 50 пМ, а в ще кращому - менше 20 пМ. У кращому варіанті людським IL-6, використовуваним у цих випробуваннях є людський рекомбінантний інтерлейкін IL-6. В одному з варіантів здійснення винаходу нейтралізуючим антитілом є гуманізоване або повністю людське антитіло. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується нейтралізуюче антитіло, що володіє специфічністю до людського IL-6 і є здатним інгібувати активність 3,84 нМ людського IL-6 на 50% при концентрації менше 1 нМ, де цю інгібіторну активність виміряють за продукуванням МСР-1 (метилакцептуючого білка-1 хемотаксису) HUVECклітинами (ендотеліальними клітинами пупкової вени людини) у відповіднь на людський IL-6 і розчинний slL-6R-peцептор. У кращому варіанті людським IL-6, використовуваним у цих випробуваннях, є людський рекомбінантний IL-6. В одному з варіантів здійснення винаходу нейтралізуючим антитілом є гуманізоване або повністю людське антитіло. У разі потреби антитіло за даним винаходом може бути кон'югованим принаймні з однією із ефекторних молекул. Цілком зрозуміло, що в різноманітних варіантах здійснення винаходу ефекторна молекула може бути одинарною або складатися із двох і більше таких молекул, зшитих таким чином, щоб утворювати єдину цілу частину, здатну приєднуватися до антитіл згідно з даним винаходом. У разі потреби отримати фрагмент антитіла, приєднаний до ефекторної молекули, таке сполучення можна приготувати за допомогою стандартних хімічних процесів або методів рекомбінантних ДНК, які дозволяють приєднувати фрагмент антитіла до ефекторної молекули безпосередньо або через зв'язуючий інгредієнт. Методи кон'югування таких ефекторних молекул з антитілами є добре відомими в даній галузі, див., наприклад, (Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Терапевтичнэ, 83, 67-123). Конкретні хімічні процеси, підходящі для такого кон'югування, описані, наприклад, в міжнародних патентних заявках (WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 21 89/01476 і WO 03031581). В альтернативному варіанті, де ефекторною молекулою є білок або поліпептид, з'єднування може здійснюватися за допомогою методів рекомбінантних ДНК, як описано, наприклад, в WO 86/01533 і ЕР 0392745. Під терміном "ефекторна молекула" в даному описі маються на увазі, наприклад, антинеопластичні речовини, ліки, токсини, біологічно активні білки, наприклад ферменти, інше антитіло або фрагменти антитіла, полімери синтетичного чи природного походження, нуклеїнові кислоти та їхні фрагменти, наприклад, ДНК, РНК та їхні фрагменти, радіонукліди і, зокрема, радіойодид, радіоізотопи, хелатовані метали, наночастки і "репортерні" групи, такі як флуоресцентні сполуки або сполуки, які можуть детектуватися за допомогою ЯМР або ЕСР спектроскопії. Ефекторними молекулами можуть служити, наприклад, цитотоксини або цитотоксичні засоби, включаючи будь-який засіб, що є руйнівним (наприклад, вбивчим) для клітин. Це можуть бути, зокрема, комбрестатини, доластатини, епотилони, стауроспорин, маїтанзиноїди, спонгістатини, ризоксин, галіхондрини, рорідини, геміастерліни, таксол, цитохалазин В, граміцидин D, етидіумбромід, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин, а також їхні аналоги та гомологи. Ефекторними молекулами можуть бути також, наприклад, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, 5фторурацилдекарбазин), алкілувальні засоби (наприклад, мехлоретамін, тіотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) і ломустин (CCNU), циклофосфамід, бусульфан, дибромоманітол, стрептозотоцин, мітоміцин С і цисдихлордіамінплатина (II) (DDP) цисплатин), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (колишній дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (колишній актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин, антраміцин (АМС), каліхеаміцини або дуокарміцини) та антиміотичні засоби (наприклад, вінкристин і вінбластин). Крім того, до числа ефекторних молекул можна включити також хелатовані радіонукліди, такі як 111 90 177 213 252 192 Іn і Y, Lu , вісмут , каліфорній , іридій і 188 188 вольфрам /реній , та ліки, наприклад, алкілфосфохоліни, інгібітори топоізомерази І, таксоїди і сурамін. Ефекторними молекулами можуть бути також білки, пептиди і ферменти. Гідними уваги ферментами у зв'язку з цим є, наприклад, протеолітичні ферменти, гідролази, ліази, ізомерази, трансферази. Підходящими для цього білками, поліпептидами і пептидами є, наприклад, імуноглобуліни, токсини, такі як абрин, рицин А, псевдомонасекзотоксин, або токсин дифтерії, білок, такий як інсулін, фактор некрозу пухлин, α-інтерферон, βінтерферон, фактор росту нервів, тромбоцитарний фактор росту або тканинний активатор плазміногену, тромботичний засіб або антиангіогенний за 96141 22 сіб, наприклад, ангіостатин або ендостатин, або модифікатор біологічної реакції, такий як лімфокін, інтерлейкін-1 (IL-1), інтерлейкін-2 (IL-2), інтерлейкін-6 (IL-6), колонієстимулювальний фактор гранулоцитних макрофагів (GM-CSF), колонієстимулювальний фактор гранулоцитів (G-CSF), фактор росту нервів (NGF) та інші фактори росту та імуноглобуліни. До числа підходящих ефекторних молекул можна включити також речовини, що детектуються і можуть використовуватися, наприклад, у діагностиці. Серед підходящих речовин, що детектуються, можна назвати різноманітні ферменти, протезні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали, біолюмінесцентні матеріали, радіоактивні нукліди, позитроноемісійні метали (для застосування в позитроноемісійній томографії) і нерадіоактивні іони парамагнітних металі; стосовно іонів металів, які можуть кон'югуватися з антитілами для застосування в діагностиці, див. (U.S. Patent No. 4,741,900). Серед підходящих ферментів можна назвати пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу та ацетилхолінестеразу. Серед підходящих протезних груп можна назвати стрептавідин, авідин і біотин; підходящими флуоресцентними матеріалами є умбелліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламін-флуоресцеїн, данзилхлорид і фікоеритрин; підходящим люмінесцентним матеріалом є люмінол; підходящими біолюмінесцентними матеріалами є люцифераза, люциферин та аекворин; підходящими радіоакти125 131 111 99 вними нуклідами є І, І, Іn і Тс. В іншому варіанті здійснення винаходу ефекторні молекули можуть збільшувати час напівжиття антитіла in vivo і/або зменшувати імуногенність антитіла, і/або збільшувати постачання антитіла через епітеліальний бар'єр в імунну систему. Серед підходящих ефекторних молекул цього типу можна назвати полімери, альбумін, альбумінзв'язуючі білки або альбумін-зв'язуючі сполуки, описані, наприклад, у заявці (WO 05/117984, опублікованій 15.12,05). Якщо ефекторна молекула є полімерною, то вона в загальному випадку може мати синтетичне або природне походження і бути, наприклад, необов'язково заміщеним прямолінійним або розгалуженим поліалкіленовим, поліалкеніленовим або поліоксіалкіленовим полімером, або розгалуженим чи нерозгалуженим полісахаридом, наприклад, гомо- або гетерополісахаридом. Замісниками, котрі в разі потреби можуть бути наявними у вищезгаданих синтетичних полімерах, можуть бути одна чи більше гідроксильних груп, метильних груп або метоксигруп. Серед підходящих синтетичних полімерів можна назвати, наприклад, необов'язково заміщені прямолінійні або розгалужені полі(етиленгліколь), полі(пропіленгліколь), полівініловий спирт) та їхні похідні і, зокрема, необов'язково заміщені полі(етиленгліколі), такі як метоксиполі(етиленгліколь) та їхні похідні. Серед підходящих полімерів природного походження можна назвати, наприклад, лактозу, амілозу, декстран, глікоген та їхні похідні. 23 Під використовуваним тут терміном "похідні" маються на увазі хімічно активні похідні, наприклад, тіолселективні хімічно активні групи на зразок малеімідів. Хімічно активна група може бути безпосередньо або через лінкерний сегмент зшитою з полімером. Цілком зрозуміло, що залишок такої групи в деяких випадках може утворювати частину продукту у формі зшивної групи між фрагментом антитіла і полімером. Розмір полімеру може бути різним залежно від потреби, але в загальному випадку його середня молекулярна маса лежить в інтервалі від 500 Да до 50000 Да, у кращому варіанті - від 5000 до 40000 Да, а в ще кращому - від 20000 до 40000 Да. Розмір полімеру може, зокрема, вибиратися, враховуючи призначення цільового продукту, наприклад, його здатність локалізуватися в деяких тканинах, наприклад у пухлинах, або володіти тривалим часом напівжиття у кровообігу, огляд з цього питання можна знайти в роботі (Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531545). Таким чином, наприклад, якщо продукт повинен залишати кровообіг і проникати в тканини, зокрема для його використання в лікуванні пухлини, то може бути вигідним використовувати порівняно низькомолекулярний полімер, наприклад з молекулярною масою 5000 Да. З іншого боку, у тих випадках, коли продукт повинен залишатися у кровообігу, може бути вигідним використовувати полімер з більшою молекулярною масою, наприклад в інтервалі від 20000 Да до 40000 Да. До числа особливо підходящих належать поліалкіленові полімери, такі як полі(етиленгліколі) і, зокрема, метоксиполі(етиленгліколь) та його похідні, молекулярна маса яких лежить в інтервалі приблизно від 15000 Да до 40000 Да. Антитіла для застосування в даному винаході в одному з прикладів його здійснення приєднуються до полі(етиленглікольних) (PEG) частин. В одному з конкретних варіантів антитілом служить фрагмент антитіла, а молекули PEG можуть приєднуватися через будь-який доступний амінокислотний бічний ланцюг або кінцеву амінокислотну функціональну групу, розташовану у фрагменті антитіла, наприклад через будь-яку вільну аміногрупу, іміногрупу, тіолову, гідроксильну або карбоксильну групу. Такі амінокислоти можуть бути природними інгредієнтами фрагмента антитіла або ж можуть штучно вводитися в такий фрагмент за допомогою методів рекомбінантних ДНК, див., наприклад, (US 5,219,996; US 5,667,425; WO 98/25971). В одному з варіантів молекула антитіла згідно з даним винаходом є модифікованим Fabфрагментом, де модифікацією є добавляння до Скінця його важкого ланцюга однієї чи більше амінокислот для того, щоб здійснити приєднання ефекторної молекули. У кращому варіанті додаткові амінокислоти утворюють модифіковану шарнірну ділянку, що містить один чи більше цистеїнових залишків, до котрих може приєднуватися ефекторна молекула. Для приєднання двох і більше PEG-молекул можуть використовуватися множинні сайти. У кращому варіанті молекули PEG ковалентно приєднуються через тіолову групу щонайменше 96141 24 одного цистеїнового залишку, розташованого у фрагменті антитіла. Кожна полімерна молекула, приєднана до модифікованого фрагмента антитіла, може бути ковалентно зв'язана з атомом сірки цистеїнового залишку, розташованого в цьому фрагменті. Ковалентний зв'язок у загальному випадку може бути дисульфідним або, що краще, сірко-вуглецевим зв'язком. Там, де точкою приєднання відповідним чином активованої ефекторної молекули служить тіолова група, можуть використовуватися наприклад, тіолові селективні похідні на зразок малеімідів і цистеїнові похідні. Сировинним матеріалом у виготовленні полімермодифікованого фрагмента антитіла, як описано вище, може служити активований полімер. Таким активованим полімером може служити будь-який полімер, що містить тіолову хімічно активну групу, наприклад, α-галоїдкарбонова кислота або естер, наприклад йодацетамід, імід, наприклад малеімід, вінілсульфон або дисульфід. Такі сировинні матеріали випускаються промисловістю (наприклад, фірмою Nektar, колишня Shearwater Polymers Inc., Хантсвіль, Алабама, США) або можуть бути приготовані із продажних сировинних матеріалів за допомогою звичайних хімічних процесів. Зокрема, підходящими PEG молекулами можуть бути 20K метокси-PEG-амін (виробництва фірми Nektar, колишньої Shearwater, а також фірм Rapp Polymere і SunBio) i M-PEG-SPA (виробництва фірми Nektar, колишньої Shearwater). В одному з варіантів здійснення винаходу запропонованим антитілом є модифікований шляхом PEG-илювання Fab-фрагмент або diFab, тобто який має ковалентно приєднаний до нього PEG (полі(етиленгліколь)) за допомогою, наприклад, методів, описаних у ЕР 0948544 або ЕР1090037, див. також ["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. В одному з прикладів здійснення винаходу PEG приєднується до цистеїну на шарнірній ділянці. В іншому прикладі PEG-модифікований Fab-фрагмент має малеімідну групу, ковалентно зв'язану з поодинокою тіоловою групою на модифікованій шарнірній ділянці. Лізиновий залишок може бути ковалентно зв'язаний з малеімідною групою, а до кожної із аміногруп на цьому лізиновому залишку може бути приєднаний метоксиполі(етиленглікольний) полімер з молекулярною масою приблизно 20000 Да. Таким чином, загальна молекулярна маса PEG, приєднаного до Fabфрагмента, може складати приблизно 40000 Да. В одному з варіантів здійснення винаходу пропонується нейтралізуюча антитіла молекула, що володіє специфічністю до людського IL-6 і являє собою модифікований Fab-фрагмент, який має важкий ланцюг, який містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:11, і легкий 25 ланцюг, який містить послідовність, представлену тут під номером SEQ ID NO:13, в на С-кінці його важкого ланцюга має модифіковану шарнірну ділянку, яка містить щонайменше один цистеїновий залишок, до котрого приєднана ефекторна молекула. У кращому варіанті зазначеною ефекторною молекулою є PEG, приєднаний за допомогою методів, описаних у (WO 98/25971 і WO 2004072116), завдяки чому до цистеїнового залишку на С-кінці важкого ланцюга приєднана лізилмалеімідна група, а кожна аміногрупа цього лізилового залишку має ковалентно зв'язаний з ним метоксиполі(етиленглікольний) залишок молекулярною масою приблизно 20000 Да. Таким чином, загальна молекулярна маса PEG, приєднаного до антитіла складає приблизно 40000 Да. В іншому прикладі ефекторні молекули можуть приєднуватися до фрагментів антитіл за допомогою методів, описаних у Міжнародних патентних заявках (WO 2005/003169, WO 2005/003170 І WO 2005/003171). Даним винаходом пропонується також відокремлена ДНК послідовність, що кодує важкий і/або легкий ланцюг (або ланцюги) молекули антитіла згідно з винаходом. У кращому варіанті запропонована ДНК послідовність кодує важкий або легкий ланцюг молекули антитіла згідно з даним винаходом. ДНК послідовність згідно з даним винаходом може містити синтетичну ДНК, отриману, наприклад, шляхом хімічного процесінгу, к-ДНК, геномну ДНК або будь-яку їх комбінацію. ДНК послідовності, що кодують молекули антитіл згідно з даним винаходом, можуть отримуватися за допомогою методів, добре відомих фахівцям у даній галузі. Наприклад, ДНК послідовності, що кодують важкий і легкий ланцюги для частини або всього антитіла, можуть бути синтезовані відповідно до потреби із певних ДНК послідовностей або на основі відповідних амінокислотних послідовностей. ДНК, що кодують акцепторні каркасні послідовності, є загальнодоступними в даній галузі і можуть бути легко синтезовані на основі їхніх відомих амінокислотних послідовностей. Для виготовлення ДНК послідовностей, що кодують молекулу антитіла згідно з даним винаходом, можуть використовуватися стандартні методи молекулярної біології. Потрібні ДНК послідовності можна синтезувати повністю або частково за допомогою методів синтезу олігонуклеотидів. Підходящими для цього можуть бути методи сайтспрямованого мутагенезу і полімеразноланцюгової реакції (PCR). У даному описі як приклади підходящих ДНК послідовностей розглядаються SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 і SEQ ID NO:17. Нуклеотиди 1-57 у послідовності SEQ ID NO:15 і нуклеотиди 1-60 у послідовності SEQ ID NO:17 кодують послідовність сигнального пептиду із мишачого антитіла В72.3 (Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505), яка, розщеплюючись, утворює нейтралізуючу молекулу антитіла згідно з даним винаходом. Таким чином, даним винаходом пропонується також відокремлена ДНК послідовність, що кодує важкий ланцюг за 96141 26 пропонованого антитіла і містить нуклеотиди 582008 послідовності SEQ ID NO:15. Даним винаходом пропонується також відокремлена ДНК послідовність, що кодує легкий ланцюг запропонованого антитіла і містить нуклеотиди 61-705 послідовності SEQ ID NO:17. Даний винахід стосується також вектора для клонування або експресії, який містить принаймні одну із ДНК послідовностей згідно з даним винаходом. Таким чином, винаходом пропонується вектор для клонування або експресії, який містить принаймні одну із ДНК послідовностей, що кодують запропоноване антитіло. У кращому варіанті запропонований вектор для клонування або експресії містить дві ДНК послідовності, що кодують відповідно легкий ланцюг і важкий ланцюг молекули антитіла згідно з даним винаходом. У кращому варіанті вектор згідно з даним винаходом містить послідовності, позначені номерами SEQ ID NO:15 і 17. Нуклеотиди 1-57 у послідовності SEQ ID NO:15 і нуклеотиди 1-60 у послідовності SEQ ID NO:17 кодують послідовність сигнального пептиду із мишачого антитіла В72.3, яка в найкращому варіанті, розщеплюючись, утворює нейтралізуючу молекулу антитіла згідно з даним винаходом. Загальні методи, за допомогою яких можуть бути сконструйовані вектори, методи трансфекції і методи культивування є добре відомі фахівцям у даній галузі. Достатню інформацію з цих питань можна знайти в довіднику ("Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing). Винаходом пропонується також клітина-хазяїн, яка містить принаймні один із векторів для клонування або експресії, які містять принаймні одну із ДНК послідовностей, що кодують антитіло за даним винаходом. Для експресії ДНК послідовностей, що кодують молекулу антитіла згідно з даним винаходом, може використовуватися будь-яка підходяща клітина-хазяїн/векторна синтез-система, а саме бактеріальні, наприклад £ соїі, та інші мікробні системи, або еукаріотичні, наприклад ссавців, системи експресії в клітинах-хазяїнах (Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165181). Підходящими для цього клітинами-хазяїнами ссавців є, наприклад, клітини яєчника китайського хом'ячка СНО, клітини NS0, клітини мієломи або гібридоми. Підходящою є в тому числі система експресії на базі глутамінсинтетази, описана в міжнародній заявці (WO 87/04462). Даним винаходом пропонується також процес виготовлення запропонованої молекули антитіла, який включає у себе культивування клітинихазяїна, що містить вектор згідно з даним винаходом в умовах, підходящих для приведення до експресії білка із ДНК, що кодує молекулу антитіла згідно з даним винаходом, і відокремлення цієї молекули антитіла. Молекула антитіла може містити лише поліпептид важкого або легкого ланцюга, у випадку чого для трансфікування клітини-хазяїна потребується використовувати послідовність, що кодує лише поліпептид важкого ланцюга або легкого ланцюга. Для виготовлення продуктів, які містять як важкий, 27 так і легкий ланцюги, клітинну лінію можна трансфікувати обома векторами, із котрих перший кодує поліпептид легкого ланцюга, а другий кодує поліпептид важкого ланцюга. В альтернативному варіанті може використовуватися один вектор, який містить послідовності, що кодують поліпептиди легкого ланцюга і важкого ланцюга. Антитіла згідно з даним винаходом можуть використовуватися в лікуванні і/або профілактиці патологічного стану. Даним винаходом пропонується також фармацевтичний або діагностичний склад, який містить молекулу антитіла згідно з даним винаходом у комбінації з одним чи більше із таких інгредієнтів: фармацевтично прийнятними ексципієнтом, розріджувачем та носієм. Таким чином, винаходом пропонується застосування антитіла згідно з даним винаходом у виготовленні медикаменту. Запропонований склад зазвичай постачається як частина стерильного, фармацевтичного складу, який звичайно включає у себе фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичний склад згідно з даним винаходом може, крім того, містити фармацевтично прийнятний ад'ювант. Даним винаходом пропонується також процес виготовлення фармацевтичного або діагностичного складу, який включає у себе додавання і змішування молекули антитіла згідно з даним винаходом разом з одним чи більше із таких інгредієнтів: фармацевтично прийнятними ексципієнтом, розріджувачем і носієм. Молекула антитіла може бути одним єдиним активним інгредієнтом у фармацевтичному чи діагностичному складі або може супроводжуватися іншими активними інгредієнтами, включаючи інші гуморальні інгредієнти, наприклад антитіла проти TNF, проти ΙL-1β, проти Т-клітини, проти IFN або проти LPS, або негуморальні інгредієнти на зразок ксантинів. Запропоновані фармацевтичні склади у кращому варіанті містять терапевтично ефективну кількість антитіла за даним винаходом. Використовуваний тут термін "терапевтично ефективна кількість" означає кількість терапевтичного засобу, потрібну для лікування, поліпшення або відвертання хвороби або патологічного стану, або для проявлення помітного терапевтичного чи профілактичного ефекту. Терапевтично ефективна кількість будь-якого антитіла може оцінюватися спочатку шляхом випробувань на клітинній культурі або на тваринних моделях, зазвичай на гризунах, кролях, собаках, свинях або приматах. Тваринні моделі можуть використовуватися також для визначення підходящого інтервалу концентрації і способу введення. Отримана в результаті таких випробувань інформація може далі використовуватися для визначення корисних доз і способів їх уведення людям. Точна терапевтична ефективна кількість для пацієнта-людини залежить від тяжкості даного хворого стану, загального стану здоров'я, віку, маси тіла і статі пацієнта, його раціону харчування, часу і частоти введення ліків, застосовуваної комбінації ліків, проб на визначення чутливості і толерантності та реакції щодо даного терапевтичного втручання. Ця кількість може визначатися шляхом 96141 28 рутинного експериментування і лежить в області компетенції лікаря-куратора. У загальному випадку терапевтично ефективна кількість лежить в інтервалі від 0,01 мг/кг до 50 мг/кг, а в кращому варіанті - від 0,1 мг/кг до 20 мг/кг. Фармацевтичні склади можуть вигідно постачатися в однодозових лікарських формах, що містять наперед визначену кількість активного засобу за даним винаходом на дозу. Склади згідно з винаходом можуть уводитися пацієнту відокремлено або в комбінації (одночасно, послідовно або окремо) з іншими засобами, ліками чи гормонами. Доза, з якою вводиться молекула антитіла згідно з даним винаходом, залежить від природи патологічного стану, на котрий вона спрямована, ступеня наявного запалення та від того, вводиться дана молекула антитіла з метою профілактики чи лікування існуючого стану пацієнта. Частота введення дози залежить від періоду напіввиведення молекули антитіла і від тривалості її дії. Якщо молекула антитіла має короткий період напіввиведення (наприклад, від 2 до 10 годин), то може потребуватися вводити більше однієї її доз за день. В альтернативному випадку якщо молекула антитіла має тривалий період напіввиведення (наприклад, від 2 до 15 днів або від 2 до 30 днів), то дозу її можна вводити один раз за день, один раз за тиждень або навіть один раз в 1 чи 2 місяці. Фармацевтично прийнятний носій не повинен сам виробляти антитіла, шкідливі для реципієнта даного складу, і бути токсичним. Підходящими носіями можуть бути великі макромолекули, що повільно метаболізуються, такі як білки, поліпептиди, ліпосоми, полісахариди, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти, полімерні амінокислоти, співполімери амінокислот і неактивні вірусні частки. Використовуватися можуть фармацевтично прийнятні солі неорганічних кислот, наприклад гідрохлориди, гідроброміди, фосфати і сульфати, та органічних кислот, наприклад ацетати, пропіонати, малонати і бензоати. Фармацевтично прийнятні носії в терапевтичних складах згідно з винаходом можуть, крім того, містити рідини - воду, фізіологічний розчин, гліцерин, етанол. До таких складів можуть входити також допоміжні речовини, такі як змочувальні засоби, емульгатори, речовини, що буферизують рН, і т.п. Такі носії дозволяють надавати фармацевтичному складу форму таблеток, пілюль, драже, капсул, рідин, гелів, сиропів, густих та рідких суспензій, прийнятних для вживання пацієнтом. Кращими для введення фармацевтичних складів згідно з винаходом є парентеральні форми, наприклад, для ін'єкцій або інфузій, наприклад у болюсах для ін'єкцій або для безперервних інфузій. Продукт, призначений для ін'єкцій або інфузій, може мати форму суспензії, розчину або емульсії у маслянистому або водному носії і може містити засоби підтримування форми, такі як суспендувальні речовини, консерванти, стабілізатори і/або диспергатори. В альтернативному варіанті молекула антитіла може бути в сухій формі, розрахова 29 ній на надання їй рідкого стану перед вживанням за допомогою відповідної стерильної рідини. Приготовані склади за даним винаходом можуть уводитися безпосередньо в організм пацієнта. Пацієнтами можуть бути будь-які тварини, але переважно фармацевтичні склади за даним винаходом призначаються для введення людям. Фармацевтичні склади за даним винаходом можуть уводитися найрізноманітнішими шляхами, включаючи, наприклад, пероральний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньоартеріальний, інтрамедулярний, внутрішньооболонковий, інтравентрикулярний, трансдермальний, черезшкірний (WO 98/20734), підшкірний, інтраперитонеальний, внутрішньоносовий, ентеральний, місцевий, під'язиковий, інтравагінальний, ректальний та інші шляхи. Для введення фармацевтичних складів за даним винаходом можуть використовуватися також гіпоспреї. Терапевтичні склади для ін'єкцій готують, як правило, у формі рідких розчинів або суспензій. При цьому можуть використовуватися також тверді первинні форми, із котрих розчини або суспензії для ін'єкцій готують шляхом змішування їх з підходящими рідкими носіями. Пряме постачання складів згідно з винаходом у загальному випадку здійснюють шляхом підшкірних, інтраперитонеальних, внутрішньовенних або внутрішньом'язових ін'єкцій, або в інтерстиціальний простір тканин. Запропоновані склади можна вводити також в ушкодження. При цьому схема лікування може бути однодозовою або багатодозовою. Цілком зрозуміло, що оскільки активним інгредієнтом запропонованого складу є молекула антитіла, вона наражається на деградацію у шлунковокишковому тракті. Таким чином, якщо фармацевтичний склад повинен уводитися через шлунковокишковий тракт, то він повинен містити засоби захисту антитіла від такої деградації, але при цьому звільняти його від захисту, коли це антитіло поглинається зі шлунково-кишкового тракту. Всебічно питання фармацевтично прийнятних носіїв розглянуто в роботі (Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991). Передбачено також, що запропоноване антитіло може вводитися за допомогою генної терапії. Для цього ДНК послідовності, що кодують важкий і легкий ланцюги молекули антитіла під керуванням відповідних компонентів ДНК, уводять пацієнту таким чином, що ланцюги антитіла експресуються із ДНК послідовності і збираються in situ. Даним винаходом пропонується також молекула антитіла для її застосування в регуляції запальних хвороб. У кращому варіанті запропонована молекула антитіла може використовуватися для пригнічення запального процесу або для запобігання його виникненню. Крім того, винаходом пропонується молекула антитіла для застосування в лікуванні і/або профілактиці патологічного розладу, опосередкованого інтерлейкіном IL-6 або пов'язаного зі зростанням рівня IL-6. Поряд з цим пропонується також застосування молекули антитіла згідно з даним винаходом у виготовленні медикаменту для лікування 96141 30 і/або профілактики патологічного розладу опосередкованого інтерлейкіном IL-6 або пов'язаного зі зростанням рівня IL-6. У кращому варіанті патологічний стан вибирають із сукупності, складовими якої є хвороби, викликані інфекціями (вірусними, бактеріальними, грибковими і паразитичними), ендотоксичний шок інфекційної природи, артрит, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, юнацький ідіопатичний артрит (JIA: juvenile idiopathic arthritis) системного виникнення, системний червоний вовчак (SLE: systemic lupus erythematosus), астма, запалення тазових органів, хвороба Альцгеймера, хвороба Крона (Crohn), виразковий коліт, синдром подразненого кишечнику, хвороба Каслмана (Castleman), анкілозивний спондиліт, дерматоміозит, ювеїт, хвороба Пейроні (Реуrоnіе), черевнопорожнинна хвороба, хвороба жовчного міхура, пілонідальна хвороба, перитоніт, посоріаз, васкуліт, хірургічні спайки, удар, діабет І типу, артрит Лайма, менінгоенцефаліт, викликані розладами імунної системи запальні хвороби центральної та периферійної нервових систем, такі як множинний склероз і синдром Пйєна-Барре (Guillain-Barr), a також інші автоімунні розлади, панкреатит, травма (хірургічна), реакція "трансплантат проти носія", відторгнення трансплантата, рак (як тверді пухлини, такі як меланоми, гепатобластоми, саркоми, плоскоклітинні різновиди раку, перехідноклітинні різновиди раку, рак яєчників і злоякісні пухлини кровотворної системи і, зокрема, гостра мієлогенна лейкемія, хронічна мієлогенна лейкемія, рак шлунку і рак товстої кишки), серцеві хвороби, включаючи ішемічні хвороби серця, такі як інфаркт міокарда, а також атеросклероз, внутрішньосудинна коагуляція, розсмоктування кісток, опіки, остеопороз, періодонтит і знижене виділення хлоридів з сечею. Патологічними розладами є переважно ревматоїдний артрит та системний червоний вовчак (SLE). Даним винаходом пропонується також молекула антитіла для застосування в лікуванні та профілактиці болю. Крім того, пропонується застосування молекули антитіла згідно з даним винаходом у виготовленні медикаменту для лікування та профілактики болю. Молекула антитіла згідно з даним винаходом може застосовуватися у будь-якій терапії, де потребується зменшувати вплив IL-6 на організм людини або тварини. IL-6 в організмі пацієнта може перебувати у кровообігу або локалізуватися в небажано великих кількостях в тих чи інших місцях організму, наприклад у місцях запалення. Молекулу антитіла згідно з даним винаходом у кращих випадках використовують для регуляції запальної хвороби. Даним винаходом пропонується також спосіб лікування пацієнтів (людей або тварин), що страждають на той чи інший опосередкований інтерлейкіном IL-6 розлад або є в його групі ризику; запропонований спосіб включає у себе введення пацієнту ефективної кількості молекули антитіла згідно з даним винаходом. 31 Молекула антитіла згідно з даним винаходом може застосовуватися також у діагностиці, наприклад in vivo, та візуалізації хворих станів із залученням IL-6. Нижче даний винахід виключно з метою ілюстрації розглянуто на прикладах його практичного здійснення з поясненнями на супровідних фігурах креслення, де: - на Фіг. 1 показана схема трансплантів у послідовностях важкого (Фіг. 2а; SEQ ID NO:11) і легкого (Фіг. 2b; SEQ ID NO:13) ланцюгів антитіла 240.gl Символом (|) показана різниця між послідовностями донор.акцептор.трансплантованих каркасів. CDR-ділянки підкреслені однією рискою. їх нумерація відповідає номенклатурі Кебота, за винятком ділянки CDR-H1, на котрій нумерація охоплює обидві номенклатури - Кебота і Чотія (Chothia). Двома рисками підкреслені послідовності залишків донорного каркасу, що збереглися в трансплантатах; на Фіг. 2а показана трансльована послідовність важкого ланцюга lgG4 240.g1, де можна бачити інтрон-екзонні межі; на Фіг. 2b показана трансльована послідовність легкого ланцюга антитіла 240.g1, де можна бачити інтрон-екзонні межі; на Фіг. 3а показаний графік інгібування антитілом 240.g1 проліферації Т1165-клітин, викликаної рекомбінантним IL-6 людини, гуманізованим IL-6 ссавця, IL-6 макаки резус, IL-6 макаки циномолгус і мишачим IL-6; на Фіг. 3d показаний графік інгібування антитілом 240.g1 продукування білка МСР-1 в HUVECклітинах, викликаного людським рекомбінантним інтерлейкіном IL-6 і розчинним slL-6R-рецептором; на Фіг. 3с показаний графік інгібування антитілом 240.g1 продукування білка МСР-1 в HUVECклітинах, викликаного IL-17-індукованими ендогенними IL-6 і sIL-6R; на Фіг. 4 показана гістограма нейтралізації in vivo hlL-6-індукованого SAA-амілоїду у мишей шляхом введення антитіла СА030_240.g1 (антитіло сайта 3) n=7-8 на групу, за винятком PBS n=6. Статистичний аналіз методом ANOVA з повторною перевіркою методом Bonferroni, **Р