Химерні віруси, які представляють неприродні поверхневі білки, і їхнє застосування

1. Химерний вірус пташиного грипу, який містить a) упакований сегмент NA вірусу грипу, що кодує злитий з нейрамінідазою (NA) білок, у якому відкрита рамка зчитування NA модифікована так, що кодуючі ектодомен NA нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену нейрамінідази інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється N-кінцем, так що зли UA (21) a200808696 (22) 01.12.2006 (24) 10.10.2011 (86) PCT/US2006/045859, 01.12.2006 (31) 60/741,833 (32) 02.12.2005 (33) US (31) 60/802,864 (32) 22.05.2006 (33) US (46) 10.10.2011, Бюл.№ 19, 2011 р. (72) ПЕЙЛІЗ ПІТЕР, US, ГАСТРІЯ-САСТРЕ АДОЛЬФО, US (73) МАУНТ СІНАЙ СКУЛ ОФ МЕДСІН, US (56) GARCIA-SASTRE A ET AL: "INFLUENZA VIRUS VECTORS" BIOLOGICALS, ACADEMIC PRESS LTD., LONDON, GB, vol. 23, no. 2, 1 June 1995 (1995-06-01), pages 171-178 (abstract). COPELAND K M ET AL: "Functional chimeras of human immunodeficiency virus type 1 Gp120 and influenza A virus (H3) hemagglutinin" JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 79, no. 10, 1 May 2005 (2005-05-01), pages 6459-6471. LI ZHU-NAN ET AL: "Chimeric influenza virus hemagglutinin proteins containing large domains of the Bacillus anthracis protective antigen: Protein characterization, incorporation into infectious influenza viruses, and antigenicity" JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 79, no. 15, 1 August 2005 (2005-08-01), pages 10003-10012. LI S ET AL: "Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97 (H5N1) viruses" JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES, UNIVERSITY OF CHICAGO PRESS, CHICAGO, IL, vol. 179, no. 5, 1 May 1999 (1999-05-01), pages 1132-1138. SCHICKLI J H ET AL: "Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates" PHILOSOPHICAL TRANSACTIONS. ROYAL SOCIETY OF LONDON.BIOLOGICAL SCIENCES, ROYAL SOCIETY, LONDON, GB, vol. 356, no. 1416, 29 December 2001 (2001-12-29), pages 1965-1973. 2 (19) 1 3 тий з нейрамінідазою білок експресується і вбудовується в химерний вірус пташиного грипу; b) упакований сегмент NA вірусу грипу, що кодує злитий з нейрамінідазою білок, у якому відкрита рамка зчитування NA модифікована так, що кодуючі ектодомен NA нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену HN псевдочуми птахів (NDV), так що злитий з нейрамінідазою білок експресується і вбудовується в химерний вірус пташиного грипу; c) упакований сегмент НА вірусу грипу, що кодує злитий з гемаглютиніном (НА) білок, у якому відкрита рамка зчитування НА модифікована так, що кодуючі ектодомен НА нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену інфекційного агента, який здатний до злиття/зв'язування рецептора, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється С-кінцем, так що злитий з гемаглютиніном білок експресується і вбудовується в химерний вірус пташиного грипу; d) упакований біцистронний сегмент НА вірусу грипу, який містить: (і) першу відкриту рамку зчитування, яка кодує білок гемаглютинін вірусу пташиного грипу, і (іі) другу відкриту рамку зчитування, яка кодує злитий з гемаглютиніном білок, у якій кодуючі ектодомен гемаглютиніну нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється за допомогою С-кінця, так що і гемаглютинін вірусу грипу, і злитий білок експресуються і вбудовуються в химерний вірус пташиного грипу; або e) упакований біцистронний сегмент NА вірусу грипу, що містить: (і) першу відкриту рамку зчитування, яка кодує білок нейрамінідазу вірусу пташиного грипу, і (іі) другу відкриту рамку зчитування, яка кодує злитий з нейрамінідазою білок, у якій кодуючі ектодомен нейрамінідази нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється N-кінцем, так що і нейрамінідаза вірусу грипу, і злитий білок експресуються і вбудовуються в химерний вірус пташиного грипу. 2. Атенюйований химерний вірус грипу, який містить a) упакований сегмент NA вірусу грипу, що кодує злитий з нейрамінідазою білок, у якому відкрита рамка зчитування NA модифікована так, що кодуючі ектодомен NA нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену нейрамінідази інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється N-кінцем, так що злитий з нейрамінідазою білок експресується і вбудовується в атенюйований химерний вірус грипу; b) упакований сегмент НА вірусу грипу, що кодує злитий з гемаглютиніном білок, у якому відкрита рамка зчитування НА модифікована так, що кодуючі ектодомен НА нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену інфекційного агента, який здатний до злиття/зв'язування рецептора, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється С-кінцем, так що злитий з гемаглютині 96140 4 ном білок експресується і вбудовується в атенюйований химерний вірус грипу; c) упакований біцистронний сегмент НА вірусу грипу, що містить: (і) першу відкриту рамку зчитування, яка кодує білок гемаглютинін вірусу пташиного грипу, і (іі) другу відкриту рамку зчитування, яка кодує злитий з гемаглютиніном білок, у якій кодуючі ектодомен гемаглютиніну нуклеотиди замінені нуклеотидами, які кодують білок, що містить принаймні один епітоп ектодомену антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, або пов'язаного з захворюванням антигену, що прикріплюється за допомогою С-кінця, так що і гемаглютинін вірусу грипу, і злитий білок експресуються і вбудовуються в атенюйований химерний вірус грипу; або d) упакований біцистронний сегмент NA вірусу грипу, що містить: (і) першу відкриту рамку зчитування, яка кодує білок нейрамінідазу вірусу пташиного грипу, і (іі) другу відкриту рамку зчитування, яка кодує злитий з нейрамінідазою білок, у якій кодуючі ектодомен нейрамінідази нуклеотиди замінені нуклеотидами, які кодують білок, що містить принаймні один епітоп ектодомену антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, або зв'язаного з захворюванням антигену, що прикріплюється Nкінцем, так що і нейрамінідаза вірусу грипу, і злитий білок експресуються і вбудовуються в атенюйований химерний вірус грипу. 3. Химерний вірус грипу за будь-яким з пп. 1 або 2, який містить упакований сегмент гена NS1, що кодує модифікований білок NS1, який зменшує антагоністичну відносно клітинного інтерферону активність вірусу. 4. Химерний вірус грипу за будь-яким з пп. 1 або 2, який містить сегмент НА, модифікований з видаленням сайта розщеплення гемаглютиніну, який містить множину основних амінокислот. 5. Химерний вірус грипу за будь-яким з пп. 1, 3 або 4, в якому химерний вірус грипу є атенюйованим. 6. Рекомбінантна ДНК-молекула, яка кодує сегмент NA або сегмент НА вірусу за будь-яким з пп. 1 або 2. 7. Спосіб одержання імуногенної композиції, який містить: (a) розмноження химерного вірусу грипу за будьяким з пп. 1-5 у яйці з ембріоном або у клітинній лінії, чутливій до інфікування вірусом грипу і (b) збір потомства вірусу, де вірус вирощують до достатніх кількостей і в умовах, що підходять для того, щоб вірус був вільний від забруднення, так що потомство вірусу прийнятне для застосування в імуногенній композиції. 8. Химерний вірус псевдочуми птахів (NDV), який містить упакований геном, що містить а) нуклеотидну послідовність, яка кодує злитий з білком F білок, що має трансмембранний і цитоплазматичний домени білка F і принаймні один епітоп ектодомену антигену інфекційного агента, відмінного від NDV, або пов'язаного з захворюванням антигену, що прикріплюється С-кінцем, так що 5 96140 6 злитий з білком F білок експресується і вбудовується в химерний NDV; або b) нуклеотидну послідовність, яка кодує злитий з HN (гемаглютинін-нейрамінідазою) білок, що має трансмембранний і цитоплазматичний домени білка HN і принаймні один епітоп ектодомену антигену інфекційного агента, відмінного від NDV, або зв'язаного з захворюванням антигену, що прикріплюється N-кінцем, так що злитий з HN білок експресується і вбудовується в химерний NDV, і в якому інфекційний агент є інфекційним патогеном або антиген не є антигеном параміксовірусу. 9. Химерний NDV за п. 8, в якому a) геном містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок F, так що білок F експресується і вбудовується в химерний NDV; b) нуклеотидна послідовність, що кодує злитий з білком F білок, заміняє нуклеотидну послідовність, що кодує білок F NDV, і злитий з білком F білок забезпечує функцію білка F; c) геном містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок HN, так що білок HN експресується і вбудовується в химерний NDV; або d) нуклеотидна послідовність, що кодує злитий з HN білок, заміняє нуклеотидну послідовність, що кодує білок UN NDV, і злитий з HN білок забезпечує функцію білка HN. 10. Химерний NDV за будь-яким з пп. 8 або 9, в якому антиген є ектодоменом антигена гемаглютиніну вірусу грипу або ектодоменом антигена нейрамінідази вірусу грипу. 11. Химерний NDV за п. 10, у якому вірус грипу є вірусом пташиного грипу. 12. Химерний NDV за будь-яким з пп. 8-11, де химерний NDV є атенюйованим. 13. Спосіб одержання імуногенної композиції, що містить: (a) розмноження химерного NDV за будь-яким з пп. 8-12 у яйці з ембріоном або у клітинній лінії, чутливій до інфікування NDV, і (b) збір потомства вірусу, причому вірус вирощують до достатніх кількостей і в умовах, адекватних для того, щоб вірус був вільний від забруднення, так що потомство вірусу може використовуватися для застосування в імуногенній композиції. 14. Химерний вірус за будь-яким з пп. 1-5 або 8-12, в якому інфекційним агентом є інфекційний патоген. 15. Химерний вірус за будь-яким з пп. 1-5, 8-12 або 14 в якому антиген не є антигеном параміксовірусу. 16. Химерний вірус за будь-яким з пп. 1-5, 8-12, 14 або 15 в якому антиген не є антигеном вірусу Сендай. 17. Застосування химерного вірусу за будь-яким з пп. 1-5, 8-12, 14-16 у виробництві медикаменту для застосування у викликанні імунної відповіді на один, два або більше інфекційних агентів у птаха або людини. 18. Імуногенна композиція, що містить химерний вірус за будь-яким з пп. 1-5, 8-12, 14-16. 19. Рекомбінантна молекула ДНК, що кодує химерний NDV за будь-яким з пп. 8-12 або 14-16. 20. Спосіб індукування в птаха або людини імунної відповіді на один, два або більше інфекційних агентів, що містить введення птаху або людині імуногенної композиції, що містить химерний вірус за будь-яким з пп. 1-5, 8-12 або 14-16, таким чином, що індукується імунна відповідь на один, два або більше інфекційних агентів. Галузь техніки Даний винахід належить до химерних вірусів, що містять негативну нитку РНК, що уможливлюють імунізацію індивіда, наприклад птаха, проти двох інфекційних агентів, використовуючи один химерний вірус за даним винаходом. Зокрема, даний винахід належить до химерних вірусів грипу, розроблених таким чином, що вони експресують і включають у свої віріони злитий білок, що містить ектодомен білка інфекційного агента і трансмембранний і цитоплазматичний домени білка вірусу грипу. Такі химерні віруси індукують імунну відповідь проти вірусу грипу й інфекційного агента. Даний винахід також належить до химерних вірусів псевдочуми птахів (NDV), розроблені так, що вони експресують і включають у свої віріони злитий білок, що містить ектодомен білка інфекційного агента і трансмембранний і цитоплазматичний домени білка NDV. Такі химерні віруси індукують імунну відповідь проти NDV і інфекційного агента. Передумови створення винаходу Ряд вірусів, які містять ДНК, були генетично сконструйовані таким чином, що спрямовують експресію гетерологічних білків у системах клітинхазяїнів (наприклад, вірус коров'ячої віспи, баку ловірус і т. п.). Недавно аналогічний прогрес був досягнутий з вірусами, що містять позитивну нитку РНК, (наприклад, поліовірусом). Вважають, що продукти експресії цих конструкцій, тобто продукт гетерологічного гена або химерний вірус, експресуючий продукт гетерологічного гена, можуть бути ефективні для композицій вакцин (або субодиничних, або суцільно-віріонних вакцин). Одним з недоліків використання вірусів, таких як вірус коров'ячої віспи, для конструювання рекомбінантних або химерних вірусів для застосування у вакцинах є відсутність варіабельності його основних епітопів. Відсутність варіабельності вірусних штамів сильно обмежує повторне використання химерного вірусу коров'ячої віспи, оскільки множинні вакцинації створюють стійкість хазяїна до штаму, так що інокульований вірус не може інфікувати хазяїна. Імунізація стійкого індивідуума химерним вірусом коров'ячої віспи, таким чином, не буде індукувати відповідь імунної системи. Навпроти, віруси, що містять негативну нитку РНК, є привабливими кандидатами для конструювання химерних вірусів, використовуваних у вакцинах. Віруси, що містять негативну нитку РНК, наприклад вірус грипу, є бажаними, оскільки їхня 7 широка генетична варіабельність уможливлює конструювання величезного набору композицій вакцин, що стимулюють імунітет без ризику розвитку стійкості. 2.1. Віруси, що містять негативну нитку РНК Сімейства вірусів, що містять покриту оболонкою однониткову РНК негативного смислового геному, класифікують у групи, які мають несегментовані геноми (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae) або які мають сегментовані геноми (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae і Arenaviridae). Сімейства Paramyxoviridae і Orthomyxoviridae докладно описані нижче і використовуються в прикладах за даним винаходом. Сімейство Paramyxoviridae складається з вірусу псевдочуми птахів (NDV), вірусу парагрипу, вірусу Сендай, мавпячого вірусу 5 і вірусу епідемічного паротиту. Сімейство Orthomyxoviridae містить віруси грипу типу А, В і С, а також віруси Тогото і Дхори і вірус інфекційної анемії сьомгових. 2.1.1. Вірус грипу Віріони грипу містять внутрішнє рибонуклеопротеїнове ядро (спіральний нуклеокапсид), що містить однонитковий РНК-геном, і зовнішню ліпопротеїнову оболонку з внутрішнім покриттям з матриксного білка (M1). Сегментований геном вірусу грипу А складається з восьми молекул (для вірусу грипу С із семи) лінійних однониткових РНК негативної полярності, які кодують десять поліпептидів, що включають білки РНК-залежної РНКполімерази (РВ2, РВ1 і РА) і нуклеопротеїн (NP), що формують нуклеокапсид; матриксні мембранні білки (M1, M2); два поверхневих глікопротеїни, що виступають з оболонки, яка містить ліпід: гемаглютинін (НА) і нейрамінідаза (NA), неструктурний білок (NS1) і білок ядерного експорту (NEP). Транскрипція і реплікація геному відбуваються в ядрі, а зборка відбувається через пупкування в плазмати 96140 8 чній мембрані. Віруси можуть перегруповувати гени під час змішаної інфекції. Вірус грипу адсорбується на клітинах за допомогою активності зв'язування НА із сіалілолігосахаридами в глікопротеїнах і гліколіпідах клітинної мембрани. Після ендоцитозу віріону в клітинній ендосомі відбувається конформаційна зміна молекули НА, що полегшує мембранне злиття, що, таким чином, запускає декапсидацію. Нуклеокапсид переміщається в ядро, де вірусна мРНК транскрибується. Вірусна мРНК транскрибується за допомогою унікального механізму, у якому вірусна ендонуклеаза відщеплює кепований 5'-кінець від клітинних гетерологічних мРНК, яка потім служать як праймери для транскрипції вірусної матричної РНК за допомогою вірусної транскриптази. Транскрипти термінуються в сайтах 15-22 основ від кінців їхніх матриць, у яких послідовності оліго(и) діють як сигнали для додавання ділянок полі(А). Вірусні РНК-транскрипти потім переміщаються в клітинну мембрану і зв'язуються з недавно транскрибованими трансмембранними вірусними білками. Потім NA відщеплює залишки сіалової кислоти від вуглеводневих складових глікопротеїнів, зв'язаних з мембраною, що приведе до упакування і вивільнення з клітини потомства вірусу. З восьми вірусних молекул РНК, отриманих таким чином, шість є моноцистронними інформаційними молекулами, що безпосередньо транслюються в білки, що представляють НА, ΝΑ, ΝΡ і вірусні полімеразні білки РВ2, РВ1 і РА. Інші два транскрипти піддаються сплайсингу, при цьому кожний дає дві мРНК, що транслюються з використанням різних рамок зчитування з одержанням M1, М2, NS1 і NEP. Іншими словами вісім вірусних РНКсегментів кодують десять білків: дев'ять структурних і один неструктурний. Короткий виклад генів вірусу грипу і їхніх білкових продуктів представлений нижче в таблиці 1. 9 Патогенність вірусів грипу модулюється множиною вірусних факторів і факторів хазяїна. Серед факторів хазяїна, втягнених у боротьбу з вірусною інфекцією, система інтерферону типу І (IFN/) представляє потужний противірусний уроджений захисний механізм, що виник відносно рано в еволюції еукаріотичних організмів (Garcia-Sastre, 2002, Microbes Infect 4: 647-55). Противірусна система IFN/ включає три основних стадії: (і) виявлення вірусної інфекції і секрецію IFN/; (іі) зв'язування IFN/ з його рецепторами й індукцію транскрипції стимульованих IFN/ генів і (ііі) синтез противірусних ферментів і білків. Більшість вірусів, однак, мають набуту специфічну генетичну інформацію, що кодує молекули антагоністів IFN/, які ефективно блокують одну або декілька стадій противірусної системи IFN/. Віруси грипу А експресують неструктур ний білок в інфікованих клітинах, білок NS1 (описаний докладно нижче), що протидіє клітинній IFN/-відповіді (GarciaSastre et al., 1998, Virology 252:324-30). 2.1.1.1. Високопатогенний вірус пташиного грипу В останні роки повідомлялося про епідемії захворювання, викликаного високопатогенним вірусом пташиного грипу (НРАІ), в Азії і Європі (Kawaoka et al., 2005, Natl. Rev. Microbiol. 3:591600; Koopmans et al., 2004, Lancet 363:587-593). Епідемії, у які втягнений вірус грипу А, віруси підтипу H5N1 і H7N7, приводили до летальних інфекцій домашньої птиці і смерті обмеженого числа людей (Tweed et al., 2004, Emerg. Infec. Dis. 10:2196-2199). Один з останніх вірусів H5N1 циркулював серед домашньої птиці в Китаї в останні роки (Chen et al., 2005, Nature 436:191-192), і хоча первинними носіями цього вірусу вважаються мігруючі птахи, вважають, що в збільшення географічного поширення вносить вклад у передачу від інфікованої домашньої птиці назад мігруючим птахам. В даний час вірус H5N1, що з'явився з Азії, поширюється по Європі й Африці (Enserink, 2006, 96140 10 Science, 311:932). Показано, що оптове вибракування виявилося успішною стратегією викорінювання епідемій H5N1 у Гонконзі в 1997 і Нідерландах у 2003 p. (Lipatov et al., 2004, J. Virol. 78:89518959). Оскільки людські жертви недавніх епідемій НРАІ мали близький контакт з інфікованою домашньою птицею, з цього випливає, що профілактику міжвидової передачі вірусів пташиного грипу (AIV) можна здійснити шляхом викорінювання AIV у домашньої птиці завдяки вибою. Однак з економічних і практичних причин тільки знищення домашньої птиці більше не вважається кращим методом контролю цього захворювання. Крім того, з етичних і екологічних причин вибракування мігруючих диких птахів вважається неприйнятною практикою. Недавно ΟΙΕ (Всесвітня організація здоров'я тварин) і FAO (Продовольча і сільськогосподарська організація об'єднаних націй) рекомендували розглядати вакцинацію домашньої птиці для контролю AIV. Крім того, повідомлялося, що вакцинація курчат інактивованою Н5-вакциною була успішною для переривання передачі вірусу в польовому дослідженні (Ellis et al., 2004, Avian Pathol. 33:405412). Недавно в Китаї вакцинація була прийнята як складова частина програми контролю AIV. Можливість того, що високопатогенний штам H5N1 може стати переданим від людини до людини, виражається в термінах глобальної пандемії, при цьому WHO не бажає оцінити загальну смертність у випадку рекомбінації вірусу H5N1 у людську форму. Тому ясна необхідність у способі контролю інфекції H5N1 у сільськогосподарської худоби, від якого, як вважають, відбулася найбільша кількість передач людині. 2.1.2. Вірус псевдочуми птахів Вірус псевдочуми птахів являє собою покритий оболонкою вірус, що містить лінійний, однонитковой, несегментований, негативний смисловий РНК-геном. Геномна РНК містить гени в порядку 3'-N-P-M-F-HN-L, докладно описаним нижче. Геномна РНК також містить лідерну послідовність на 3'кінці. 11 Структурні елементи віріону включають вірусну оболонку, що є ліпідною двошаровою оболонкою, яка походить з плазматичної мембрани клітини. З оболонки виступає глікопротеїн, гемаглютинін-нейрамінідаза (HN), що забезпечує активність як гемаглютину (наприклад, зв'язування з рецептором/злиття), так і нейрамінідази. Глікопротеїн злиття (F), що також взаємодіє з вірусною мембраною, спочатку продукується у вигляді неактивного попередника, потім піддається посттрансляційному розщепленню з утворенням двох зв'язаних дисульфідними зв'язками поліпептидів. Активний білок F втягнений у проникнення NDV у клітини-хазяїна шляхом полегшення злиття вірусної оболонки з плазматичною мембраною клітинихазяїна. Матриксний білок (М) втягнений у зборку вірусу і взаємодіє як з вірусною мембраною, так і білками нуклеокапсиду. Основною білковою субодиницею нуклеокапсиду є нуклеокапсидний білок (N), що додає капсиду симетрію спірали. В асоціації з нуклеокапсидом знаходяться білки Ρ і L. Вважають, фосфопротеїн (Р), який піддається фосфорилюванню, відіграє регуляторну роль у транскрипції і може бути втягнений у метилювання, фосфорилювання і поліаденілювання. Ген L, що кодує РНКзалежну РНК-полімеразу, потрібний для синтезу вірусної РНК разом з білком Р. Білок L, що займає майже половину кодуючої здатності вірусного геному, є найбільшим з вірусних білків і відіграє важливу роль як у транскрипції, так і реплікації. Реплікація усіх вірусів, що містять негативну нитку РНК, у тому числі NDV, ускладнена відсутністю клітинного механізму, необхідного для реплікації РНК. Крім того, геном у вигляді негативної нитки не може транслюватися безпосередньо в білок, а повинен спочатку транскрибуватися в копію у вигляді позитивної нитки (мРНК). Отже, після проникнення в клітину-хазяїна вірус не може синтезувати необхідну РНК-залежну РНК-полімеразу. При інфікуванні разом з геномом у клітину повинні потрапити білки L, Ρ і N. Була висунута гіпотеза, що більшість або всі вірусні білки, які транскрибують мРНК NDV, також здійснюють їхню реплікацію. Механізм, за допомогою якого регулюється альтернативне застосування (тобто транскрипція або реплікація) тієї самої сполуки білків, не точно визначений, але очевидно, у не його убудований надлишок вільних форм одного або декількох нуклекапсидних білків, зокрема N. Безпосередньо після проникнення вірусу транскрипція ініціюється білком L з використанням як матриці негативної нитки РНК у нуклеокапсиді. Синтез вірусної РНК регулюється так, що під час транскрипції продукуються моноцистронні мРНК. Після транскрипції другою істотною подією при інфікуванні вірусами, що містять негативну нитку РНК, є реплікація вірусного геному. Як і у випадку інших вірусів, що містять негативну нитку РНК, реплікація геному вірусу псевдочуми птахів (NDV) опосередковується специфічними відносно вірусу білками. Першими продуктами реплікативного синтезу РНК є комплементарні копії (тобто позитивної полярності) РНК геному NDV (кРНК). Ці плюсниткові копії (антигеноми) відрізняються від транс 96140 12 криптів у вигляді плюс-ниткових мРНК за структурою їхніх кінців. На відміну від транскриптів у вигляді мРНК антигеномні кРНК не є кепованими і метильованими на 5'-кінці і не є зрізаними і поліаденільованими на 3'-кінці. кРНК є кінцевими з їхніми негативно-нитковими матрицями і містять усю генетичну інформацію кожного сегменту геномної РНК у комплементарній формі. кРНК служать як матриці для синтезу вірусних геномів у вигляді негативних ниток NDV (vPHK). Геноми у вигляді негативних ниток NDV (vPHK), так і антигеноми (кРНК) укладаються у капсид за допомогою нуклеокапсидних білків; єдиними не укладеними в капсиди різновидами РНК є вірусні мРНК. Для NDV місцем реплікації вірусної РНК є цитоплазма, що також є місцем транскрипції. Зборка вірусних компонентів, очевидно, відбувається в плазматичній мембрані клітини-хазяїна, і зрілий вірус вивільняється за допомогою пупкування. 2.2. Імуногенні композиції Технологія рекомбінантних ДНК і способи конструювання з використанням «зворотної генетики» надають унікальний підхід до одержання рекомбінантних вірусів, використовуваних в імуногенних композиціях. Зокрема, даний винахід належить до способу конструювання РНК вірусу, що містить негативну нитку, так, що він експресує, або представляє не тільки природні вірусні антигени, тa також будь-який антиген, який можна сконструювати так, щоб він включався в білкову оболонку вірусу. Особливий інтерес представляють антигени інфекційних організмів, відмінних від вірусу грипу. Таким чином, можна розробити один вірус як імуногенний компонент, який використовується для стимуляції, або активації індукції імунної відповіді, який би надав захист проти принаймні двох патогенів. Такий химерний вірус можна піддати додатковій розробці, якщо необхідно модифікувати його вірулентність, тобто так, щоб він міг бути атенюйованим або додатково атенюйованим. Атенюйовані віруси грипу можуть бути ефективні, оскільки є імуногенними і здатні реплікуватися, але не є патогенними. Вважають, що живі вакцини індукують підвищену перехресну клітинну цитотоксичність, а також гуморальну відповідь, що забезпечує кращий захист, ніж інактивовані вакцини (Gorse and Belshe, 1990, J. Clin. Microbiol. 28:2539-2550; і Gorse et al., 1995, J. Infect. Dis. 172:1-10). По-друге, імовірно, що в захисний імунітет проти вірусних захворювань втягнена IgA-відповідь слизових оболонок, що не відзначається при традиційних внутрішньом'язових вакцинах (Nelson et al., 1998, Vaccine 16:1306-1313). Нарешті, живі вакцини також мають перевагу інтраназального введення, що виключає набрякання і хворобливість м'яза, іноді супровідне внутрішньом'язове введення інактивованої вакцини, доповненої ад'ювантом. Повідомлялося, що живі вакцини індукують не тільки гуморальні відповіді проти гомотипового вірусу грипу, але також перехресну клітинну цитотоксичність. Таким чином, даним винаходом пропонується можливість розробки нових і більш ефективних імунних композицій, наприклад, композицій вакцин, 13 для діагностики, профілактики, або регулювання лікування як вірусних, так і невірусних патогенів. 3. Короткий виклад суті винаходу Даний винахід належить до химерних вірусів, що містять негативну нитку РНК, розроблених для експресії злитих білків, що включаються у віріон, до способів одержання таких химерних вірусів і до застосування таких вірусів, наприклад як імуногенів, в імуногенних композиціях або у in vitro аналізах. Химерні віруси за даним винаходом характеризуються тим, що на поверхні віріону презентовані не тільки антигени, зв'язані з вірусом, але також злитих білків. Даний винахід належить до химерних вірусів грипу і химерних NDV, що уможливлюють імунізацію індивіда, наприклад, птаха або людини, проти двох інфекційних агентів шляхом введення химерного вірусу або грипу химерного NDV. В одному з аспектів використання одного вірусу для індукції імунної відповіді зменшує частоту введення імунізуючої композиції. В іншому аспекті використання одного вірусу для індукції імунної відповіді знижує вартість імунізації індивідів. Більш низька вартість імунізації індивідів збільшує імовірність того, що більше індивідів зможуть мати можливість піддатися імунізації, і, отже, знижує витрати, зв'язані з лікуванням індивідів, що страждають інфекцією. Даний винахід також належить до застосування химерного вірусу за даним винаходом в композиціях (наприклад, імуногенних композиціях) для людей або тварин. Зокрема, химерні віруси за даним винаходом можна використовувати як вакцини проти широкого ряду вірусів і/або антигенів. Оскільки химерний вірус розробляється з метою експресії чужорідного епітопу у віріоні, то композиції (наприклад, композиції вакцин), що містять химерний вірус за даним винаходом, можуть бути призначені для імунізації проти множини штамових варіантів, різних вірусів або проти зовсім різних інфекційних агентів або зв'язаних із захворюванням антигенів (наприклад, бактерій, паразитів, грибів або специфічних відносно пухлин антигенів). Можна використовувати велику розмаїтість способів введення композицій живих атенюйованих вірусів людині або тварині для індукування імунної відповіді або відповіді з відповідним продукуванням цитокінів. До таких способів належать, але ними не обмежуються, інтраназальний, інтратрахіальний, пероральний, інтрадермальний, внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний і підшкірний способи. Химерні віруси за даним винаходом уможливлюють імунізацію індивіда (наприклад, птахів) проти двох інфекційних захворювань шляхом введення химерних вірусів. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу химерні віруси за даним винаходом уможливлюють імунізацію птахів проти вірусу пташиного грипу і вірусу псевдочуми птахів шляхом введення химерного вірусу за даним винаходом. Птахів можна легко імунізувати обприскуванням химерним вірусом або уведенням химерного вірусу у водному розчині, такому як вода, що вони п'ють. Даний винахід оснований частково на виявленні, зробленому заявниками, що ефективну іму 96140 14 нну відповідь проти двох інфекційних агентів можна одержати шляхом розробки вірусу грипу, який експресує і включає у свій віріон злитий білок, що містить цитоплазматичний і трансмембранний домени принаймні одного основного глікопротеїну вірусу і ектодомен білка другого інфекційного агента, причому злитий білок функціонально заміщує основний глікопротеїн. В одному з аспектів вбудовування злитого білка у віріон приводить до збільшення імунної відповіді на ектодомен другого інфекційного агента. Конструювання цитоплазматичного і трансмембранного доменів основного глікопротеїну вірусу в злитому білку уможливлює вбудовування злитого білка у віріон. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу основний глікопротеїн являє собою один з білків НА і/або NA вірусу грипу або обидва ці білки. В іншому варіанті здійснення даного винаходу основний глікопротеїн являє собою один з білків HN і F NDV, або обидва ці білки. Функціональне заміщення принаймні одного основного глікопротеїну вірусу виключає необхідність обмежувати розмір вірусного геному (наприклад, геному вірусу грипу). У деяких варіантах здійснення даного винаходу функціональне заміщення принаймні одного основного глікопротеїну вірусу злитим білком послабляє реплікацію вірусу в індивідів. Даний винахід належить до химерного вірусу пташиного грипу, що містить злитий білок, що має (і) ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, злитий з (іі) трансмембранним і цитоплазматичним доменами глікопротеїну, що кодується основним геном вірусу грипу, де злитий білок міститься у вірусі пташиного грипу, у якому функція основного гена забезпечується злитим білком або природним глікопротеїном, властивим вірусу пташиного грипу. У певних варіантах здійснення даного винаходу основним геном вірусу грипу є ген гемаглютиніну (НА). В інших варіантах здійснення даного винаходу основним геном вірусу грипу є ген нейрамінідази (NA). У певних варіантах здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу є атенюйованим. Відповідно до цих варіантів здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу може бути атенюйований мутацією в гені NS1. Даний винахід належить до химерного вірусу пташиного грипу, що містить злитий білок, який має (і) ектодомен білка HN NDV, злитий з (іі) трансмембранним і цитоплазматичним доменами білка NA вірусу грипу, де злитий білок міститься у вірусі пташиного грипу, у якому функція білка NA забезпечується злитим білком або природним глікопротеїном, властивим вірусу пташиного грипу. У певних варіантах здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу є атенюйованим. Відповідно до цих варіантів здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу може бути атенюйований мутацією в гені NS1. Відповідно до даного винаходу можна використовувати будьякий тип, підтип або штам вірусу пташиного грипу. Даний винахід належить до химерного вірусу пташиного грипу, що містить упакований сегмент NA вірусу грипу, що кодує злитий з нейрамінідазою білок, у якому відкрита рамка зчитування NA мо 15 дифікована так, що кодуючі ектодомен NA нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену нейрамінідази інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється Nкінцем, так що злитий з нейрамінідазою білок експресується і вбудовується в химерний вірус пташиного грипу. Даний винахід належить до химерного вірусу пташиного грипу, що містить упакований сегмент НА вірусу грипу, що кодує злитий з гемаглютиніном білок, у якому відкрита рамка зчитування НА модифікована так, що кодуючі ектодомен НА нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен здатного до злиття/що зв'язується з рецептором антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється С-кінцем, так що злитий з гемаглютиніном білок експресується і вбудовується в химерний вірус пташиного грипу. Даний винахід належить до химерного вірусу пташиного грипу, що містить упакований біцистронний сегмент НА вірусу грипу, що включає (а) першу відкриту рамку зчитування, яка кодує білок гемаглютинін вірусу пташиного грипу, і (b) другу відкриту рамку зчитування, яка кодує злитий з гемаглютиніном білок, у якій кодуючі ектодомен гемаглютиніну нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, або що кодують пов'язаний із захворюванням антиген, що прикріплюється С-кінцем, так що і гемаглютинін вірусу грипу, і злитий білок експресуються і включаються в химерний вірус пташиного грипу. У певних варіантах здійснення даного винаходу першу відкриту рамку зчитування сегменту НА химерного вірусу пташиного грипу модифікують, видаляючи множину, що міститься, основних амінокислот сайту розщеплення гемаглютиніну. Даний винахід належить до химерного вірусу пташиного грипу, що містить упакований біцистронний сегмент ΝΑ вірусу грипу, що включає: (а) першу відкриту рамку зчитування, яка кодує білок нейрамінідазу вірусу пташиного грипу, і (b) другу відкриту рамку зчитування, яка кодує злитий з нейрамінідазою білок, у якій кодуючі ектодомен нейрамінідази нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, або що кодують пов'язаний із захворюванням антиген, що прикріплюється N-кінцем, так що і нейрамінідаза вірусу грипу, і злитий білок експресуються і включаються в химерний вірус пташиного грипу. У певних варіантах здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу включає сегмент НА, що має відкриту рамку зчитування, модифіковану видаленням сайта розщеплення гемаглютиніни, що містить множину основних амінокислот. Даний винахід належить до химерного вірусу пташиного грипу, що містить упакований сегмент ΝΑ вірусу грипу, який кодує злитий з нейрамінідазою білок, у якому відкрита рамка зчитування ΝΑ модифікована так, що кодуючі ектодомен нейрамінідази замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену HN NDV, так що злитий з нейрамінідазою білок експресується і вбудовується в химерний вірус пташиного грипу. Злитий з нейра 96140 16 мінідазою білок забезпечує химерний вірус пташиного грипу активністю нейрамінідази. У певних варіантах здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу за даним винаходом містить упакований сегмент гена NS1, що кодує модифікований білок NS1, який зменшує антагоністичну відносно клітинного інтерферону активність вірусу. Необмежувальні приклади мутацій у гені NS1, що приводять до модифікованого білка NS1, представлені в розділі 5.1.2. нижче. Даний винахід належить до рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот (наприклад, рекомбінантних ДНК-молекул), що кодують сегмент ΝΑ химерних вірусів пташиного грипу за даним винаходом. Даний винахід також належить до рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот (наприклад, рекомбінантних ДНК-молекул), що кодують сегмент НА химерних вірусів пташиного грипу за даним винаходом. Крім того, даний винахід належить до рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот (наприклад, рекомбінантним РНК-молекулам), що кодують сегмент ΝΑ або сегмент НА химерних вірусів пташиного грипу за даним винаходом. Даний винахід належить до способів розмноження химерного вірусу пташиного грипу за даним винаходом, що включає культивування химерного вірусу пташиного грипу в яйці з ембріоном або клітинної лінії, чутливої до інфікування вірусом пташиного грипу. Даний винахід також належить до способів одержання імуногенної композиції, що включає (а) розмноження химерного вірусу пташиного грипу за даним винаходом в яйці з ембріоном або клітинної лінії, чутливої до інфікування вірусом пташиного грипу; і (b) збір потомства вірусу, причому вірус вирощують до достатніх кількостей і в умовах, адекватних для того, щоб вірус був вільний від забруднення, так що потомство вірусу прийнятне для застосування в імуногенних композиціях, наприклад, композиціях вакцин. Даний винахід належить до атенюйованого химерного вірусу грипу, що містить злитий білок, що має (і) ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, злитий з (іі) трансмембранним і цитоплазматичним доменами глікопротеїну, що кодується основним геном вірусу грипу, причому злитий білок міститься в атенюйованому вірусі грипу, у якому функція основного гена забезпечується злитим білком або природним глікопротеїном, властивим атенюйованому вірусу грипу. У певних варіантах здійснення даного винаходу основним геном вірусу грипу є ген гемаглютиніну (НА). В інших варіантах здійснення даного винаходу основним геном вірусу грипу є ген нейрамінідази (ΝΑ). Атенюйований химерний вірус пташиного грипу може бути будь-як типом, або підтипом штамом вірусу грипу. Наприклад, атенюйований химерний вірус грипу може бути вірусом грипу А, вірусом грипу В або вірусом грипу С. Даний винахід належить до атенюйованого химерного вірусу грипу, що містить упакований сегмент ΝΑ вірусу грипу, що кодує злитий з нейрамінідазою білок, у якому відкрита рамка зчитування ΝΑ модифікована так, що кодуючі ектодомен ΝΑ нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену нейрамінідази інфек 17 ційного агента, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється N-кінцем, так що злитий з нейрамінідазою білок експресується і вбудовується в атенюйований химерний вірус пташиного грипу. У певних варіантах здійснення даного винаходу атенюйований химерний вірус грипу за даним винаходом містить сегмент НА, що має відкриту рамку зчитування, модифіковану видаленням сайта розщеплення гемаглютиніни, що містить множину основних амінокислот. Даний винахід належить до атенюйованого химерного вірусу грипу, що містить упакований сегмент НА вірусу грипу, що кодує злитий з гемаглютиніном білок, у якому відкрита рамка зчитування НА модифікована так, що кодуючі ектодомен НА нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену гемаглютиніну інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, який прикріплюється С-кінцем, так що злитий з гемаглютиніном білок експресується і вбудовується в атенюйований химерний вірус грипу. Даний винахід належить до атенюйованого химерного вірусу грипу, що містить упакований біцистронний сегмент НА вірусу грипу, що містить (а) першу відкриту рамку зчитування, яка кодує білок гемаглютинін вірусу грипу, і (b) другу відкриту рамку зчитування, яка кодує злитий з гемаглютиніном білок, у якій кодуючі ектодомен гемаглютиніну нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, або що кодують пов'язаний із захворюванням антиген, що прикріплюється Скінцем, так що і гемаглютинін вірусу грипу, і злитий білок експресуються і включаються в атенюйований химерний вірус грипу. У певних варіантах здійснення даного винаходу першу відкриту рамку зчитування сегменту НА атенюйованого химерного вірусу грипу модифікують з видаленням сайта розщеплення гемаглютиніну, який містить множину основних амінокислот. Даний винахід належить до атенюйованого химерного вірусу грипу, що містить упакований біцистронний сегмент NA вірусу грипу, що містить (а) першу відкриту рамку зчитування, яка кодує білок нейрамінідазу вірусу грипу, і (b) другу відкриту рамку зчитування, яка кодує злитий з нейрамінідазою білок, у якій кодуючі ектодомен нейрамінідази нуклеотиди замінені нуклеотидами, що кодують ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, або що кодують пов'язаний із захворюванням антиген, що прикріплюється N-кінцем, так що і нейрамінідаза вірусу грипу, і злитий білок експресуються і містяться в атенюйованому химерному вірусі грипу. У певних варіантах здійснення даного винаходу атенюйований химерний вірус грипу за даним винаходом містить сегмент НА, що має відкриту рамку зчитування, модифіковану видаленням сайта розщеплення гемаглютиніну, який містить множину основних амінокислот. У певних варіантах здійснення даного винаходу атенюйований химерний вірус грипу за даним винаходом містить упакований сегмент гена NS1, що кодує модифікований білок NS1, який зменшує 96140 18 антагоністичну, відносно клітинного інтерферону, активність вірусу. Даний винахід належить до рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот (наприклад, рекомбінантних ДНК-молекул), що кодують сегмент NA атенюйованих химерних вірусів грипу за даним винаходом. Даний винахід також належить до рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот (наприклад, рекомбінантних ДНК-молекул), що кодують сегмент НА атенюйованих химерних вірусів грипу за даним винаходом. Крім того, даний винахід належить до рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот (наприклад, рекомбінантних РНК-молекул), що кодують сегмент NA або сегмент НА атенюйованих химерних вірусів грипу за даним винаходом. Даний винахід належить до способів розмноження атенюйованого химерного вірусу грипу за даним винаходом, що містить культивування атенюйованого химерного вірусу грипу в яйці з ембріоном або клітинної лінії, чутливої до інфікування вірусом грипу. Даний винахід також належить до способів одержання імуногенної композиції, що включає (а) розмноження атенюйованого химерного вірусу грипу за даним винаходом в яйці з ембріоном або клітинної лінії, чутливої до інфікування атенюйованим вірусом грипу; і (b) збір потомства вірусу, причому вірус вирощують до достатніх кількостей і в умовах, адекватних для того, щоб вірус був вільний від забруднення, так що потомство вірусу прийнятне для застосування в імуногенних композиціях, наприклад, композиціях вакцин. Даний винахід також належить до химерних вірусів NDV. Зокрема, даний винахід належить до химерних NDV, які включають злитий білок, що має (і) ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від NDV, злитий з (іі) трансмембранним і цитоплазматичним доменами глікопротеїну, що кодується основним геном NDV, де злитий білок міститься в NDV, у якому функція основного гена забезпечується злитим білком або природним глікопротеїном, властивим NDV. У певних варіантах здійснення даного винаходу основним геном NDV є ген, що кодує білок F. В інших варіантах здійснення даного винаходу основним геном NDV є ген, що кодує білок HN. Відповідно до цього винаходу можна використовувати будь-який тип, підтип або штам NDV. Даний винахід належить до химерного NDV, що включає упакований геном, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, злитий з білком F, що має трансмембранний і цитоплазматичний домени білка F і ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від NDV, або зв'язаного з захворюванням антигену, що прикріплюється С-кінцем, так що білок, злитий з білком F, експресується і вбудовується в химерний NDV. У певних варіантах здійснення даного винаходу геном химерного NDV містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок F, так що білок F експресується і вбудовується в химерний NDV крім білка, злитого з білком F NDV. В інших варіантах здійснення даного винаходу нуклеотидна послідовність, що кодує білок, злитий з білком F NDV, заміняє нуклеотидну послідовність, що кодує білок F NDV, 19 і білок, злитий з білком F, забезпечує функцію білка F у химерному NDV. Даний винахід належить до химерного NDV, що містить упакований геном, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, злитий з FEN, що має трансмембранний і цитоплазматичний домени білка HN і ектодомен антигену інфекційного агента, відмінного від NDV, або антигену, що зв'язується з захворюванням, що прикріплюється N-кінцем, так що білок, злитий з HN, експресується і вбудовується в химерний NDV. У певних варіантах здійснення даного винаходу геном химерного NDV містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок HN, так що білок HN експресується і вбудовується в химерний NDV крім білка, злитого з HN NDV. В інших варіантах здійснення даного винаходу нуклеотидна послідовність, що кодує білок, злитий з HN, заміняє нуклеотидну послідовність, що кодує білок HN NDV, і білок, злитий з HN, забезпечує функцію білка HN у химерному NDV. Даний винахід належить до рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, що кодують білок F або білок HN NDV. Даний винахід належить до способів розмноження химерного NDV за даним винаходом, що містить культивування химерного NDV у яйці з ембріоном або клітинній лінії, чутливій до інфікування NDV. Даний винахід також належить до способу одержання імуногенної композиції, що включає (а) розмноження химерного NDV за даним винаходом в яйці з ембріоном або клітинної лінії, чутливої до інфікування NDV; і (b) збір потомства вірусу, причому вірус вирощують до достатніх кількостей і в умовах, адекватних для того, щоб вірус був вільний від забруднення, так щоб потомство вірусу могло б використовуватися в імуногенних композиціях, наприклад, композиціях вакцин. Даний винахід належить до яєць з ембріонами, які включають химерні віруси за даним винаходом. Даний винахід також належить до клітинних ліній, що містять химерні віруси за даним винаходом. Даний винахід, крім того, належить до імуногенних композицій, що містять химерні віруси за даним винаходом. Даний винахід належить до способів індукування у індивіда імунної відповіді на один, два або більше інфекційних агенти, що містить введення ефективної кількості химерного вірусу грипу за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення даного винаходу індивідом є людина. В інших варіантах здійснення даного винаходу індивідом є ссавець, який не є людиною (наприклад, свиня, кінь, собака або кішка). У ще одному варіанті здійснення даного винаходу індивідом є птах. У конкретному варіанті здійснення даний винахід належить до способу індукування імунної відповіді в птаха на один, два або більше інфекційних агентів, що містить введення ефективної кількості химерного вірусу пташиного грипу за даним винаходом. Даний винахід належить до способів індукування в індивіда імунної відповіді на один, два або більше інфекційних агентів, що включає введення індивіду ефективної кількості химерного NDV за даним винаходом. У певних варіантах здійснення даного винаходу індивідом є людина. В інших ва 96140 20 ріантах здійснення даного винаходу індивідом є ссавець, який не є людиною (наприклад, свиня, кінь, собака або кішка). У ще одному варіанті здійснення даного винаходу індивідом є птах. У конкретному варіанті здійснення даний винахід належить до способів індукування імунної відповіді в птаха на один, два або більше інфекційних агентів, що включає введення птаху ефективної кількості химерного NDV за даним винаходом. Даний винахід належить до способів індукування в індивіда імунної відповіді на один, два або більше інфекційних агентів, що включає введення індивіду ефективної кількості атенюйованого химерного вірусу грипу за даним винаходом. У певних варіантах здійснення даного винаходу індивідом є людина. В інших варіантах здійснення даного винаходу індивідом є ссавець, який не є людиною (наприклад, свиня, кінь, собака або кішка). У ще одному варіанті здійснення даного винаходу індивідом є птах. У конкретному варіанті здійснення даний винахід належить до способів індукування в людини імунної відповіді на один, два або більше інфекційних агентів, що містить введення хворому ефективної кількості химерного вірусу за даним винаходом. Даний винахід належить до способів індукування імунної відповіді на пов'язаний із захворюванням антиген, що включає введення індивіду ефективної кількості химерного вірусу за даним винаходом. У певних варіантах здійснення даного винаходу індивідом є людина. В інших варіантах здійснення даного винаходу індивідом є птах. 3.1. Термінологія Використовуваний у даному описі термін «тварина» включає, але ними не обмежуються, домашніх тварин (наприклад, собак і кішок), тварин зоопарку, тварин ферм (наприклад, жуйних, нежуйних, велику рогату худобу і домашню птицю), диких тваринних і лабораторних тварин (наприклад, гризунів, таких як щурі, миші і морські свинки, і кролики) і тварин, яких клонували або модифікували або генетичним, або іншим способом (наприклад, трансгенних тварин). Використовуваний у даному описі термін «приблизно» при використанні відносно числа належить до будь-якого числа в межах 1, 5 і 10% зазначеного числа. Використовуваний в даному описі вираз «амінокінець» NS1 належить до амінокислот Nкінцевого амінокислотного залишку (амінокислотного залишку 1) по амінокислотний залишок 115, амінокислотні залишки з 1 по 100, амінокислотні залишки з 1 по 75, амінокислотні залишки з 1 по 50, амінокислотні залишки з 1 по 25 або амінокислотні залишки з 1 по 10 білка NS1 вірусу грипу. Делеції амінокінця можуть включати делеції, які складаються з 5, переважно, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 або 175 амінокислотних залишків з N-кінця NS1. Використовуваний в даному описі вираз «карбоксильний кінець» NS1 належить до амінокислот з 116 по карбоксикінцевий амінокислотний залишок, амінокислот з 101 по карбоксикінцевий аміно 21 кислотний залишок, амінокислот з 76 по карбоксикінцевий амінокислотний залишок, амінокислот з 51 по карбоксикінцевий амінокислотний або залишок амінокислот з 26 по карбоксикінцевий амінокислотний залишок білка NS1 вірусу грипу кінських, коли амінокінець NS1 являє собою амінокислоти з 1 по амінокислотний залишок 115, амінокислоти з 1 по 100, амінокислоти с 1 по 75, амінокислоти з 1 по 50 або амінокислоти з 1 по 25, відповідно, білка NS1 вірусу грипу. Делеції карбоксикінця можуть включати делеції, які складаються з 5, переважно, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 або 175 амінокислотних залишків з карбоксикінця NS1. Використовувані в даному описі взаємозамінні терміни «захворювання» або «порушення» належать до стану індивіда й охоплюють, але ними не обмежуються, проліферативні захворювання (наприклад, лейкоз, фіброз, карциному (у тому числі злоякісну, незлоякісну, метастатичну і неметастатичну карциноми) і лімфому) і інфекції, викликані інфекційним агентом (наприклад, вірусом, бактерією, паразитом) і супроводжуючі їх стан або симптом. Використовуваний у даному описі термін «епітоп» належить до сайтів, фрагментів або району молекули (наприклад, поліпептиду або білка), що має антигенну або імуногенну активність індивіда. Епітоп, що має імуногенну активність, являє собою сайт, фрагмент або район молекули (наприклад, поліпептиду або білка), що викликає гуморальну відповідь в індивіда. Епітоп, що має антигенну активність, являє собою сайт, фрагмент або район молекули, з яким антитіло імуноспецифічно зв'язується, що можна визначити будь-яким способом, добре відомим кваліфікованому в даній галузі фахівцю, наприклад, за допомогою імунологічних аналізів. Використовуваний у даному описі термін «фрагмент» у контексті агента, подібного до білка, належить до пептиду або поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність принаймні з 2 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 5 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 10 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 15 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 20 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 25 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 40 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 50 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 60 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 70 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 80 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 90 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 100 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 125 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 150 безперервних амінокислотних залишків, по крайній мері з 175 безперервних амінокислотних залишків, принаймні з 200 безперервних амінокислотних або залишків принаймні з 250 безперервних амінокислотних залишків амінокислотної послідовності пе 96140 22 птиду, поліпептиду або білка. В одному з варіантів здійснення даного винаходу фрагмент повнорозмірного білка зберігає активність повнорозмірного білка. В іншому варіанті здійснення даного винаходу фрагмент повнорозмірного білка не зберігає активності повнорозмірного білка. Використовуваний у даному описі термін «фрагмент» у контексті нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид або білок, належить до нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 2 безперервних нуклеотидів, принаймні з 5 безперервних нуклеотидів, принаймні з 10 безперервних нуклеотидів, принаймні з 15 безперервних нуклеотидів, принаймні з 20 безперервних нуклеотидів, принаймні з 25 безперервних нуклеотидів, принаймні з 30 безперервних нуклеотидів, принаймні з 35 безперервних нуклеотидів, принаймні з 40 безперервних нуклеотидів, принаймні з 50 безперервних нуклеотидів, принаймні з 60 безперервних нуклеотидів, принаймні з 70 безперервних нуклеотидів, принаймні з 80 безперервних нуклеотидів, принаймні з 90 безперервних нуклеотидів, принаймні з 100 безперервних нуклеотидів, принаймні з 125 безперервних нуклеотидів, принаймні з 150 безперервних нуклеотидів, принаймні з 175 безперервних нуклеотидів, принаймні з 200 безперервних нуклеотидів, принаймні з 250 безперервних нуклеотидів, принаймні з 300 безперервних нуклеотидів, принаймні з 350 безперервних нуклеотидів або принаймні з 380 безперервних нуклеотидів послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, поліпептид або білок. У переважному варіанті здійснення даного винаходу фрагмент нуклеїнової кислоти кодує пептид або поліпептид, що зберігає активність повнорозмірного білка. В іншому варіанті здійснення даного винаходу фрагмент повнорозмірного білка не зберігає активності повнорозмірного білка. Термін «гетерологічна послідовність», який використовується у контексті агента, подібного до білка, належить до молекули, що не зустрічається в природі у вигляді молекули, зв'язаної з основою химерного вірусу або, зокрема, глікопротеїном химерного вірусу. Термін «гетерологічна послідовність» у контексті послідовності нуклеїнової кислоти або молекули нуклеїнової кислоти належить до молекули, що не зустрічається в природі у вигляді молекули, зв'язаної з геномом основи химерного вірусу. Використовуваний у даному описі термін «імуноспецифічно зв'язує антиген» і аналогічні терміни належать до молекул, що специфічно зв'язуються з антигеном і не специфічно зв'язуються з іншою молекулою (наприклад, специфічні відносно антигену антитіла містять як модифіковані антитіла (тобто антитіла, що містять модифікований константний домен IgG (наприклад, lgG1), або їхній FcRn-зв'язувальний фрагмент (наприклад, або Fcдомен шарнірна область - Fc-домен)) і немодифіковані антитіла (тобто антитіла, що не містять модифікований константний домен IgG (наприклад, lgG1), або їхній FcRn-зв'язувальний фрагмент (наприклад, Fc-домен або шарнірна область - Fcдомен)). Молекули, що специфічно зв'язують один антиген, можуть перехресно реагувати з родинни 23 ми антигенами. Переважно, щоб молекула, що специфічно зв'язує один антиген, не реагувала перехресно з іншими антигенами. Молекулу, що специфічно зв'язує антиген, можна ідентифікувати, наприклад, за допомогою імунологічного аналізу, ВІАcore і інших методів, добре відомих фахівцям у даній галузі. Молекула, специфічно зв'язує антиген, якщо вона зв'язує зазначений антиген з великою спорідненістю, ніж будь-який інший перехресно реагуючий антиген, що визначається з використанням експериментальних методів, таких як радіоімуноаналізи (RIA) і твердофазний їмуноферментний аналіз (ELISA). Дивися, наприклад, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336, відносно обговорення, що стосується специфічності антитіл. Використовуваний у даному описі термін «у комбінації» у контексті призначення індивіду терапії(й) належить до застосування більше одного виду терапії (наприклад, більше одного профілактичного засобу і/або терапевтичного засобу). Використання терміна «у комбінації» не обмежує порядок, у якому терапію (наприклад, профілактичні і/або терапевтичні засоби) призначають індивіду (наприклад, індивіду з інфекцією, викликаною вірусом грипу, і викликаною NDV або інфекцією із супроводжуючим їх або симптомом або станом індивіду з іншою інфекцією (наприклад, іншою вірусною інфекцією). Перший вид терапії (наприклад, перший профілактичний або терапевтичний засіб) можна призначати перед (наприклад, за 5 хвилин, 15 хвилин, 30 хвилин, 45 хвилин, 1 година, 2 години, 4 години, 6 годин, 12 годин, 24 години, 48 годин, 72 години, 96 годин, 1 тиждень, 2 тижня, 3 тижня, 4 тижня, 5 тижнів, 6 тижнів, 8 або тижнів 12 тижнів) призначенням другого виду терапії, одночасно з призначенням другої терапії або після (наприклад, через 5 хвилин, 15 хвилин, 30 хвилин, 45 хвилин, 1 година, 2 години, 4 години, 6 годин, 12 годин, 24 години, 48 годин, 72 години, 96 годин, 1 тиждень, 2 тижня, 3 тижня, 4 тижня, 5 тижнів, 6 тижнів, 8 тижнів або 12 тижнів) призначення другої терапії (наприклад, другого профілактичного або терапевтичного агента) індивіду (наприклад, індивіду з інфекцією, викликаною вірусом грипу, викликаною NDV або інфекцією із супроводжуючим їх симптомом або станом, або з іншою інфекцією (наприклад, іншою вірусною інфекцією)). Використовуваний в даному описі вираз «антагоністична відносно інтерферону активність» агента, подібного до білка, належить до білка або поліпептиду або їхнього фрагменту, похідного або аналогу, які зменшують або інгібують імунну відповідь, у яку втягнений клітинний інтерферон. Зокрема, білок або поліпептид або їхній фрагмент, похідне або аналог (наприклад, NS1 вірусу грипу), що володіють антагоністичною відносно інтерферону активністю, знижують або інгібують експресію і/або активність інтерферону. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу вираз «антагоністична відносно інтерферону активність» належить до вірусного білка або поліпептиду або його фрагменту, похідного або аналогу (наприклад, білка вірусу грипу), що зменшують або інгібують імунну 96140 24 відповідь, у яку втягнений клітинний інтерферон. Вірусний білок або поліпептид з антагоністичною відносно інтерферону активністю може переважно впливати на експресію і/або активність одного або двох типів інтерферону (IFN). В одному з варіантів здійснення даного винаходу вплив відбувається на експресію і/або активність IFN- В іншому з варіантів здійснення даного винаходу вплив відбувається на експресію і/або активність IFN-. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу вплив відбувається на експресію і/або активність IFN-. У певних варіантах здійснення даного винаходу експресія і/або активність IFN-, IFN- і/або IFN- у яйці з ембріоном або клітині зменшується від приблизно 1 до приблизно 100 разів, від приблизно 5 до приблизно 80 разів, від приблизно 20 до приблизно 80 разів, від приблизно 1 до приблизно 10 разів, від приблизно 1 до приблизно 5 разів, від приблизно 40 до приблизно 80 або разів у 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 разів за допомогою агента, подібного до білка, з антагоністичною відносно інтерферону активністю щодо експресії і/або активності IFN-, IFN- і/або IFN- у контрольному яйці з ембріоном або клітині, які не експресують або не приводяться в контакт із таким агентом, подібним до білка, що визначається методами, описаними в даному описі або відомих фахівцю в даній галузі. Використовуваний в даному описі вираз «системи з браком IFN» або «субстрати з браком IFN» належить до систем, наприклад, клітин, ліній клітин і тварин, таких як миші, кури, індички, кролики, щури, коні і т. п., у яких не продукується один, два або більше типів IFN, або взагалі не продукується який-небудь тип IFN, або продукуються низькі рівні одного, двох або більше типів IFN, або продукуються низькі рівні будь-якого IFN (тобто знижена експресія IFN на 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% або більше у порівнянні з компетентною відносно IFN системою при одних і тих умовах), що не відповідають або відповідають менш ефективно на один, два або більше типів IFN, або не відповідають на будь-який тип IFN, і/або в яких є брак активності противірусних генів, які індукуються одним, двома або більше типами IFN або індукованих будь-яким типом IFN. Використовувані в даному описі терміни «інфекція», «викликана вірусом грипу інфекція», «викликана вірусом пташиного грипу інфекція» і «викликана NDV інфекція» належать до всіх стадій життєвого циклу вірусу грипу, вірусу пташиного грипу, NDV або іншого інфекційного агента (наприклад, вірусної або бактеріальної інфекції) в індивіда (у тому числі інвазії і реплікації вірусу грипу, вірусу пташиного грипу, NDV або іншого інфекційного агента в клітині або тканині організму), а також патологічному стану, що є наслідком інвазії і реплікації вірусу грипу, вірусу пташиного грипу або NDV. Інвазія і розмноження вірусу грипу, вірусу пташиного грипу, NDV або іншого інфекційного агента містять, без обмеження, наступні стадії: приєднання вірусу (наприклад, частинки вірусу грипу, вірусу пташиного грипу або NDV) до кліти 25 ни, злиття вірусу з клітинною мембраною, введення генетичної інформації вірусу в клітину, експресію вірусних білків (наприклад, білків вірусу грипу, вірусу пташиного грипу або NDV), продукування нових вірусних частинок (тобто частинок вірусу грипу, вірусу пташиного грипу або NDV) і вивільнення вірусу (наприклад, частинок вірусу грипу, вірусу пташиного грипу або NDV) із клітини. Інфекція дихальних шляхів (наприклад, викликана вірусом грипу або NDV інфекція) може бути інфекцією верхніх дихальних шляхів (URI), інфекцією нижніх дихальних шляхів (LRI) або їх комбінацією. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу інфекція є вторинною інфекцією (наприклад, вторинною пневмонією), що виявляється після виникнення первинної інфекції (наприклад, вірусної пневмонії). Вторинні інфекції виникають завдяки первинній інфекції або симптому або стану, що супроводжує її, які провокують в інфікованого індивіда таку вторинну інфекцію. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу патологічний стан, що є наслідком інвазії і реплікації вірусу грипу, вірусу пташиного грипу або NDV, є гостре захворювання, викликане вірусом грипу, вірусом пташиного грипу або NDV. Гострі стадії інфекцій дихальних шляхів можуть виявлятися у вигляді пневмонії і/або бронхіоліту, симптоми яких можуть включати гіпоксію, асфіксію, дистрес-синдром, швидке дихання, стерторозне дихання, ціаноз і т. п. У гострій стадії інфекцій дихальних шляхів (наприклад, викликаних вірусом грипу і NDV інфекцій) необхідно, щоб піддати індивідуума медичному втручанню, такому як госпіталізація, введення кисню, інтубація і/або вентиляція. Використовуваний у даному описі термін «виділений» у контексті вірусів належить до вірусу, що походить з одного батьківського вірусу. Вірус можна виділити, використовуючи звичайні способи, відомі фахівцю в даній галузі, що містять, але ними не обмежуючи, способи, основані на очищенні з бляшки і серійному розведенні. Використовуваний у даному описі термін «виділений» у контексті молекул нуклеїнових кислот належить до молекули нуклеїнової кислоти, відділеної від інших молекул нуклеїнових кислот, які присутні у природному джерелі молекули нуклеїнової кислоти. Крім того, «виділена» молекула нуклеїнової кислоти, така як молекула кДНК, може бути власне кажучи вільна від іншого клітинного матеріалу, або культурального середовища при одержанні рекомбінантними методами, або власне кажучи вільна від хімічних попередників або інших хімічних продуктів при хімічному синтезі. У переважному варіанті здійснення даного винаходу молекулануклеїнової кислоти, що кодує вірусний білок, є виділеною. Використовувані в даному описі терміни «регулювати», «регулювання» і «регулювання» належать до позитивних ефектів, що індивід одержує від терапії (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу), що не приводить до лікування захворювання (наприклад, інфекції). У певних варіантах здійснення даного винаходу індивіду призначають один або декілька видів терапії (наприклад, профілактичних або терапевтичних засобів, 96140 26 таких як антитіло за даним винаходом) для регулювання інфекції, викликаної вірусом грипу, інфекції, викликаної вірусом пташиного грипу або NDV, або інфекції, викликаної іншим інфекційним агентом, одного або декількох її симптомів або стани, що супроводжує інфекцію, викликану вірусом грипу, або викликану NDV інфекцію, або інфекцію, викликану іншим інфекційним агентом, посиленого такою інфекцією або посилюючого таку інфекцію, для профілактики або прогресування погіршення інфекції. Використовуваний в даному описі вираз «множинність зараження» або «MOI» - це середнє число вірусів на інфіковану клітину. MOI визначають розподілом числа доданих вірусів (мл додані  бляшкоутворюючі одиниці) на число доданих клітин (мл додані  клітини/мл). Використовуваний в даному описі вираз «ген NS1» належить до гена, що кодує неструктурний білок (NS1) вірусу грипу. NS1 є однієї з восьми молекул, які кодуються сегментованим геномом вірусу грипу А і інших вірусів. «Продукт гена NS1» належить до продукту гена (наприклад, РНК або білку), що кодується геном NS1. У випадку білка продукт гена NS1 є повнорозмірним і має активність NS1 дикого типу (наприклад, зі штаму A/WSN/33). Використовувані в даному описі терміни «нуклеїнові кислоти», «нуклеотидні послідовності» і «молекули нуклеїнових кислот» містять молекули ДНК (наприклад, кДНК або геномну ДНК), молекули РНК (наприклад, мРНК), комбінації молекул ДНК і РНК або гібридні молекули ДНК/РНК і аналоги молекул ДНК або РНК. Такі аналоги можна створити з використанням, наприклад, нуклеотидних аналогів, що містять, але ними не обмежуються, інозин або тритильовані основи. Такі аналоги можуть включати молекули ДНК або РНК, що містять модифіковані скелети, що додають молекулам корисних властивостей, таких як, наприклад, стійкість до нуклеаз або збільшена здатність перетинати клітинні мембрани. Нуклеїнові кислоти або нуклеотидні послідовності можуть бути однонитковими, двонитковими, можуть містити й однониткові, і двониткові частини і можуть містити триниткові частини, але переважною є двониткова ДНК. Використовувані в даному описі терміни «профілактика» і «запобігання» належать до запобігання або рецидиву виникнення одного або декількох симптомів захворювання (наприклад, вірусної інфекції або іншого інфекційного захворювання) або зменшенню таких симптомів в індивіда в результаті призначення терапії (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу). Наприклад, у контексті призначення індивіду терапії інфекції «профілактика» і «запобігання» належать до інгібування або зменшення розвитку або виникнення інфекції (наприклад, інфекції, викликаної вірусом грипу, викликаної NDV інфекції, або супроводжуючого її стану, або інфекції, відмінної від інфекції, викликаної вірусом або грипу NDV, або супроводжуючого її стану) або запобіганню рецидиву, або виникнення розвитку одного або декількох симптомів інфекції (наприклад, інфекції, викликаної вірусом грипу, викликаної NDV 27 або інфекції супроводжуючого їх стану, або інфекції, відмінної від інфекції, викликаної вірусом грипу, викликаної NDV або інфекції супроводжуючого її стану) в індивіда в результаті призначення терапії (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу) або призначення комбінації терапії (наприклад, комбінації профілактичних і терапевтичних засобів). Використовуваний у даному описі термін «протективний антиген» у контексті інфекційного агента включає будь-яку молекулу, що при введенні індивіду здатна викликати захисну імунну відповідь проти інфекційного агента. Використовувані в даному описі терміни «профілактичний засіб» і «профілактичні засоби» належать до будь-якого засобу (засобів), які можна використовувати для профілактики захворювання (наприклад, інфекції) або його симптому (наприклад, інфекції, викликаної вірусом грипу, викликаної NDV інфекції, або супроводжуючого їх стану або симптому, або інфекції, відмінної від інфекції, викликаної вірусом або грипу NDV, або супроводжуючого їх стану або симптому). Переважно, профілактичний засіб являє собою засіб, що, як відомо, можна використовувати, був використаний або використовується в даний момент часу для профілактики або профілактики виникнення, розвитку, прогресування і/або тяжкості захворювання або його симптому (наприклад, інфекції або стану або симптому, що супроводжує її). Використовуваний в даному описі вираз «очищений» у контексті вірусів належить до вірусу, що власне кажучи вільний від клітинного матеріалу і культуральних середовищ джерела у вигляді клітини або тканини, з яких вірус одержують. Формулювання «власне кажучи вільний від клітинного матеріалу» включає препарати вірусу, у яких вірус відділений від компонентів клітин, з яких його виділяють або у який його рекомбінантно продукують. Таким чином, вірус, що власне кажучи вільний від клітинного матеріалу, включає препарати білка, що мають менше приблизно 30%, 20%, 10% або 5% (по сухій вазі) клітинного білка (на який у даному описі також приводиться посилання у вигляді «забруднюючий білок»). Вірус також власне кажучи вільний від культурального середовища, тобто культуральне середовище представляє менше приблизно 20%, 10% або 5% об'єму препарату вірусу. Вірус можна очистити з використанням традиційних способів, відомих фахівцю в даній галузі, що містять, але ними не обмежуються, хроматографію і центрифугування. Використовувані в даному описі терміни «індивід» або «пацієнт» використовуються взаємозамінно. Використовувані в даному описі терміни «індивід» або «індивіди» належать до тварини (наприклад, птахів, рептилій і ссавців). У деяких варіантах здійснення даного винаходу індивідом є ссавець, включаючи ссавця, який не є приматом (наприклад, верблюда, осла, зебру, корову, коня, кішку, собаку, щура і мишу) і примата (наприклад, мавпу, шимпанзе і людину). У деяких варіантах здійснення даного винаходу індивідом є ссавець, який не є людиною. В інших варіантах здійснення даного винаходу індивідом є людина. У певних 96140 28 варіантах здійснення даного винаходу вік ссавця (наприклад, людини) складає 0-6 місяців, 6-12 місяців, 1-5 років, 5-10 років, 10-15 років, 15-20 років, 20-25 років, 25-30 років, 30-35 років, 35-40 років, 40-45 років, 45-50 років, 50-55 років, 55-60 років, 60-65 років, 65-70 років, 70-75 років, 75-80 років, 80-85 років, 85-90 років, 90-95 років або 95-100 років. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу індивідом або пацієнтом є птах. У певних варіантах здійснення даного винаходу вік птаха складає 0-3 місяця, 3-6 місяців, 6-9 місяців, 9-12 місяців, 12-15 місяців, 15-18 або місяців 18-24 місяці. Використовуваний у даному описі термін «синергічний» у контексті призначення або результату терапії належить до комбінованої терапії (наприклад, комбінування профілактичних або терапевтичних засобів), яка більш ефективна, ніж адитивні ефекти будь-яких двох або більше окремих терапій (наприклад, одного або більше профілактичних або терапевтичних агентів). Синергічний ефект комбінованої терапії (наприклад, комбінування профілактичних або терапевтичних засобів) уможливлює використання більш низьких доз одного або декількох видів терапії (наприклад, одного або декількох профілактичних або терапевтичних засобів) і/або більш рідке призначення зазначеної терапії індивіду з захворюванням (наприклад, викликаної вірусом грипу інфекцією, викликаної NDV інфекцією або супроводжуючим їх станом або симптомом, або інфекцією, відмінною від викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції, або супроводжуючим її станом або симптомом). Можливість використовувати більш низькі дози терапії (наприклад, профілактичних або терапевтичних засобів) і/або призначати зазначену терапію рідше знижує токсичність, пов'язану з призначенням зазначеної терапії індивіду, не знижуючи ефективності зазначених видів терапії для профілактики або лікування захворювання (наприклад, викликаної вірусом грипу інфекції або супроводжуючого її стану або симптому, або інфекції, відмінної від викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції, або супроводжуючого їх стану або симптому). Крім того, синергічний ефект може привести до збільшення ефективності терапії (наприклад, профілактичних або терапевтичних засобів) для профілактики, регулювання або лікування захворювання (наприклад, викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції або супроводжуючого їх стану або симптому, або інфекції, відмінної від викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції, або супроводжуючого їх стану або симптому). Нарешті, синергічний ефект комбінованої терапії (наприклад, профілактичних або терапевтичних засобів) може виключити або зменшити несприятливі або небажані побічні ефекти, пов'язані з застосуванням будь-якої терапії окремо. Використовувані в даному описі терміни «терапії» і «види терапії» можуть належати до будьякого протоколу(ів), способу(ів) і/або засобу(ів), які можна використовувати для профілактики, лікування, регулювання або зменшення інтенсивності захворювання (наприклад, раку, викликаної віру 29 сом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції, або супроводжуючого їх стану або симптому, або інфекції, відмінної від викликаної вірусом грипу або інфекції викликаної NDV інфекції, або супроводжуючого їх стану або симптому). У певних варіантах здійснення даного винаходу терміни «терапія» і «види терапії» належать до біологічної терапії, підтримуючої терапії і/або інших видів терапії, використовуваних для лікування, регулювання, профілактики або зменшення інтенсивності захворювання, або інфекції супровідногооджуючого їх стану або симптому, відомим фахівцю в даній галузі. Використовувані в даному описі терміни «терапевтичний засіб» і «терапевтичні засоби» належать до будь-якого засобу(ів), які можна використовувати для профілактики, лікування, регулювання або зменшення інтенсивності захворювання (наприклад, інфекції або її симптому (наприклад, викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції або супроводжуючого їх стану або симптому, інфекції, відмінної від викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції, або супроводжуючого їх стану або симптому). Переважно, терапевтичним засобом є засіб, що, як відомо, можна використовувати, або який використовували або використовується в даний момент часу для профілактики, лікування, регулювання або зменшення інтенсивності захворювання або супроводжуючого його симптому (наприклад, викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції або супроводжуючого їх стану або симптому, інфекції, відмінної від викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції, або супроводжуючого їх стану або симптому). Використовувані в даному описі терміни «лікувати» і «лікування» у контексті призначення індивіду терапії належить до виключення, зменшення або зменшення інтенсивності симптомів захворювання, на яке спрямована терапія. Що стосується інфекцій (наприклад, викликаних вірусом грипу або вірусом NDV) лікування належить до виключення або контролю реплікації інфекційного агента (наприклад, вірусу), зменшенню числа інфекційних агентів (наприклад, зниженню титру вірусу), зменшенню прогресування, тяжкості і/або тривалості інфекції (наприклад, викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції або супроводжуючих їх стани або симптомів, інфекції, відмінної від викликаної вірусом грипу інфекції, викликаної NDV інфекції, або супроводжуючого їх стану або симптому) або зменшенню інтенсивності одного або декількох симптомів, що є наслідком призначення однієї або декількох терапій (у тому числі, але ними не обмежуються, введення одного або декількох профілактичних або терапевтичних засобів). Що стосується раку, лікування належить до виключення, видалення, модифікації або контролю первинної, регіональної або метастатичної ракової тканини, що є наслідком введення одного або декількох терапевтичних засобів за даним винаходом. У певних варіантах здійснення даного винаходу такі терміни належать до мінімізації або відстрочки поширення раку, що є наслідком введення одного або декількох терапевтичних засобів 96140 30 за даним винаходом індивіду з таким захворюванням. В інших варіантах здійснення даного винаходу такі терміни належать до виключення викликаючих захворювання клітин. 4. Опис фігур Фіг. 1. Схематичне представлення гібридної конструкції NAf-HN Конструкція містить нуклеотиди 3' некодуючої області вірусної РНК ΝΑ WSN, нуклеотиди кодуючої ΝΑ області, які відповідають цитоплазматичному хвостовому і трансмембранному доменам білка ΝΑ плюс перша амінокислота ектодомену ΝΑ, за якою йдуть нуклеотиди кодуюючої області білка ΗΝ NDV В1 (ектодомен ΗΝ), два послідовних стоп-кодони, нетрансльовані нуклеотиди рамки зчитування NA WSN і 5' некодуюча область вірусної WSN WSN. Фіг. 2. Схематичне представлення зміни послідовності з множиною основних амінокислот НА Нуклеотидна послідовність, яка визначається як НА Η5Ν1, представляє нуклеотиди 1013-1045 (SEQ ID NO:13; амінокислотна послідовність SEQ ID NO:14) відкритої рамки зчитування поверхневого глікопротеїну НА Influenza A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Нуклеотиди 1026-1038 замінили одним нуклеотидом цитозином, використовуючи видаляючу ПЛР і сайт-направлений мутагенез, що привело до одержання нуклеотидної послідовності невірулентного НА (SEQ ID NO:15; амінокислотна послідовність SEQ ID NO:16). Зміни в послідовності відповідають заміні послідовності з 5 основних амінокислот однією амінокислотою треоніном. Фіг. 3. Схематичне представлення зміни послідовності нуклеїнової кислоти НА Послідовність, яка визначається як невірулентний НА, представляє нуклеотиди 1013-1033 відкритої рамки зчитування поверхневого глікопротеїну НА, основаних на консенсусних послідовностях білків НА невірулентного Influenza A/Vietnam/1203/04 (H5N1) (SEQ ID NO:15; амінокислотна послідовність SEQ ID NO:16). Підкреслені залишки аденозину замінені так, що мутації були синонімічними, що привело до одержання нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:17 і амінокислотної послідовності SEQ ID NO:16. Фіг. 4. Схема зрізаних мутантів pPol1VN1203 NS А. Кодуюча область сегменту гена NS H5N1 являє собою 833 нуклеотиди. B. Конструкція pPol1VN1203 NS1-126 має делецію в гені NS з нуклеотидів 379-456 кодуючої області, вставку 3 стоп-кодонів і рестрикційного сайта для Bglll. C. Конструкція pPol1VN1203 NS1-99 має делецію в гені NS з нуклеотидів 298-456 кодуючої області, вставку 4 стоп-кодонів, рестрикційного сайта для Bglll і рестрикційного сайта для PacI. D. Конструкція pPol1VN1203 NS1-73 має делецію в гені NS з нуклеотидів 219-456 кодуючої області, вставку 4 стоп-кодонів, рестрикційного сайта для Bglll і рестрикційного сайта для PacI. Фіг. 5. Схема pNDV/B1 Зображена послідовність фланкована на 3'кінці промотором Т7 і на 5'-кінці рибозимом HDV і термінатором Т7. Сайт вбудовування між генами Ρ 31 і Μ включає унікальний рестрикційний сайт для XbaІ. Фіг. 6. Аналіз Вестерн-блотингом експресії KGFR у химерних вірусах rNDV Химерні віруси rNDV (лінія 1), rNDV-KGFR (лінія 2) і rNDV-KGFR/F-CT (лінія 3) вирощували в курячих яйцях з ембріонами віком 10 днів. Очищені віруси піддавали аналізу Вестерн-блотингом з використанням щурячого антитіла проти KGFR і антимишачого HRPO як першого і другого антитіл, відповідно. Фіг. 7. Аналіз Вестерн-блотингом експресії НА Н7 у химерних вірусах rNDV Химерні віруси rNDV (лінія 1), rNDV-KGFR (лінія 2) і rNDV-KGFR/F-CT (лінія 3) вирощували в курячих яйцях з ембріонами віком 10 днів. Очищені віруси піддавали аналізу Вестерн-блотингом з використанням щурячого антитіла проти НА Н7 і антимишачого HRPO як першого і другого антитіл, відповідно. Фіг. 8. Модифікація сайта розщеплення білка F rNDV (А) Схематичне представлення геному rNDV/B1 із двома або трьома амінокислотними замінами в сайті розщеплення білків F. Пептидний зв'язок, що піддається розщепленню, у білку F показаний з використанням косої риски. (В) Утворення співкліть у клітинах CEF, інфікованих rNDV з модифікованими білками F. Клітини CEF інфікували при множинності зараження, що складає 0,001, вірусами rNDV/B1, rNDV/F2aa і rNDV/F3aa. Поширення вірусів контролювали кожні 24 години за допомогою імунофлуоресцентного аналізу. Фіг. 9. Конструювання і характеристика здатного до злиття вектора rNDV, який експресує білок НА НРАІ Н7 (А) Схематичне представлення кДНКконструкції rNDV/F3aa-chimericH7 із представленими послідовностями GE/GS, Коzак і частковою послідовністю НА Н7 (SEQ ID NO: 36). (В) Порівняння кінетик росту вірусів, Log TCID проти часу після інокуляції (год). Квадрат, rNDV/B1; трикутник rNDV/F3aa; виділена жирним зірочка rNDV/B1-Н7; зірочка rNDV/F3aa-chimericH7. (C) Експресія білка НА Н7 дикого типу або химерного білка НА Н7 у клітинах, інфікованих rNDV. Лінія 1: хибно інфіковані; лінія 2: rNDV/F3aa; лінія 3: rNDV/B1-H7; лінія 4: rNDV/F3aa-chimericH7. Ряд 1: Н7 -пташиного грипу; ряд 2: -NDV. (D) Вбудовування химерного білка НА Н7 у віріони rNDV збільшено в порівнянні з вбудовуванням білка НА Н7 дикого типу. Лінія 1: rNDV/B1-H7; лінія 2: rNDV/F3aa-chimericH7. Ряд 1: Н7 -пташиного грипу; ряд 2: -NDV. 5. Докладний опис винаходу Даний винахід належить до химерних вірусів, що містять негативну нитку РНК, сконструйованих з метою експресії злитих білків, що вбудовуються у віріон, до способів одержання таких химерних вірусів і застосування таких вірусів, наприклад, як імуногенів, в імуногенних композиціях або у in vitro аналізах. Химерні віруси за даним винаходом характеризуються наявністю на поверхні віріону не тільки антигенів, зв'язаних з вірусом, але також злитого білка. 96140 32 Віруси, що можуть бути сконструйовані відповідно до способів за даним винаходом, можуть являти собою будь-який покритий оболонкою вірус. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу віруси, що можуть бути сконструйовані відповідно до способів за даним винаходом, можуть бути сегментованими або несегментованими геномами, однонитковими або двонитковими геному і експресувать принаймні один основний глікопротеїн (наприклад, NA, НА, HN або F), який включається в оболонку вірусу. Віруси, які використовуються відповідно до способів за даним винаходом, можуть бути вибрані з природних штамів, варіантів або мутантів; підданих мутагенезу вірусів (наприклад, за допомогою впливу УФопроміненням, мутагенів і/або пасирування); гібридних вірусів, що містять частини геномів двох різних вірусів (для вірусів із сегментованими геномами); і/або генетично сконструйованих вірусів. Наприклад, мутантні віруси можна одержати за допомогою природної мінливості, впливу УФопроміненням, впливу хімічними мутагенами, за допомогою пасирування в не факультативних хазяях, за допомогою формування гібридних вірусів, що містять частини геномів двох різних вірусів (тобто за допомогою коінфікування атенюйованого сегментованого вірусу з іншим штамом, що має бажані антигени) і/або за допомогою генної інженерії (наприклад, з використанням «зворотної генетики»). Необмежувальні приклади вірусів із сегментованими геномами, які використовуються відповідно до способів за даним винаходом, містять віруси сімейства Orthomyxoviridae (наприклад, віруси грипу), Bunyaviridae (наприклад, Bunyamwera), Reoviridae і Arenaviridae (наприклад, вірус лихоманки Ласса). Необмежувальні приклади вірусів з несегментованими геномами, які використовуються відповідно до способів за даним винаходом, містять віруси сімейства Coronaviridae (наприклад, коронавірус людини (SARS)), Hepadnaviridae (наприклад, вірус гепатиту А, В або С), Herpesviridae (наприклад, вірус простого герпеса), Poxviridae (наприклад, вірус натуральної віспи), Rhabdoviridae (наприклад, вірус везикулярного стоматиту (VSV), вірус Сендай і вірус сказу), Paramyxoviridae (наприклад, вірус кору і респіраторно-синцитіальний вірус) і Filoviridae (наприклад, віруси Марбург і Ебола). У певних варіантах здійснення даного винаходу сегментованим вірусом є вірус грипу. В інших варіантах здійснення даного винаходу несегментованим вірусом є NDV. У певних варіантах здійснення даного винаходу віруси, які вибираються для застосування в даному винаході, є атенюйованими і/або мають брак антагоністичної відносно IFN активності, тобто вони є інфекційними і можуть реплікуватися in vivo, але дають лише низькі титри, що приводять до субклінічних рівнів інфекції, що не є патогенними. Такі віруси можна атенуювати будь-яким способом, відомим у даній галузі і/або приведених як приклад у даному описі, наприклад, створенням вірусу, що містить мутацію в гені NS1 або містить модифікацію в амінокислотній послідовності з множиною основних амінокислот перед сайтом розщеплення в білку НА. Такі атенюйовані віруси, 33 розроблені відповідно до даного винаходу, є, отже, ідеальними кандидатами для імуногенних композицій, наприклад, живих противірусних вакцин. При введенні індивіду атенюйовані химерні віруси за даним винаходом здатні викликати імунну відповідь і індукувати імунітет як до вірусу, так і до неприродного або злитого білка. У деяких варіантах здійснення даного винаходу неприродний білок походить з патогену. На додаток, введення індивіду такого химерного вірусу викликає імунну відповідь і/або імунітет до зазначеного патогенну, крім вірусу. Даний винахід також належить до застосування химерного вірусу за даним винаходом в композиціях (наприклад, імуногенних композиціях) для людей або тварин (наприклад, птахів). Зокрема, химерні віруси, що є атенюйованими, можна використовувати як вакцини проти широкого ряду вірусів і/або захворювань. Оскільки химерний вірус конструюється для експресії гетерологічних генних послідовностей як чужорідних епітопів у вірioні, композиції, що містять химерний вірус за даним винаходом, (наприклад, композиції вакцин) можуть бути призначені для імунізації проти множини штамових варіантів, різних вірусів або проти зовсім різних інфекційних агентів або пов'язаних із захворюванням антигенів (наприклад, бактерій, паразитів, грибів або специфічних відносно пухлин антигенів), з яких походять гетерологічні генні послідовності. Можна використовувати велике число різних способів введення композицій живих атенюйованих вірусів індивіду, що є людиною або твариною, для індукування імунної відповіді або відповіді, у який втягнені відповідні цитокіни. До них належать, але ними не обмежуються, інтраназальний, інтратрахіальний, пероральний, інтрадермальний, внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний і підшкірний способи. 5.1. Химерні віруси грипу 5.1.1. Химерний вірус пташиного грипу, що містить злитий білок, який вбудовується в його віріон Даний винахід належить до конструювання такого вірусу пташиного грипу, коли злитий білок кодується геномом і при його експресії вбудовується у віріон. Можна вибрати і використовувати відповідно до даного винаходу будь-який тип, підтип або штам вірусу пташиного грипу, який можна сконструювати для експресії і вбудовування злитого білка у віріон пташиного грипу, у тому числі, але ними не обмежуючи, природні штами, варіанти або мутанти, піддані мутагенезу віруси, гібридні віруси, що містять частини геномів двох різних вірусів, і/або генетично сконструйованих вірусів. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу віруси пташиного грипу за даним винаходом являють собою неприродні віруси. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу віруси пташиного грипу за даним винаходом представляють генетично сконструйовані віруси. Необмежувальні приклади вірусів пташиного грипу містять підтипи H5N1, H6N2, H7N3, H9N2 і H10N7 віруси грипу А. Для генетичного маніпулювання вірусом грипу потрібно сконструювати принаймні один з восьми сегментів вірусної РНК, що складають вірусний геном. Мутагенез геному можна одержати завдяки 96140 34 методам «зворотного конструювання» (дивися розділ 5.4). Однак гнучкість геному вірусу грипу обмежена як числом сегментів, так і довжиною сегментів, які можна стабільно інтегрувати у вірус. Загальна стабільність довгих вставок невідома, і сегменти, що містять такі вставки, або їхні частини, можуть бути загублені завдяки утворенню гібридних вірусів, що містять частини геномів двох різних вірусів, через декілька поколінь. Таким чином, у переважному варіанті здійснення даного винаходу вірус пташиного грипу конструюють таким чином, що один з його основних поверхневих білків заміщається злитим білком. Відповідно, даний винахід належить до химерного вірусу пташиного грипу, що містить принаймні один злитий білок, що включає ектодомен (ED) білка інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, і цитоплазматичний (СТ) і трансмембранні (ТМ) домени або трансмембранний (ТМ) домен принаймні одного основного глікопротеїну вірусу грипу, причому принаймні один злитий білок функціонально заміщує принаймні один основний глікопротеїн вірусу пташиного грипу. Іншими словами, вірус пташиного грипу служить як «основа», яку конструюють для експресії і вбудовування в її віріон злитого білка замість основного глікопротеїну вірусу грипу. Вбудовування ТМ і СТ доменів або ТМ домена глікопротеїну вірусу грипу, що відповідає основному глікопротеїну вірусу пташиного грипу, який функціонально заміщається злитим білком, уможливлює вбудовування злитого білка у віріон вірусу пташиного грипу. ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка можуть відповідати або походити з будь-якого вірусу грипу, який дозволяє вбудовувати злитий білок у віріон вірусу пташиного грипу, який використовується як основа. У певних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або ТМ домену типу, підтипу або штаму вірусу пташиного грипу, відмінного від вірусу пташиного грипу, який використовується як основа. В інших варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або ТМ домену вірусу грипу, відмінного від вірусу пташиного грипу. В інших варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або ТМ домену вірусу пташиного грипу, який використовується як основа. Віріон вірусу пташиного грипу містить два основних поверхневих глікопротеїни, гемаглютинін (НА) і нейрамінідазу (NA), кожний з яких містить цитоплазматичний домен, трансмембранний домен і ектодомен. Відповідно, у певних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або білка НА, або білка NA вірусу грипу. Оскільки СТ домен НА або NA може не вимагатися для вбудовування злитого білка у віріон вірусу пташиного грипу, то в деяких варіантах здійснення даного винаходу злитий білок конструюють таким чином, що він містить тільки ТМ домен НА або NA. Наприклад, показано, що СТ домен NA не потрібний для правильного упаковування цього білка в оболонки вірусу грипу 35 A (Garcia-Sastre et al., 1995, Virus Res. 37:37-47, який включений як посилання в повному об'ємі). Отже, якщо при створенні злитого білка використовуються структурні домени, що відповідають доменам білка NA, той даний винахід належить до конструювання злитого білка, що містить тільки ТМ домен, який відповідає білку NA вірусу грипу. Відповідно, в одному з варіантів здійснення даного винаходу конструюють злитий білок, що містить тільки ТМ домен, який відповідає ТМ домену білка NA вірусу грипу. ТМ і СТ домени білків НА і NA вірусу грипу структурно відрізняються тим, що домени знаходяться на С-кінці білка НА і на N-кінці білка NA. Крім різної орієнтації двох доменів у кожному класі поверхневого глікопротеїну ТМ і СТ структурні домени можуть включати ще невідомі розходження у функціональні групи, які залежать від їх відносного розташування в межах поліпептидного ланцюга. Тому при конструюванні злитого білка у вірусі пташиного грипу орієнтація ектодомену інфекційного агента, що зливається з ТМ і СТ доменами або ТМ доменом глікопротеїну вірусу грипу, буде визначатися вибором ТМ і СТ доменів або ТМ домену. Наприклад, якщо ектодомен інфекційного агента прикріплюється N-кінцем, то можна використовувати ТМ і СТ домени білка NA вірусу грипу. НА і NA виявляють конкуруючу активність відносно злиття з клітиною і вивільнення з клітини, відповідно, які необхідні для інфективності і розмноження вірусу. НА зв'язується з Nацетилнейраміновою кислотою (NeuNAc; сіаловою кислотою) на поверхні клітини, що приводить до поглинання вірусу клітиною-хазяїном, у той час як NA відщеплює складові сіалової кислоти з поверхні клітини, що приводить до вивільнення потомства вірусу з інфікованої клітини. Порушення будьякого з цих двох видів активності приводить до нефункционального вірусу. Відповідно, для збереження компетентності вірусу при заміщенні поверхневого глікопротеїну його функція в химерному вірусі повинна забезпечуватися злитим білком. В одному з варіантів здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу включає злитий білок, що виявляє нейрамінідазну активність. В іншому варіанті здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу містить злитий білок, що виявляє активність зв'язування з рецептором. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу містить два злитих білки, один із яких виявляє нейрамінідазну активність, а інший - активність зв'язування з рецептором. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу містить злитий білок, що містить епітоп гетерологічного інфекційного агента, при цьому злитий білок виявляє нейрамінідазну активність або активність зв'язування з рецептором. В іншому варіанті здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу містить злитий білок, що виявляє активність зв'язування з рецептором. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу містить поверхневий білок, що містить ектодомен білка HN вірусу псевдочуми птахів (NDV) і ТМ і СТ домени білка NA вірусу грипу 96140 36 A/WSN/33, при цьому ектодомен HN виявляє нейрамінідазну активність. В інших варіантах здійснення даного винаходу химерний вірус пташиного грипу містить поверхневий білок, що містить ектодомен білка НА гетерологічного вірусу грипу (наприклад, білка НА Н7 або білка НА Н9). НА і NA кодуються окремими сегментами вірусного геному, і заміна всієї кодуючої області природного білка усуває більшість обмежень довжини послідовності, що кодує вбудований білок. У певних варіантах здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен плюс 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків(у) ектодомену основного глікопротеїну вірусу грипу. Наприклад, у конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен білка NA вірусу грипу, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків(у) ектодомену білка NA вірусу грипу і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може заміщати функцію білка NA. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить цитоплазматичний і трансмембранний домени білка NA вірусу грипу, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 залишків(у) ектодомену білка NA вірусу грипу, які безпосередньо прилягають до трансмембранного домену білка NA вірусу грипу, і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може функціонально замістити білок NA. В іншому варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен або цитоплазматичний і трансмембранний домени білка NA, повний домен ніжки, або його фрагмент, білка NA, який передує його глобулярній головці, і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може функціонально замістити білок NA. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен білка НА вірусу грипу, 1-15, 1-10, 15, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків(у) ектодомену білка НА вірусу грипу і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може функціонально замістити білок НА. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить цитоплазматичний і трансмембранний домени білка НА вірусу грипу, 1-15, 1-10, 15, 1-3, 2 або 1 залишків(у) ектодомену білка НА вірусу грипу, які безпосередньо прилягають до трансмембранного домену білка НА вірусу грипу, і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може функціонально замістити білок НА. У певних варіантах здійснення даного винаходу принаймні один злитий білок химерного вірусу пташиного грипу за даним винаходом не містить повнорозмірний ектодомен гетерологічного білка (наприклад, містить антигенний фрагмент ектодомену білка гетерологічного інфекційного агента) і може містити або може не містити, крім того, один або декілька фрагментів ектодомену природного основного глікопротеїну. Відповідно, у певних ва 37 ріантах здійснення даного винаходу ектодомен злитого білка може містити фрагмент ектодомен білка гетерологічного інфекційного агента. В інших варіантах здійснення даного винаходу ектодомен злитого білка може містити фрагменти і природного основного глікопротеїну, і білка гетерологічного інфекційного агента. У варіантах здійснення даного винаходу, у яких злитий білок заміщує основний поверхневий глікопротеїн, функцію поверхневого глікопротеїну повинен забезпечувати злитий білок, тобто злитий білок повинен виявляти функціональність поверхневого глікопротеїну, який він заміщує. Даний винахід належить до нуклеотидних послідовностей (тобто рекомбінантних сегментів), що кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.1. У переважних варіантах здійснення даного винаходу рекомбінантні сегменти, що містять нуклеїнові кислоти, які кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.1, містять 3' і 5' сигнали вбудовування, які необхідні для правильної реплікації, транскрипції й упакування вірусної РНК (Fujii et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 2002-2007; Zheng et al., 1996, Virology 217:242-251, кожний з яких включені в опис як посилання в повному об'ємі). У переважному варіанті здійснення даного винаходу в рекомбінантних сегментах за даним винаходом, отже, використовуються 3' і 5' некодуючі і/або нетрансльовані послідовності сегментів вірусів усередині того самого типу або штаму вірусу, що і використовуваний як основа вірус пташиного грипу. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу рекомбінантні сегменти містять нуклеїнові кислоти, що кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.1, що містять 3' некодуючу область РНК ΝΑ вірусу грипу, кодуючу ΝΑ область, що відповідає СТ і ТМ доменам білка ΝΑ, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 і 1 залишків (залишок) ектодомену білка ΝΑ вірусу грипу, які безпосередньо прилягають до трансмембранного домену білка ΝΑ вірусу грипу, нетрансльовані області рамки зчитування білка ΝΑ і 5' некодуючу область вірусної РНК ΝΑ. Як альтернативу заміщенню білків ΝΑ або НА вірусу пташиного грипу для одержання химерного вірусу грипу, що містить ектодомен, або його фрагмент, білка інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, і ТМ і/або СТ домени вірусу грипу, можна використовувати «зворотну генетику» і біцистронні методи. Дивися, наприклад, патент США № 6887699, патент США № 6001634, патент США № 5854037 і патент США № 5820871, кожний з який, таким чином, включений як посилання в повному об'ємі. Біцистронні підходи містять вбудовування кодуючої області, злитого білка у відкриту рамку зчитування необхідного білка вірусу і його стоп-кодону. Вставка фланкується IRES і будьякими нетрансльованими сигнальними послідовностями необхідного білка, у який вона вбудовується, і не повинна порушувати відкриту рамку зчитування, сигнал упакування, поліаденілювання або промотори транскрипції необхідного вірусного білка. Будь-які IRES, добре відомі в даній галузі або описані в даному винаході, можна використовувати відповідно до даного винаходу (наприклад, IRES гена ВiР, нуклеотиди 372-592 НUМGRР78 96140 38 даних, введених у базу даних GenBank; або IRES вірусу енцефаломіокардиту (EMCV), нуклеотиди 1430-2115 СQ867238-даних, введених у базу даних GenBank). Оскільки при біцистронному підході функція НА або NA не заміщається, то частина ектодомену злитого білка не обмежується білком, що забезпечує функцію білка НА або NA, що заміщається. Ектодомен такого злитого білка може відповідати будь-якій гетерологічній молекулі або включати фрагмент будь-якої гетерологічної молекули, що містить, але ними не обмежуються, антигени, пов'язані з захворюванням антигени й антигени будь-якого білка інфекційного агента (наприклад, будь-якого проективного антигену, пов'язаного з вірусними, бактеріальними або паразитарними інфекційними агентами). Необмежувальні приклади антигенів, інформаційних агентів або зв'язаних з ними, для застосування відповідно до способів за даним винаходом представлені в розділі 5.3 нижче. Заміщення необхідного поверхневого білка вірусу-основи або введення рекомбінантного сегменту у вірусний геном може атенуювати одержуваний у результаті химерний вірус, тобто химерний вірус буде виявляти знижену реплікацію відносного дикого типу. У певних варіантах здійснення даного винаходу бажана атенуація химерного вірусу, так що химерний вірус залишається, принаймні частково, інфекційним і може реплікуватися in vivo, але тільки утворює низькі титри, що приводить до субклінічних рівнів інфекції, що не є патогенними. Такі атенюйовані химерні віруси особливо ефективні для таких варіантів здійснення даного винаходу, у яких вірус вводять індивіду для дії як імуногену, наприклад, для живої вакцини. Віруси можна атенуювати будь-яким способом, відомим у даній галузі і/або приведеного як приклад, наприклад, розробки вірусу, що містить мутацію в гені NS1 або містить модифікацію в амінокислотній послідовності з множиною основних амінокислот перед сайтом розщеплення в білку НА (дивися патент США № 6468544; патент США № 6669943; Li et al., 1999, J. Infect. Dis. 179: 1132-1138, кожний з який, таким чином, включений як посилання в повному об'ємі). В одному з варіантів здійснення даного винаходу атенюйований химерний вірус пташиного грипу за даним винаходом включає геном, що містить мутацію в гені NS1 вірусу пташиного грипу, який використовується як основа, що, як відомо, в інших вірусах грипу зменшує здатність продукту гена NS1 служити антагоністом відповіді, у який втягнений клітинний інтерферон. В іншому варіанті здійснення даного винаходу атенюйований химерний вірус пташиного грипу за даним винаходом включає геном, що містить мутацію в гені НА вірусу пташиного грипу, який використовується як основа, що, як відомо, в інших вірусах грипу зменшує здатність клітинних протеаз розщеплювати білок у її активну форму і, таким чином, зменшує або виключає індуковане НА злиття і інфективність. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу атенюйований химерний вірус пташиного грипу за даним винаходом включає геном, що містить мутацію як у гені НА, так і в гені NS1 вірусу пташино 39 го грипу, який використовується як основа, що, як відомо, в інших вірусах грипу зменшують вірусну активність або окремо, або при об'єднанні. Титри атенюйованих химерних вірусів пташиного грипу і вірусів пташиного грипу дикого типу можна визначити за допомогою будь-якого методу, добре відомого в даній галузі або описаного в даному описі (наприклад, аналізів гемаглютинації, аналізу бляшкоутворення, інфекційних доз для яйця (EID50), інфекційних доз для культури тканин (TCID50) і т. п.), і віруси можна розмножити в умовах, описаних у даному описі або добре відомих у даній галузі (наприклад, у клітинах CEF, клітинах MDCK (наприклад, у MEM, 10% об'єм/об'єм фетальної телячої сироватки (FCS), 1% пеніцилін/стрептоміцин при 37°С в інкубаторі з 5% СО2 і зволоженням) або курячих яйцях з ембріонами (наприклад, у стаціонарному інкубаторі при 37°С с 55% відносною вологістю). Альтернативно, віруси можна розмножити в клітинах (наприклад, клітинах CEF, клітинах MDCK і т. п.), що вирощують у безсироваткованому середовищі або середовищі зі зменшеним вмістом сироватки (наприклад, ТРСК трипсин). 5.1.2. Химерний атенюйований вірус грипу, що містить злитий білок, вбудований у його віріон Даний винахід належить до конструювання атенюйованого вірусу грипу, у якого злитий білок кодується геномом і при експресії вбудовується у віріон. Іншими словами даний винахід належить до застосування атенюйованого вірусу грипу (батьківського вірусу) як «основи», яку конструюють для експресії і вбудовування в його віріон злитого білка. Як «основа», яку конструюють для експресії і вбудовування у вірусний віріон злитого білка, можна використовувати будь-який тип або штам атенюйованого вірусу грипу, що містить, але ними не обмежувані, природні штами, варіанти або мутанти, піддані мутагенезу віруси; гібридні віруси, що містять частини геномів двох різних вірусів, і/або генетично модифіковані віруси. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу батьківські віруси грипу, які використовуються відповідно до даного винаходу, не є природними вірусами. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу батьківські віруси грипу, які використовуються відповідно до даного винаходу, є генетично сконструйованими вірусами. Віруси грипу, які використовуються як основа за даним винаходом, можуть природним чином мати атенюйований фенотип, або їх можна сконструювати з вбудовуванням зв'язаної з атенюйованим фенотипом мутації, відомої в даній галузі або описаної в даному описі (наприклад, мутації у вірусному білку NS1 або вірусному білку НА). У конкретних варіантах здійснення даного винаходу атенюйованим вірусом є вірус грипу А. В інших варіантах здійснення даного винаходу атенюйованим вірусом є вірус грипу В. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу атенюйованим вірусом є вірус грипу С. Необмежувальні приклади вірусів грипу, які можна сконструювати відповідно до даного винаходу, містять підтип H10N4, підтип H10N5, підтип H10N7, підтип H10N8, підтип H10N9, підтип H11N1, підтип H11N13, підтип H11N2, підтип H11N4, підтип H11N6, підтип 96140 40 H11N8, підтип H11N9, підтип H12N1, підтип H12N4, підтип H12N5, підтип H12N8, підтип H13N2, підтип H13N3, підтип H13N6, підтип H13N7, підтип H14N5, підтип H14N6, підтип H15N8, підтип H15N9, підтип H16N3, підтип Н1N1, підтип H1N2, підтип H1N3, підтип НІN6, підтип Н1N9, підтип H2N1, підтип H2N2, підтип H2N3, підтип H2N5, підтип H2N7, підтип H2N8, підтип H2N9, підтип H3N1, підтип H3N2, підтип H3N3, підтип H3N4, підтип H3N5, підтип H3N6, підтип H3N8, підтип H3N9, підтип H4N1, підтип H4N2, підтип H4N3, підтип H4N4, підтип H4N5, підтип H4N6, підтип H4N8, підтип H4N9, підтип H5N1, підтип H5N2, підтип H5N3, підтип H5N4, підтип H5N6, підтип H5N7, підтип H5N8, підтип H5N9, підтип H6N1, підтип H6N2, підтип H6N3, підтип H6N4, підтип H6N5, підтип H6N6, підтип H6N7, підтип H6N8, підтип H6N9, підтип H7N1, підтип H7N2, підтип H7N3, підтип H7N4, підтип H7N5, підтип H7N7, підтип H7N8, підтип H7N9, підтип H8N4, підтип H8N5, підтип H9N1, підтип H9N2, підтип H9N3, підтип H9N5, підтип H9N6, підтип H9N7, підтип H9N8 або підтип H9N9 вірусу грипу А; штам Aichi/5/88, штам Akita/27/2001, штам Akita/5/2001, штам Alaska/16/2000, штам Alaska/1777/2005, штам Argentina/69/2001, штам Arizona/146/2005, штам Arisona/148/2005, штам Bangkok/163/90, штам Bangkok/34/99, штам Bangkok/460/03, штам Bangkok/54/99, штам Barcelona/215/03, штам Beijing/15/84, штам Beijing/184/93, штам Beijing/243/97, штам Beijing/43/75, штам Beijing/5/76, штам Beijing/76/98, штам Вelgium/WV106/2002, штам Вelgium/WV107/2002, штам Belgium/WV109/2002, штам Belgium/WV114/2002, штам Belgium/WV122/2002, штам Bonn/43, штам Brazil/952/2001, штам Bucharest/795/03, штам Buenos Aires/161/00, штам Buenos Aires/9/95, штам Buenos Aires/SW16/97, штам Buenos Aires/VL518/99, штам Canada/464/2001, штам Canada/464/2002, штам Chaco/366/00, штам Chaco/R113/00, штам Cheju/303/03, штам Chiba/447/98, штам Chongqing/3/2000, штам - клінічний ізолят SA1 Thailand/2002, штам - клінічний ізолят SA10 Thailand/2002, штам - клінічний ізолят SA100 Philippines/2002, штам - клінічний ізолят SA101 Philippines/2002, штам - клінічний ізолят SA110 Philippines/2002, штам - клінічний ізолят SA112 Philippines/2002, штам - клінічний ізолят SA113 Philippines/2002, штам - клінічний ізолят SA114 Philippines/2002, штам - клінічний ізолят SA2 Thailand/2002, штам - клінічний ізолят SA20 Thailand/2002, штам - клінічний ізолят SA38 Philippines/2002, штам - клінічний ізолят SA39 Thailand/2002, штам - клінічний ізолят SA99 Philippines/2002, штам CNIC/27/2001, штам Colorado/2597/2004, штам Cordoba/VA418/99, штам Czechoslovakia/16/89, штам Czechoslovakia/69/909, штам Daeku/10/97, штам Daeku/45/97, штам Daeku/47/97, штам Daeku/9/97, штам B/Du/4/78, штам B/Durban/39/98, штам B/Durban/43/98, штам B/Durban/44/98, штам B/Durban/52/98, штам Durban/55/98, штам Durban/56/98, штам England/1716/2005, штам England/2054/2005, штам England/23/04, штам 41 Finland/154/2002, штам Finland/159/2002, штам Finland/160/2002, штам Finland/161/2002, штам Finland/162/03, штам Finland/162/2002, штам Finland/162/91, штам Finland/164/2003, штам Finland/172/91, штам Finland/173/2003, штам Finland/176/2003, штам Finland/184/91, штам Finland/188/2003, штам Finland/190/2003, штам Finland/220/2003, штам Finland/WV5/2002, штам Fujian/36/82, штам Geneva/5079/03, штам Genoa/11/02, штам Genoa/2/02, штам Genoa/21/02, штам Genova/54/02, штам Genova/55/02, штам Guangdong/05/94, штам Guangdong/08/93, штам Guangdong/5/94, штам Guangdong/55/89, штам Guangdong/8/93, штам Guangzhou/7/97, штам Guangzhou/86/92, штам Guangzhou/87/92, штам Gyeonggi/592/2005, штам Hannover/2/90, штам Harbin/07/94, штам Hawaii/10/2001, штам Hawaii/1990/2004, штам Hawaii/38/2001, штам Hawaii/9/2001, штам Hebei/19/94, штам Hebei/3/94, штам Henan/22/97, штам Hiroshima/23/2001, штам Hong Kong/110/99, штам Hong Kong/1115/2002, штам Hong Kong/112/2001, штам Hong Kong/123/2001, штам Hong Kong/1351/2002, штам Hong Kong/1434/2002, штам Hong Kong/147/99, штам Hong Kong/156/99, штам Hong Kong/157/99, штам Hong Kong/22/2001, штам Hong Kong/22/89, штам Hong Kong/336/2001, штам Hong Kong/666/2001, штам Hong Kong/9/89, штам Houston/1/91, штам Houston/1/96, штам Houston/2/96, штам Hunan/4/72, штам Ibaraki/2/85, штам Ncheon/297/2005, штам India/3/89, штам India/77276/2001, штам Israel/95/03, штам Israel/WV187/2002, штам Japan/1224/2005, штам Jiangsu/10/03, штам Johannesburg/1/99, штам Johannesburg/96/01, штам Kadoma/1076/99, штам Kadoma/122/99, штам Kagoshima/15/94, штам Kansas/22992/99, штам Khazkov/224/91, штам Kobe/1/2002, штам Kouchi/193/99, штам Lazio/1/02, штам Lee/40, штам Leningrad/129/91, штам Lissabon/2/90, штам Los Angeles/1/02, штам Lusaka/270/99, штам Lyon/1271/96, штам Malaysia/83077/2001, штам Maputo/1/99, штам Mar del Plata/595/99, штам Maryland/1/01, штам Memphis/1/01, штам Memphis/12/97-MA, штам Michigan/22572/99, штам Міе/1/93, штам Milano/1/01, штам Minsk/318/90, штам Moscow/3/03, штам Nagoya/20/99, штам Nanchang/1/00, штам Nashville/107/93, штам Nashville/45/91, штам Nebraska/2/01, штам Netherland/801/90, штам Netherland/429/98, штам New York/1/2002, штам NIB/48/90, штам Ningxia/45/83, штам Norway/1/84, штам Oman/16299/2001, штам Osaka/1059/97, штам Osaka/983/97-V2, штам Oslo/1329/2002, штам Oslo/1846/2002, штам Panama/45/90, штам Paris/329/90, штам Parma/23/02, штам Perth/211/2001, штам Peru/1364/2004, штам Philippines/5072/2001, штам Pusan/270/99, штам Quebec/173/98, штам Quebec/465/98, штам Quebec/7/01, штам Roma/1/03, штам Saga/S172/99, штам Seoul/13/95, штам Seoul/37/91, штам Shangdong/7/97, штам Shanghai/361/2002, штам Shiga/T30/98, штам Sichuan/379/99, штам Singapore/222/79, штам Spain/WV27/2002, штам Stockholm/10/90, штам Switzerland/5441/90, штам 96140 42 Taiwan/0409/00, штам Taiwan/0722/02, штам Taiwan/97271/2001, штам Tehran/80/02, штам Tokyo/6/98, штам Trieste/28/02, штам Ulan Ude/4/02, штам United Kingdom/34304/99, штам USSR/100/83, штам Victoria/103/89, штам Vienna/1/99, штам Wuhan/356/2000, штам WV194/2002, штам Xuanwu/23/82, штам Yamagata/1311/2003, штам Yamagata/K500/2001, штам Alaska/12/96, штам GA/86, штам NAGASAKI/1/87, штам Tokyo/942/96 або штам Rochester/02/2001 вірусу грипу В; штам Aichi/1/81, штам Arm Arbor/1/50, штам Aomori/74, штам California/78, штам England/83, штам Greece/79, штам Hiroshima/246/2000, штам Hiroshima/252/2000, штам Hyogo/1/83, штам Johannesburg/66, штам Kanagawa/1/76, штам Kyoto/1/79, штам Mississippi/80, штам Miyagi/1/97, штам Miyagi/5/2000, штам Miyagi/9/96, штам Nara/2/85, штам New Jersey/76, штам Pig/Beijing/115/81, штам Saitama/3/2000, штам Shizuoka/79, штам Yamagata/2/98, штам Yamagata/6/2000, штам Yamagata/9/96, штам BERLIN/1/85, штам ENGLAND/892/8, штам GREAT LAKES/1167/54, штам JJ/50, штам PIG/BEIJING/10/81, штам PIG/BEIJING/439/82, штам TAYLOR/1233/47 або штам C/YAMAGATA/10/81 вірусу грипу С. В одному з варіантів здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу (батьківський вірус), який використовується відповідно до даного винаходу, має знижену здатність служити антагоністом клітинного інтерферону (IFN). У конкретному варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус (батьківський вірус), який використовується відповідно до даного винаходу, є типом або штамом вірусу грипу, що містить мутацію в гені NS1, що приводить до зниження здатності вірусу служити антагоністом відповіді, у яку втягнений клітинний інтерферон. Приклади типів мутацій, що можуть бути вбудовані в ген NS1 вірусу грипу, містять делеції, заміни, вставки і їхні комбінації. Одну або декілька мутацій можна ввести де-небудь у гені NS1 (наприклад, N-кінці, С-кінці або де-небудь між цими кінцями) і/або в регуляторному елементі гена NS1. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу (батьківський вірус), який використовується відповідно до даного винаходу, включає геном, що має ген NS1 вірусу грипу з мутацією на N-кінці. В іншому варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу (батьківський вірус) включає геном, що має ген NS1 вірусу грипу з мутацією на С-кінці. В іншому варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу (батьківський вірус), який використовується відповідно до даного винаходу, включає геном, що має мутацію в гені NS1 вірусу грипу, що приводить до делеції, яка складається з 5, переважно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 або 175 амінокислотних залишків із С-кінця NS1 або делеції між 5-170, 25170, 100-170, 100-160, або 105-160 амінокислотними залишками з С-кінця. В іншому варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу 43 (батьківський вірус), який використовується відповідно до даного винаходу, включає геном, що містить мутацію в гені NS1 вірусу грипу, що приводить до делеції всіх амінокислотних залишків за винятком амінокислотних залишків 1-126, амінокислотних залишків 1-120, амінокислотних залишків 1-115, амінокислотних залишків 1-110, амінокислотних залишків 1-100, амінокислотних залишків 199, амінокислотних залишків 1-95, амінокислотних залишків 1-85, амінокислотних залишків 1-80, амінокислотних залишків 1-75, амінокислотних залишків 1-73, амінокислотних залишків 1-70, амінокислотних залишків 1-65, амінокислотних залишків 160, причому N-кінцева амінокислота відповідає номеру 1. В одному з варіантів здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу за даним винаходом містить геном, що містить мутацію в гені NS1 вірусу грипу, який використовується як основа, що зменшує здатність продукту гена NS1 служити антагоністом відповіді, у яку втягнений клітинний інтерферон, і дозволяє при множинності зараження (MOI) між 0,0005 і 0,001, 0,001 і 0,01, 0,01 і 0,1 або 0,1 і 1 або MOI, що складає 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 або 6,0 атенюйованому вірусу рости до титрів, більш низьких від приблизно 1 до приблизно 100 разів, від приблизно 5 до приблизно 80 разів, від приблизно 20 до приблизно 80 або разів від приблизно 40 до приблизно 80 разів, від приблизно 1 до приблизно 10 разів, від приблизно 1 до приблизно 5 разів, від приблизно 1 до приблизно 4 разів, від приблизно 1 до приблизно 3 разів, від приблизно 1 до приблизно 2 або разів приблизно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 разів у порівнянні з титрами вірусу грипу дикого типу, у клітинах (наприклад, клітинах, що походять від людини, миші, щура, свині, собаки, коня або птаха (наприклад, НЕр-2, А549, 293Т, клітинах нирки собаки Madin-Darby (MDCK) або фібробластах курячих ембріонів (CEF)), що визначається через приблизно 2-10 днів, 3-7 днів, 3-5 або днів 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 днів після інфікування при розмноженні в тих самих умовах. Титри атенюйованих вірусів грипу і вірусів грипу дикого типу можна визначити з використанням будь-якого методу, добре відомого в даній галузі або описаного в даному описі (наприклад, аналізів гемаглютинації, аналізу бляшкоутворення, інфекційних доз для яйця (EID50), інфекційних доз для культури тканин (TCID50) і т. п.), і віруси можна розмножити в умовах, описаних у даному описі або добре відомих у даній галузі (наприклад, у клітинах CEF, клітинах MDCK (наприклад, у MEM, 10% об'єм/об'єм фетальної телячої сироватки (FCS), 1% пеніцилін/стрептоміцин при 37°С в термостаті з 5% СО2 і зволоженням) або в курячих яйцях з ембріонами (наприклад, у стаціонарному термостаті при 37°С з 55% відносною вологістю). Альтернативно, віруси можна розмножити в клітинах (наприклад, клітинах CEF, клітинах MDCK і т. п.), що вирощують у безсироваткованому середовищі або середовищі зі зменшеним вмістом сироватки (наприклад, ТРСК трипсин). 96140 44 В іншому варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу (батьківський вірус), який використовується відповідно до даного винаходу, включає геном, що містить мутацію в гені НА вірусу грипу, який використовується як основа, що зменшує або виключає здатність клітинних протеаз розщеплювати білок у його активну форму. Приклади типів мутацій, які можна ввести в ген НА вірусу грипу, містять делеції, заміни, вставки або їхні комбінації. Одну або декілька мутацій, переважно, вводять у сайт розщеплення НА (наприклад, нуклеотиди 1013-1039 AY818135-даних, введених у базу даних GenBank). Як правило, мутації, що зменшують розщеплюваність білка НА, яка визначається за допомогою стандартних способів у CEF, корелюють зі зниженням вірулентності в in vivo аналізах (Horimoto and Kawaoka, 1994, 68: 3120-3128; який у такий спосіб цілком включений у даний опис як посилання). У конкретному варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу (батьківський вірус), який використовується відповідно до даного винаходу, включає геном, що має мутацію в гені НА вірусу грипу, що приводить до заміни нуклеотидів 1026-1038 єдиним нуклеотидом з основою у вигляді тиміну. В іншому варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу за даним винаходом включає геном, що містить мутацію в гені НА вірусу грипу, який використовується як основа, що зменшує або виключає здатність клітинних протеаз розщеплювати білок у його активну форму і дозволяє при множинності зараження (MOI) між 0,0005 і 0,001, 0,001 і 0,01, 0,01 і 0,1 або 0,1 і 1 або MOI, що складає 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 або 6,0 атенюйованому вірусу рости до титрів, більш низьких від приблизно 1 до приблизно 100 разів, від приблизно 5 до приблизно 80 разів, від приблизно 20 до приблизно 80 або разів від приблизно 40 до приблизно 80 разів, від приблизно 1 до приблизно 10 разів, від приблизно 1 до приблизно 5 разів, від приблизно 1 до приблизно 4 разів, від приблизно 1 до приблизно 3 разів, від приблизно 1 до приблизно 2 або разів приблизно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 разів у порівнянні з титрами вірусу грипу дикого типу, у клітинах (наприклад, клітинах, що походять від людини, миші, щура, свині, собаки, коней або птаха (наприклад, НЕр-2, А549, 293Т, клітинах нирки собаки Madin-Darby (MDCK) або фібробластах курячих ембріонів (CEF)), що визначається через приблизно 2-10 днів, 3-7 днів, 3-5 або днів 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 днів після інфікування при розмноженні в тих самих умовах. Білок НА, що містить таку мутацію, антигенно не відрізняється від батьківського білка НА дикого типу, тобто всі антитіла, спрямовані проти білка НА дикого типу, будуть перехресно реагувати з мутантним білком НА, і всі антитіла проти мутантного білка НА будуть перехресно реагувати з білком НА дикого типу. Титри атенюйованих вірусів грипу і вірусів грипу дикого типу можна визначити з використанням будь-якого методу, добре відомого в даній галузі або описаного в даному описі (наприклад, аналізів гемаглютинації, 45 аналізів бляшкоутворення, інфекційних доз для яйця (EID50), інфекційних доз для культури тканин (TCID50) і т. п.), і віруси можна розмножити в умовах, описаних у даному або описі добре відомих у даній галузі (наприклад, у клітинах CEF, клітинах MDCK (наприклад, у MEM, 10% об'єм/об'єм фетальної телячої сироватки (FCS), 1% пеніцилін/стрептоміцин при 37°С в термостаті з 5% СО2 і зволоженням) або в курячих яйцях з ембріонами (наприклад, у стаціонарному термостаті при 37°С з 55% відносною вологістю). Альтернативно, віруси можна розмножити в клітинах (наприклад, клітинах CEF, клітинах MDCK і т. п.), що вирощують у безсироваткованому середовищі або середовищі зі зменшеним вмістом сироватки (наприклад, ТРСК трипсин). В іншому варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу (батьківський вірус), який використовується відповідно до даного винаходу, містить геном, що містить (і) мутацію в гені НА вірусу грипу, який використовується як основа, що зменшує або виключає здатність клітинних протеаз розщеплювати білок у його активну форму, і (іі) мутацію в гені NS1, що приводить до зменшення здатності вірусу служити антагоністом відповіді, у яку втягнений клітинний інтерферон. В іншому варіанті здійснення даного винаходу атенюйований вірус грипу за даним винаходом включає геном, що містить мутацію й у гені НА, і в гені NS1 вірусу грипу, який використовується як основа, що дозволяє при множинності зараження (MOI) між 0,0005 і 0,001, 0,001 і 0,01, 0,01 і 0,1 або 0,1 і 1 або MOI, що складає 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 або 6,0 атенюйованому вірусу рости до титрів, більш низьких від приблизно 1 до приблизно 100 разів, від приблизно 5 до приблизно 80 разів, від приблизно 20 до приблизно 80 або разів від приблизно 40 до приблизно 80 разів, від приблизно 1 до приблизно 10 разів, від приблизно 1 до приблизно 5 разів, від приблизно 1 до приблизно 4 разів, від приблизно 1 до приблизно 3 разів, від приблизно 1 до приблизно 2 або разів приблизно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 разів у порівнянні з титрами вірусу грипу дикого типу, у клітинах (наприклад, клітинах, що походять від людини, миші, щура, свині, собаки, коней або птаха (наприклад, Нер-2, А549, 293Т, клітинах нирки собаки Madin-Darby (MDCK) або фібробластах курячих ембріонів (CEF)), що визначається через приблизно 2-10 днів, 3-7 днів, 3-5 або днів 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 днів після інфікування при розмноженні в тих самих умовах. Даний винахід належить до химерного атенюйованого вірусу грипу, що містить принаймні один злитий білок, що має ектодомен (ED), або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, і цитоплазматичний (СТ) і трансмембранний (ТМ) домени або трансмембранний (ТМ) домен основного глікопротеїну вірусу грипу, причому принаймні один злитий білок функціонально заміщує принаймні один основний глікопротеїн вірусу пташиного грипу. Іншими словами, атенюйований вірус грипу служить як «основа», яку 96140 46 конструюють для експресії і вбудовування в її віріон принаймні одного злитого білка замість основного глікопротеїну вірусу грипу. Вбудовування ТМ і СТ доменів або ТМ домена глікопротеїну вірусу грипу, що відповідає основному глікопротеїну вірусу грипу, який функціонально заміщається злитим білком, уможливлює вбудовування злитого білка у віріон атенюйованого вірусу грипу. ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка можуть відповідати або походити з будь-якого вірусу грипу, що уможливлює вбудовування злитого білка у віріон атенюйованого вірусу грипу, який використовується як основа. У певних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або ТМ домену типу, підтипу або штаму вірусу грипу, відмінного від атенюйованого вірусу грипу, який використовується як основа. В інших варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або ТМ домену вірусу грипу різновиду, відмінної від атенюйованого вірусу грипу, який використовується як основа. У переважних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або ТМ домену атенюйованого вірусу грипу, який використовується як основа. У певних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або білка НА, або білка NA вірусу грипу. Оскільки СТ домен НА або NA може бути необхідний для вбудовування злитого білка у віріон вірусу грипу, у деяких варіантах здійснення даного винаходу злитий білок конструюють так, що він містить тільки ТМ домен НА або NA. ТМ і СТ домени білків НА і NA вірусу грипу структурно відрізняються по тому, що домени знаходяться на С-кінці білка НА і на N-кінці білка NA. Крім різного розташування двох доменів у кожному класі поверхневого глікопротеїну ТМ і СТ структурні домени можуть містити ще невідомі розходження у функціональних групах, що залежать від їхнього відносного розташування в межах поліпептидного ланцюга. Тому при конструюванні злитого білка в атенюйованому вірусі грипу розташування ектодомену, або його фрагмента, інфекційного агента, що зливається з ТМ і СТ доменами або ТМ доменом глікопротеїну вірусу грипу, буде визначатися вибором ТМ і СТ доменів або ТМ домена. Для збереження компетентності вірусу при заміщенні поверхневого глікопротеїну його функція в химерному вірусі повинна забезпечуватися злитим білком. В одному з варіантів здійснення даного винаходу химерний атенюйований вірус грипу містить злитий білок, що виявляє нейрамінідазну активність. В іншому варіанті здійснення даного винаходу химерний атенюйований вірус грипу містить злитий білок, що виявляє активність зв'язування з рецептором. В іншому варіанті здійснення даного винаходу химерний атенюйований вірус містить два злитих білки, один із яких виявляє нейрамінідазну активність, а інший - активність зв'язування з рецептором. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу химерний атенюйова 47 ний вірус грипу містить злитий білок, що містить фрагмент білка гетерологічного інфекційного агента, при цьому злитий білок виявляє нейрамінідазну активність або активність зв'язування з рецептором. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу химерний атенюйований вірус грипу містить поверхневий білок, що містить ектодомен білка HN вірусу псевдочуми птахів (NDV) і ТМ і СТ домени білка NA вірусу грипу A/WSN/33, при цьому ектодомен HN виявляє нейрамінідазну активність. В інших варіантах здійснення даного винаходу химерний атенюйований вірус грипу включає злитий білок, що містить ектодомен білка ЕА гетерологічного підтипу або штаму вірусу грипу (наприклад, ектодомен НА Н7 або ектодомен НА Н9). У певних варіантах здійснення даного винаходу принаймні один злитий білок химерного атенюйованого вірусу грипу за даним винаходом не містить весь ектодомен гетерологічного білка (наприклад, включає антигенний або протективний фрагмент ектодомену білка гетерологічного інфекційного агента) і може містити або може не містити, крім того, один або декілька фрагментів ектодомену природного основного глікопротеїну. Відповідно, у певних варіантах здійснення даного винаходу ектодомен злитого білка може включати фрагмент ектодомену білка гетерологічного інфекційного агента. В інших варіантах здійснення даного винаходу ектодомен злитого білка може включати фрагменти і природного основного глікопротеїну, і білка гетерологічного інфекційного агента. У варіантах здійснення даного винаходу, коли злитий білок заміщує основний поверхневий глікопротеїн, функцію поверхневого глікопротеїну повинний забезпечувати злитий білок, тобто злитий білок повинний виявляти функціональність поверхневого глікопротеїну, який він заміщує. Ектодомен злитих білків, описаних у розділі 5.1.2, може відповідати або походить з будь-якого глікопротеїну, або його фрагмента, інфекційного агента (у тому числі вірусних, бактеріальних або паразитарних інфекційних агентів). Необмежувальні приклади глікопротеїнів інфекційних агентів представлені в розділі 5.3 нижче. У певних варіантах здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен плюс 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків (залишок) ектодомену основного глікопротеїну вірусу грипу. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен білка NA вірусу грипу, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків (залишок) ектодомену білка NA вірусу грипу і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може функціонально заміщати білок NA. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить цитоплазматичний і трансмембранний домени білка NA вірусу грипу, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 залишків (залишок) ектодомену білка NA вірусу грипу, які безпосередньо прилягають до трансмембранного домену білка NA вірусу грипу, і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може функціона 96140 48 льно заміщати білок NA. В іншому варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен або цитоплазматичний і трансмембранний домени білка NA, повний домен ніжки, або його фрагмент, білка NA, який передує його глобулярнійголовці, і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може функціонально заміщати білок NA. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен білка НА вірусу грипу, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків (залишок) ектодомену білка НА вірусу грипу і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може заміщати функцію білка НА. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить цитоплазматичний і трансмембранний домени білка НА вірусу грипу, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 залишків (залишок) ектодомену білка НА вірусу грипу, які безпосередньо прилягають до трансмембранного домену білка НА вірусу грипу, і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, так що злитий білок може функціонально заміщати білок НА. Даний винахід належить до нуклеотидних послідовностей (тобто рекомбінантних сегментів), що кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.2. У переважних варіантах здійснення даного винаходу рекомбінантні сегменти, що містять нуклеїнові кислоти, що кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.2., містять 3' і 5' сигнали вбудовування, які необхідні для правильної реплікації, транскрипції й упакування вірусної РНК (Fujii et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007; Zheng et al., 1996, Virology 217:242-251, кожний з який цілком включений у даний опис як посилання). У переважному варіанті здійснення даного винаходу в рекомбінантних сегментах за даним винаходом, отже, використовуються 3' і 5' некодуючі і/або нетрансльовані послідовності сегментів вірусів усередині того самого або типу штаму вірусу, що атенюйований вірус грипу, який використовується як основа. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу рекомбінантні сегменти містять нуклеїнові кислоти, що кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.2, що містять 3' некодуючу область РНК ΝΑ вірусу грипу, кодуючу ΝΑ область, що відповідає СТ і ТМ доменам білка ΝΑ, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 і 1 залишків (залишок) ектодомену білка ΝΑ вірусу грипу, які безпосередньо прилягають до трансмембранного домену білка ΝΑ вірусу грипу, нетрансльовані області рамки зчитування білка ΝΑ і 5' некодуючу область вірусної РНК ΝΑ. У певних варіантах здійснення даного винаходу рекомбінантні сегменти містять нуклеїнові кислоти, що кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.2, що містять повнорозмірний домен ніжки, або його фрагмент, білка NA, який передує його глобулярній головці. Як альтернативу заміщенню білків NA або НА атенюйованого вірусу грипу для одержання химерного вірусу грипу, що містить ектодомен інфекційного агента, відмінного від вірусу грипу, або пов'язаний із захворюванням антиген і ТМ і/або СТ 49 домени вірусу грипу, можна використовувати «зворотну генетику» і біцистронні методи. Дивися, наприклад, патент США № 6887699, патент США № 6001634, патент США № 5854037 і патент США № 5820871, кожний з який у такий спосіб включений як посилання в даному описі в повному об'ємі. Необмежувальні приклади гетерологічних молекул, таких як пов'язані з захворюванням антигени й антигени, що походять з інфекційного агента, які можна використовувати відповідно до способів за даним винаходом, (наприклад, пов'язані з захворюванням антигени або вірусні білки) представлені в розділі 5.3 нижче. 5.1.3. Химерні віруси пташиного грипу, що містять ектодомен білка HN вірусу псевдочуми птахів Даним винаходом охоплюється конструювання вірусу пташиного грипу, у якому злитий білок, що містить ектодомен білка HN вірусу псевдочуми птахів, кодується геномом і при експресії вбудовується у віріон. Можна вибрати і використовувати відповідно до даного винаходу будь-який тип або штам вірусу пташиного грипу, який можна сконструювати для експресії і вбудовування у віріон вірусу пташиного грипу злитого білка, включаючи, але ними не обмежуючи, природні штами, варіанти або мутанти, піддані мутагенезу віруси; гібридні віруси, що містять частини геномів двох різних вірусів, і/або генетично сконструйовані віруси. Необмежувальні приклади вірусів пташиного грипу містять підтип H5N1, H6N2, H7N3, H9N2 або H10N7 віруси грипу А. Даний винахід належить до химерного вірусу пташиного грипу, що містить злитий білок, що має ектодомен (ED) білка HN вірусу псевдочуми птахів (NDV) і цитоплазматичний (СТ) і трансмембранний (ТМ) домени або трансмембранний (ТМ) домен білка NA вірусу грипу, причому злитий білок функціонально заміщує білок NA вірусу пташиного грипу. Іншими словами, вірус пташиного грипу служить як «основа», яку конструюють для експресії і вбудовування в її віріон злитого білка замість білка NA вірусу пташиного грипу. Вбудовування ТМ і СТ доменів або ТМ домена білка NA вірусу грипу в злитий білок уможливлює вбудовування злитого білка у віріон вірусу пташиного грипу. ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка можуть відповідати або походити з будь-якого вірусу грипу, що уможливлює вбудовування злитого білка у віріон вірусу пташиного грипу, який використовується як основа. Кодуючі послідовності ТМ і СТ доменів, які використовуються відповідно до даного винаходу, можуть бути отримані або походити з опублікованої послідовності будь-якого білка NA будь-якого штаму або підтипу вірусу грипу (наприклад, AY651447-даних, введених у базу даних GenBank, зі штаму A/Viet Nam/1203/2004(H5N1); AY96877даних, введених у базу даних GenBank, зі штаму A/turkey/Canada/63(H6N2); AY706954-даних, введених у базу даних GenBank, зі штаму A/duck/Hainan/4/2004(H6N2); AY646080-даних, введених у базу даних GenBank, зі штаму A/chicken/British Columbia/GSC_human_B/04(H7N3); або DQ064434даних, введених у базу даних GenBank, з штаму 96140 50 A/chicken/Beijing/8/98(H9N2)). У певних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або ТМ домену типу або штаму вірусу пташиного грипу, відмінного від вірусу пташиного грипу, який використовується як основа. В інших варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або ТМ домену вірусу грипу, відмінного від вірусу пташиного грипу. У переважних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени або ТМ домен злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам або ТМ домену вірусу пташиного грипу, який використовується як основа. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і СТ домени злитого білка відповідають ТМ і СТ доменам білка NA A/WSN/33 вірусу грипу. У певних варіантах здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен білка NA вірусу грипу, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків (залишок) ектодомену білка NA вірусу грипу, і ектодомен білка HN NDV. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить цитоплазматичний і трансмембранний домени білка ΝΑ вірусу грипу, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 залишків (залишок) ектодомену білка ΝΑ вірусу грипу, які безпосередньо прилягають до трансмембранного домену білка ΝΑ вірусу грипу, і ектодомен білка HN NDV. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить повнорозмірний домен ніжки, або його фрагмент, білка ΝΑ, який передує його глобулярній головці, і ектодомен білка HN NDV. В інших конкретних варіантах здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен або цитоплазматичний і трансмембранний домени білка NA і, крім того, включає повний домен ніжки, або його фрагмент, білка NA, який передує його глобулярній головці, і ектодомен білка HN NDV. Як альтернативу заміщенню білка NA вірусу пташиного грипу для одержання химерного вірусу грипу, що містить ектодомен білка HN NDV і ТМ і/або СТ домени вірусу грипу, можна використовувати «зворотну генетику» і біцистронні методи. Дивися, наприклад, патент США № 6887699, патент США № 6001634, патент США № 5854037 і патент США № 5820871, кожний з який у такий спосіб у повному обсязі включений у даний опис як посилання. Даний винахід належить до нуклеотидних послідовностей (тобто рекомбінантні сегменти), що кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.3. У переважних варіантах здійснення даного винаходу рекомбінантні сегменти, що містять нуклеїнові кислоти, які кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.3, містять 3' і 5' сигнали вбудовування, що необхідні для правильної реплікації, транскрипції й упакування вірусної РНК (Fujii et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007; Zheng et al., 1996, Virology 217:242-251, кожний з який у такий спосіб у повному обсязі включений у даний опис як посилання). У переважному варіанті здійснення даного винаходу в рекомбінантних сегментах за даним винаходом, отже, використовуються 3' і 5' 51 некодуючі і/або нетрансльовані послідовності сегментів вірусів усередині того самого або типу штаму вірусу, що використовуваний як основу вірус пташиного грипу. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу рекомбінантний сегмент включає нуклеїнові кислоти, що кодують злиті білки, описані в розділі 5.1.3, що містять 3' некодуючу область РНК ΝΑ вірусу грипу, кодуючу ΝΑ область, що відповідає СТ і ТМ доменам білка ΝΑ, 1-15, 110, 1-5, 1-3, 2 і 1 залишків (залишок) ектодомену білка NA вірусу грипу, які безпосередньо прилягають до трансмембранного домену білка NA вірусу грипу, нетрансльовані області рамки зчитування білка NA і 5' некодуючу область вірусної РНК ΝΑ. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу рекомбінантний сегмент включає, у напрямку від 3' до 5', 3' некодуючу область РНК ΝΑ вірусу WSN (19 нуклеотидів), нуклеотиди, що кодують амінокислотні залишки 1-36 (108 нуклеотидів) кодуючої ΝΑ області, нуклеотиди, що кодують амінокислотні залишки 51-568 білка HN NDV B1, два послідовних стоп-кодони, 157 нуклеотидів нетрансльованої області рамки зчитування білка NA WSN і 5' некодуючу область РНК вірусу WSN (28 нуклеотидів). Дивися Фіг. 1. Заміщення білка ΝΑ вірусу грипу, який використовується як основа, або введення рекомбінантного сегменту у вірусний геном може атенуювати одержуваний у результаті химерний вірус, тобто химерний вірус буде виявляти знижену реплікацію відносного дикого типу. У певних варіантах здійснення даного винаходу бажана атенуація химерного вірусу, так що химерний вірус залишається, принаймні частково, інфекційним і може реплікуватися in vivo, але утворює тільки низькі титри, що приводить до субклінічних рівнів інфекції, що не є патогенними. Такі атенюйовані химерні віруси особливо підходять для таких варіантів здійснення даного винаходу, у яких вірус вводять індивіду для того, щоб він діяв як імуноген, наприклад, для живої вакцини. Віруси можна атенуювати за допомогою будь-якого способу, відомого в даній галузі і/або приведеного як приклад у даному описі, наприклад конструювання вірусу, що містить мутацію в гені NS1 або містить модифікацію в амінокислотній послідовності з множиною основних амінокислот перед сайтом розщеплення в білку НА (дивися патент США № 6468544; патент США № 6669943; Li et al., 1999, J. Infect. Dis. 179:1132-1138, кожний з який у такий спосіб у повному обсязі включений у даний опис як посилання). В одному з варіантів здійснення даного винаходу атенюйований химерний вірус пташиного грипу за даним винаходом включає геном, що містить мутацію в гені NS1 вірусу пташиного грипу, який використовується як основа, що, як відомо, в інших вірусах грипу зменшує здатність продукту гена NS1 служити антагоністом відповіді, у яку втягнений клітинний інтерферон. В іншому варіанті здійснення даного винаходу атенюйований химерний вірус пташиного грипу за даним винаходом включає геном, що містить мутацію в гені ЕА вірусу пташиного грипу, який використовується як основа, що, як відомо, в інших вірусах грипу зменшує або виключає здатність клітинних протеаз розще 96140 52 плювати білок у її активну форму і, таким чином, або зменшує виключає індуковане НА злиття і інфективність. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу атенюйований химерний вірус пташиного грипу за даним винаходом містить геном, що містить мутацію й у гені НА, і в гені NS1 вірусу пташиного грипу, який використовується як основа, що, як відомо, в інших вірусах грипу зменшують або виключають вірусну активність або окремо, або при об'єднанні. Титри атенюйованих химерних вірусів пташиного грипу і вірусів пташиного грипу дикого типу можна визначити з використанням будь-якого методу, добре відомого в даній галузі або описаного в даному описі (наприклад, аналізів гемаглютинації, аналізів бляшкоутворення, інфекційних доз для яйця (EID50), інфекційних доз для культури тканин (TCID50) і т. п.), і віруси можна розмножити в умовах, описаних у даному описі або добре відомих у даній галузі (наприклад, у клітинах CEF, клітинах MDCK (наприклад, у MEM, 10% об'єм/об'єм фетальної телячої сироватки (FCS), 1% пеніцилін/стрептоміцин при 37°С в інкубаторі з 5% СО2 і зволоженням) або курячих яйцях з ембріонами (наприклад, у стаціонарному інкубаторі при 37°С з 55% відносною вологістю). Альтернативно, віруси можна розмножити в клітинах (наприклад, клітинах CEF, клітинах MDCK і т. п.), що вирощують у безсироваткованому середовищі або середовищі зі зменшеним вмістом сироватки (наприклад, ТРСК трипсин). 5.2. Химерний вірус псевдочуми птахів Даний винахід належить до конструювання вірусу псевдочуми птахів (NDV), у якому принаймні один злитий білок кодується геномом і при експресії міститься у віріоні. Можна вибрати і використати відповідно до даного винаходу будь-який тип або штам NDV, який можна сконструювати для експресії і вбудовування у віріон NDV принаймні одного злитого білка, що містить, але ними не обмежуючись, природні штами, варіанти або мутанти, піддані мутагенезу віруси; гібридні віруси, що містять частини геномів двох різних вірусів, і/або генетично сконструйовані віруси. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу NDV є вірусом, що зустрічається в природі. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу NDV є генетично сконструйованим вірусом. Наприклад, як описано в даному описі, відповідно до способів за даним винаходом можна використовувати мутантні штами рекомбінантного NDV, rNDV/F2aa і rNDV/F3aa, у яких сайт розщеплення білка F замінений сайтом, що містить один або два додаткові залишки аргініну, що уможливлює активацію мутантного сайта розщеплення за допомогою повсюдно експресованих протеаз сімейства фуринів. Необмежувальні приклади NDV, які можна використовувати відповідно до способів за даним винаходом, містять В1, LaSota, YG97, МЕТ95 і F48E9. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу химерний NDV або rNDV за даним винаходом включає злитий білок, що містить ектодомен білка НА вірусу грипу; у конкретному прикладі відповідно до цього варіанту здійснення білком НА вірусу грипу є білок НА вірусу грипу Н7. 53 Даний винахід належить до химерного NDV, що містить, принаймні, один злитий білок, який має ектодомен (ED), або його фрагмент, білка інфекційного агента, відмінного від білка NDV, і цитоплазматичний (СТ) і/або трансмембранний (ТМ) домени основного глікопротеїну NDV. Даний винахід також належить до химерного NDV, що містить принаймні один злитий білок, що має ED, або його фрагмент, і ТМ домен білка інфекційного агента, відмінного від глікопротеїну NDV, і СТ домен основного глікопротеїну NDV. Даний винахід, крім того, належить до химерного NDV, що містить злитий білок, що має ED, або його фрагмент, і СТ домен білка інфекційного агента, відмінного від глікопротеїну NDV, і ТМ домен основного глікопротеїну NDV. Іншими словами, вірус NDV служить як «основа», яку конструюють для експресії і вбудовування в її віріон злитого білка. Вбудовування ТМ і/або СТ доменів основного глікопротеїну NDV у злитий білок уможливлює вбудовування злитого білка у віріон NDV. ТМ і/або СТ домени злитого білка можуть відповідати або походити з будьякого NDV, що уможливлює вбудовування злитого білка у віріон NDV, який використовується як основа. У певних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і/або СТ домени злитого білка відповідають ТМ і/або СТ доменам або типу штаму NDV, відмінного від NDV, який використовується як основа. У переважних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і/або СТ домени злитого білка відповідають ТМ і/або СТ доменам NDV, який використовується як основа. Віріон NDV включає два основних поверхневих глікопротеїни, білок злиття (F) і гемаглютиніннейрамінідазу (HN), обидва з яких містять цитоплазматичний домен, трансмембранний домен і ектодомен. Відповідно, у певних варіантах здійснення даного винаходу ТМ і/або СТ домени злитого білка відповідають ТМ і/або СТ доменам або білка F, або білка HN NDV. ТМ і СТ домени білків F або FTN NDV структурно відрізняються по тому, що домени знаходяться на С-кінці білка F і на N-кінці білка FTN. Тому при конструюванні злитого білка в NDV орієнтація ектодомену інфекційного агента, що зливається з ТМ і/або СТ доменами глікопротеїну NDV, буде визначатися вибором ТМ і/або СТ доменів. У певних варіантах здійснення даного винаходу принаймні один злитий білок химерного NDV включає ТМ домен і 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків (залишок) ектодомену основного глікопротеїну NDV. Наприклад, у конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен білка F NDV, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків (залишок) ектодомену білка F NDV і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від NDV, так що злитий білок може функціонально заміщати білок F. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить цитоплазматичний і трансмембранний домени білка F NDV, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3,2 або 1 залишків (залишок) ектодомену білка F NDV, які безпосере 96140 54 дньо прилягають до трансмембранного домену білка F NDV, і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від NDV, так що злитий білок може функціонально заміщати білок F. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить трансмембранний домен білка HN NDV, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 або 1 безпосередньо прилягаючих залишків (залишок) ектодомену білка HN NDV і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від NDV, так що злитий білок може заміщати функцію білка HN. В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок містить цитоплазматичний і трансмембранний домени білка HN NDV, 1-15,1-10,1-5,1-3, 2 або 1 залишків (залишок) ектодомену білка HN NDV, які безпосередньо прилягають до трансмембранного домену білка HN NDV, і ектодомен, або його фрагмент, інфекційного агента, відмінного від NDV, так що злитий білок може функціонально заміщати білок HN. У певних варіантах здійснення даного винаходу поверхневий глікопротеїн NDV (тобто білок HN або F) заміщений злитим білком, що забезпечує необхідну функцію(ї) глікопротеїну NDV. Відповідно до цих варіантів здійснення даного винаходу ектодомен злитого білка повинен вибиратися так, щоб він забезпечував необхідну функцію(ї) заміщеного глікопротеїну NDV. В інших варіантах здійснення даного винаходу злитий білок експресуєтьоя і вбудовується у віріон NDV, крім природних поверхневих глікопротеїнів NDV. У певних варіантах здійснення даного винаходу принаймні один злитий білок химерного NDV за даним винаходом не включає повний ектодомен гетерологічного білка (наприклад, включає антигенний фрагмент ектодомену білка гетерологічного інфекційного агента) і може містити або може не містити, крім того, один або декілька фрагментів ектодомену природного основного глікопротеїну. Відповідно, у певних варіантах здійснення даного винаходу ектодомен злитого білка може включати фрагмент ектодомену білка гетерологічного інфекційного агента. В інших варіантах здійснення даного винаходу ектодомен злитого білка може включати фрагменти і природного основного глікопротеїну, і білка гетерологічного інфекційного агента. У варіантах здійснення даного винаходу, у яких злитий білок заміщує основний поверхневий глікопротеїн, функцію поверхневого глікопротеїну повинний забезпечувати злитий білок, тобто злитий білок повинний виявляти функціональність поверхневого глікопротеїну, який він заміщує. За умови, що злитий білок, описаний у розділі 5.2, не потрібно для заміщення функції необхідного вірусного глікопротеїну, ектодомен злитого білка може відповідати або походити з будь-якої гетерологічної молекули, що містить, але ними не обмежуються, будь-який антиген інфекційного агента (у тому числі антигени вірусних, бактеріальних і паразитарних інфекційних агентів) і будь-який пов'язаний із захворюванням антиген. Необмежувальні приклади антигенів інфекційних агентів і/або зв'язаних із захворюванням антигенів представлені в розділі 5.3 нижче. 55 Даним винаходом охоплюються нуклеотидні послідовності, що кодують злиті білки, описані в розділі 5.2. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу нуклеотидна послідовність включає нуклеїнові кислоти, що кодують послідовність Кozaк, за якої випливає кінець гена, міжцистронний нуклеотид (Т), і послідовність початку гена білка F NDV, за яким випливає 5' нетрансльована область і ORF білка НА H7N2. У переважних варіантах здійснення даного винаходу штами NDV, які використовуються відповідно до даного винаходу, є штамами вірусу зі зниженою вірулентністю, тобто такі штами, що звичайно виявляють низьку вірулентність або безсимптомну інфекцію в птахів, наприклад, штам В1, штам LaSota або штам Met95. Даний винахід також належить до застосування високовирулентних штамів NDA, наприклад, YG97 або F48E9, або штамів NDV, що були модифіковані за допомогою генетичної рекомбінації з використанням способів, відомих у даній галузі або приведених як приклад у даному описі. У конкретному варіанті здійснення даний винахід належить до застосування NDV, у якому білок F NDV був генетично модифікований у сайті розщеплення для того, щоб збільшити активність злиття. У конкретному прикладі відповідно до даного винаходу модифікований білок F включає дві-три амінокислотних мутацій у сайті розщеплення F. Заміщення необхідного поверхневого білка вірусу, який використовується як основа, або введення нуклеотидної послідовності, що кодує злитий білок, у вірусний геном може привести до атенуації, або додаткової атенуації, одержуваного в результаті химерного вірусу, тобто химерний вірус буде виявляти знижену реплікацію щодо дикого типу. У певних варіантах здійснення даного винаходу бажана атенуація, або додаткова атенуація, химерного вірусу, так що химерний вірус залишається, принаймні частково, інфекційним і може реплікуватися in vivo, але утворює тільки низькі титри, що приводить до субклінічних рівнів інфекції, що не є патогенними. Такі атенюйовані химерні віруси особливо підходять для таких варіантів здійснення даного винаходу, у яких вірус вводять індивіду для того, щоб він діяв як імуноген, наприклад, для живої вакцини. Віруси можна атенуювати за допомогою будь-якого способу, відомого в даній галузі. 5.3. Антигени, які можна сконструювати в химерних вірусах за даним винаходом Відповідно до даного винаходу можна сконструювати будь-яку гетерологічну молекулу у вірусі, який використовується як основа, для виклику імунної відповіді на зазначену молекулу. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу будьякий антиген будь-якого інфекційного патогену або будь-який антиген, пов'язаний з яким-небудь захворюванням, що здатний викликати імунну відповідь, можна сконструювати в NDV і/або вірусі грипу, який використовується як основа. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу антигеном є глікопротеїн. У певних варіантах здійснення даного винаходу антиген здатний функціонально замістити основний глікопротеїн вірусу грипу і/або NDV. У конкретних варіантах здійснен 96140 56 ня даного винаходу антиген виявляє активності нейрамінідази або гемаглютиніну (наприклад, злиття/зв'язування з рецептором). При виборі використовуваного як основи вірусу для експресії антигену береться до уваги орієнтація нуклеотидів, що кодують антиген. Наприклад, якщо антиген у природі прикріплюється амінокінцем, ТМ і СТ домени або ТМ домен, які використовуються при конструюванні злитого білка, будуть відповідати ТМ і СТ доменам або ТМ домену необхідного вірусного білка вірусу, який використовується як основа, або родинного вірусу, що також у природі прикріплюється через його амінокінець, наприклад, білка NA вірусу грипу або білка HN NDV. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу вірусний антиген конструюють у NDV або вірусі грипу як основу. Необмежувальні приклади вірусних антигенів містять антигени Adenoviridae (наприклад, мастаденовіруса й авиаденовіруса), Herpesviridae (наприклад, вірусу 1 простого герпеса, вірусу 2 простого герпеса, вірусу 5 простого герпеса, вірусу 6 простого герпеса, вірусу Епштейна-Барра, HHV6-HHV8 і цитомегаловірусу), Leviviridae (наприклад, левівірусу, ентеробактерій фази MS2, алолевивірусу), Poxviridae (наприклад, поксвірусів хребетних, парапоксивірусу, авіпоксвірусу, каприпоксвірусу, лепорипоксвірусу, суїпоксвірусу, вірусу контагіозного молюска і поксвірусів комах), Papovaviridae (наприклад, поліомавірусу і папіломавірусу), Paramyxoviridae (наприклад, параміксовірусу, вірусу 1 парагрипу, Mobillivirus (наприклад, вірусу кору), Rubulavirus (наприклад, вірусу епідемічного паротиту), Pneumonovirinae (наприклад, пневмовірусу, респіраторносинцитіального вірусу), респіраторносинцитіального вірусу людини і метапневмовірусу (наприклад, пневмовірусу птахів і метапневмовірусу людини)), Picornaviridae (наприклад, ентеровірусу, риновірусу, гепатовірусу (наприклад, вірусу гепатиту А людини), кардіовірусу й артровірусу), Reoviridae (наприклад, ортореовірусу, орбівірусу, ротавірусу, циповірусу, фідживірусу, фітореовірусу й оризавірусу), Retroviridae (наприклад, ретровірусів типу В ссавцівь, ретровірусів типу С ссавців, ретровірусів типу С птахів, групи ретровірусів типу D, ретровірусів BLV-HTLV, лентивірусу (наприклад, вірусу 1 імунодефіциту людини і вірусу 2 імунодефіциту людини (наприклад, gp160 ВІЛ), спумавірусу), Flaviviridae (наприклад, вірусу гепатиту С, вірусу денге, вірусу Західного Нілу), Hepadnaviridae (наприклад, вірусу гепатиту В), Togaviridae (наприклад, альфавірусу (наприклад, вірусу Синдбіс) і Rubivirus (наприклад, вірусу краснухи), Rhabdoviridae (наприклад, везикуловірусу, лісавірусу, вірусу ефемерної лихоманки, циторабдовірусу і нуклеорабдовірусу), Arenaviridae (наприклад, аренавірусу, вірусу лімфоцитарного хоріоменінгіту, іпі-вірусу і вірусу Ласа) і Coronaviridae (наприклад, коронавірусу і торовірусу). У конкретному варіанті здійснення даного винаходу вірусний антиген являє собою gp120 ВІЛ, nef ВІЛ, глікопротеїн F RSV, глікопротеїн G RSV, нейрамінідазу вірусу грипу, гемаглютинін вірусу грипу, білок Tax HTLV, глікопротеїн вірусу простого герпесу (наприклад, gB, gC, gD і gE) або поверхневий антиген 57 вірусу гепатиту В, білок Ε вірусу гепатиту С або білок шипа коронавірусу. У певних варіантах здійснення даного винаходу вірусний антиген не є gp41. У певних варіантах здійснення даного винаходу вірусний антиген походить з параміксовірусу. В інших альтернативних варіантах здійснення даного винаходу вірусний антиген не походить з параміксовірусу. У певних варіантах здійснення даного винаходу вірусний антиген походить з вірусу типу 1 парагрипу людини, вірусу типу 3 парагрипу людини, RSV або вірусу Сендай. В інших альтернативних варіантах здійснення даного винаходу вірусний антиген не походить з вірусу типу 1 парагрипу людини, вірусу типу 3 парагрипу людини, RSV або вірусу Сендай. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу вірус, який використовується як основа, являє собою вірус грипу, а антиген, конструйований у вірусі грипу, який використовується як основа, не є антигеномвірусу грипу. В інших конкретних варіантах здійснення даного винаходу вірус, який використовується як основа, являє собою NDV, а антиген, конструйований у NDV, який використовується як основа, не є антигеном NDV. В іншому варіанті здійснення даного винаходу бактеріальний антиген (наприклад, білок бактеріальної оболонки або антиген, зв'язаний із зазначеною бактерією) конструюють у NDV або вірусі грипу, який використовується як основа. Необмежувальні приклади бактеріальних антигенів містять антигени бактерій сімейства Aquaspirillum, сімейства Azospirillum, сімейства Azotobacteraceae, сімейства Bacteroidaceae, роду Bartonella, сімейства Bdellovibrio, роду Campylobacter, роду Chlamydia (наприклад, Chlamydia pneumoniae), роду Clostridium, сімейства Enterobacteriaceae (наприклад, роду Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter aerogenes, роду Erwinia, Escherichia coli, роду Hafnia, роду Klebsiella, роду Morganella, Proteus vulgaris, Providencia, роду Salmonella, Serratia marcescens і Shigella flexneri), сімейства Gardinella, Haemophilus influenzae, сімейства Halobacteriaceae, сімейства Helicobacter, сімейства Legionallaceae, роду Listeria, сімейства Methylococcaceae, мікобактерій (наприклад, Mycobacterium tuberculosis), сімейства Neisseriaceae, сімейства Oceanospirillum, сімейства Pasteurellaceae, роду Pneumococcus, роду Pseudomonas, сімейства Rhizobiaceae, сімейства Spirillum, сімейства Spirosomaceae, роду Staphylococcus (наприклад, стійкого до метициліну Staphylococcus aureus і Staphylococcus pyrogenes), роду Streptococcus (наприклад, Streptococcus enteritidis, Streptococcus fasciae і Streptococcus pneumoniae), сімейства Helicobacter, сімейства Yersinia, Bacillus antracis і сімейства Vampirovibrio. В інших варіантах здійснення даного винаходу антиген, зв'язаний з паразитом (наприклад, найпростіших) конструюють у NDV або вірусі грипу, який використовується як основа. Відповідно до способів за даним винаходом можна використовувати будь-який антиген, зв'язаний з паразитом, або антиген паразита. Необмежувальні приклади антигенів паразитів містять антигени паразита, 96140 58 такого як амеба, малярійного паразита, Plasmodium, Trypanosoma cruzi. В іншому варіанті здійснення даного винаходу антиген гриба конструюють у NDV або вірусі грипу, який використовується як основа. Необмежувальні приклади антигенів грибів містять антигени грибів роду Absidia (наприклад, Absidia corymbifera і Absidia ramosa), роду Aspergillus (наприклад, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger і Aspergillus terreus), Basidiobolus ranarum, Blastomyces dermatitidis, роду Candida (наприклад, Candida albicans, Candida glabrata, Candida kerr, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida pseudotropicalis, Candida quillermondii, Candida rugosa, Candida stellatoidea і Candida tropicalis), Coccidioides immitis, роду Conidiobolus, Cryptococcus neoforms, роду Cunninghamella, дерматофитов, Histoplasma capsulatum, Microsporum gypseum, Mucor pusillus, Paracoccidioides brasilientis, Pseudallescheria boydii, Rhinosporidium seeberi, Pneumocystis carinii, роду Rhizopus (наприклад, Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae і Rhizopus microsporus), роду Saccharomyces, Sporothrix schenckii, зигоміцетів і класів, таких як Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes і Oomycetes. В іншому варіанті здійснення даного винаходу, зв'язаний з пухлиною антиген конструюють у NDV або вірусі грипу, який використовується як основа. Відповідно до способів за даним винаходом можна використовувати будь-який зв'язаний з пухлиною антиген, відомий у даній галузі. Необмежувальні приклади зв'язаних з пухлиною антигенів містять антигени MAGE-1, MAGE-3, В AGE, GAGE-1, GAGE-2, N-ацетилглюкозамінілтрансферазу-V, Р15, MART-1/MelanA, TRP-1 (gp75), тирозиназу, циклінзалежну кіназу 4, -катенін, MUM-1, CDK4, HER-2/neu, папіломавірус-Е6 чоловік, папіломавірус-Е7 чоловік, MUC-1, каспазу-8, CD5, CD20, x СЕА, муцин-1, Lewis , CA-125, рецептор епідермаHER2 льного фактора росту, p185 , IL-2R, Fap-, тенасцин, антигени, пов'язані з металопротеїназою, і САМРАТН-1. 5.4. Конструювання і розмноження химерних вірусів за даним винаходом Химерні віруси за даним винаходом можна створити, використовуючи метод зворотної генетики. Метод зворотної генетики включає готування синтетичних рекомбінантних вірусних РНК, що містять некодуючі області негативної нитки РНК вірусу, які важливі для впізнавання вірусними полімеразами й упакування сигналів, необхідних для одержання зрілого віріону. Рекомбінантні РНК синтезують з рекомбінантних ДНК-матриць і відновлюють in vitro з використанням очищеного вірусного полімеразного комплексу з утворенням рекомбінантних рибонуклеопротеїнів (РНР), які можна використовувати для трансфекції клітин. Більш ефективна трансфекція досягається, якщо вірусні полімеразні білки присутні під час транскрипції синтетичної РНК або in vitro, або in vivo. Синтетичні рекомбінантні РНР можна відновити в інфекційні вірусні частинки. Вищевикладені методи описані в патенті США № 5166057, виданому 24 листопада 1992, у патенті США № 5854037, вида 59 ному 29 грудня 1998, у публікації Європейського патенту ЕР 0702085А1, опублікованої 20 лютого 1996, у заявці на патент США № 09/152845, у публікації міжнародної заявки на патент РСТ WO97/12032, опублікованої 3 квітня 1997, і WO96/34625, опублікованої 7 листопада 1996, у публікації Європейського патенту ЕР А780475, у заявці WO99/02657, опублікованої 21 січня 1999, у заявці WO98/53078, опублікованої 26 листопада 1998, у заявці WO98/02530, опублікованої 22 січня 1998, у заявці WO99/15672, опублікованої 1 квітня 1999, у заявці WO98/13501, опублікованої 2 квітня 1998, у заявці WO97/06270, опублікованої 20 лютого 1997, і ЕРО 780475А1, опублікованої 25 червня 1997, кожний з яких у такий спосіб у повному обсязі включений у даний опис як посилання. Для конструювання химерного вірусу за даним винаходом можна також використовувати плазмідну технологію без фага-помічника. Коротко, що стосується вірусу грипу, повнорозмірні кДНК вірусних сегментів ампліфікують, використовуючи ПЛР із використанням праймерів, що містять унікальні рестрикційні сайти, які дозволяють вбудовувати ПЛР-продукт у плазмідний вектор (Flandorfer et al., 2003, J. Virol. 77:9116-9123; Nakaya et al., 2001, J. Virol. 75:11868-11873, кожний з який у такий спосіб у повному обсязі включений у даний опис як посилання). Плазмідний вектор призначений для позиціонування ПЛР-продукту між зрізаним промотором РНК-полімерази І людини і послідовністю рибозиму вірусу гепатиту дельта, так що з промотору полімерази І продукується точний негативний (смислова вірусна РНК) транскрипт. Окремі плазмідні вектори, що містять кожний з вірусних сегментів, а також експресуючі вектори, що містять необхідні вірусні білки, трансфікують у клітини, що приводить до продукування рекомбінантних вірусних частинок. Відносно докладного опису плазмідної технології без фага-помічника дивися, наприклад, публікацію міжнародної заявки WO 01/04333, патент США № 6649372, Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682; Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113; Neumann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350, кожний з який у такий спосіб у повному обсязі включений у даний опис як посилання. Аналогічно, що стосується геному NDV у вигляді одного сегменту, повну кДНК штаму Hitchner В1 конструюють, вбудовують у плазмідний вектор і розробляють зі вмістом унікального рестрикційного сайта між генами Ρ і М. Злитий білок, сконструйований відповідно до даного винаходу, можна потім вмонтувати у вірусний геном в унікальному рестрикційному сайті. Єдиний сегмент вміщують між промотором Т7 і рибозимом вірусу гепатиту дельта з одержанням точного негативного транскрипта за допомогою полімерази Т7. Плазмідний вектор і експресуючі вектори, що містять необхідні вірусні білки, трансфікують у клітини, що приводить до продукування рекомбінантних вірусних частинок (дивися, Swayne et al., 2003, Avian Dis. 47:1047-1050; Swayne et al., 2001, J. Virol. 11868-11873, кожний з який у такий спосіб у повному обсязі включений у даний опис як посилання). 96140 60 Химерні віруси грипу за даним винаходом можна розробити так, що вони будуть містити сегменти РНК, які є біцистронними. Біцистронні методи дозволяють конструювати кодуючи послідовності множини білків в єдиній мРНК завдяки використанню послідовностей IRES. Послідовності IRES керують внутрішнім рекрутментом рибосом на молекулі РНК і уможливлюють трансляцію в напрямку 3' незалежним від кеп-групування чином. Коротко, кодуючу область одного білка вбудовують у ORF другого білка. Вставка фланкована IRES і будь-якими нетрансльованими сигнальними послідовностями, необхідними для правильної експресії і/або функціонування. Вставка не порушує відкриту рамку зчитування, поліаденілювання або промотори транскрипції другого білка (дивися, наприклад, Garcia-Sastre et al., 1994, J. Virol. 68:6254-6261; Garcia-Sastre et al., 1994, Dev. Biol. Stand. 82:237-246, кожний з який у такий спосіб у повному обсязі включений у даний опис як посилання). 5.4.1. Розмноження химерних вірусів Химерні віруси за даним винаходом можна розмножувати в будь-якому субстраті, що дозволяє вірусу рости до титрів, що уможливлюють застосування химерних вірусів, описаних у даному описі. В одному з варіантів здійснення даного винаходу субстрат дозволяє химерним вірусам рости до титрів, порівнянних з титрами, які визначаються для відповідних вірусів дикого типу. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу атенюйовані химерні віруси за даним винаходом розмножують у субстратах з браком IFN. Химерні віруси за даним винаходом можна вирощувати в клітинах (наприклад, клітинах птахів, клітинах курей і т. п.), що є чутливими до інфікування вірусами, у яйцях з ембріонами або тварин (наприклад, птахах). Такі способи добре відомі кваліфікованими в даній галузі фахівцям. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу клітини, які використовуються для розмноження атенюйованих вірусів зі зниженою антагоністичною відносно інтерферону активністю, є клітинами з браком IFN. В одному з варіантів здійснення даного винаходу химерні віруси птахів за даним винаходом розмножують у клітинах курей або яйцях з ембріонами. Приклади клітин курей містять, але ними не обмежуються, фібробласти курячих ембріонів або клітини нирки курячих ембріонів. Химерні віруси за даним винаходом можна розмножувати в яйцях з ембріонами, наприклад, віком 6-14 днів. Яйця з молодими або недорозвиненими ембріонами можна використовувати для розмноження атенюйованих химерних вірусів грипу за даним винаходом. Яйця з недорозвиненими ембріонами містять яйця віком менше десяти днів, наприклад яйця віком 6-9 днів, з браком IFN. Яйця з недорозвиненими ембріонами також містять яйця, що штучно імітують яйця з недорозвиненими ембріонами віком аж до, але менше десяти днів у результаті змін умов росту, наприклад, зміни температур інкубації, обробки лікарськими засобами або будь-яких інших змін, що приводять до уповільнення розвитку яйця, так що система IFN не цілком розвивається в порівнянні з яйцями віком