Білок h5 вірусу грипу, молекула нуклеїнової кислоти і вектор, який її кодує, та їх застосування

Реферат: Винахід належить до білка Н5 вірусу грипу, де білок Н5 має амінокислоту 223N і модифікацію 328К+, де модифікація 328К+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка Н5 вбудований UA 99117 C2 (12) UA 99117 C2 другий лізин, молекули нуклеїнової кислоти, вектору, способу одержання даного білка Н5. Винахід також належить до вакцини, що містить білок Н5, способу її одержання, застосування білка Н5 як лікарського засобу, призначеного для профілактики та лікування інфекції, викликаної вірусом грипу. UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується галузі медицини, переважно галузі інфекційних хвороб. Зокрема, даний винахід стосується білків вірусу грипу, нуклеїнових кислот і векторів, які кодують вказані білки, і вакцин проти грипу. Більш конкретно даний винахід стосується застосування будь-яких із вказаних білків, молекул нуклеїнових кислот, векторів або вакцин для лікування й попередження інфекції, яка викликається вірусом грипу, а також для попередження внутрішньоі міжвидової передачі вірусу грипу. Інфекція, яка викликається вірусом грипу, залишається важливою для тварин і людини інфекцією. Грип викликається вірусами, які зазнають постійних антигенних змін/модифікацій і які мають тварину-резервуар. У результаті цього в майбутньому можуть виникати нові епідемії й пандемії й важко досягти викорінювання захворювання. Віруси грипу добре відомі в даній галузі й описані більш докладно в P. Palese, Nature Medicine, т. 10, №. 12, грудень 2004 р., стор. 82-86 і в додаткових вказаних в цій публікації посиланнях. У цілому, геном вірусу грипу А складається з одноланцюгових сегментів, і на поверхні вірусних частинок присутні два основні глікопротеїни: гемаглютинін (H) і нейрамінідаза (N). У результаті того, що є принаймні 16 різних підтипів гемаглютиніну (H1-H16) і 9 різних підтипів нейрамінідаз (N1-N9), існує значна антигенна варіабельність між вірусами грипу. Продемонстровано, що вірус грипу типу H5N1, тобто вірус чуми свійських птахів (Fowl Plague) заражає свійських птахів, свиней і людину. Віруси можуть передаватися також безпосередньо від різних видів птахів людині (Claas і ін., Lancet, 351, 1998, с. 472; Suarez і ін., J. Virol. 72, 1998, с. 6678; Subbarao і ін., Science, 279, 1998, с. 393; Shortridge, Vaccine, 17 (додаток 1), 1999, стор. 26-29). Відомі клінічні випадки, коли смертність людей досягала приблизно 50 %. Протягом останнього десятиліття свині стали важливим переносником при пандеміях грипу. Свині, верблюди й тюлені, переважно свині, можуть служити як "камери для змішування" для вірусів пташиного грипу й тому являють собою потенційний фактор ризику, що дозволяє переборювати видові бар'єри від свійських птахів, які є природним резервуаром вірусів грипу, до ссавців. Це відбувається, як правило, шляхом подвійного зараження чутливих тварин, наприклад свиней, як властивим для ссавців (свинячим), так і пташиним вірусом грипу. Таке подвійне зараження може приводити до виникнення нових рекомбінантних вірусів, які можуть викликати людські або свинячі пандемії. Однак згідно із сучасними даними рекомбінація існуючих штамів вірусу пташиного грипу H5 і вірусів грипу ссавців не призвела до одержання рекомбінантів, які мають високу вірулентність. З іншого боку, вірус пташиного грипу може заражати свиней і в результаті спонтанних мутацій може адаптуватися до організму свиней. Критичний бар'єр може бути подоланий, якщо вірус набуде здатність до горизонтального шляху передачі в популяції свиней (або інших ссавців). Проте, більша частина свиней у Південно-Східній Азії виявилися зараженою штамом пташиного вірусу грипу (H5), джерелом якого виявилися сусідні пташники. Доти, поки вказані інфекції є доклінічними, їх можна діагностувати тільки лабораторними методами, і тому вони часто залишаються непоміченими. Існує високий ризик, що такі свині, які мають зараження на доклінічному рівні, можуть служити як сприятливий організм для адаптації вірусу до системи ссавців, що приводить до поширення вірусу в популяції свиней, а також може приводити до зараження людини. Сучасні вакцини проти грипу являють собою субодиничну вакцину (Babai і ін., Vaccine, 17(910), 1999, стор. 1223-1238; Crawford і ін., Vaccine, 17(18), 1999, стор. 2265-2274; Johansson і ін., Vaccine, 17(15-16), 1999, стор. 2073-2080), ослаблену вакцину (Horimoto і ін., Vaccine, 22(17-18), 2004, стор. 2244-2247), ДНК-вакцину (Watabe і ін., Vaccine, 19(31), 2001, стор. 4434-4444) і інактивовану вакцину проти грипу (Cao і ін., Vaccine, 10(4), 1992, стор. 238-242), причому остання знайшла найбільш широке застосування в промисловості (Lipatov і ін., J Virol, 78(17), 2004, стор. 8951-8959). Субодиничні вакцини, рекомбінантні гемаглютинін і нейрамінідаза (Babai і ін., Vaccine, 17(910), 1999, стор. 1223-1238; Crawford і ін., Vaccine, 17(18), 1999, стор. 2265-2274; Johansson і ін., Vaccine, 17(15-16), 1999, стор. 2073-2080) можуть бути важливою альтернативною інактивованій вакцині, хоча вони не знайшли зараз застосування як наявні у продажі вакцин. Очевидно, що одержання таких вакцин є більш безпечним, ніж одержання інактивованої вакцини. Крім того, субодиничні вакцини не викликають гуморальної імунної відповіді на існуючі в організмі білки вірусу грипу, і тому вони дозволяють відрізняти вакцинованих і інфікованих тварин (Crawford і ін., Vaccine, 17(18), 1999, стор. 2265-2274). Білок гемаглютиніну являє собою глікопротеїн вірусу грипу, який зв'язується з рецептором і злитий з мембраною, і він є мішенню для нейтралізуючих інфекційність антитіл. Повний білок гемаглютиніну (HA) з H5N1 складається з 568 амінокислот, має молекулярну масу 56 кда. Молекула HA складається із субодиниць HA1 і HA2, при цьому субодиниця HA1 опосередковує 1 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перинний контакт із клітинною мембраною, а HA2 відповідає за злиття з мембраною (Chizmadzhev, Bioelectrochemistry, 63(1-2), 2004, сс.129-136). Системи бакуловірус/клітина комахи застосовували для експресії генів гемаглютиніну, виділених з підтипів пташиного грипу (Babai і ін., Vaccine, 17(9-10), 1999, стор. 1223-1238; Crawford і ін., Vaccine, 17(18), 1999, стор. 2265-2274; Johansson і ін., Vaccine, 17(15-16), 1999, стор. 2073-2080); Nwe і ін., BMC Mircobiology, 6(16), 2006, doi:10.1186/1471-2180-6-16). Однак вказані рекомбінантні білки, імовірно в деяких випадках можуть не мати захисної дії або мають лише невисоку ефективність відносно деяких видів (Treanor і ін., Vaccine, 19, 2001, стор. 17321737). Таким чином, існує необхідність у підвищенні доступності поліпшених вакцин і нових підходів вакцинації для забезпечення боротьби із грипом і надання позитивного впливу на вірусне навантаження при захворюванні. Перед описом варіантів здійснення даного винаходу слід зазначити, що в контексті даного опису й у доданій формулі винаходу при згадуванні однини мається на увазі також і множина, якщо з контексту не очевидно інше. Так, наприклад, посилання на "препарат" стосується багатьох вказаних препаратів; посилання на "носій" стосується одного або декількох носіїв або їх еквівалентів, відомих фахівцям у даній галузі, і т.д. Якщо не вказане інше, то всі технічні й наукові поняття мають значення, загальновідомі фахівцям в галузі, до якої належить даний винахід. Всі наведені діапазони й значення можуть відрізнятися на 1-5 %, якщо спеціально не вказане інше або якщо інше не відомо фахівцям у даній галузі, таким чином, поняття "приблизно" виключено з опису. Хоча для застосування на практиці або оцінки даного винаходу можна застосовувати будь-які методи й матеріали, подібні або еквівалентні до наведених у даному описі, у ньому представлені переважні методи, пристрої й матеріали. Всі згадані публікації включені в даний опис як посилання з метою опису або розкриття субстанцій, ексципієнтів, носіїв і методологій, описаних у публікаціях, які можна застосовувати у зв'язку з винаходом. Ніщо в даному описі не повинне розглядатися як допущення того, що винахід не має права включати заднім числом такий опис за допомогою посилання на попередній винахід. Вирішення вказаної вище технічної проблеми запропоновано в описі й варіантах здійснення винаходу, обсяг яких представлений у формулі винаходу. Білки вірусів грипу і молекули нуклеїнових кислот, які їх кодують Даний винахід стосується білка H5 вірусу грипу, де білок H5 має амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, при цьому нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень у наведеній як приклад SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+). Переважно вказаний білок H5 і будь-який інший білок H5, запропонований у винаході, являє собою виділений білок H5. При створенні винаходу несподівано було встановлено, що білки H5, які мають вказані вище модифікації, мають вищу антигенність в порівнянні з білками H5, які не мають відповідних амінокислот у положеннях 223 і 328/329. Поняття "гемаглютинін 5 (H5)" або "H5 вірусу пташиного грипу" або "білок H5" у контексті даного опису стосується, але, не обмежуючись тільки ними, будь-якого білка H5, що зустрічається в природних умовах, і будь-яких модифікованих форм білка H5, включаючи будьякий делеційний, що несе заміну та/або інсерційний мутант білка H5, де вказані білки H5 мають амінокислоту 223N і модифікацію 328K+. Нумерація амінокислотних положень білка H5 у контексті даного опису як приклад представлена в SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 позначає амінокислотну послідовність гемаглютиніну штаму duck/China/ E319-2/03 (качиний/Китай/E319-2/03), але в ній відсутній амінокінцевий сигнальний пептид. Інакше кажучи, при посиланні на амінокислоту в положенні 223 (амінокислота 223) мається на увазі амінокислотний залишок, що відповідає амінокислоті 223 SEQ ID NO:1. Однак цей не означає, що білки H5, запропоновані у винаході, мають амінокислотну послідовність, ідентичну до SEQ ID NO:1. Це означає тільки те, що відповідні амінокислотні залишки білків H5, запропонованих у винаході, являють собою саме вказаний амінокислотний залишок. У цьому випадку амінокислота 223 повинна являти собою серин (S). Наприклад, поняття "223N" або "155N" означають, що амінокислота в положеннях 223 і 155 відповідно (нумерація відповідно до амінокислотних положень в SEQ ID NO:1) повинна являти собою амінокислоту аспарагін (N). Інакше кажучи, якщо посилання зроблене на "білок H5, що має амінокислоту 223N", це означає, що амінокислота в молекулі H5 в амінокислотному положенні 223 (нумерація відповідно до амінокислотних положень в SEQ ID NO:1), що у нормі являють собою серин, замінена на аспарагін (N). Поняття "328K+" або "модифікація 328K+" означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 (нумерація відповідно до амінокислотних положень в SEQ ID NO:1) вбудований другий лізин (K+). У тому випадку, коли амінокислоти, що 2 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зустрічаються в природних умовах, в положеннях 328 і 329 амінокислотної послідовності являють собою лізин-лізин, то додатковий лізин (K) не може бути вбудований. Однак у більшості відомих послідовностей Н5 у положеннях 328 і 329 присутні амінокислоти лізинаргінін. У будь-якому випадку поняття "модифікація 328K+" означає, що другий лізин (K) може бути вбудований між лізином у положенні 328 і аргініном у положенні 329. У результаті модифікована послідовність повинна зчитуватися як лізин-лізин-аргінін (KKR). Таким чином, даний винахід стосується білка H5 і будь-яких модифікованих форм білка H5, включаючи делеційний, отриманий у результаті заміни та/або інсерційний мутант білка H5, де вказані білки H5 мають амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, де нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень у представленій як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+). Очевидно, що будь-який з білків H5, представлених у даному винаході, є антигенним, тобто має антигенні властивості при оцінці за допомогою стандартного для вірусів грипу тесту гальмування гемаглютинації. Наступним варіантом здійснення даного винаходу є будь-яка частина білка H5, тобто будьякий пептидний фрагмент, що має антигенні властивості при оцінці за допомогою стандартного для вірусів грипу тесту гальмування гемаглютинації, який несе принаймні амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, де нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень у представленій як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+). Білок Н5 має антигенні властивості, якщо він інгібує (гальмує) гемаглютинацію при оцінці за допомогою стандартного тесту гальмування гемаглютинації, який описаний, наприклад, у прикладі 2. Як правило, вказаний антигенний фрагмент білка H5 містить 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 або переважно 105 суміжних амінокислот амінокислотної послідовності, що відповідає білку H5, як він описаний вище, модифікованому або немодифікованому, який має антигенні властивості при оцінці за допомогою стандартного тесту гальмування гемаглютинації, який описаний, наприклад, у прикладі 2. Стандартний тест гальмування гемаглютинації, наприклад, описаний також з додатковими посиланнями в Stephenson і ін., Virus Research т. 103, 2004, стор. 91-95. Однак слід розуміти, що описаний у прикладі 2 HI-тест являє собою відповідний еталонний аналіз, який можна застосовувати в сполученні з усіма об'єктами винаходу, які представлені в даному описі. У цілому, HI-тест здійснювали для виявлення присутності HA-специфічних антитіл. Гетерологічний вірус H5N2-підтипу A/chicken/Mexico/232/94 (A/курячий/Мехіко/232/94) застосовували в концентрації, що відповідає чотирьом гемаглютинуючим одиницям [4 HAодиниць] в HI-тесті. У титраційних мікропланшетах з U-подібним дном послідовно змішували серійні дворазові розведення в ЗФР із рівними об'ємами (25 мкл) вірусу, який містить 4 HAодиниці, й інкубували при кімнатній температурі (приблизно 25 °C) протягом 30 хв. Курячі еритроцити в концентрації 0,5 % у ЗФР додавали в лунки, що містять сироватку-вірус, і інкубували 40 хв при кімнатній температурі. Визначали HI-титри у вигляді обернених величин найбільших розведень сироватки, при яких виявлене гальмування гемаглютинації. Слід зазначити, що Haesebrouck і Pensaert, 1986, встановили, що "може існувати кореляція між HI-титрами відносно контрольного зараження вірусом і захисту від контрольного зараження". Haesebrouck і Pensaert, 1986, визначили також, що свині, у яких HI-титри становили >40, були "повністю стійкі до контрольного зараження й у їх дихальних шляхах не відбувалася реплікація вірусів при контрольному зараженні". Таким чином, досягнення при вакцинації свиней HI-титрів >40 повинно корелювати із захистом тварин (F. Haesebrouck і M.B. Pensaert, 1986, "Effect of intratracheal challenge of fattening pigs previously immunized with an inactivated influenza H1N1 vaccine", Veterinary Microbiology, 11, 1986, стор. 239-249). Можна припустити, що еквівалентні або принаймні близькі до еквівалентних HI-титри H5 повинні також приводити до повного імунного захисту свиней від вірусу пташиного грипу. Більш низькі титри приводять принаймні до сероконверсії у вакцинованих тварин і в результаті цього до часткового імунного захисту вказаних тварин, що може також різко знижувати ризик пандемій. Крім того, антигенний фрагмент білка H5, запропонований у винаході, включає, але, не обмежуючись тільки ними, делеційні мутанти білка H5, які містять: I. принаймні 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 або найбільш переважно 8 суміжних амінокислот амінокислотної послідовності, які оточують і включають амінокислоту 223N; і II. принаймні 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 або найбільш переважно 8 суміжних амінокислот амінокислотної послідовності, які оточують і включають амінокислотну модифікацію 328K+; і 3 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 III. при цьому будь-який із вказаних антигенних фрагментів білка H5 опосередковує гальмування гемаглютинації при оцінці за допомогою стандартного тесту гальмування гемаглютинації, описаного в прикладі 2. Переважно амінокислоти, що оточують амінокислоту 223N та/або 328K+, відповідають вказаним в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:4. Крім того, переважні білки H5, запропоновані у винаході, являють собою: I. будь-який із вказаних вище білків, що має амінокислоту 223N і модифікацію 328K+; II. будь-який із вказаних вище білків, що має амінокислоту 94N/223N і модифікацію 328K+; III. будь-який білок H5 пташиного походження, що має амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, де під пташиним походженням мається на увазі, що послідовність Н5 виведена з ізоляту вірусу, який спочатку виділений з свійських птахів, заражених вірусом пташиного грипу типу 5; або IV. будь-який білок H5 пташиного походження, що має амінокислоти 94N/223N і модифікацію 328K+, де під пташиним походженням мається на увазі, що послідовність Н5 виведена з ізоляту вірусу, який спочатку виділений з свійських птахів, заражених вірусом пташиного грипу типу 5; або V. будь-який білок H5 пташиного походження, що має амінокислоти 155N/223N і модифікацію 328K+, де під пташиним походженням мається на увазі, що послідовність Н5 виведена з ізоляту вірусу, який спочатку виділений з свійських птахів, заражених вірусом пташиного грипу типу 5; або VI. будь-який білок H5 пташиного походження, що має амінокислоти 120N/155N/223N і модифікацію 328K+, де під пташиним походженням мається на увазі, що послідовність Н5 виведена з ізоляту вірусу, який спочатку виділений з свійських птахів, заражених вірусом пташиного грипу типу 5; або VII. будь-який білок H5, що має модифікації 94N/223N і модифікацію 328K+; або VIII. будь-який білок H5, що має модифікації 94N/155N/223N і модифікацію 328K+; або IX. будь-який білок H5, що має модифікації 94N/120N/155N/223N і модифікацію 328K+; або X. будь-який білок H5, що має модифікацію 223N, модифікацію 328K+ і один або декілька наступних амінокислотних кластерів, вибраних із групи, яка включає: а. aк 93 - 95:GNF б. aк 123-125:SDH в. aк 128-130:SSG г. aк 138-140:GSS д. aк 226-228:MDF е. aк 270-272:EVE ж. aк 309-311:NKL; або XI. будь-який білок H5, що має амінокислоту 223N і модифікацію 328K+ і один або декілька наступних амінокислотних кластерів, вибраних із групи, яка включає: а. aк 93 - 95:GNF б. aк 128-130:SSG в. aк 138-140:GSS; або XII. будь-який білок H5, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4. Крім того, переважні білки H5, запропоновані у винаході, включають білки H5, які описані в Hoffmann і ін., PNAS, т. 106, №.36, 6 вересня 2005 р., стор. 12915-12920, де білки H5 включають одну або декілька описаних вище модифікацій, принаймні амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, при цьому нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень, наведеній як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+). Зміст вказаної публікації повністю включений в даний опис як посилання. Крім того, переважні білки H5, запропоновані у винаході, включають білки H5, які містять пептид, що несе амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, при цьому нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень, наведеній як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+), і: I. амінокислотні послідовності SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:6; або II. будь-який пептид, послідовність якого гомологічна принаймні на 85 %, більш переважна послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 90 %, ще більш переважна послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 95 %, ще більш переважна послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 97 %, ще більш переважна 4 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 98 % і ще більш переважна послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 99 %, до поліпептиду, описаного в підпункті I), що опосередковує гальмування гемаглютинації при оцінці стандартним тестом гальмування гемаглютинації, який описаний вище; або III. будь-який антигенний фрагмент поліпептидів, представлених у підпунктах I) або II), що містить принаймні 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 або найбільш переважно 8 суміжних амінокислот будь-якого з пептидів, представлених у підпунктах I) або II); IV. будь-який з пептидів, представлених у підпунктах I), II) або III), що має амінокислоти 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 223N, 223N або 120N/155N; V. будь-який з пептидів, представлених у підпунктах I), II), III) або IV), що має один або декілька наступних амінокислотних кластерів, вибраних із групи, яка включає: а. ак 93 - 95:GNF б. ак 123-125:SDH в. ак 128-130:SSG г. ак 138-140:GSS д. ак 226-228:MDF е. ак 270-272:EVE ж. ак 309-311:NKL; або VI. будь-який з пептидів, представлених у підпунктах I), II), III) або IV), що має один або декілька наступних амінокислотних кластерів, вибраних із групи, яка включає: а. ак 93 - 95:GNF б. ак 128-130:SSG в. ак 138-140:GSS. Визначення "гомології послідовностей" у контексті даного опису стосується методу визначення подібності двох послідовностей. Для визначення гомології послідовностей дві або більші кількості послідовності піддають оптимальному вирівнюванню й при необхідності інтродукують проломи. На відміну від оцінки ідентичності послідовностей при визначенні гомології послідовностей консервативні амінокислотні заміни вважають такими, що задовольняють умовам гомології. Інакше кажучи, для того, щоб поліпептид або полінуклеотид мав 95 % гомологію послідовності з референс-послідовністю, 85 %, переважно 90 %, ще більш переважно 95 % амінокислотних залишків або нуклеотидів у референс-послідовності повинні відповідати або містити консервативну заміну на іншу амінокислоту або нуклеотид, або кількість амінокислот або нуклеотидів, що становить аж до 15 %, переважно аж до 10 %, ще більш переважно аж до 5 % від загальної кількості амінокислотних залишків або нуклеотидів, не включаючи консервативні заміни, у референс-послідовності можна вбудовувати в референспослідовність. Переважно гомологічна послідовність містить принаймні ділянку, що складається з 50, ще більш переважно з 100, ще більш переважно з 250, ще більш переважно з 500 нуклеотидів. При вказаному порівняльному аналізі первинної структури гомологію послідовностей оцінюють за типом "положення з положенням", наприклад, послідовності є "гомологами" у конкретному положенні, якщо в цьому положенні нуклеотиди або амінокислотні залишки є ідентичними. Загальна кількість таких ідентичних положень потім ділять на загальну кількість нуклеотидів або амінокислотних залишків у референс-послідовності, одержуючи % гомології послідовностей. Гомологію послідовностей легко розраховувати за допомогою відомих методів, включаючи, але, не обмежуючись тільки ними, методи, описані в Computational Molecular Biology, під ред. Lesk A. N., вид-во Oxford University Press, New York 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, під ред. Smith D.W., вид-во Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, частина I, під ред. Griffin A.M. і Griffin H. G., видво, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., видво Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, під ред. Gribskov M. і Devereux J., вид-во M. Stockton Press, New York, 1991; і Carillo H. і Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, с. 1073, зміст яких включений в даний опис як посилання. Переважні методи визначення гомології послідовностей створені так, щоб одержувати найбільшу відповідність між досліджуваними послідовностями. Методи визначення гомології послідовностей наведені в систему в доступних громадськості комп'ютерних програмах, які дозволяють визначати ідентичність послідовностей між даними послідовностями. Прикладами таких програм є, але, не обмежуючись тільки ними, пакет програм GCG (Devereux J. і ін., Nucleic Acids Research, 12(1), 1984, с. 387), BLASTP, BLASTN і FASTA (Altschul S.F. і ін., J. Molec. Biol., 215, 1990, стор. 403-410). Програма BLASTX є доступної громадськості від фірми NCBI і інших джерел (BLAST Manual, Altschul S. і ін., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul S. F. і ін., J. Molec. Biol., 215, 1990, стор. 403-410), зміст 5 UA 99117 C2 5 яких включений в даний опис як посилання). Ці програми дозволяють здійснювати оптимальне вирівнювання послідовностей за допомогою прийнятих за замовчуванням значень, таких як вага пролому, для того, що одержувати найбільш високий рівень гомології послідовностей між досліджуваною послідовністю й референс-послідовністю. Крім того, переважні білки H5 включають білки H5, які містять вказану вище модифікацію 328K+, і амінокислотну послідовність, представлену в таблиці 1, або її будь-який імуногенний фрагмент: Таблиця 1 H5-антигени Найменування послідовності 223N/328K+ 36T/223N/328K+ 36K/223N/328k+ 83A/223N/328k+ 83T/223N/328k+ 83D/223N/328k+ 86A/223N/328k+ 86V/223N/328k+ 120N/223N/328k+ 120S/223N/328k+ 155N/223N/328k+ 155S/223N/328k+ 156A/223N/328k+ 156T/223N/328k+ 189R/223N/328k+ 189K/223N/328k+ 212K/223N/328k+ 212R/223N/328k+ 212E/223N/328k+ 223N/263A/328k+ 223N/263T/328k+ 120N/155N/223N/328k+ # Основна послідовність 36 будь-який HA H5 будь-який T HA H5 будь-який K HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 будь-який HA H5 83 Амінокислотні положення 86 120 155 156 189 212 223 263 N N N A N T N D N A N V N N N S N N N S N A N T N R N K N K N R N E N N A N T 6 N N N UA 99117 C2 Продовження таблиці 1 A/качиний/Китай/E3192/03/328k+ A/качиний/Китай/E3192/03_223N/328k+ A/качиний/Китай/E3192/03_120N/223N/328k+ A/качиний/Китай/E3192/03_155N/223N/328k+ A/качиний/Китай/E3192/03_120N/155N/223N/328k+ HA/HK/213/03/328k+ HA/В'єтнам/1203/04 HA/ В'єтнам /1203/04 _223N/328k+ HA// В'єтнам/3046/04 _223N/328k+ HA/ В'єтнам/3062/04 _223N/328k+ HA/курячий/ В'єтнам/ 39/04_223N/328k+ HA/соколиний/HKD0028/04_223N/328k+ HA/качиний/Сінгапур/3/97 _223N/328k+ HA/HK/156/97/328k+ AAR99628 T A A S D A R K N A AAR99628 T A A S D A R K N A AAR99628 T A A N D A R K N A AAR99628 T A A S N A R K N A AAR99628 T A A S N N R K N A AY518362 T K A T A V N S N S A T R K K R N N A T K T V S S T K R N T T A V S S T K R N T T A V S S T K R N T T A V S S T K R N T T A A S S A K E N A T D V S N A K E N A T A A S S A K E N T # амінокислотні положення, представлені в таблиці 1, відповідають положенням, наведеним як приклад в SEQ ID NO:1. Інакше кажучи, амінокислота 223 у таблиці 1 відповідає амінокислоті 223 у послідовності SEQ ID NO:1. -означає, що амінокислоти в цих положеннях відрізняються від представлених у референспослідовності. 5 10 15 20 25 Крім того, даний винахід стосується білків H5, які мають принаймні амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, де нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень, наведеній як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+), і які містять: I. пептид, що включає послідовності, які мають реєстраційні номери NCBI: AAT65209, CAJ32556, ABC47656, CAF21874, CAF21870, AAC58998, AAC58997, AAC58996, AAC58994, AAC58993, AAC58992, AAC58991, AAC58990, AAC58995, AAS45134, AAN17270, AAN17269, AAN17268, AAN17267, AAN17266, AAN17265, AAN17264, AAN17263, AAN17262, AAN17261, AAN17260, AAN17259, AAN17257, AAN17256, AAN17255, AAN17254, AAA43083, AAA43082, AAB19079, BAE48696, BAE48693, BAE48696, BAE48695, BAE48694, BAE48692, BAE48691, BAE48690, BAE48689, BAE48688, BAE48687, BAE48686, BAE48685, BAE48684, BAE48683, AAC58999, ABC72082, AAV91149, AAP71993, AAP71992, AAP71991, AAP71990, AAP71989, AAP72011, AAP72010, AAP72009, AAP72008, AAP72007, AAP72006, AAP72005, AAP72004, AAP72003, AAP72002, AAP72001, AAP72000, AAP71999, AAP71998, AAP71997, AAP71996, AAP71995, AAP71994, AAF99718, ABF58847, AAG38534, AAC32102, AAC32099, AAL75847, AAC32101, AAC32098, AAC32088, AAC32078, AAR99628, AAC32100, AAM49555, AAL75843, AAL75839, AAD13573, AAD13568, AAF04720, AAF04719, AAC34263, AAR16155, AAD13574, AAD13570, AAD13575, AAD13572, AAD13569, AAD13567, AAD13566, AAK57506, AAG01225, AAG01215, AAG01205, AAG01195 або ABD83813, модифіковані, як описано вище, це означає, що ці послідовності несуть вищевказані модифікації 223N і 328 K+, які не є частиною послідовностей дикого типу; або II. будь-який пептид, послідовність якого гомологічна принаймні на 85 %, більш переважна послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 90 %, ще більш переважна послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 95 %, ще більш переважна послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 97 %, ще більш переважна 7 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 98 % і ще більш переважна послідовність якого гомологічна принаймні приблизно на 99 %, до поліпептиду, описаного в підпункті I), і який опосередковує гальмування гемаглютинації при оцінці стандартним тестом гальмування гемаглютинації, який описаний вище; III. будь-який з пептидів, представлених у підпунктах I) або II), що має амінокислоти 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 263A, 263T або 120N/155N; або IV. будь-який з пептидів, представлених у підпунктах I), II) або III), що має один або декілька наступних амінокислотних кластерів, вибраних із групи, яка включає: а. ак 93-95: GNF б. ак 123-125: SDH в. ак 128-130: SSG г. ак 138-140: GSS д. ак 226-228: MDF е. ак 270-272: EVE ж. ак 309-311: NKL; або V. будь-який з пептидів, представлених у підпунктах I), II), III) або IV), що має один або декілька наступних амінокислотних кластерів, вибраних із групи, яка включає: а. ак 93-95: GNF б. ак 128-130: SSG в. ак 138-140: GSS. Іншим варіантом здійснення даного винаходу є також молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-який з білків H5, описаних вище. Переважно вказані молекули нуклеїнових кислот являють собою молекули РНК, ДНК або ДНК-копії (кДНК). Таким чином, даний винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, переважно молекули кДНК, що кодує білок H5 або будь-які модифіковані форми білка H5, включаючи будь-який делеційний, що несе заміну та/або інсерційний мутант білка H5, де вказані білки H5 мають амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, при цьому нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень, наведеній як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+). Другим варіантом здійснення даного винаходу є також молекула нуклеїнової кислоти, переважно молекула кДНК, що кодує будь-який фрагмент білка H5, тобто яка кодує будь-який пептидний фрагмент, що має антигенні властивості при оцінці за допомогою стандартного тесту гальмування гемаглютинації, описаного вище, і який має принаймні амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, при цьому нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень, наведеній як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+). Як правило, такі молекули нуклеїнових кислот, які кодують антигенний фрагмент білка H5, мають 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360, 330 або найбільш переважно 315 суміжних нуклеотидів нуклеотидної послідовності, що кодує вказаний вище білок H5, модифікований або немодифікований, і який має антигенні властивості при оцінці за допомогою стандартного тесту гальмування гемаглютинації, описаного вище. Інші варіанти антигенних фрагментів білка H5 описані вище. У компетенції фахівця в даній галузі знаходиться конструювання будь-яких вказаних молекул нуклеїнових кислот, переважно молекул кДНК, які кодують антигенний фрагмент білка H5, описаний вище. Вони включають також, але, не обмежуючись тільки ними, конструювання молекул нуклеїнових кислот, переважно молекул кДНК, які кодують описані вище антигенні фрагменти білка H5, у тому числі делеційні мутанти білка H5, які містять: I. принаймні 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 або найбільш переважно 24 суміжних кодуючих амінокислоту нуклеотидів нуклеотидної послідовності, що оточує й включає кодувальну послідовність, яка кодує амінокислоту 223N; і II. принаймні 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 або найбільш переважно 24 суміжних кодуючих амінокислоту нуклеотидів нуклеотидної послідовності, що оточує й включає кодувальну послідовність, яка кодує модифікацію 328K+; і III. при цьому, будь-який вказаний антигенний фрагмент білка H5 опосередковує гальмування гемаглютинації при оцінці за допомогою стандартного тесту гальмування гемаглютинації, який описаний у прикладі 2. Переважними нуклеотидами, які оточують нуклеотиди, які кодують амінокислоти 223N та/або 328K+, є ті нуклеотиди, які кодують SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:4. 8 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Крім того, переважними молекулами нуклеїнових кислот, що кодують білок H5, запропонований у винаході, є: I. будь-яка із вказаних вище молекул, що кодує амінокислоту 223N і модифікацію 328K+; II. будь-яка із вказаних вище молекул, що кодує амінокислоту 94N/223N і модифікацію 328K+; III. будь-яка з молекул нуклеїнових кислот пташиного походження, що кодує амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, де під пташиним походженням мається на увазі, що послідовність Н5 виведена з ізоляту вірусу, який спочатку виділений з свійських птахів, заражених вірусом пташиного грипу типу 5; або IV. будь-яка з молекул нуклеїнових кислот пташиного походження, що кодує амінокислоти 94N/223N і модифікацію 328K+, де під пташиним походженням мається на увазі, що послідовність Н5 виведена з ізоляту вірусу, який спочатку виділений з свійських птахів, заражених вірусом пташиного грипу типу 5; або V. будь-яка з молекул нуклеїнових кислот пташиного походження, що кодує амінокислоти 155N/223N і модифікацію 328K+, де під пташиним походженням мається на увазі, що послідовність Н5 виведена з ізоляту вірусу, який спочатку виділений з свійських птахів, заражених вірусом пташиного грипу типу 5; або VI. будь-яка молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує білок H5 пташиного походження, що має амінокислоти 120N/155N/223N і модифікацію 328K+, де під пташиним походженням мається на увазі, що послідовність Н5 виведена з ізоляту вірусу, який спочатку виділений з свійських птахів, заражених вірусом пташиного грипу типу 5; або VII. будь-яка молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує білок H5, що має модифікації 94N/223N і модифікацію 328K+; або VIII. будь-яка молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує білок H5, що має модифікації 94N/155N/223N і модифікацію 328K+; або IX. будь-яка молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує білок H5, що має модифікації 94N/120N/155N/223N і модифікацію 328K+; або X. будь-яка молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує білок H5, що має модифікації 223N, модифікацію 328K+ і один або декілька наступних амінокислотних кластерів, вибраних із групи, яка включає: а. ак 93-95: GNF б. ак 123-125: SDH в. ак 128-130: SSG г. ак 138-140: GSS д. ак 226-228: MDF е. ак 270-272: EVE ж. ак 309-311: NKL; або XI. будь-яка молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує білок H5, що має амінокислоту 223N, модифікацію 328K+ і один або декілька наступних амінокислотних кластерів, вибраних із групи, яка включає: а. ак 93-95: GNF б. ак 128-130: SSG в. ак 138-140: GSS; або XII. будь-яка молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує білок H5, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4. Крім того, переважні білки H5, запропоновані у винаході, включають білки H5, які описані в Hoffmann і ін., PNAS, т. 106, №.36, 6 вересня 2005 р., стор. 12915-12920, де білки H5 включають одну або декілька описаних вище модифікацій, принаймні амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, при цьому нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень, наведеній як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+). Зміст вказаної публікації повністю включений в даний опис як посилання. Таким чином, наступними варіантами здійснення даного винаходу є також молекула будь-якої нуклеїнової кислоти, переважно молекула кДНК, яка кодує будь-який з білків, описаних в Hoffmann і ін., PNAS, т. 106, №.36, 6 вересня 2005 р., стор. 12915-12920, де білки H5 включають одну або декілька описаних вище модифікацій, принаймні амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, при цьому нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень, наведеній як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+). 9 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Методи інтродукції будь-якої із вказаних вище модифікацій у нуклеотидну послідовність, включаючи кодувальну послідовність білка H5 вірусу грипу, добре відомі в даній галузі. Геномну послідовність повного вірусу грипу можна модифікувати відповідно до винаходу, наприклад, за допомогою методів, описаних в US 6951754, у тому числі в додаткових, наведених у ньому посиланнях. Крім того, можна застосовувати традиційні методи молекулярної біології, мікробіології й рекомбінантної ДНК, відомі в даній галузі, для модифікації нуклеотидної послідовності, що кодує антиген, представлений у даному описі. Такі методи докладно описані в літературі (див., наприклад, Sambrook і ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е вид., вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; DNA Cloning: A Practical Approach, т. I і т. II, під ред. D. N. Glover, 1985; Oligonucleotide Synthesis, під ред. M. J. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization під ред. B. D. Hames і S. J. Higgins, 1985; Transcription And Translation, під ред. B. D. Hames і S. J. Higgins, 1984; Animal Cell Culture, під ред. R. I. Freshney, 1986; Immobilized Cells And Enzymes, вид-во IRL Press, 1986; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984, Current Protocols in Molecular Biology, під ред. F. M. Ausubel і ін., вид-во, John Wiley & Sons, Inc., 1994). Наступним варіантом здійснення даного винаходу є також вектор, що містить будь-яку з описаних вище молекул нуклеїнових кислот. Інакше кажучи, даний винахід стосується вектора, що включає кодувальну послідовність будь-якого із представлених білків H5 або його фрагмент, вказаний вище. Переважно вектор являє собою експресійний вектор, що забезпечує експресію будь-якого із вказаних вище білків H5 або їх фрагментів. Вектори, запропоновані у винаході, являють собою вектори, придатні для трансфекції або зараження клітин бактерій, дріжджів або тварин in vitro або in vivo. Вектори й методи створення та/або застосування векторів (або рекомбінантів) для експресії можуть бути такими ж або аналогічними до тих, які описані серед іншого в: US 4603112, 4769330, 5174993, 5505941, 5338683, 5494807, 4722848, 5942235, 5364773, 5762938, 5770212, 5942235, 382425, публікаціях PCT WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update", PNAS USA 93, жовтень 1996 р., стор. 11349-11353, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety", PNAS USA 93, жовтень 1996 р., стор. 11341-11348, Smith і ін., US 4745051, (рекомбінантний бакуловірус), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" під ред. Richardson C.D.,1995, вид-во Humana Press Inc., Smith і ін., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, т. 3, №. 12, грудень 1983 р., стор. 2156-2165; Pennock і ін., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector", Molecular and Cellular Biology Mar., т. 4, №. 3, 1984, стор. 399-406; EPA 0370573, заявка па патент США 920197, зареєстрована 16 жовтня 1986 р., публікація EP 265785, U S 4769331 (рекомбінантний вірус герпесу простого), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors", PNAS USA 93, жовтень 1996 р., стор. 11307-11312, Andreansky і ін., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors", PNAS USA 93, жовтень 1996 р., стор. 11313-11318, Robertson і ін., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93, жовтень 1996 р., стор. 1133411340, Frolov і ін., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications", PNAS USA 93, жовтень 1996 м., стор. 11371-11377, Kitson і ін., J. Virol. 65, 1991, стор. 3068-3075; U S 5591439, 5552143, WO 98/00166, прийняті заявки на патент США, сер. №№ 08/675556 і 08/675566, обидві зареєстровані 3 липня 1996 р. (рекомбінантний аденовірус), Grunhaus і ін., 1992 "Adenovirus as cloning vectors", Seminars in Virology, т. 3, 1993, стор. 237-252, Ballay і ін., EMBO Journal, т. 4, стор. 3861-65, Graham, Tibtech 8, квітень 1990, стор. 85-87, Prevec і ін., J. Gen Virol. 70, с. 42434, PCT WO 91/11525, Felgner і ін., J. Biol. Chem. 269, 1994, стор. 2550-2561, Science, 259, 1993, стор. 1745-1749 і McClements і ін., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93, жовтень 1996 р., стор. 11414-11420, і US 5591639, 5589466 і 5580859, а також WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660, Tang і ін., Nature і Furth і ін., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors. Методи описані також в WO 98/33510; Ju і ін., Diabetologia, 41, 1998, стор. 736-739 (лентивірусная система експресії); Sanford і ін., US 4945050; Fischbachet і ін, (фірма Intracel), WO 90/01543; Robinson і ін., Seminars in Immunology т. 9, 1997, стор. 271-283, (системи на основі ДНК-вектора); Szoka і ін., US (метод інсерції ДНК у живі клітини); McCormick і ін., US 5677178 (застосування цитопатичних вірусів); і U S 5928913 (вектори для введення гена) (див. також інші документи, процитовані в вказані вище). 10 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вірусний вектор вибирають, наприклад, з вірусів герпесу свиней, такого як вірус, що викликає хворобу Ауескі, свинячий аденовірус, поксивірус, насамперед вірус коров'ячої віспи, вірус віспи птахів, вірус віспи канарок і вірусу віспи свиней, а також ДНК-вектори (ДНКплазміди), і їх доцільно застосовувати для втілення винаходу на практиці. Способи одержання білків H5, запропонованих у даному винаході Іншим об'єктом даного винаходу є способи одержання та/або виділення рекомбінантного білка Н5 у значних кількостях шляхом: I) здійснення зараження чутливих клітин у культурі рекомбінантним вірусним вектором, що містить кодувальні H5 послідовності ДНК, при цьому білок H5 експресується за допомогою рекомбінантного вірусного вектора, і II) наступного виділення білка H5 із клітинної культури. Поняття "значні кількості" білка H5 стосується рівнів, але не обмежуючись тільки ними, що становить більше приблизно 20 мкг/мл клітинної культури, переважно більше приблизно 25 мкг/мл, ще більш переважно більше приблизно 30 мкг/мл, ще більш переважно більше приблизно 40 мкг/мл, ще більш переважно більше приблизно 50 мкг/мл, ще більш переважно більше приблизно 60 мкг/мл, ще більш переважно більше приблизно 80 мкг/мл, ще більш переважно більше приблизно 100 мкг/мл, ще більш переважно більше приблизно 150 мкг/мл, найбільш переважно більше приблизно 190 мкг/мл. Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу білок H5 виділяють шляхом збору цільних (тобто інтактних) SF+-клітин, які експресують білок H5. Переважними клітинами є клітини, чутливі до зараження відповідним рекомбінантним вірусним вектором, що містить ДНК H5 і які експресують білок H5. Переважно клітини являють собою клітини комах, і найбільш переважно вони являють собою клітини комах, які надходять у продаж під торговельним знаком Sf+ (фірма Protein Sciences Corporation, Мериден, шт. Коннектикут). У переважних клітинних культурах кількість клітин становить приблизно 0,3-2,0 × 6 6 10 клітин/мл, більш переважно приблизно 0,35-1,9 × 10 клітин/мл, ще більш переважно 6 6 приблизно 0,4-1,8 × 10 клітин/мл, ще більш переважно приблизно 0,45-1,7 × 10 клітин/мл і 6 найбільш переважно приблизно 0,5-1,5 × 10 клітин/мл. Переважними вірусними векторами є бакуловіруси, такі як BaculoGold (фірма BD Biosciences Pharmingen, Сан-Дієго, шт. Каліфорнія), при цьому передбачається, що клітинамипродуцентами є клітини комах. Хоча бакуловірусна система експресії є переважною, фахівцям у даній галузі повинно бути очевидно, що для цілей даного винаходу можна застосовувати інші експресійні системи, зокрема експресію H5 можна здійснювати в супернатанті клітинної культури. У вказаних інших експресійних системах може вимагатися застосування сигнальної послідовності для здійснення експресії H5 у середовищах. Фахівцям у даній галузі відомі також відповідні живильні середовища, при цьому переважними живильними середовищами є безсироваткові середовища для клітин комах, такі як Excell 420 (фірма JRH Biosciences, Inc., Ленекса, шт. Канзас) і т.п. Рекомбінантний вірусний вектор, що містить послідовності ДНК Н5, переважно має множинність зараження (MOI), що становить приблизно 0,03-1,5, більш переважно приблизно 0,05-1,3, ще більш переважно приблизно 0,09-1,1 і найбільш переважно 0,1-1,0, коли його застосовують для зараження чутливих клітин. Переважно вказані вище значення MOI виражені в перерахуванні на 1 мл рідкої клітинної культури. Переважно в запропонованому у винаході 6 способі мається на увазі, що заражають 0,35-1,9 × 10 клітин/мл, ще більш переважно 6 6 приблизно 0,4-1,8 × 10 клітин/мл, ще більш переважно приблизно 0,45-1,7 × 10 клітин/мл і 6 найбільш переважно приблизно 0,5-1,5 × 10 клітин/мл, рекомбінантним вірусним вектором, що містить ДНК H5 і який експресує білок H5, при MOI (множинність зараження), що становить приблизно 0,03-1,5, більш переважно приблизно 0,05-1,3, ще більш переважно приблизно 0,091,1 і найбільш переважно приблизно 0,1-1,0. Заражені клітини потім інкубують протягом періоду часу, що становить аж до 10 днів, більш переважно від 2 днів до приблизно 10 днів, ще більш переважно від приблизно 4 днів до приблизно 9 днів і найбільш переважно від приблизно 5 днів до приблизно 8 днів. Переважні умови інкубації включають температуру приблизно 22-32 °C, більш переважно приблизно 2430 °C, ще більш переважно приблизно 25-29 °C, ще більш переважно приблизно 26-28 °C і найбільш переважно приблизно 27 °C. Переважно в Sf+-клітинах після інкубації оцінюють характерні індуковані бакуловірусом зміни. Така оцінка може включати моніторинг тенденцій клітинної щільності й зниження життєздатності під час періоду після зараження. Було встановлено, що пік вірусного титру виявлений через 3-5 днів після зараження, а пік експресії білка H5 у клітинах виявлений між 5 і 8 днями, та/або коли життєздатність клітин знижена до менше 10 %. Таким образом, одним з об'єктів даного винаходу є спосіб одержання та/або виділення рекомбінантного білка H5, переважно в вказаній вище кількості, який полягає в тому, що I) 11 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснюють зараження певної кількості чутливих клітин (див. вище) у культурі рекомбінантним вірусним вектором при вказаному вище значенні MOI, II) експресують білок H5 за допомогою рекомбінантного вірусного вектора й III) потім виділяють білок H5 з отриманих клітин через 5-8 днів після зараження та/або, коли життєздатність клітин знизиться до менше 10 %. Переважно рекомбінантний вірусний вектор являє собою рекомбінантний бакуловірус, що містить кодувальні послідовності ДНК Н5, а клітини являють собою Sf+-клітини. Крім того, переважно культуру періодично піддають макроскопічному й мікроскопічному обстеженню для одержання даних про забруднення або атипічних змінах клітинної морфології в процесі періоду після зараження. Будь-яку культуру, що містить яке-небудь забруднення, слід видаляти. Для виділення білка H5, який можна застосовувати в імуногенній або імунологічній композиції, такій як вакцина, переважним є включення стадії інактивації для інактивації вірусного вектора. Поняття "імуногенна або імунологічна композиція" стосується композиції, запропонованій у винаході, що містить принаймні один антиген, який викликає імунологічну відповідь у хазяїні, таку як клітинна та/або гуморальна імунна відповідь на композицію або вакцину, що представляє інтерес. Як правило, "імунологічна відповідь" включає, але не обмежуючись тільки ними, одну або декілька наступних реакцій: виробництво або активація антитіл, B-клітин, Тклітин-хелперів, Т-клітин-супресорів та/або цитотоксичних T-клітин та/або гамма-дельта-тклітин, специфічних відносно антигену або антигенів, що входять до складу композиції або вакцини, що представляє інтерес. Переважно в хазяїна, у якого виникає терапевтична або захисна імунна відповідь, така як стійкість до нової інфекції, повинно відбуватися зниження розвитку та/або серйозності клінічних симптомів захворювання. Вказаний захист можна продемонструвати або за зниженням або відсутністю симптомів, характерних для зараженого хазяїна, більш швидкого відновленню та/або за зниженим вірусним титром в зараженого хазяїна. Таким чином, даний винахід стосується також способу одержання та/або виділення рекомбінантного білка H5, переважно у вказаній вище кількості, який полягає в тому, що I) здійснюють зараження певної кількості чутливих клітин (див. вище) у культурі рекомбінантним вірусним вектором при вказаному вище значенні MOI, II) експресують білок H5 за допомогою рекомбінантного вірусного вектора й III) потім виділяють білок H5 з отриманих клітин через 5-8 днів після зараження та/або, коли життєздатність клітин знизиться до менше 10 %, і IV) інактивують рекомбінантний вірусний вектор. Переважно вказану інактивацію здійснюють безпосередньо до або безпосередньо після стадії фільтрації, при цьому переважно інактивацію здійснюють після стадії фільтрації. Для цілей даного винаходу можна використовувати будь-який загальноприйнятий метод інактивації. Так, інактивацію можна здійснювати шляхом хімічної та/або фізичної обробки. У переважних варіантах здійснення винаходу визначають об'єм зібраної рідини й температуру доводять приблизно до 32-42 °C, більш переважно приблизно до 34-40 °C і найбільш переважно приблизно 35-39 °C. Переважні методи інактивації включають додавання циклізованого бінарного етиленіміну (BEI), переважно в концентрації від приблизно 1 до приблизно 20 мМ, переважно від приблизно 2 до приблизно 10 мМ, ще більш переважно від приблизно 2 до приблизно 8 мМ, ще більш переважно від приблизно 3 до приблизно 7 мМ, найбільш переважно приблизно 5 мМ. Наприклад, інактивація включає додавання розчину гідроброміду 2брометиленаміну, переважно приблизно 0,4M, який був циклізований до 0,4M бінарного етиленіміну (BEI) в 0,3н. NaOH, до рідин до одержання кінцевої концентрації приблизно 5 мМ BEI. Переважно потім рідини перемішують протягом 72-96 ч і інактивовані зібрані рідини можна зберігати в замороженому стані при температурі -40 °C або нижче або приблизно 1-7 °C. Після завершення інактивації додають розчин тіосульфату натрію, переважно 1,0M, для нейтралізації яких-небудь залишкових кількостей BEI. Переважно тіосульфат натрію додають у кількості, еквівалентній відносно кількості BEI, доданій раніше для інактивації. Наприклад, якщо BEI додають до кінцевої концентрації 5 мм, то додають 1,0M тіосульфат натрію до досягнення кінцевої мінімальної концентрації 5 мм для нейтралізації яких-небудь залишкових кількостей BEI. Таким образом, ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання рекомбінантного білка H5, переважно у вказаних вище кількостях, який полягає в тому, що I) здійснюють зараження певної кількості чутливих клітин (див. вище) у культурі рекомбінантним вірусним вектором при вказаному вище значенні MOI, II) експресують білок H5 за допомогою рекомбінантного вірусного вектора й III) потім виділяють білок H5 з отриманих клітин через 5-8 днів після зараження та/або, коли життєздатність клітин знизиться до менше 10 %, і IV) інактивують рекомбінантний вірусний вектор. Переважно рекомбінантний вірусний вектор являє 12 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 собою бакуловірус, що містить кодувальні послідовності ДНК Н5, і клітини являють собою SF+клітини. Переважні стадії інактивації описані вище. Переважно інактивацію здійснюють приблизно при 35-39 °C і в присутності 2-8 мМ BEI, ще більш переважно в присутності приблизно 5 мМ BEI. Таким чином, згідно із ще одним об'єктом даного винаходу описаний вище спосіб включає також стадію нейтралізації після стадії IV. На стадії V) додають в еквівалентній кількості агент, який нейтралізує інактивуючий агент у розчині. Переважно, якщо інактивуючий агент являє собою BEI, то переважно додають тіосульфат натрію до досягнення еквівалентної кількості. Таким чином, згідно із ще одним об'єктом винаходу стадія V) полягає в тому, що додають розчин тіосульфату натрію до кінцевої концентрації від приблизно 1 до приблизно 20 мМ, переважно від приблизно 2 до приблизно 10 мМ, ще більш переважно від приблизно 2 до приблизно 8 мМ, ще більш переважно від приблизно 3 до приблизно 7 мМ, найбільш переважно приблизно 5 мМ, коли інактивуючий агент являє собою BEI. У переважних варіантах здійснення винаходу й насамперед у варіантах, які дозволяють застосовувати рекомбінантний білок H5 в імуногенній композиції, такій як вакцина, кожну партію зібраного білка H5 треба тестувати відносно інактивації шляхом пересівання в залежні від прикріплення, чутливі до бакуловірусів клітини комах, такі як Sf9-клітини. У переважному 2 варіанті цієї оцінки 150 см моношару відповідні клітинні культури інокулюють 1,0 мл інактивованих утримуючих H5 рідин і витримують при 25-29 °C протягом 14 днів принаймні із двома пересіваннями. Наприкінці періоду підтримування клітинні моношари оцінюють у відношенні цитопатогенної дії (ЦПД), типової для бакуловірусу, що містить H5. Переважно застосовують також позитивні вірусні контролі. Такі контролі можуть являти собою тільки одну культуру Sf9-клітин, інокульованих неактивованим референс-бакуловірусом, що містить H5, і одну колбу із Sf9-клітинами, що залишилися неінокульованими. Після інкубації й пересівання відсутність заражених вірусом клітин в оброблених BEI рідинах, що містять віруси, повинне задовольняти вимогам тесту на інактивацію. Відносно контрольних клітин, інокульованих референс-вірусом, повинно проявлятися ЦПД, характерне для бакуловірусу, що містить H5, а в неінокульованій колбі не повинні бути присутні ознаки зв'язаного з H5 бакуловірусу ЦПД. В іншому варіанті наприкінці стадії підтримування можна збирати зразки супернатанта й інокулювати Sf9-клітини на 96-лункову планшеті, завантаженому Sf9-клітинами, і потім підтримувати при 25-29 °C протягом 5-6 днів. Потім планшет фіксують і фарбують антитілом до H5, кон'югованим з ФІТЦ, або будь-яким міченим антитілом до специфічних для бакуловірусу білків (тобто gp64). Відсутність ЦПД, експресії H5 або експресії специфічних білків бакуловірусу (тобто gp64) в оброблених BEI рідинах, які містять віруси, задовольняють вимогам тесту на інактивацію. У контрольних клітинах, інокульованих референс-вірусом, повинні проявлятися ЦПД і активність, яка виявляється за допомогою методу непрямої імунофлуоресценції (IFAактивність), а в неінокульованій колбі не повинні бути присутні ознаки зв'язаного з H5 бакуловірусу ЦПД і повинна бути відсутня IFA-активність. Таким чином, ще одним об'єктом винаходу є тест на інактивацію, призначений для визначення ефективності інактивації рекомбінантного вірусного вектора, який експресує білок, що включає наступні стадії, на яких: I) приводять у контакт принаймні частину культуральної рідини, що містить рекомбінантний вірусний вектор, з інактивуючим агентом, переважно описаним вище, II) додають нейтралізуючий агент для нейтралізації інактивуючого агента, переважно описаний вище, і III) визначають залишкову інфективність за допомогою описаних вище аналізів. Після інактивації відносна кількість рекомбінантного білка H5 у зразку можна визначати різними шляхами. Переважними методами кількісної оцінки є ДСН-ПААГ-денситометрія, ELISA і досліди з використанням вакцинації тварин, які засновані на кореляції відомих кількостей вакцини й клінічних наслідків (серологія й т.д.). Коли для кількісної оцінки застосовують ДСНПААГ, то зразок продукту, що містить невідому кількість рекомбінантного білка H5, розганяють у гелі разом зі зразками, які містять різні відомі кількості рекомбінантного білка H5. Потім можна одержувати стандартну криву на основі даних для зразків з відомим вмістом білка й кількість рекомбінантного H5 у зразках з невідомим вмістом можна визначати шляхом порівняння зі стандартної кривої. Оскільки ELISA, як правило, визнані як індустріальний стандарт для кількісної оцінки антигенів, то цей аналіз є переважним для кількісної оцінки. Вакцини, що містять білки H5 або молекули нуклеїнових кислот, які їх кодують, або вектори Ще одним об'єктом даного винаходу є вакцини або фармацевтичні композиції в цілому, які містять: I. один або декілька білків H5, запропонованих у даному винаході; 13 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 II. одну або декілька молекул нуклеїнових кислот, запропонованих у даному винаході, які кодують будь-який з білків H5; та/або III. один або декілька векторів, запропонованих у даному винаході, які включають будь-яку з молекул нуклеїнових кислот і кодують будь-який із вказаних білків H5, запропонованих у даному винаході; і IV. фармацевтично прийнятний носій та/або екципієнт. Поняття "фармацевтична композиція", "фармацевтична композиція/вакцина" у контексті даного опису включать, але не обмежуючись тільки ними, вакцини, призначені для зниження або попередження інфекції, або для включення в композицію, запропоновану у винаході, призначений для лікування й зниження інфекції. Одержання вакцин, переважно кДНК-вакцин, на основі нуклеїнових кислот, що кодують гемаглютинін грипу, описано, наприклад, в Deck і ін., Vaccine 15(1), 1997, стор. 71-78; Ulmer і ін., Science, 259, 1993, стор. 1745-1749; Ulmer і ін., Vaccine, 12(16), 1994, стор. 1541-1544. Будь-який з описаних методів можна застосовувати для одержання вакцин, переважно кДНК-вакцин, на основі нуклеїнових кислот, які кодують білок H5 грипу. Крім того, вакцину, що містить запропонований у винаході білок H5 або його фрагмент, можна одержувати з використанням традиційних підходів, наприклад методами рекомбінантної експресії або методами біохімічного очищення й розділення. Методи рекомбінантної експресії, включаючи методи експресії в клітинах комах, добре відомі в даній галузі й описані, наприклад, в Sambrook і ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е вид., вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; DNA Cloning: A Practical Approach, Т.Т.I і II під ред. D. N. Glover, 1985; Oligonucleotide Synthesis под. ред. M. J. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization, під ред. B. D. Hames і S. J. Higgins, 1985; Transcription And Translation, під ред. B. D. Hames і S. J. Higgins, 1984; Animal Cell Culture, під ред. R. I. Freshney, 1986; Immobilized Cells And Enzymes, вид-во IRL Press, 1986; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984; Current Protocols in Molecular Biology, під ред. F. M. Ausubel і ін., вид-во John Wiley & Sons, Inc., 1994. Крім того, прикладами добре вивчених рекомбінантних експресійних систем є бактеріальні системи експресії, такі як E. coli або B. subtilis, експресійні системи на основі дріжджів, таких як S. cerevisiae або S. pombe, або експресійні системи на основі клітин ссавців, наприклад, системи експресії на основі клітин BHK, CHO та/або NS0. Такі системи добре відомі в даній галузі, і, як правило, їх можна купувати через фірму Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303-4607, USA. Інші стратегії експресії описані, наприклад, в Luschow і ін., Vaccine №19, 2001, стор. 4249-425 або в Veit і ін., PNAS, т. 103, 2006, стор. 81978202. Крім того, добре відомі системи на основі рекомбінантного аденоасоційнованого вірусу, і вони описані, наприклад, в US 5436146 або WO 2002/03872, у тому числі в додаткові наведені в вказаних документах посиланнях. Крім того, системи експресії на основі вірусу коров'ячої віспи (віспа, хвороба з висипаннями на шкірі), наприклад, описані в US 6265183, у тому числі в додаткові наведені в ньому посиланнях, також є добре відомими і їх можна застосовувати для одержання рекомбінантного(их) антигену(ів), антигенної(их) композиції(ій) відповідно до винаходу. Інші придатні експресійні системи, створені на основі рекомбінантних вірусів Попова, таких як ОВ-40, вірус пташиного грипу, вірус псевдосказу й ретровіруси. Прийнятні фармацевтичні композиції/вакцини, запропоновані в даному винаході, можуть містити також запропонований у даному винаході інактивований вірус, який містить білок H5, непатогенну версію живого вірусу, який містить білок H5, препарат та/або фрагмент вірусу, де препарат та/або фрагмент містять білок H5, запропонований у даному винаході. Фахівцям у даній галузі відомі інші компоненти, які можуть входити до складу композицій/вакцин у сполученні з антигеном (див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е вид., вид-во Mack Publ., Easton, 1990). Експертові відомі ін'єковані, фізіологічно прийнятні стерильні розчини. Для приготування готового до застосування розчину широко відомі водні ізотонічні розчини, наприклад, фізіологічний розчин або відповідні розчини білків плазми. Фармацевтична композиція /вакцина можуть являти собою ліофілізати або сухі препарати, які можна відновлювати відомим ін'єкованим розчином безпосередньо перед застосуванням у стерильних умовах, наприклад, являти собою набір, що складається з компонентів. Крім того, фармацевтичні композиції/вакцини, запропоновані в даному винаході, можуть містити також один або декілька прийнятних для застосування у ветеринарії носіїв. У контексті даного опису поняття "прийнятний для застосування у ветеринарії носій" включає, але не обмежуючись тільки ними, будь-які й всі розчинники, дисперсійні середовища, матеріали для нанесення покриття, ад'юванти, стабілізатори, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні й 14 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 протигрибкові агенти, агенти для додання ізотонічності, агенти, які сповільнюють адсорбцію й т.п. Розріджувачі можуть являти собою воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин і т.п. Агенти для додання ізотонічності можуть являти собою, зокрема, хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт і лактозу. Стабілізатори являють собою, зокрема, альбумін і солі лужних металів і етилендіамінтетраоцтової кислоти. Поняття "консервант" у контексті даного опису стосується діючої речовини, яка має протимікробну активність, такої, наприклад, як гентаміцин, мертіолат і т.п. Зокрема, додавання консерванту найбільш переважно при приготуванні композиції у вигляді декількох доз. Вказані діючі речовини, які мають протимікробну активність, додають у концентраціях, ефективних для попередження будь-якого мікробного забруднення композиції, що представляє інтерес, або для інгібування росту мікроорганізмів у композиції, що представляє інтерес. Поняття "ад'юванти" у контексті даного опису може стосуватися гідроксиду алюмінію й фосфату алюмінію, сапонінів, таких, наприклад, як, Quil A, QS-21 (фірма Cambridge Biotech Inc., Кембридж, шт. Масачусетс), GPI-0100 (фірма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бірмінгем, шт. Алабама), емульсія воді-у-маслі, емульсія масло-у-воді, емульсія вода-у-маслі-у-воді. Основою емульсії може бути, зокрема, легке рідке парафінове масло (яке відповідає Європейській фармакопеї); ізопреноїдне масло, таке як сквалан або сквален; масло, яке утворилося в результаті олігомеризації алкенів, насамперед ізобутену або децену; ефіри кислот або спиртів, що містять лінійну алкільну групу, більш конкретно рослинні олії, етилолеат, ди(каприлат/капрат) пропіленгліколю, три(каприлат/капрат) гліцерини або діолеат пропіленгліколю; ефіри розгалужених жирних кислот або спиртів, зокрема, ефіри ізостеаринової кислоти. Масла застосовують у сполученні з емульгаторами для одержання емульсії. Емульгатори переважно являють собою неіоногенні поверхнево-активні речовини, насамперед складні ефіри сорбітану, маніду (наприклад, безводний манітолеат), гліколю, полігліцерину, пропіленгліколю й олеїнової, ізостеаринової, рицинолеїнової або гідроксистеаринової кислоти, які необов'язково є етоксилованими, і блок-співполімери поліоксипропілену-поліоксіетилену, зокрема продукти типу Pluronic, насамперед L121 (див. Hunter і ін., The Theory and Practical Application of Adjuvants, під ред. Stewart-Tull D. E. S., вид-во JohnWiley and Sons, NY, стор. 51-94, 1995 і Todd і ін., Vaccine 15, 1997, стор. 564-570). Прикладами прийнятних емульсій типу масло® ® у-воді є ад'юванти на основі емульсигену (Emulsigen), такі як EMULSIGEN , EMULSIGEN-D , ® ® EMULSIGEN-P , EMULSIGEN-75 (фірма MVP Laboratories, Inc., Омаха, шт. Небраска). При створенні винаходу несподівано було встановлено, що можна підвищувати ефективність фармацевтичних композицій/вакцин, які містять білок H5, переважно рекомбінантний білок H5, запропонований у винаході, за допомогою емульсій типу масло-у-воді, переважно за допомогою ® ад'ювантів на основі емульсигену, більш переважно за допомогою EMULSIGEN і EMULSIGEN® P . Крім того, можна застосовувати SPT-емульсію, описану на с. 147 в: "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", під ред. M. Powell і M. Newman, з Plenum Press, 1995, і емульсію MF59, описану на с. 183 у цій же публікації. Іншим прикладом ад'юванту є сполука, вибрана з полімерів акрилової або метакрилової кислоти й співполімерів малеїнового ангідриду й алкенільного похідного. Переважними ад'ювантами є полімери акрилової або метакрилової кислоти, насамперед, зшиті із простими поліалкеніловими ефірами цукрів або багатоатомних спиртів. Ці сполуки відомі за назвою карбомери (Phameuropa, т. 8, №. 2 червня 1996 р.). Фахівцям у даній галузі як посилання можна запропонувати US 2909462, у якому описані вказані акрилові полімери, які зшиті з полігідроксилованою сполукою, яка має принаймні 3 гідроксильні групи, переважно не більше 8, при цьому атоми водню принаймні трьох гідроксильних груп заміщені ненасиченими аліфатичними радикалами, які мають принаймні 2 атоми вуглецю. Переважними є радикали, які містять від 2 до 4 атомів вуглецю, наприклад, вінільні, алільні й інші ненасичені групи ряду етилену. Ненасичені радикали можуть самі містити інші замісники, такі як метил. Найбільш переважними є продукти, що надходять у продаж за назвою карбопол (Carbopol) (фірма BF Goodrich, шт. Огайо). Їх зшивають із алілсахарозою або алілпентаеритритолом. Серед насамперед слід згадати Carbopol 974P, 934P і 971P. Найбільш переважним для застосування є Cabopol 971P. Із співполімерів малеїнового ангідриду й алкенільного похідного слід згадати співполімери EMA (фірма Monsanto), що представляють собою співполімери малеїнового ангідриду й етилену. Розчинення цих полімерів у воді приводить до одержання кислого розчину, який слід нейтралізувати, переважно до фізіологічного значення pН, для одержання розчину ад'юванту, у який можна включати імуноногену, імунологічну композицію або вакцину. 15 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також прийнятними ад'ювантами серед іншого є, але не обмежуючись тільки ними, система RIBI- ад'ювантів (фірма Ribi Inc.), блок-співполімери (фірма CytRx, Анланта, шт. Джорджия), SAF-M (фірма Chiron, Emeryville, шт. Каліфорнія), монофосфорил-ліпід A, ад'ювант на основі ліпіду аврідин-аміну, термолабільний ентеротоксин E. coli (рекомбінантний чи ні), токсин холери або мураміл-дипептид. Переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Ще більш переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Ще більш переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 500 мкг до приблизно 5 мг на дозу. Ще більш переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 750 мкг до приблизно 2,5 мг на дозу. Найбільш переважно ад'ювант додають у кількості приблизно 1 мг на дозу. Фармацевтичні композиції/вакцини можуть містити також один або декілька інших імуномодулуючих агентів, таких, наприклад, як інтерлейкіни, інтерферони або інші цитокіни. Фармацевтичні композиції/вакцини можуть містити також гентаміцин і мертіолат. Хоча фахівець у даній галузі легко може визначити кількості й концентрації ад'ювантів і добавок, які можна застосовувати в контексті даного винаходу, у даному винаході запропоновані композиції, що містять від приблизно 50 до приблизно 2000 мкг ад'юванту й переважно приблизно 250 мкг/мл дози композиції вакцини. Іншим переважним варіантом здійснення даного винаходу є композиції вакцин, що містять від приблизно 1 до приблизно 60 мкг/мл антибіотиків і більш переважно менш приблизно 30 мкг/мл антибіотиків. Таким чином, наступним варіантом здійснення даного винаходу є фармацевтична композиція/вакцина, що містить: I. у терапевтично ефективній кількості будь-який з білків H5 вірусу грипу, запропонованих у даному винаході, де білок H5 має амінокислоту 223N і модифікацію 328K+, при цьому нумерація амінокислотних положень білка H5 відповідає нумерації амінокислотних положень, наведеній як приклад в SEQ ID NO:1, і де модифікація 328K+ означає, що в амінокислотне положення 328 білка H5 вбудований другий лізин (K+); і II. фармацевтично прийнятні ад'юванти, описані вище. Переважно ад'ювант вибирають із групи, що включає: ® а) EMULSIGEN , емульсія масло-у-воді (o/w); ® б) EMULSIGEN-D , емульсія масло-у-воді (o/w) із бромідом диметилдіоктадециламонію (DDA); в) Polygen, співполімер; ® г) EMULSIGEN-P , емульсія масло-у-воді (o/w) із імуностимулятором, який входить до її складу; д) Carbigen, що представляє собою сітчастий полімер; ® е) EMULSIGEN-75 , подвійний ад'ювант, що представляє собою емульсію масло-у-воді (o/w) із сітчастим полімером; ж) ISA 70, що представляє собою емульсію воді-у-маслі (w/o). Найбільш переважно ад'юванти являють собою емульсію масло-у-воді, як у випадку ® ад'ювантів, основою яких є емульсиген, які вибирають із групи, що включає EMULSIGEN , ® ® ® ® ® EMULSIGEN-D , EMULSIGEN-P , EMULSIGEN-75 , EMULSIGEN і EMULSIGEN-P . Найбільш переважно в препаративних формах, запропонованих у даному винаході, застосовують ® ® EMULSIGEN і EMULSIGEN-P . Таким чином, наступним об'єктом винаходу є фармацевтичні композиції/вакцини, що містять один або декілька антигенів. Переважно додатковий антиген являє собою пташиний патоген або патоген ссавців. Відповідно до додаткових варіантів здійснення винаходу додатковий антиген являє собою інший антиген вірусу грипу, такий як гемаглютинін H3, H7, H9 або будьякий інший гемаглютинін віруси грипу. Додатковий(і) антиген(и) можна вводити в очищеній формі, як частину антигенного препарату, у формі вбитого мікроорганізму або у формі модифікованого живого мікроорганізму. Поняття "антиген" у контексті даного опису включає, але не обмежуючись тільки ними, пептиди, поліпепептиди, глікопептиди або полісахариди, які мають здатність специфічно взаємодіяти з антигенрозпізнавальною молекулою імунної системи, такою як імуноглобулін (антитіло) або T-клітинний рецептор антигену, викликаючи, активуючи або стимулюючи імунну відповідь проти вказаного антигену в хазяїні, у який вводять антиген. Поняття "антиген" стосується також молекул нуклеїнових кислот, переважно молекул ДНК або РНК, будь-яка з яких кодує й експресує пептид, поліпептид або глікопептид, які мають здатність специфічно взаємодіяти з антигенрозпізнавальною молекулою імунної системи, такою як імуноглобулін (антитіло) або T-клітинний рецептор антигену, викликаючи, активуючи або стимулюючи імунну 16 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідь проти антигену, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти. Антиген, який використовується для приготування фармацевтичної композиції, що застосовують відповідно до винаходу, являє собою мікроорганізм або антигенний фрагмент та/або препарат, що включає вказаний мікроорганізм. У цьому зв'язку поняття "імунізація" у контексті даного опису включає, але не обмежуючись тільки ними, будь-яке викликання або посилення імунної відповіді. Поняття "імунна відповідь" уже пояснена вище. Стратегії застосування протигрипозних вакцин добре відомо в даній галузі. До них належать стратегії мукозальної вакцинації при застосуванні противірусних вакцин, що містять інактивовані або ослаблені віруси. Коли слизова оболонка є мішенню для місцевого введення вакцин, можна застосовувати різні стратегії для введення імуногенних білків у слизову оболонку. Відповідно до конкретного варіанта здійснення винаходу вакцину можна вводити в суміші або у вигляді кон'югату або у вигляді химерного злитого білка з токсином холери, таким як холерний токсин В або химера A/B холерного токсину (Hajishengallis, J Immunol., 154, 1995, стор. 4322-4332; Jobling і Holmes, Infect Immun., 60, 1992, стор. 4915-4924). Описані мукозальні вакцини, основою яких є субодиниці холерного токсину B (Lebens і Holmgren, Dev Biol Stand 82, 1994, стор. 215-227). В іншому варіанті здійснення винаходу для мукозальної вакцинації можна застосовувати суміш із термолабільним ентеротоксином (LT). Інші стратегії мукозальної імунізації передбачають капсуловані вірусу в мікрокапсули (US 5075109, US 5820883 і US 5853763) і за допомогою мембранного носія, який посилює імунізацію (WO 98/0558). Імуногенність імуногенів, які вводять перорально, можна підсилювати за допомогою еритроцитів (rbc) або гемолізованих еритроцитів (US 5643577), або за допомогою антигену вірусу "синього язика" (US 5690938). Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання фармацевтичної композиції/вакцини, описаної вище, переважно спосіб одержання вакцини, що містить рекомбінантний, білок H5, який експресується бакуловірусом, описаний вище. У цілому, спосіб полягає в тому, переносять конструкцію у вірус, де конструкція містить I) рекомбінантну кДНК H5, запропоновану в даному описі, II) заражають живильні середовища трансфектованим вірусом, III) забезпечують експресію рекомбінантного білка H5, запропонованого у винаході, IV) виділяють експресований білок H5 з культури й V) готують композицію шляхом змішування експресованого білка H5 із прийнятним ад'ювантом та/або іншим фармацевтично прийнятним носієм. Переважні ад'юванти описані вище. Таким чином, наступним об'єктом винаходу є спосіб одержання антигенної композиції, такої, наприклад, як вакцина, призначена для викликання імунної відповіді на грипозну інфекцію, який полягає в тому, що I) одержують і виділяють білок H5 і II) змішують його із прийнятними ад'ювантами. Крім того, до складу композиції вакцини, запропонованої в даному винаході, можуть входити також розріджувачі, агенти для додання ізотонічності, стабілізатори та/або консерванти. Розріджувачі можуть являти собою воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин і т.п. Агенти для додання ізотонічності можуть являти собою серед іншого солі неорганічних або органічних кислот, наприклад, хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт, і лактозу, сахариди, трегалозу, маніт, сахарозу. Стабілізатори являють собою, зокрема, альбумін і солі лужних металів і етилендіамінтетраоцтової кислоти. Прийнятні ад'юванти описані вище. Медичне застосування будь-яких вказаних білків H5, молекул нуклеїнових кислот, векторів і вакцин Описані вище білки H5, молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-які вказані білки H5, вектори, які містять будь-які молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-які білки H5, запропоновані у винаході, і будь-яку фармацевтичну композицію/вакцину, що містить будь-який вказаний білок H5, молекулу нуклеїнової кислоти або вектор, можна застосовувати в медицині, переважно для лікування й профілактики інфекцій, які викликаються вірусом грипу, найбільш переважно вірусом грипу A. Описані вище білки H5, молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-які вказані білки H5, вектори, які містять будь-які молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-які білки H5, запропоновані у винаході, і будь-яку фармацевтичну композицію/вакцину, що містить будь-який вказаний білок H5, молекулу нуклеїнової кислоти або вектор, можна застосовувати для лікування або профілактики людини, а також у ветеринарії. При застосуванні у ветеринарії переважним застосуванням є лікування свійських птахів, переважно птахів, курей, качок, індичок і т.п., а також ссавців, переважно свиней, корів, коней, тюленів, верблюдів, собак, кішок, хом'яків, мишей і т.п. Таким чином, наступним варіантом даного винаходу є застосування описаних вище білків H5, молекул нуклеїнових кислот, що кодують будь-які вказані білки H5, векторів, що містять будь-які молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-які білки H5, запропоновані у винаході, і 17 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 будь-яких фармацевтичних композицій/вакцин у медицині, переважно для лікування людини та/або у ветеринарії. Крім того, описані вище білки H5, молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-які вказані білки H5, вектори, які містять будь-які молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-які білки H5, запропоновані у винаході, можна застосовувати для приготування фармацевтичної композиції, запропонованої у винаході, призначеної для профілактики або лікування інфекцій, які викликаються вірусом грипу. Як відзначалося вище, вказані фармацевтичні композиції/композиції вакцин можна застосовувати для лікування та/або профілактики людини, а також для лікування та/або профілактики тварин, таких як домашній птах, переважно птахів, курей, качок, індичок і т.п., а також ссавців, переважно свиней, корів, коней, тюленів, верблюдів, собак, кішок, хом'яків, мишей і т.п. Описані вище білки H5, молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-які вказані білки H5, вектори, які містять будь-які молекули нуклеїнових кислот, які кодують будь-які білки H5, запропоновані у винаході, можна застосовувати для приготування фармацевтичної композиції, запропонованої у винаході, призначеної для лікування й профілактики інфекції, яка викликається вірусом грипу, переважно викликуваної вірусом пташиного, свинячого або людського грипу або будь-якою їх комбінацією або гібридом. Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб лікування або профілактики інфекцій, які викликаються вірусом грипу, який полягає в тому, що вводять у терапевтично ефективній кількості білок H5, запропонований у винаході, індивідуумові, що має потребу в такому лікуванні. Крім того, даний винахід стосується способу лікування або профілактики інфекцій, які викликаються вірусом грипу, який полягає в тому, що вводять у терапевтично ефективній кількості будь-яку молекулу нуклеїнової кислоти H5 або вектор, запропоновані у винаході, які кодують будь-який білок H5, запропонований у винаході, індивідуумові, що має потребу в такому лікуванні. Крім того, даний винахід стосується також способу лікування або профілактики інфекцій, які викликаються вірусом грипу, який полягає в тому, що вводять у терапевтично ефективній кількості вакцину, що містить будь-які запропоновані у винаході білок H5, молекулу нуклеїнової кислоти або вектор, індивідуумові, що має потребу в такому лікуванні. Індивідуум, що має потребу в такому лікуванні, може являти собою людину, а також тварини, переважно свійських птахів, переважно птахів, курей, качок, індичок і т.п., а також ссавців, переважно свиней, корів, коней, тюленів, верблюдів, собак, кішок, хом'яків, мишей і т.п. Переважно, коли здійснюють вакцинацію курей, то білок H5, запропонований у винаході, можна застосовувати для вакцинації курей віком 1 день або більш старшого віку, наприклад, у день 10 або в дні 1-10 або в день 10, або пізніше. Переважно грип, який можна лікувати шляхом введення будь-якого білка H5, молекули нуклеїнової кислоти або вектора, що кодує будь-який вказаний білок H5, або будь-яких фармацевтичних композицій/вакцин, запропонованих у винаході, викликається вірусом пташиного, свинячого або людського грипу або будь-якою їх комбінацією або гібридом. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є набір, який складається з компонентів, що містить I) будь-який вказаний білок H5, запропонований у винаході, молекулу нуклеїнової кислоти або вектор, які кодують будь-який вказаний білок H5, або будь-яку фармацевтичну композицію/вакцину, що містить запропоновані у винаході будь-який вказаний білок H5, молекулу нуклеїнової кислоти або вектор, і II) листівка-вкладиш в упаковці, у якій міститься інструкція із застосування вказаного білка H5, молекули нуклеїнової кислоти, вектора або вакцини для лікування або профілактики інфекцій, які викликаються вірусом грипу. Коли здійснюють вакцинацію курей, то білок H5, запропонований у винаході, застосовують для вакцинації курей віком 1 день або більше старшого віку. Таким чином, ще одним варіантом здійснення є набір, що складається з компонентів, що містить принаймні один додатковий антиген, що представляє собою патоген свійських птахів або ссавців, і інформацію про медичні показання, медичне або ветеринарне застосуванню вказаного додаткового антигену. Приклади У наведені нижче прикладах представлені переважні матеріали й процедури, запропоновані в даному винаході. Слід розуміти, що ці приклади подані тільки з метою ілюстрації й не спрямовані на обмеження загального обсягу винаходу. Приклад 1 Конструювання рекомбінантних бакуловірусів, які кодують і експресують антигени HA H5 Рекомбінантний бакуловірус, що містить антиген H5 HA, створювали в такий спосіб: кодувальні послідовності H5 HA (SEQ ID NO:2) одержували хімічним синтезом і субклонували у векторі для перенесення pVL1392 (фірма BD Biosciences Pharmingen, Сан-Дієго, шт. 18 UA 99117 C2 5 10 15 20 25 30 Каліфорнія). H5 HA MutК+ (SEQ ID NO:4) створювали, використовуючи олігонуклеотидні праймери й набір для сайтнаправленого мутагенезу QuikChange® (фірма Stratagene, ЛаДжоллa, шт. Каліфорнія), і субклонували у векторі для перенесення pVL1392 (фірма BD Biosciences Pharmingen, Сан-Дієго, шт. Каліфорнія). Плазмідами pVL1392, що містять гени, які кодують антиген H5 HA (SEQ ID NO:2) і H5 HA MutК+ (SEQ ID NO:4), спільно трансфектували бакуловірусну ДНК DiamondBac® (фірма Sigma) у клітинах комах лінії Sf9 (фірма BD Biosciences Pharmingen) з одержанням рекомбінантного бакуловірусу, що містить гени H5 HA, що кодують SEQ ID NO:2, і H5 HA mutК+, що кодують SEQ ID NO:4. Рекомбінантні бакуловіруси, що містять гени, які кодують H5 HA (SEQ ID NO:2) і H5 HA MutК+ (SEQ ID NO:4), очищали методом вірусних бляшок і майстер-посіви вірусів (MSV) розмножували в клітинах лінії SF9, розділяли на аліквотів і зберігали при -70 °C. Клітини комах, заражені утримуючими H5 HA бакуловірусами, які, як описано вище, застосовували для створення MSV або робочих посівів вірусів, експресували антиген H5 HA (SEQ ID NO:2) і антиген H5 HA MutК+ (SEQ ID NO:4), що встановлено з використанням поліклональної сироватки або моноклональних антитіл за допомогою непрямого аналізу флуоресценція антитіл або методом Вестерн-блотингу. Після засіву відповідними кількостями рекомбінантних бакуловірусів (H5 HA і H5 HA MutК+ відповідно) обертові колби, що містять SF+-клітини (фірма Protein Sciences, Inc., Meriden, шт. Коннектикут), інкубували при 27±2 °C протягом 7 днів зі швидкістю обертання протягом цього періоду 100 об/хв. Колби були обладнані вентиляційними кришками для забезпечення проходження потоку повітря. Збирали культуру неочищених цільних клітин, що містить заражені бакуловірусом SF+-клітини, і супернатанти будь-якої клітинної культури. Приклад 2 Одержання фармацевтичних композицій (вакцин), що містять антигени HA H5 Збирали білок H5 HA і білок H5 HA Mutk+ неочищених цільних клітин, які експрессувались у клітинах комах, трансфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу. Бакуловіруси інактивували обробкою 5 мМ циклізованим бінарним етиленіміном (BEI) (кінцева концентрація) при температурі приблизно від 32 до 39 °C протягом 72-96 год. Після завершення інактивації додавали 0,3M тіосульфат натрію до кінцевої концентрації 5 мМ для нейтралізації будь-яких залишкових кількостей BEI. Після нейтралізації додавали різні ад'юванти й у результаті одержували наступні вакцини/фармацевтичні композиції. Вакцини Незапатентована назва продукту 501 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA, який Антиген експресується у клітинах комах, трансфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 Препаративна форма HA. У вакцину як ад'ювант додавали Emulsigen (емульсиген). Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма 502 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу. Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Emulsigen-D. 503 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Polygen 35 19 UA 99117 C2 Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма 504 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Emulsigen-P. 505 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Carbigen. 506 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Emulsigen-75. 507 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали ISA 70. 5 Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма 508 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA mutК+, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Emulsigen. 509 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA mutК+, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Emulsigen-D. 510 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA mutК+, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Polygen. 20 UA 99117 C2 Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма Незапатентована назва продукту Антиген Препаративна форма 511 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA mutК+, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Emulsigen-P. 512 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA mutК+, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Carbigen. 513 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA mutК+, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали Emulsigen-75. 514 Присутній у неочищених цільних клітинах білок H5 HA mutК+, який експресується у клітинах комах, трнсфектованих експресійною системою на основі бакуловірусу Експериментальна вакцина, що складається з культур клітин комах і супернатантів, які експресують рекомбінантний H5 HA. У вакцину як ад'ювант додавали ISA 70. 5 10 15 20 Приклад 3 Вакцинація свиней (поросят) проти пташиного грипу 1. Введення Метою даного дослідження було визначення здатності експериментальних вакцин, що містять як антиген неочищений екстракт рекомбінантного гемаглютиніну H5 (HA), для індукції реакції гальмування гемаглютинації (HI) у свиней. У сполученні з антигенами H5 HA вивчали різні ад'юванти. Вивчені при створенні винаходи прототипні вірусні вакцини HA H5 містили антиген або зі стандартного H5 HA, або H5 HA MutК+. Стандартний H5 HA одержували зі штаму A/качиний/Китай/E319-2/03, а H5 HA MutК+ складався зі стандартного H5 HA, що створювали таким чином, щоб він містив три специфічні амінокислотні заміни S120N, D150N, S223N і 328mutК+. Він містив також амінокислоту 94N. Вказані амінокислотні заміни в H5 HA Mut K+ приводили до одержання H5 HA, більшою мірою що нагадує HA штаму A/HK/213/03. Зараз вважається, що амінокислотний склад H5 HA штаму A/HK/213/03 сприяє розпізнаванню антитілом H5 HA. 2. План експерименту: 21 UA 99117 C2 Таблиця 1 Схема досліду Група 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5 10 15 20 Кількість поросят 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Прототипна вірусна вакцина 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 немає День 0 День 21 Взяття крові й внутрішньо-м'язова вакцинація (у плечоголовну групу) шляхом введення 1 мл у ліву сторону шиї) Взяття крові й внутрішньо-м'язова вакцинація (у плечоголовну групу) шляхом введення 1 мл у праву сторону шиї) Взяття крові День 35 Взяття крові Взяття крові й закінчення досліду На початку досліду поросята мали вік 3 тижні ± 5 днів. На початку досліду поросята були клінічно здорові. Зразки крові брали в дні 0, 21 і 35 досліду. Всіх піддослідних тварин обстежили щодня в дні 1-35 досліду відносно загального стану здоров'я. Протягом 7 днів після будь-якої вакцинації місце ін'єкції обстежили щодня й фіксували видимі реакції. Після завершення проведеної на твариніфази досліду в день 35 всіх тварин гуманно умертвляли. 3. Вакцини Вакцини 501-514, описані в прикладі 2, застосовували в дослідах з вакцинації поросят. 4. Тест гальмування гемаглютинації Свиней вакцинували прототипними вірусними вакцинами, які містять H5 HA, в дні 0 і 21. Збирали сироватку свиней для оцінки реакції гальмування гемаглютинації (HI) у дні 0, 21, 35. HIтест здійснювали для виявлення присутності специфічних у відношенні HA антитіл. Гетерологічний вірус типу H5N1, тобто A/chicken/Mexico/232/94, застосовували в концентрації, що відповідає чотирьом гемаглютинуючим одиницям [4 HA-одиниці] в HI-тесті. У титраційних мікропланшетах з U-подібним дном послідовно змішували серійні дворазові розведення в ЗФР із рівними об'ємами (25 мкл) вірусу, що місить 4 HA-одиниці, і інкубували при кімнатній температурі (приблизно 25 °C) протягом 30 хв. Курячі еритроцити в концентрації 0,5 % у ЗФР додавали в лунки, що містять сироватку-вірус. Визначали HI-титри, як обернені величини найбільших розведень сироватки, при яких виявлене гальмування гемаглютинації. 5. Результати Для HI-тесту застосовували офіційний затверджений Мексиканським урядом антиген H5N1 (A/ chicken/Mexico/232/94) [4 HA-одиниці] і режим вакцинації 1 × 1 мл у дні 0 і 21. 25 501 502 503 504 505 506 507 H5 K+ - Emulsigen H5 K+ -Emulsigen-D H5 K+ - Polygen 22 HI-титр День 21 0 0 0 0 0 0 0 День 35 4 4 0 2 4 16 16 0 0 0 H5 - Emulsigen H5 - Emulsigen-D H5 - Polygen H5 - Emulsigen-P H5 - Carbigen H5 - Emulsigen-75 H5 ISA 70 508 509 510 День 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 128 64 16 UA 99117 C2 511 512 513 514 Контроль 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 H5 K+ - Emulsigen-P H5 K+ - Carbigen H5 K+ - Emulsigen-75 H5 K+ - ISA 70 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 16 32 Немає 0 0 0 BIV H5 (отриманий з вірусу грипу A (A/duck/China/E319-2/03(H5N1)) BIV H5 K+ (мутантний BIV H5, що включає S120N, D155N, S223N, і з модифікацією 328K+) Результати продемонстрували, що більша частина композицій вакцин викликали імунну відповідь у вакцинованих поросят. Зокрема, більшість композицій вакцин викликало сероконверсію, це означає, що в більшості вакцинованих поросят виникали специфічні антитіла до вірусу пташиного грипу, що застосовували для HI-тесту. Крім того, результати очевидно свідчать і переконливо доводять, що запропонована у винаході ідея реалізується дуже добре. Ризик пандемії поросяти (тварин другого виду), зв'язаної з вірусом пташиного грипу (патоген першого виду), можна різко знижувати шляхом вакцинації поросят відповідним антигеном вірусу пташиного грипу. Це чітко продемонстровано. Крім того, відповідно до запропонованої концепції вакцинації, передачу й адаптацію вірусу пташиного грипу ссавцем, включаючи людини, можна різко знижувати. Свині є одним з найбільш важливих резервуарів пташиних патогенів, включаючи вірус пташиного грипу. Якщо реплікацію вірусу у свинях і, як наслідок, ризик адаптації вірусу пташиного грипу до організму свиней різко знижувати й контролювати, то ризик якої-небудь адаптації вірусу пташиного грипу до організму людини також повинен різко знижуватися. У випадку, коли введення антигену приводило до одержання більше низьких HIтитрів, тобто титрам нижче 30, то можуть знадобитися додаткові реімунізації антигеном для подальшого підвищення HI-титру й для посилення імунного захисту у вакцинованих поросят. Таким чином, низький титр не означає, що не можна досягти ніякого захисту, а тільки свідчать про те, що можуть знадобитися додаткові реімунізації для підвищення імунної відповіді. Той факт, що імунну відповідь можна оцінювати у вакцинованих поросят, демонструє, що ідея, яка лежить в основі даного винаходу, реалізується дуже добре. Інакше кажучи, наведені в даному описі експерименти зрозуміло й переконливо демонструють, що ідея, яка лежить в основі даного винаходу, реалізується дуже добре. Приклад 4 Вакцинація птахів проти пташиного грипу 1. Введення Метою даного дослідження було визначення здатності експериментальних вакцин, що містять як антиген гемаглютинін неочищеного екстракту рекомбінантного H5mutk+ (H5 HA mutk+), для індукції реакції гальмування гемаглютинації (HI) у курей. Крім того, як контроль застосовували антиген, що представляє собою стандартний рекомбінантний H5 (H5 HA), а також інактивовану вакцину Volvac® AI (фірма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Мехіко). Крім того, у сполученні з антигенами H5 HA вивчали різні ад'юванти. 2. План експерименту: SPF-курей (15-25) вакцинували незалежно різними експериментальним вакцинами у віці 1 або 10 днів підшкірно в задню ділянку шиї, використовуючи по 0,5 мл препарату; всіх птахів у процесі експерименту містили в ізоляторах. Птахи мали вільний доступ до корму й води. Контрольне зараження здійснювали в день 31 або 32 після вакцинації високопатогенним штамом пташиного грипу H5N2. Зразки сироватки одержували шляхом взяття в птахів крові черезяремну вену через 15, 30 днів після вакцинації. Отримані зразки сироватки зберігали при 4 °C до оцінки реакції гальмування гемаглютинації (HI-тест) відповідно до методу, описаного в прикладі 3, одержуючи дані про титри антитіл. 3. Вакцини й вірус, застосовуваний для контрольного зараження: Незалежно оцінювали чотири різні препаративні форми: 1. Стандартна масляна емульсія H5HA Mut k+: Антиген H5 HA mutk+ включали до складу масляної емульсії (неповний ад'ювант Фрейнда) відповідно до процедури фірми Boehringer Ingelheim Vetmedica. 2. H5HA Mut k+ фірми Seppic: Антиген H5 HA mutk+ готували з використанням нетрадиційного ад'юванту (ISA 206, W/O/W, фірми Seppic) відповідно до рекомендацій постачальника. 23 UA 99117 C2 5 10 15 3. Стандартна масляна емульсія H5HA: Антиген H5 HA включали до складу масляної емульсії (неповний ад'ювант Фрейнда) відповідно до процедури фірми Boehringer Ingelheim Vetmedica. 4. H5HA фірми Seppic: Антиген Н5 НА готували з використанням нетрадиційного ад'юванту (ISA 206, W/O/W, фірми Seppic) відповідно до рекомендацій постачальника. Як контроль застосовували вакцину проти пташиного грипу у вигляді масляної емульсії фірми Boehringer Ingelheim Vetmedica Volvac® AI (фірма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Мехіко). Контрольне зараження вакцинованих і невакцинованих курчат проводили шляхом 6,7 інтраназальної інокуляції, використовуючи по 0,2 мл препарати, що містить 10 CEID вірусу для контрольного зараження штаму H5N2 на птаха. Після контрольного зараження оцінювали симптоми й смертність. Через 10 днів після інокуляції всіх курчат, що вижили, умертвляли відповідно до процедур лабораторного утримання тварин. 4. Результати: Результати представлені нижче в таблицях: Препаративна форма H5HA Mut k+ фірми Seppic Стандартна масляна емульсія H5HA Mut k+ H5HA фірми Seppic Стандартна масляна емульсія H5HA Volvac AI KV Негативний контроль Препаративна форма вакцини H5HA Mut k+ фірми Seppic Стандартна масляна емульсія H5HA Mut k+ H5HA фірми Seppic Стандартна масляна емульсія H5HA Volvac AI KV Негативний контроль 20 25 30 Вакцинація птахів віком 1 день Контрольне зараження в день 31 після вакцинації Кількість Смертність, % загиблих Вакцинація птахів віком 10 днів Контрольне зараження в день 32 після вакцинації Кількість Смертність, % загиблих 8/25 32 % 0/20 0% 0/24 0% 0/20 0% 17/25 68 % 7/19 36,8 % 4/25 16 % 2/20 10 % 10/10 100 % 0/14 14/14 0% 100 % Вакцинація птахів віком 1 день Вакцинація птахів віком 10 днів (0,5 мл) (0,5 мл) HI-титри через 30 HI-титри через 30 Захист після Захист після днів після днів після контрольного контрольного вакцинації вакцинації зараження (%) зараження (%) (MG Log2) (MG Log2) 0,56 68 2,5 100 2,59 100 4,3 100 0,18 32 1,3 63,2 0,7 84 1,6 100 ------------------------ -------------------------- 8,8 0 100 0 Позитивний сироватковий титр відповідав log2 4 відповідно до стандарту Всесвітньої організації з захисту здоров'я тварин (OIE). Відповідно до цього критерію серологічні результати були негативними, хоча виявлено невелику кількість позитивних значень при порівнянні з основним рівнем. Найвищі серологічні титри виявлені при використанні препаративної форми вакцини на основі масляного ад'юванту з антигеном H5HA Mut k+ у птахів, вакцинованих у віці 1 день або 10 днів. Найменші серологічні титри виявлені при використанні препаративної форми прототипної вірусної вакцини фірми Seppic, що містить антиген H5HA. У досліді з використанням контрольного зараження виявлено, що прототипні вірусні вакцини забезпечують захисну дію, насамперед при застосуванні стандартної препаративної форми вакцини у вигляді масляної емульсії, що містить антиген H5HA Mut k+. Найменший рівень захисту в досліді з використанням контрольного зараження виявлений для вакцини, що містить H5HA, фірми Seppic, при застосуванні якої загибель досягала 68 %. На відміну від цього, найбільш високий 24 UA 99117 C2 серологічний титр виявлений у птахів, вакцинованих у день 10, у порівнянні із птахами, яких вакцинували в перший день життя. 5 25 UA 99117 C2 26 UA 99117 C2 27 UA 99117 C2 28