Вектор, що містить дві гомологічні нуклеотидні послідовності

Реферат: Винахід належить до векторів, що містять дві гомологічні нуклеотидні послідовності, і способів їх одержання шляхом заміщення основ у гомологічних нуклеотидних послідовностях на відмінні основи, таким чином, щоб не змінювати кодовану амінокислотну послідовність. При цьому UA 105193 C2 (12) UA 105193 C2 знижується внутрішньомолекулярна рекомбінація послідовностями, особливо в клітинах ссавців. між гомологічними нуклеотидними UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рівень техніки винаходу Феномен гомологічної рекомбінації нуклеїнових кислот передбачає фізичний розрив і возз'єднання різнорідних ланцюгів нуклеїнових кислот у межах гомологічних послідовностей. Рекомбінація і генна конверсія в клітинах ссавців досліджувалися багатьма групами, що спостерігали відновлення селектовних генів після інфікування відповідним способом сконструйованими вірусними або плазмідними субстратами. (Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 6:2520-2526, 1986). Результати цих експериментів показують, що клітини ефективно підтримують як внутрішньо-, так і міжмолекулярну рекомбінацію і генну конверсію. (Id.) Міжмолекулярна рекомбінація стосується рекомбінації між гомологічними послідовностями, представленими в двох різних молекулах нуклеїнової кислоти, тоді як внутрішньомолекулярна рекомбінація стосується рекомбінації між гомологічними послідовностями, представленими в одній і тій же молекулі нуклеїнової кислоти. Міжмолекулярна рекомбінація може відбутися між генами в плазміді або вірусі і гомологічними послідовностями усередині клітини. (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902, 1986.) Цей тип рекомбінації може бути причиною утворення інфекційного вірусу з ослабленого вірусу. Fuller et al. кодон-оптимізували виділені послідовності генів HIV-1 gag і HIV-1 pol для збільшення їх експресії в клітинах ссавців. Ці оптимізації також знизили ідентичність нуклеотидів в області, що перекривається, довжиною приблизно 200 нуклеотидних пари, представленої в HIV гені gag-pol, що також привело до знижених рівнів внутрішньомолекулярної рекомбінації між відкритими рамками зчитування gag і pol, розташованими в двох незалежних плазмідах, і зрізаним геном gag, що міститься в рекомбінантному ретровірусному векторі. (Fuller et al., Hum. Gene Ther. 12:2081-2093, 2001.) Внутрішньомолекулярна рекомбінація може відбуватися між векторами, у яких дупліковані області гена або генного фрагмента представлені як прямі повтори, розділені вставними послідовностями. Цей тип рекомбінації звичайно приводить до делеції вставних послідовностей і однієї копії повторюваних послідовностей. Частота внутрішньомолекулярної рекомбінації звичайно набагато вища, ніж частота міжмолекулярної рекомбінації. Рівень внутрішньомолекулярної рекомбінації в плазмідних векторах був підрахований для клітин тварин. (Rubnitz and Subrami, Mol. Cell. Biol. 4:2253-2258, 1984.) У залежності від розміру гомологічних областей, частота міжмолекулярної рекомбінації в трансфекованій плазмідній ДНК змінюється між 0,306% і 0,002%. (Id.) Низька ефективність рекомбінації спостерігалася для гомології усього лише 14 нуклеотидних пар. (Id.) Внутрішньомолекулярна рекомбінація між гомологічними послідовностями також підтверджена документально для багатьох тваринних вірусів, включаючи пікорнавіруси, вірус грипу, аденовіруси і поксвіруси. (Gritz et al., J. Virol. 64:5948-5957, 1990). Для вірусів вакцини було показано, що тандемно дупліковані послідовності є генетично нестабільними. (Id.) Для вірусів рівень, що спостерігається, внутрішньомолекулярної рекомбінації був набагато вищим, ніж для плазмідних векторів. Наприклад, для ретровірусу частота рекомбінації між двома ідентичними послідовностями в одній і тій же РНК молекулі була знайдена такою, що дорівнює приблизно 62%. (Zhang et al., J. Virol. 75:6348-6358, 2001). 99% цих рекомбінацій були внутрішньомолекулярними (між двома послідовностями однієї молекули РНК), на противагу міжмолекулярної (між двома молекулами РНК). (Id.) Для аденоасоційованого вірусу внутрішньомолекулярна рекомбінація також була знайдена набагато більш ефективною в порівнянні з міжмолекулярною рекомбінацією. (Choi et al., J. Virol. 79:6801-6807, 2005). Було показано, що Herpes simplex вірус тип I також демонструє високі рівні рекомбінації. (Dutch et al., J. Virol. 66:277-285.). Для поксвірусів спостерігали високу частоту гомологічної рекомбінації. Експериментальну систему використовували для визначення рекомбінації для вірусів вакцини шляхом розташування гена тимідинкінази (tk) між двома прямими повторами 1,5 тпо ДНК (Ball, J. Virol. 61: 1788-1795, 1987.). Протягом кожного з перших восьми пасажів при неселективних умовах 40% tk+ вірусів вакцини утратили свій tk+ фенотип. (Id.) При неселективних умовах відносна кількість tk-вірусів збільшилася до 99,73% загальної популяції вірусу. (Id.) Навіть при селективних умовах рекомбінація відбувалася з такою високою частотою, що більшість інфекційних вірусних частинок, що було можливо виділити з одиничних бляшок, містили ДНК, що вже піддалася рекомбінації, з наступною втратою гена tk. (Id.). Використовуючи рекомбінантний вірус вакцини, сконструйований для експресії трьох гетерологічних генів, усі експресовані з VV p7.5-промоторів, Howley et al., Gene 172:233-237, 1996, продемонстрували рекомбінацію між повторюваними послідовностями промоторів. Рекомбінант вірусу вакцини, сконструйований як такий, що містить область С-повтору (CRR) з М-білка Streptococcus pyogenes, містить складну суміш варіантів, що містять від 1 до більше ніж 20 копій CRR. (Hruby et al., P.N.A.S. 88:3190-3194, 1991.) 1 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Хоча і було показано, що множинні гени з гомологією приблизно 60-75%, вставлені в різні сайти інтеграції MVA, приводять до стабільного множинного рекомбінантного вірусу (WO 03/097846), в області техніки існує, однак, необхідність у композиціях і способах, що знижують рівень внутрішньомолекулярної рекомбінації у векторах, таких як, наприклад, вірусні вектори, для забезпечення одержання стабільних векторів, що містять множинні гомологічні нуклеотидні послідовності, що містять більш довгі ідентичні ділянки. Винахід Даний винахід стосується рекомбінантних векторів і способів їх виготовлення і застосування. Особливо, даний винахід охоплює вектор, що містить дві нуклеотидні послідовності розміром 300 нуклеотидів, кожна з яких кодує 100 амінокислот, де 100 амінокислот, кодовані кожною з двох нуклеотидних послідовностей, мають щонайменше 75% ідентичних амінокислот, і де одна з двох нуклеотидних послідовностей має щонайменше 75 відмінних від іншої нуклеотидної послідовності нуклеотидів, де відмінні нуклеотиди не змінюють ідентичні амінокислоти, кодовані названими двома нуклеотидними послідовностями. Разюче, як було показано відповідно до даного винаходу, ризик міжмолекулярної рекомбінації може бути не тільки значно знижений, але і навіть його можна уникнуть шляхом систематичного заміщення однозначних кодонів у щонайменше двох схожих або ідентичних нуклеотидних послідовностях усередині однієї молекули нуклеїнової кислоти, такої, наприклад, як вектор, таким чином, приводячи до створення стабільних векторів, що містять щонайменше дві або більше схожих або ідентичних нуклеотидних послідовності. Проте, стратегія, використовувана в даному винаході, є також застосовною для векторів, що містять три або більше схожих нуклеотидних послідовності. Результати, одержані в даному винаході, показують, що є можливим замінити велику кількість нуклеотидів у нуклеотидній послідовності для зниження внутрішньомолекулярної рекомбінації у векторі, тоді як, зненацька, експресія кодованого білка в той же час усе ще зберігається. При уведенні великої кількості нуклеотидних варіантів у довгі ділянки нуклеотидних послідовностей, як було зроблено за даним винаходом, кваліфікований фахівець може очікувати, що експресія зазначеної послідовності або гена більше не буде правильно працювати, тобто не очікувалося, що змінена нуклеотидна послідовність буде залишатися придатною для ефективної експресії. Використовувана тут стратегія придатна не тільки для коротких ділянок нуклеотидних послідовностей довжиною 300 нуклеотидів, але також і для набагато більш довгих ділянок, наприклад, повнорозмірних генів, що, звичайно, містять ділянки довжиною 300 нуклеотидів як заявлено. Результати є застосовними для множини різних генів, векторів і вірусів і є вкрай корисними для розробки вакцин, як, наприклад, розробка мультивалентних вакцин, але також можуть бути корисними для інших технологій, як, наприклад, експресія білків або для одержання рекомбінантних клітинних ліній. В інших варіантах здійснення винахід також охоплює способи одержання вірусів і векторів, і способи для зниження внутрішньомолекулярної рекомбінації. Винахід охоплює спосіб одержання вектора, як описано вище, і названий спосіб включає стадії а) одержання першої нуклеотидної послідовності довжиною 300 нуклеотидів, що кодує 100 амінокислот, і б) одержання другої нуклеотидної послідовності довжиною 300 нуклеотидів, що кодує 100 амінокислот, де 100 амінокислот, кодовані кожною з двох нуклеотидних послідовностей, мають щонайменше 75% амінокислотної ідентичності і де одна з двох нуклеотидних послідовностей має щонайменше 75 нуклеотидів, що відрізняються від іншої нуклеотидної послідовності, де відмінні нуклеотиди не змінюють ідентичні амінокислоти, кодовані названими двома нуклеотидними послідовностями; і в) інтеграції двох відмінних нуклеотидних послідовностей у вектор. В особливо переважному варіанті здійснення, винахід охоплює спосіб для зниження внутрішньомолекулярної рекомбінації у векторі, що містить дві нуклеотидні послідовності довжиною 300 нуклеотидів, що кодують кожна 100 амінокислот, де 100 амінокислот, кодовані кожною з двох нуклеотидних послідовностей мають щонайменше 75% амінокислотної ідентичності, названий спосіб, що включає заміну нуклеотидів в одній або обох нуклеотидній(их) послідовності(-ях) для одержання двох відмінних послідовностей, що мають відмінність щонайменше у 75 нуклеотидів, де відмінні нуклеотиди не змінюють ідентичні амінокислоти, кодовані названими двома нуклеотидними послідовностями. При використанні вірусних векторів, спосіб знижує рівень внутрішньомолекулярної рекомбінації протягом кожного покоління вірусного поширення. Переважно, гомологічні нуклеотидні послідовності рекомбінують менше ніж у 20, 15, 10, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05 або 0,01% вірусного потомства на покоління. 2 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому переважному варіанті здійснення, винахід охоплює спосіб одержання вірусу, переважно, поксвірусу, що містить дві гомологічні нуклеотидні послідовності, де зазначений спосіб включає стадії а) одержання вірусу, що містить нуклеотидну послідовність довжиною 300 нуклеотидів, що кодує 100 амінокислот, і б) інтеграції другої нуклеотидної послідовності довжиною 300 нуклеотидів, що кодує 100 амінокислот, у вірус; де 100 амінокислот, кодовані кожною з двох нуклеотидних послідовностей, мають щонайменше 75% амінокислотної ідентичності, і де одна з двох нуклеотидних послідовностей має щонайменше 75 нуклеотидів, що відрізняються від іншої нуклеотидної послідовності, де відмінні нуклеотиди не змінюють ідентичні амінокислоти, кодовані названими двома нуклеотидними послідовностями. Як використовується тут, «вектор» може бути будь-яким засобом, здатним доставляти і експресувати молекули нуклеїнової кислоти в хазяїна або об'єкт. Так, вектор може бути ПЛРпродуктом або будь-яким фрагментом нуклеїнової кислоти, введеним у клітину і/або інтегрованим у клітинний геном; або репліконом, таким як плазміда, фаг або косміда, у який може бути вставлений інший фрагмент ДНК, таким чином, щоб здійснювати реплікацію уставленого фрагмента. У загальному випадку, вектор може реплікуватися, коли він асоційований із придатними контрольними елементами. Придатні векторні основи для використання за даним винаходом включають, наприклад, використовувані повсюдно в галузі техніки, такі як плазміди, віруси, штучні хромосоми, BAC, YAC або PAC, або навіть рекомбінантні клітини, такі як бактерії або еукаріотичні клітини. Термін «вектор» включає вектори для клонування й експресії, також як і вірусні вектори й інтегруючі вектори. «Експресійний вектор» є вектором, що містить регуляторну область. Придатні експресійні вектори для використання в даному винаході включають, без обмеження, плазміди і вірусні вектори, одержані з, наприклад, рослинних вірусів, бактеріофагів, бакуловірусів, вірусу тютюнової мозаїки, ретровірусів і поксвірусів. Придатні невірусні вектори включають плазміди, такі як pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAX і pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi et al, 2002, J. Virol. 76, 12735-12746). Численні вектори і експресійні системи є комерційно доступними в різних корпораціях, таких як Novagen (Madison, Wis.), Clontech (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.) і Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, Calif.). При розробці вакцин рекомбінантний вірус може бути використаний як вектор-переносник або вектор вакцини для доставки генетичного матеріалу в клітину. Опинившись у клітині, генетична інформація транскрибується і транслюється в білки, включаючи інтегрований антиген, спрямований проти визначеного захворювання. Лікування є успішним, якщо антиген, доставлений вектором у клітину, індукує імунну відповідь організму проти антигену, що захищає від захворювання. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, вектор є плазмідою або вірусним вектором. Вірусний вектор може бути оснований на ослабленому вірусі, що не може реплікуватися в клітині-хазяїні, але здатний індукувати і експресувати чужорідний ген в інфікованій клітині. Вірус або рекомбінантний вірус є, таким чином, здатним продукувати білок і презентувати його імунній системі хазяїна. Деякі основні характеристики вірусних векторівтакі, що вони можуть викликати гуморальну (В-клітинну) і/або клітинно-опосередковану (Т-клітинну) імунну відповідь. Вірусні вектори можуть бути одержані з множини різних вірусів. В одному варіанті здійснення, вірус є вірусом тварин. Вектор може бути одержаний спеціально з вірусу, вибраного з групи вірусів, що складається з ретровірусу, пікорнавірусу, вірусу грипу, аденовірусу, аденоасоційованого вірусу (AAV), поксвірусу, вірусу герпесу (наприклад, HSV-1), вірусу кору і губчатого вірусу. Вірусні вектори часто використовуються дослідниками для розробки вакцин для запобігання і лікування інфекційних захворювань і раку. З цих, поксвіруси (включаючи чуму канарок, коров'ячу віспу і віспу птахів) належать до групи найбільш розповсюджених кандидатів для векторних вакцин. Поксвіруси є переважним вибором для перенесення генетичного матеріалу в нових хазяїнів через них щодо великої ємності для вставки послідовностей у вірусний геном і через їх здатність реплікувати їх геном і проводити транскрипцію в цитоплазмі інфікованої клітини замість ядра, у такий спосіб мінімізуючи ризик інсерційного мутагенезу шляхом інтегрування генетичного матеріалу в геном клітини-хазяїна, як відбувається для інших векторів, наприклад, ретровірусних векторів. Віріони поксвірусів є більш великими в порівнянні з більшістю інших вірусів тварин (більш детально див. Fields et al., eds., Virology, 3rd Edition, Volume 2, Chapter 83, pages 2637 ff). У переважному варіанті здійснення винаходу, вірусний вектор одержаний з поксвірусу (див., наприклад, Cox et al. in "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press). 3 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Він може бути одержаний з будь-якого члена poxviridae і може бути, зокрема, авіпоксвірусом або ортопоксвірусом. Приклади авіпоксвірусів, що придатні для використання в даному винаході, включають будьякий авіпоксвірус, такий як Fowlpoxvirus, Canarypoxvirus, Uncopoxvirus, Mynahpoxvirus, Pigeonpoxvirus, Psittacinepoxvirus, Quailpoxvirus, Peacockpoxvirus, Penguinpoxvirus, Sparrowpoxvirus, Starlingpoxvirus і Turkeypoxvirus. Переважними авіпоксвірусами є Canarypoxvirus і Fowlpoxvirus. Авіпоксвіруси є в природі обмеженими по хазяїну і продуктивно реплікуються тільки в пташиних видах і клітинах (Taylor et al., Biological and immunogenic properties of a canarypoxrabies recombinant, ALVAC-RG (vCP65) in non-avian species, Vaccine 13: 539-549, 1995). Якщо людські клітини інфіковані авіпоксвірусами, гетерологічні гени експресуються з вірусного геному. Однак авіпоксвірус не цілком реплікується в людських клітинах і, таким чином, немає ризику, що людській істоті буде нанесена шкода продуктивною вірусною реплікацією. Різні рекомбінантні авіпоксвіруси були сконструйовані таким чином, щоб експресувати так звані продукти лентивірусних генів (US 5766598), цитокіни і/або рак-асоційовані антигени (US 5833975) або Gглікопротеїн сказу (Taylor et al., Biological and immunogenic properties of a canarypox-rabies recombinant, ALVAC-RG (vCP65) in non-avian species, Vaccine 13: 539-549, 1995). Рекомбінантний canarypox вірус, експресуючий чотири HIV гени gag, pol, env і nef, був уже використаний у клінічних дослідженнях (Peters, B. S., The basis for HIV immunotherapeutic vaccines, Vaccine 20: 688-705, 2001). Оскільки авіпоксвіруси продуктивно реплікуються тільки в пташиних клітинах, ці клітини повинні бути використані для ампліфікації вірусу і для одержання рекомбінантних вірусів. Прикладом canarypox вірусу є штам Rentschler. Очищений на бляшках Canarypox штам, названий ALVAC (US 5766598), був поміщений відповідно до умов Будапештського договору в American Type Culture Collection (ATCC), номер доступу VR-2547. Інший штам Canarypox є комерційним canarypox вакцинним штамом, позначеним LF2 CEP 524 24 10 75, що є в наявності в Institute Merieux, Inc. Прикладами Fowlpox вірусу є штами FP-1, FP-5 і TROVAC (US 5766598). FP-1 є Duvette штамом, модифікованим для використання як вакцини для курчат віком один день. Штам є комерційним вакцинним штамом fowlpox вірусу, позначеним 0 DCEP 25/CEP67/2309 October 1980 і наявним у наявності в Institute Merieux, Inc. FP-5 є комерційним вакцинним штамом fowlpox вірусу, виділеним з ембріонів курчат, що є в наявності в American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Madison, Wisconsin, United States Veterinary License No. 165, serial No. 30321. З поксвірусів виду vaccinia (коров'яча віспа) і variola (натуральна віспа) є найбільш відомими. Вірус variola є причиною натуральної віспи. На відміну від вірусу variola, вірус vaccinia звичайно не викликає системного захворювання в імунокомпетентних індивідуумів і, таким чином, використовувався як жива вакцина для імунізації проти натуральної віспи. Успішна по усьому світі вакцинація вірусом vaccinia привела в 1980х до ерадикації натуральної віспи як природного захворювання (The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication; History of Public Health, No. 4, Geneva: World Health Organization, 1980). З цього часу вакцинація була припинена на багато років, за винятком людей, що мають високий ризик поксивірусної інфекції (наприклад, працівників лабораторій). Однак, зростає побоювання, що, наприклад, variola, що викликає натуральну віспу, може бути використана як зброя біотероризму. Більше того, існує ризик, що інші поксвіруси, такі як коров'яча віспа, верблюжа віспа і мавп’яча віспа, можуть потенційно мутувати, за допомогою механізмів селекції, і набути подібні з variola фенотипи. Таким чином, деякі уряди накопичують запаси vaccinia-основаних вакцин для використання як перед впливом (перед зустріччю з вірусом variola), так і після впливу (після зустрічі з вірусом variola) передбачуваної або актуальної атаки натуральної віспи. У детальному переважному варіанті здійснення винаходу вектор є вектором на основі vaccinia вірусу (вірусу коров'ячої віспи). Вірус vaccinia (вірус коров'ячої віспи) є надзвичайно імуностимулюючим і викликає сильний В- (гуморальний) і Т-опосередкований (клітинний) імунітет як до його власних генних продуктів, так і до множині продуктів чужорідних генів, експресованих з генів, інтегрованих у vaccinia геном. Вірус vaccinia представляється, таким чином, ідеальним вектором для вакцин проти натуральної віспи й інших інфекційних захворювань і раку у формі рекомбінантних вакцин. Багато які з рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, описаних у літературі, основані на цілком компетентному в реплікації штамі vaccinia вірусу Western Reserve. Однак, відомо, що цей штам 4 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 має надзвичайну нейровірулентність і є, таким чином, погано придатний для застосування в людей і тварин (Morita et al. 1987, Vaccine 5, 65-70). Придатний вірус vaccinia (вірус коров'ячої віспи) може бути вибраний із групи, що складається зі штаму Copenhagen (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 and 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401), штаму Wyeth, NYVAC (див. WO92/15672 і Tartaglia et al., 1992, Virology 188, 217-232) і сильно ослабленого модифікованого Ankara (MVA) штаму (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16). Переважним прикладом придатного вірусу vaccinia є сильно ослаблений штам вірусу vaccinia NYVAC, що одержаний із клонованого на бляшках ізоляту вакцинного штаму Copenhagen шляхом делеції 18 відкритих рамок зчитування (ORF) з вірусного геному (Tartaglia et al., NYVAC: A highly attenuated strain of vaccinia virus, Virology 188, 217-232, 1992). NYVAC характеризується істотно зниженою здатністю до реплікації в різних клітинах культури тканин людини, але здатністю, що залишається, до індукування сильних імунних відповідей на сторонні антигени. Усі вищеописані віруси є однаково придатними для використання в даному винаході. У найбільш переважному варіанті здійснення винаходу вірус є модифікованим вірусом коров'ячої віспи Ankara (MVA), що відомий як винятково безпечний при вакцинації. Модифікований вірус коров'ячої віспи Ankara (MVA) належить до вірусу Vaccinia, члену роду Orthopoxvirus у сімействі Poxviridae. MVA був одержаний у 516 послідовних пасажах на фібробластах ембріона курчати дермального vaccinia штаму Ankara (Chorioallantois vaccinia virus Ankara, CVA) (для огляду див. Mayr, A., et al., Passage History: Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA, Infection 3, 6-14, 1975). Унаслідок цих довгострокових пасажів результуючий вірус MVA утратив приблизно 31 кілобаз своєї геномної послідовності і, таким чином, був описаний як сильно обмежений по хазяїну до пташиних клітин (Meyer, H. et al., Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991; (Meisinger-Henschel et al., Genomic sequence of chorioallantois vaccinia virus Ankara, the ancestor of modified vaccinia virus Ankara, J. Gen. Virol. 88, 3249-3259, 2007). Було показано на множині тваринних моделей, що результуючий MVA є вірогідно авірулентним (Mayr, A. & Danner, K. Vaccination against pox diseases under immunosuppressive conditions, Dev. Biol. Stand. 41: 225-34, 1978). Додатково, цей штам MVA був протестований у клінічних дослідженнях як вакцина для імунізації проти натуральної віспи людини (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., MVA vaccination against smallpox: clinical tests with an attenuated live vaccinia virus strain (MVA) (аuthоr's transl), Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392, 1974). У цих дослідженнях брали участь більше 120000 чоловік, включаючи пацієнтів з високим ризиком, і було доведено, що в порівнянні з вакцинами на основі Vaccinia MVA має зменшену вірулентність або інфективність, тоді як зберігає гарну імуногенність. Винахід охоплює рекомбінантні MVA віруси, одержані з будь-яким і всіма MVA вірусами. Прикладом MVA штаму є депозит VR-1508, розміщений у American Type Culture collection (ATCC), Manassas, VA 20108, USA. В іншому варіанті здійснення штам MVA-Vero або його похідний може бути використаний відповідно до даного винаходу. Штам MVA-Vero був поміщений у Європейську Колекцію Тваринних Клітинних Культур під номером доступу ECACC V99101431 і ECACC 01021411. Додатковими прикладами для MVA вірусних штамів, використовуваних у даному винаході, є штами MVA 572 і 575, поміщені в Європейську Колекцію Тваринних Клітинних Культур (ECACC) під номерами доступу ECACC V94012707 і ECACC V00120707, відповідно. Особливо переважні MVA віруси є MVA варіантними штамами MVABN®, як, наприклад, поміщений у ECACC під номером V00083008, і похідні, що мають ті ж властивості, що MVA-BN®. MVA-BN® є вірусом, використовуваним у виробництві відособленої противіспової вакцини третього покоління. MVA-BN® був розроблений для додаткових пасажів MVA штам 571/572. В даний час, більше ніж 1500 суб'єктів, включаючи суб'єкти з атопічним дерматитом (AD) і ВІЛінфекцією, були вакциновані в клінічних дослідженнях вакциною на основі MVA-BN®. Похідні, що мають ті ж властивості, що і поміщений у колекцію штам MVA-BN®, мають здатність репродуктивної реплікації in vitro у фібробластах ембріона курчати (CEF), але не здатність репродуктивної реплікації в людських клітинах, у яких MVA 575 або MVA 572 можуть репродуктивно реплікуватися. Найбільш переважно, MVA не має здатності репродуктивної реплікації в клітинній лінії кератиноцитів людини HaCaT, лінії клітин нирки ембріона людини 293, клітинної лінії людської остеосаркоми кісти 143В і клітинної лінії людської цервікальної аденосаркоми HeLa. 5 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін «не здатний до репродуктивної реплікації» використаний у даній заявці як визначено в WO 02/42480 і патенті США № 6761893, відповідно. Так, зазначений термін застосовується до вірусу, що має коефіцієнт вірусної ампліфікації на 4 день після інфікування менше ніж 1, використовуючи аналіз, описаний у патенті США № 6761893, що включений тут за допомогою посилання. «Коефіцієнт ампліфікації» вірусу є відношенням кількості вірусу, продукованого інфікованою клітиною (Вихід), до кількості спочатку використовуваної для інфікування клітин спочатку (Уведення). Співвідношення «1» між Виходом і Введенням визначає статус ампліфікації, де кількість вірусу, продукованого інфікованою кліткою, є тою ж самою, що і кількість, спочатку використовувана для інфікування клітин. У найбільш переважному варіанті здійснення штам MVA, використовуваний у даному винаході, є MVA-BN® або його похідним, як описано вище. Особливості MVA-BN®, опис біологічних підходів, що дозволяють визначити, або є MVA штам MVA-BN® або його похідним, і способи, що дозволяють одержати MVA-BN® або MVA, що має властивості MVA-BN®, розкриті в WO 02/42480. Зміст цих заявок включений в дану заявку за допомогою посилання. Високо ослаблений MVA-BN® вірус може бути одержаний, наприклад, шляхом додаткового пасування модифікованого вірусу коров'ячої віспи Ankara (MVA), такої як MVA-572 або MVA-575, і, при бажанні, очищенням на клонах або бляшках. MVA-BN® не має приблизно 13% (26,5 тпо із шести великих і множинних дрібних сайтів делецій) геному в порівнянні з родовим CVA вірусом. Делеції стосуються деякої кількості генів вірулентності і множини хазяїнів, також як і великий фрагмент гена, що кодує А-тип білка включення (ATI), і гена, що кодує структурний білок, що спрямовує зрілі вірусні частинки в тільця включення А-типу. Особливо, зроблене посилання на визначення властивостей MVA за винаходом як описано у WO 02/42480, таких як властивості MVA-BN® і властивості MVA-BN® і визначення похідних MVA-BN®. Зазначене посилання також розкриває, як MVA і інші віруси коров'ячої віспи можуть бути розмножені. Коротко, еукаріотичні клітини інфікуються вірусом. Еукаріотичні клітини є клітинами, що піддані інфікуванню відповідним поксвірусом і дозволяють реплікацію і продукцію інфекційного вірусу. Для MVA прикладом такого типу клітин є фібробласти ембріона курчати (CEF) і BHK клітини (Drexler et al., Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells, J. Gen. Virol. 79, 347-352, 1998). CEF клітини можна культивувати при умовах, відомих фахівцю в галузі техніки. Переважно, CEF клітини культивують у безсироватковому середовищі в стаціонарних флаконах або ролерних флаконах. Інкубацію, переважно, продовжують 48-96 годин при 37°C. Для інфікування MVA, переважно, використовується при множинності зараження (MOI) 0,05-1 TCID50, і інкубація продовжується переважно 48-72 години при 37°C. Вірус, при використанні за даним винаходом, може бути розмножений на різних клітинних культурах, особливо на культурах клітин тварин. Вірусу дозволяють інфікувати чутливі клітинні культури і репродуктивно реплікуватися. Вірусне потомство збирають із застосуванням звичайних в галузі техніки методик. Наприклад, для MVA вірусів і інших вірусів коров'ячої віспи, фібробласти ембріона курчати (CEF) у середовищі з сироваткою або в безсироватковому середовищі можуть бути інфіковані вірусами. Після того, як вірусу дозволили репродуктивно реплікуватися, збирають вірусне потомство. Даний винахід також стосується рекомбінантних поксвірусів, переважно, вірусу коров'ячої віспи, особливо MVA, що допускає експресію двох або більше гомологічних нуклеотидних послідовностей, зокрема, кодуючих послідовностей. Вірус може містити дві, три, чотири або більше гомологічних нуклеотидних кодуючих послідовностей. Вектор за даним винаходом містить дві нуклеотидні послідовності розміром 300 нуклеотидів. У переважному варіанті здійснення вектор містить три, чотири, п'ять, шість і більше нуклеотидних послідовності, що, звичайно, включають також дві заявлені нуклеотидні послідовності. 300 нуклеотидів можуть, звичайно, бути також частиною більш довгої нуклеотидної послідовності. Крім того, у різних варіантах здійснення дві або більше нуклеотидних послідовностей мають розмір 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 або 3000 або навіть більше нуклеотидів, всі з яких можуть бути частиною більш довгої нуклеотидної послідовності і які, звичайно, включають 300 нуклеотидів, як заявлено. Як використовується тут, терміни «полінуклеотид», «нуклеотидна послідовність», «нуклеїнова кислота», «молекула нуклеїнової кислоти» використовуються взаємозамінно і визначають полімер або полідезоксирибонуклеотидних (ДНК), або полірибонуклеотидних (РНК) 6 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або молекул будь-якої їх комбінації. Визначення включає одно- і дволанцюжкові, лінійні або кільцеві, що зустрічаються в природі або синтетичні полінуклеотиди. Нуклеотидна послідовність за даним винаходом може бути кодуючою послідовністю, і може містити повні гени, відповідно. Термін «кодуюча послідовність», як використовується тут, стосується нуклеотидної послідовності, що кодує визначену амінокислотну послідовність. Послідовності некодуючих генів, включають інтрони і контрольні області, такі як промотори, оператори і термінатори. Нуклеотидні послідовності також можуть містити фрагменти генів. Нуклеотидні послідовності можуть містити синтетичні послідовності, такі як нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні лінкерні послідовності або епітопи. Нуклеотидні послідовності можуть складатися із суміші генів, фрагментів генів і синтетичних послідовностей. Нуклеотидні послідовності можуть також містити аналоги, такі як нуклеотидні аналоги, аналоги фосфатних ефірів і/або аналоги пентозного цукру. Також у визначення нуклеотидних аналогів включені нуклеотиди, у яких фосфатний ефір і/або цукрово-фосфатні ефірні зв'язки заміщені іншими типами зв'язків, такими як N-(2-аміноетил)-гліцин аміди й інші аміди (див., наприклад, Nielsen et al., 1991, Science 254: 1497-1500; WO 92/20702; патент США № 5719262; патент США № 5698685;); морфоліни (див., наприклад, патент США № 5698685; патент США № 5378841; патент США № 5185144); карбамати (див., наприклад, Stirchak & Summerton, 1987, J. Org. Chem. 52: 4202); метилен(метиліміно) (див., наприклад, Vasseur et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 4006); 3'-тіоформацетали (див., наприклад, Jones et al., 1993, J. Org. Chem. 58: 2983); сульфамати (див., наприклад, патент США № 5470967); 2-аміноетилгліцин, згадуваний часто як PNA, (див., наприклад, Buchardt, WO 92/20702; Nielsen (1991) Science 254:1497-1500); і інші (див., наприклад, патент США № 581,781; Frier & Altman, 1997, Nucl. Acids Res. 25:4429 і посилання, процитовані в них). Аналоги фосфатних ефірів включають, але не обмежуються, (i) C1-C4 алкілфосфонат, наприклад, метилфосфонат; (ii) фосфорамідат; (iii) C 1-C6 алкілфосфотриефір; (iv) фосфоротіоат; і (v) фосфородитіоат. Додаткові модифікації включають хімічні модифікації (наприклад, див. WO 92/03568; US 5118672) у метою збільшення in vivo стабільності нуклеїнової кислоти, посилення її доставки, або зниження рівня очищення від об'єктів хазяїна. Більше того, в одному варіанті здійснення нуклеотидна послідовність може містити гібридні гени, штучні гени і поліепітопи. Гібридний ген, як позначається тут, є гібридним геном, сформованим із двох раніше самостійних генів, генних фрагментів або штучної ДНК або епітопів. Він може виникнути в результаті транслокації, інтерстиціальної делеції або інверсії. Гібридний ген може бути сконструйований шляхом сполучення щонайменше двох ДНК фрагментів, де ДНК фрагменти кодують ідентичні або різні амінокислотні послідовності. Гібридні білки можуть полегшувати експресію і/або очищення білків. Наприклад, поліпептид за винаходом може бути одержаний як глутатіон-S-трансфераза (GST) гібридний білок. Такі GST гібридні білки можуть бути використані для полегшення очищення поліпептиду за винаходом, а саме шляхом використання глутатіон-похідних матриксів (див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). В іншому варіанті здійснення, гібридний ген, що кодує лідерну послідовність для очищення, таку як полі(His)/сайт розщеплення ентерокіназої на N-кінці бажаної частини рекомбінантного білка, може уможливити очищення проекспресованого гібридного білка способом афінної хроматографії з 2+ використанням Ni металевої смоли. Лідерна послідовність для очищення може бути вилучена при обробці ентерокіназою для одержання очищеного білка (наприклад, див. Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411: 177; and Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). Додаткові гетерологічні послідовності, що кодують поліпептид, що дозволяє детекцію, ізоляцію, розчинення і/або стабілізацію поліпептиду, що був злитий, включають полі-His tag, myc, HA, протеїн A, протеїн G, кальмодулінзв`язуючий пептид, тіоредоксин, мальтозазв`язуючий білок, поліаргінін, полі-His-Asp, FLAG, частину імуноглобулінового білка і пептид трансцитозу. Методи одержання гібридних генів добре відомі. Фактично, сполучення різних ДНК фрагментів, що кодують різні поліпептидні послідовності, проводиться відповідно до звичайних методів, включаючи тупі і липкі кінці для лігування, розщеплення рестрикційними ферментами для одержання відповідних кінців, добудування липких кінців у випадку потреби, обробка лужною фосфатазою для запобігання небажаного сполучення і ферментативного лігування. В іншому варіанті, гібридний ген може бути синтезований традиційним методом, що включає автоматичне синтезування ДНК. Альтернативно, ПЛР ампліфікація фрагментів генів може проводитися з використанням якірних праймерів, що приводить до комплементарного перекривання між двома послідовними фрагментами, що можуть бути послідовно з'єднані для 7 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержання химерної послідовності гена (див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992) і способом гібридизаційної ПЛР, де два або більше полінуклеотиди мають ділянку ідентичності, що у реакції ПЛР може приводити до гібридної полінуклеотидної послідовності. В іншому переважному варіанті здійснення, нуклеотидна послідовність за даним винаходом кодує поліепітоп. Поліепітоп є химерним білком, що містить окремі епітопи з щонайменше одного білка/антигену, переважно, з більше ніж одного білка/антигену. Зазначені епітопи можуть бути «очищеними» або «біологічно чистими». Термін «очищений» стосується матеріалу, що є головним чином вільним від компонентів, що звичайно супроводжують його, як знайдено в його оточенні, що зустрічається в природі. «Очищений» епітоп стосується епітопу, що не містить сусідніх амінокислот із усієї послідовності антигену або білка, з якого епітоп походить. Стосовно амінокислотної послідовності, «епітоп» є набором амінокислотних залишків, що залучені в розпізнавання визначеним імуноглобуліном, або в контексті Т-клітин, ці залишки необхідні для впізнавання Т-клітинними рецепторними білками і/або молекулами Головного Комплексу Гістосумісності (Major Histocompatibility Complex (MHC)). Термін «пептид» належить до ряду амінокислот, з'єднаних один з одним, звичайно пептидними зв'язками між аміно- і карбоксильною групами прилягаючих амінокислот. Епітопи мають визначену довжину і зв'язуються з молекулами, що функціонують в імунній системі, переважно, HLA клас I і Т-клітинним рецептором. Епітопи в поліепітопному конструкті можуть бути епітопами HLA класу I і, можливо, епітопами HLA класу II. Епітопи HLA класу I називають CTL епітопами, і епітопи HLA класу II називають HTL епітопами. Деякі поліепітопні конструкти можуть мати підгрупу епітопів HLA класу I, і інші - підгрупу епітопів HLA класу II. CTL епітоп звичайно складається з 13 або менше амінокислотних залишків у довжину, 12 або менше амінокислотних залишків у довжину або 11 або менше амінокислотних залишків у довжину, переважно, 8-13 амінокислотних залишків у довжину, найбільш переважно, 8-11 амінокислотних залишків у довжину (тобто, 8, 9, 10 або 11). HTL епітоп складається з 50 або менше амінокислотних залишків у довжину, і звичайно з 6-30 залишків, більш звичайно з 12-25 і, переважно, складається з 15-20 (тобто, 15, 16, 17, 18, 19 або 20) амінокислот у довжину. Поліепітопний конструкт за даним винаходом, переважно, включає 2 або більше, 5 або більше, 10 або більше, 13 або більше, 15 або більше, 20 або більше або 25 або більше CTL епітопів. Більш точно, поліепітопний конструкт включає щонайменше 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60 або більше CTL епітопів. Гомологічні нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути одержані з будьякого організму, мікроорганізму, такого як будь-який вірус, будь-яка бактерія, будь-який гриб або паразит. Гомологічні нуклеотидні послідовності можуть бути як гетерологічні послідовності вектора, так і гомологічні йому. Коли, наприклад, вірус використовується як вектор, також власні вірусні нуклеотидні послідовності можуть бути розмножені за даним винаходом, наприклад, щоб надекспресувати білок вірусу для одержання посиленої імунної реактивності або безпеки. Переважно, гомологічні нуклеотидні послідовності одержують з інфекційного або патогенного мікроорганізму, і найбільш переважно з різних штамів або скарбів, різновидів, підтипів або серотипів зазначеного мікроорганізму. Терміни "штам" або "скарб" є технічними термінами, відомими фахівцю, що належить до таксономії мікроорганізмів. Таксономічна система класифікує усі дотепер охарактеризовані мікроорганізми в ієрархічному порядку: Сімейство, Рід, Вид, Штам (Fields Virology, ed. by Fields B. N., Lippincott-Raven Publishers, 4th edition 2001). У той час як критерієм для членів Сімейства є їх філогенетичні відношення, Роду включають всіх учасників, що розділяють загальні характеристики, і Вид визначений як політетичний клас, що утворює відтворювану лінію, і займає визначену екологічну нішу. Термін "штам" або "скарб" описує мікроорганізм, тобто вірус, що розділяє загальні характеристики, такі як основна морфологія або структура геному й організацію, але змінюється по біологічних властивостях, таким як діапазон хазяїна, тихорєцький тропізм, географічний розподіл, ослаблення або патогенність. Термін "різновиди" або "серотипи" далі розрізняє членів того ж самого штаму, що також називаються підтипами, що показують окремі спектри інфікування або алергенні властивості через незначні геномні зміни. Відповідно до подальшого варіанта здійснення даного винаходу, гомологічні нуклеотидні послідовності, переважно, відібрані з вірусів. Типові приклади вірусів включають без обмеження ВІЛ (ВІЛ-1 або ВІЛ-2), віруси герпесу (наприклад, HSV1 або HSV2), цитомегаловірус (CMV), вірус Епштейна-Барр (EBV), віруси гепатиту (наприклад, вірус гепатиту А (HAV), HBV, HCV і вірус гепатиту E), флавівіруси (наприклад, вірус жовтої лихоманки), вірус вітряної віспи (VZV), 8 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 параміксовіруси, респіраторно-синтиціальні віруси (RSV), віруси парагрипу, вірус кору, віруси грипу і папіломавірусу. Відповідно до іншого варіанта здійснення, гомологічні нуклеотидні послідовності відібрані з генів вірусу Dengue. Найбільш переважними є гени, одержані з різних серотипів вірусу, де ці гени можуть бути одержані з одного, двох, трьох або з усіх чотирьох серотипів вірусу Dengue. У переважному варіанті здійснення дві гомологічні нуклеотидні послідовності кодують гени респіраторно-синцитіального вірусу (RSV). У переважному варіанті здійснення гомологічні нуклеотидні послідовності кодують RSV-F і/або RSV-G білки. Переважно, один з RSV генів є повнорозмірним, а інший є зрізаним. В іншому переважному варіанті здійснення, дві, переважно, три гомологічні нуклеотидні послідовності кодують білки вірусу Ебола (EBOV). Три гомологічні нуклеотидні послідовності, що кодують білки вірусу Ебола (EBOV), звичайно, також покривають дві гомологічні нуклеотидні послідовності. У переважному варіанті здійснення гомологічні нуклеотидні послідовності кодують EBOV глікопротеїни (GP). У найбільш переважному варіанті здійснення нуклеотидні послідовності кодують білки-попередники глікопротеїну з EBOV штамів EBOV-B (Bundibugyo), EBOV-S (Sudan ebolavirus strain Gulu) і EBOV-Z (Zaire ebola virus strain Mayinga). В іншому варіанті здійснення гомологічні нуклеотидні послідовності відібрані з бактерій. Типові приклади придатних бактерій до яких включається без обмеження: несерія (наприклад, N. gonorrhea і N. meningitidis); бордетела (наприклад, B. pertussis, B. parapertussis і B. bronchiseptica), мікобактерії (наприклад, M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis); легіонела (наприклад, L. pneumophila); ешерихія (наприклад, ентеротоксична E. coli, ентерогеморагічна E. coli, ентеропатогенна E. coli); шигела (наприклад, S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii); сальмонела (наприклад, S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis); лістерія (наприклад, L. monocytogenes); хелікобактер (наприклад, H. pylori); псевдомона (наприклад, P. aeruginosa); стафілокок (наприклад, S. aureus, S. epidermidis); ентерокок (наприклад, E. faecalis, E. faecium); бацила (наприклад, B. anthracis); корінебактерія (наприклад, C. diphtheriae), і хламідія (наприклад, C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci). Типові приклади паразитів до яких включається без обмеження: плазмодій (наприклад, P. falciparum); токсоплазма (наприклад, T. gondii); лейшманія (наприклад, L. major); пневмоцистис (наприклад, P. carinii); і шизостома (наприклад, S. mansoni). Представницькі приклади грибів до яких включається без обмеження: кандида (наприклад, C. albicans) і апрегілус. Щонайменше дві нуклеотидні послідовності можуть бути одного розміру або різних розмірів. У переважному варіанті здійснення, одна з двох нуклеотидних послідовностей є зрізаною в порівнянні з іншою. Усікання може бути як з 5'-, так і з 3'-кінця. У різних варіантах здійснення 300 нуклеотидів у двох нуклеотидних послідовностях кодують 100 амінокислот, що мають щонайменше 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 або 100% амінокислотної ідентичності. У переважному варіанті здійснення, зазначена амінокислотна ідентичність знаходиться на ділянці 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 або 1000 або більш послідовних амінокислот. В особливо переважному варіанті здійснення, амінокислоти мають щонайменше 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 або 100% амінокислотної ідентичності на ділянці щонайменше 150 або 200 послідовних амінокислот. В інших переважних варіантах здійснення, білок, кодований двома нуклеотидними послідовностями, має щонайменше 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 або 100% амінокислотної ідентичності на ділянці 300 або 500 послідовних амінокислот. В інших переважних варіантах здійснення, білок, кодований двома нуклеотидними послідовностями, має 85-100%, особливо 100% амінокислотної ідентичності на ділянці 100, 200, 400, 600 або 800 послідовних амінокислот у попарному порівнянні. Як використовується тут, будь-який термін, що стосується «процентної ідентичності послідовності», такий як «амінокислотна ідентичність», стосується ступеня ідентичності між будь-якою даною запитуваною послідовністю і послідовністю-об'єктом. Зокрема, терміни, що випливають, використовуються для опису споріднення послідовності між двома або більше нуклеїновими кислотами, полінуклеотидами або амінокислотними послідовностями: «референсна послідовність», «вікно порівняння», «ідентичність послідовності», «відсоток ідентичності послідовності» і «структурна ідентичність». «Референсна послідовність» є визначеною послідовністю, використовуваною як основа для порівняння послідовності; референсна послідовність може бути частиною більшої послідовності. Терміни «ідентичний» або процентно «ідентичний», у контексті однієї або більше послідовностей нуклеїнової кислоти або поліпептиду, стосується двох або більше послідовностей або підпослідовностей, що є такими же самими або мають визначений відсоток 9 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислотних залишків або нуклеотидів, що є тими ж (наприклад, 75% ідентичний, 80% ідентичний, 85% ідентичний, 90% ідентичний, 99 або 100% ідентичний у попарному порівнянні), при порівнянні і вирівнюванні для найбільшої відповідності у вікні порівняння або позначеної області при вимірюванні з використанням алгоритму порівняння послідовності або шляхом ручного вирівнювання і візуального огляду. Відсоток обчислюють шляхом визначення числа позицій, у яких гомологічні основи нуклеїнової кислоти або залишки амінокислот присутні в обох послідовностях для одержання числа позицій, що збіглися, поділяючи число позицій, що збіглися, на загальну кількість позицій у вікні порівняння і множачи результати на 100 для одержання процентності ідентичності послідовності. Фраза «значно ідентичний», у контексті двох нуклеїнових кислот або поліпептидів, стосується двох або більше послідовностей або підпослідовностей, що мають щонайменше приблизно 85% ідентичності, щонайменше приблизно 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100% ідентичності нуклеотидів або амінокислотних залишків, при порівнянні і вирівнюванні попарно для найбільшої відповідності, при вимірюванні з використанням алгоритму порівняння послідовності або шляхом візуального огляду. У прикладі здійснення значна ідентичність є в наявності протягом області послідовності, що має довжину щонайменше приблизно 50 залишків. В іншому прикладі здійснення, значна ідентичність є в наявності протягом області послідовності, що має довжину щонайменше приблизно 100 залишків. У ще іншому прикладі здійснення, значна ідентичність є в наявності протягом області послідовності, що має довжину щонайменше приблизно 150 або більше залишків. В одному прикладі здійснення, послідовності значно ідентичні протягом усієї довжини послідовності нуклеїнової кислоти або послідовності білка. Для порівняння послідовностей, як правило, одна послідовність служить референтною послідовністю, з якою порівнюють тестові послідовності. При використанні алгоритму порівняння послідовності тестову і референсну послідовності вводять у комп'ютер, координати підпослідовності визначаються, у випадку потреби, і визначаються параметри програми алгоритму послідовності. Можуть використовуватися параметри програми за замовченням, або альтернативні параметри можуть бути визначені. Алгоритм порівняння послідовності потім обчислює відсоток ідентичності послідовностей для тестової послідовності відносно референсної послідовності на основі параметрів програми. "Вікно порівняння", як використовується тут, включає посилання на відрізок з будь-якою кількістю послідовних позицій, відібраних із групи, що складається з від 20 до 600, звичайно 2050, від приблизно 50 до приблизно 100, від приблизно 100 до приблизно 200, частіше від приблизно 100 до приблизно 150 або приблизно 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 або 3000 або навіть більше, у якому послідовність може бути порівняна з референсною послідовністю з тією же самою кількістю послідовних позицій після того, як ці дві послідовності оптимально вирівняні. Процентна ідентичність може бути визначена з використанням способу порівняння Needleman і Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970), що є еквівалентним Sellers (SIAM J. of Applied Math 26; 787-793 (1974). Процентна ідентичність може бути визначена, наприклад, шляхом порівняння інформації про послідовність з використанням комп'ютерної програми GAP, версія 6.0, описаної Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) і доступної в University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG), що використовує цей спосіб порівняння. Переважні параметри за замовченням для програми GAP включають: (1) унарну матрицю порівняння (що містить значення 1 для ідентичності і 0 для неідентичності) для нуклеотидів і обважнену матрицю порівняння Gribskov і Burgess, Nucl Acids Res. 14:6745, 1986, як описано Schwartz і Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) штраф, що дорівнює 3,0 для кожної невідповідності і додатковий штраф 0,10 для кожного символу в кожній невідповідності; і (3) відсутність штрафу для закінчення невідповідності. Іншим придатним інструментом для застосування є ContigExpress з VectorNTI Advance програми (INVITROGEN), наприклад, версії 10.3.1 від 2007 року. Відповідно до даного винаходу, виродженість генетичного коду використовується, щоб зробити гомологічні або ідентичні нуклеотидні послідовності менш гомологічними, з метою запобігання внутрішньомолекулярної рекомбінації. Зазначені розходження можуть бути уже включені в нуклеотидні послідовності природою і/або включені штучно шляхом заміщення. У різних варіантах здійснення, кількість різних нуклеотидів, що беруть початок від природи, плюс від штучного заміщення складає щонайменше 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500. Переважно, кількість різних основ складає щонайменше 75, 200 або 10 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 450. Кількість розходжень, звичайно, змінюється і збільшується, відповідно, з кількістю нуклеотидів у нуклеотидних послідовностях. У переважному варіанті здійснення заміщені щонайменше 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500 нуклеотидів. Зазначені заміни штучно введені незалежно від кількості вже присутніх відмінних нуклеотидів, внесених, наприклад, мутаціями, що мовчать. У різних варіантах здійснення, дві нуклеотидні послідовності з ділянками ідентичності не більше ніж 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 або 4 послідовних нуклеотидів після заміщення є переважними. У випадку більше ніж двох нуклеотидних послідовностей, ділянки ідентичності не більше ніж 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 або 4 послідовних нуклеотидів після заміщення є переважними. В іншому варіанті здійснення, нуклеотидні послідовності можуть мати щонайменше 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 заміщених нуклеотидів з 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 або 1600 або більше нуклеотидів. У контексті цього винаходу, заміщення нуклеотидів відмінними нуклеотидами позначає технічну або штучну заміну нуклеотидів іншими нуклеотидами. Переважно, заміщені нуклеотиди не змінюють кодовану амінокислотну послідовність. Заміщення може бути здійснене шляхом ідентифікації кодонів у двох гомологічних нуклеотидних послідовностях, що кодують ті самі амінокислоти, і зміни кодонів в одній із двох гомологічних нуклеотидних послідовностей таким чином, що кодони продовжують кодувати ті ж самі амінокислоти. Зміна може бути зроблена в одній, обох або всіх гомологічних нуклеотидних послідовностях. Наприклад, амінокислота пролін кодується кодонами CCA, CCC, CCG і CCU (на рівні ДНК U замінюється на T). Проста нуклеотидна послідовність, CCCCCC, що спочатку кодує два проліни в двох гомологічних нуклеотидних послідовностях може бути перетворена в CCACCG, що також кодує два проліни, в одній із двох гомологічних нуклеотидних послідовностей. Альтернативно, одна з послідовностей, що кодують пролін-пролін, може бути перетворена в CCCCCG, і інша в CCACCC. Більш складним прикладом служить амінокислота серин, що кодується кодонами UCA, UCC, UCG, UCU, AGC і AGU. Аналогічно, UCAUCA, що спочатку кодує два різних серини, може бути перетворена в множинних гомологічних послідовностях у AGCAGC (не має загальних нуклеотидів з UCAUCA) і UCGAGU (що має тільки одну загальну позицію з UCAUCA або двох позицій з AGCAGC) і так далі. Це дозволяє велику гнучкість у введенні різних нуклеотидних варіантів у двох або більше нуклеотидних послідовностей, що кодують серин-серин. Переважно, при кодон-оптимізації, як описано в даному винаході, уникають використання рідких кодонів для бажаного хазяїна, оскільки рідкі кодони можуть блокувати або знизити експресію кодованого білка. Також переважно уникають замін, що можуть увести сигнали нуклеїнових кислот для бажаного хазяїна. Такі сигнали включають, але не обмежуються, сигнали сплайсингу, сигналу термінації і сигнали ініціації. Переважно, мотиви послідовності, що випливають, можуть уникатися в залежності від типу використовуваного вектора, наприклад, сигнал ранньої термінації транскрипції вірусу коров'ячої віспи не має потребу в запобіганні для багатьох інших векторів, що не є поксвірусними векторами: - внутрішні TATA-бокси, chi-сайти і сайти зв'язування рибосоми; - АТ-багаті і GC-багаті ділянки послідовності; - ARE, INS і CRS елементи послідовності; - повторювані послідовності і РНК вторинні структури; - (неявні) донорні й акцепторні сайти сплайсингу, і сайти розгалуження; і - сигнали ранньої термінації транскрипції для вірусу коров'ячої віспи: (TTTTTNT). Короткий опис фігур Більш повний винахід може бути зрозумілий при зверненні до фігур, на яких: Фіг. 1 зображує порівняння нуклеотидних послідовностей, що кодують повнорозмірний RSVF (F) білок з нуклеотидною послідовністю, що кодує заміщений зрізаний RSV-F_trunc (F_trunc) білок. Ідентичні послідовності виділені чорними, і заміщені нуклеотиди залишаються невиділеними. Показано розташування праймерів А1 і В2. Фіг. 2 зображує порівняння повнорозмірного RSV-F (F) білка з зрізаним RSV-F_trunc (F_trunc) білком. Повнорозмірна послідовність RSV-F зрізана на 50 ак, що приводить до одержання зрізаного RSV-F_trunc білка. Білок RSV-F_trunc перекриває приблизно 91% повнорозмірного білка. Фіг. 3 зображує експресію RSV-F і RSV-F_trunc з рекомбінантних MVA-BN® вірусів у людській клітинній лінії. Вестерн-блот аналіз з екстрактами з інфікованих людських клітин після інфікування різними вірусами на основі MVA-BN®, з MOI 10 і лізисом через 24 години після 11 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інфікування. MVA-BN® (контроль з порожнім вектором; доріжка 1), MVA-mBN172B (рекомбінантний MVA-BN® з повнорозмірним RSV-F; доріжка 2), MVA-mBN173B (рекомбінантний MVA-BN® зі зрізаним RSV-F_trunc; доріжка 3) і доріжка 4: MVA-mBN175B (рекомбінантний MVA-BN® з RSV-F і RSV-F_trunc). Підрахована молекулярна вага білків: RSV-F (61,6 кДа) і RSV-F_trunc (56,1 кДа). Фіг. 4A-C зображують ПЛР аналіз MVA-mBN175B. Показані RSV-F (F) і RSV-F_trunc (F_trunc). А. Результати ПЛР із різними праймерними парами. M=маркер (1 kb-ladder, New England Biolabs). Доріжка 1 - MVA-mBN175B. Доріжка 2 - позитивна контрольна плазміда (pBN345). Доріжка 3 - MVA-mBN®. Доріжка 4 - водний контроль . Доріжка 5 - позитивна контрольна плазміда (pBN343). B. Схема MVA-mBN175B, що показує розташування праймерів, використовуваних для ПЛР, показаних на Фіг. 4А. C. Схема MVA-mBN® дикого типу, що показує розташування праймерів. Фіг. 5A-C зображують гіпотетичну рекомбінацію F/Ftrunc між повнорозмірним RSV-F геном (F) і зрізаним F геном (Ftrunc) у двічі рекомбінантному MVA, і розташування ПЛР праймерів у рекомбінантному і нерекомбінантному вірусах і контрольних плазмідах. A. MVA-mBN175B. B. pMISC173. C. pMISC172. Фіг. 6 зображує аналіз ДНК, виділеної з клітин, інфікованих MVA-mBN175B. Доріжки 1 і 7 є маркерними. Доріжка 2 - MVA-mBN175B. Доріжка 3 є плазмідним контролем для гена F (pBN343). Доріжка 4 є плазмідним контролем для зрізаного гена F (pBN345). Доріжка 5 - MVABN®. Доріжка 6 - водний контроль. Очікуваний ПЛР продукт гіпотетичної рекомбінації між RSV-F геном і зрізаним F геном RSV-F_trunc у MVA-mBN175B становить 613 нуклеотидних пар. Фіг. 7 зображує порівняння трьох EBOV (вірус Ебола) GP (глікопротеїн) білкових послідовностей. Порівнювали амінокислотні послідовності трьох GP білків вірусу Ебола штамів EBOV-B, EBOV-S і EBOV-Z. У порівнянні Gaps були не дозволені. Загальна ідентичність у всіх трьох білкових послідовностях становила 48,5%. Сірий фон: ідентичні у всіх трьох білкових послідовностях. Чорний фон: ідентичні в двох білках. Фіг. 8A і 8B зображують порівняння трьох EBOV GP кодуючих послідовностей, використовуваних у рекомбінантному конструкті на основі MVA-BN®. Кодуючі послідовності для GP генів, що походять з трьох EBOV штамів EBOV-B, -S і -Z, порівнювали перед (неопт; див. Фіг. 8А) і після (опт; див. Фіг. 8В) оптимізації. У порівнянні Gaps були не дозволені. Сірий фон: ідентичні нуклеотидні позиції в трьох кодуючих послідовностях. Чорний фон: ідентичні нуклеотидні позиції в двох кодуючих послідовностях. Ідентичність у нуклеотидних позиціях трьох генів перед оптимізацією (неопт) становить 45,3%, тоді як після оптимізації (опт) становить 44,6. Фіг. 9 зображує попарне порівняння трьох EBOV GP кодуючих послідовностей, використовуваних у рекомбінантному конструкті на основі MVA-BN®. Кодуючі послідовності для GP генів, що походять з трьох EBOV штамів EBOV-B, -S і -Z порівнювали попарно перед (неопт; див. Фіг. 9А) і після (опт; див. Фіг. 9В) оптимізації. У порівнянні Gaps були не дозволені. Сірий фон: ідентичні нуклеотидні позиції в кодуючий послідовності. Ідентичність у нуклеотидних позиціях трьох генів перед (неопт) і після (опт) оптимізації зведена в таблиці С. Фіг. 10 зображує розщеплення рестрикційними ферментами і плазмідну карту плазміди pMISC210, що містить повнорозмірний (RSV-F) і зрізаний (RSV-F_trunc) білок. Доріжка 1: плазміда pMISC210, що містить RSV-F і RSV-F_trunc; Доріжка 2: контрольна плазміда pMISC209, що містить тільки RSV-F_trunc; Доріжка 3: маркер молекулярної ваги. Показано розмір смуг маркера в парах нуклеотидних основ (по). Приклади Приклад 1 Одержання заміщеного, зрізаного гена F Було бажане створення рекомбінантного MVA, експресуючого як повнорозмірний білок RSVF, так і зрізану версію RSV-F_trunc. Однак, на основі результатів з MVA і іншими вірусами коров'ячої віспи, що містять повторювані послідовності, очікувалося, що внутрішньомолекулярна рекомбінація приведе до рекомбінації між двома копіями гена F, результатом чого буде делеція однієї з копій гена F. Щоб мінімізувати наявність довгих ділянок ідентичних нуклеотидів між двома генами F, кодони в нуклеотидній послідовності, що кодує ген RSV-F_trunc, були заміщені зі збереженням амінокислотної послідовності генів F. Уникали використання рідких кодонів для ссавців і курчат. Крім того, уникали замін, що могли б ввести сигнали в нуклеїнову кислоту. Такі сигнали уключали внутрішні TATA-бокси, chi-сайти і сайти зв'язування рибосоми; АТ-багаті і GC-багаті ділянки послідовності; ARE, INS і CRS елементи послідовності; повторювані послідовності і РНК вторинні структури; (неявні) донорні й акцепторні сайти сплайсингу, сайти розгалуження; і 12 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сигнали термінації для коров'ячої віспи (TTTTTNT). Заміщена нуклеотидна послідовність показана на Фіг. 1, у порівнянні з кодуючою послідовністю повнорозмірного RSV-F білка. Хоча значна ідентичність зберігається протягом всіх двох кодуючих послідовностей, у двох кодуючих послідовностях немає великих ділянок ідентичності, що залишаються, більше ніж дев'ять послідовних нуклеотидів. На Фіг. 2 представлене порівняння білків, кодованих двома кодуючи ми послідовностями. Два білки мають 100% ідентичність протягом перших 524 амінокислот (заміщений білок F зрізаний з карбоксильного кінця). Таким чином, хоча ці дві кодуючи послідовності кодують ділянку ідентичних амінокислот, одна з послідовностей була заміщена стосовно іншої. Приклад 2 Одержання рекомбінантних вірусів, що містять RSV-F гени ДНК, що кодує повнорозмірний RSV-F ген, була інтегрована в MVA у двох різних сайтах інтеграції для одержання MVA-mBN170B і MVA-mBN172B (у сайте IGR88/89). Заміщений RSVF_trunc ген був інтегрований у MVA у сайт IGR148/149 для одержання MVA-mBN173B. Потім був створений двічі рекомбінантний MVA, що містить повнорозмірний RSV-F ген, інтегрований у MVA у сайті IGR88/89, і заміщений RSV-F_trunc ген, інтегрований у той же MVA у сайті IGR148/149. Двічі рекомбінантний вірус був названий MVA-mBN175B. Схематичне зображення цього вірусу представлено на Фіг. 4В. Приклад 3 Експресія F білків з рекомбінантних вірусів З метою визначити, чи експресується білок із заміщеною нуклеотидною послідовністю, був проведений вестерн-блот аналіз на білкових екстрактах з людської клітинної лінії, інфікованої рекомбінантним MVA-BN®-основаним вірусом, що кодує повнорозмірний RSV-F ген (MVAmBN172B), вірусом, що кодує заміщений RSV-F_trunc ген (MVA-mBN173B), і двічі рекомбінантним вірусом, що кодує обидва, повнорозмірний і RSV-F_trunc гени (MVA-mBN175B). Усі три віруси показали продукцію RSV-F білків відповідного розміру на вестерн-блот аналізі (Фіг. 3), тоді як MVA-BN® контроль (порожній вектор) не показав яких-небудь смуг, як і очікувалося. Таким чином, повнорозмірний F білок і зрізаний F білок, експресований із заміщеної нуклеотидної послідовності, були експресовані індивідуально з однократно рекомбінантного MVA-BN®, але обоє були коекспресовані з одного двічі рекомбінантного MVABN® вірусу (MVA-mBN175B) у людській клітинній лінії. Приклад 4 Нарощування рекомбінантного вірусу Клітини фібробластів ембріона курчати були інфіковані MVA-mBN175B, конструктом, що містить як повнорозмірний F ген, так і заміщений RSV-F_trunc ген, або конструктом, що містить тільки один повнорозмірний F ген, для одержання першого вірусного стоку. Подібні титри двічі 7 рекомбінантного вірусу, що містить як повнорозмірний F ген, так і заміщений F ген (1,34×10 TCID50), спостерігали в порівнянні з титрами вірусу, що містить тільки один повнорозмірний F 7 ген (1,46×10 TCID50). Ці результати означають, що стабільний двічі рекомбінантний MVA був одержаний, і що рекомбінація між двома копіями F гена була обмежена шляхом заміщення нуклеотидних основ у послідовностях. Приклад 5 ПЛР аналіз рекомбінантних вірусів ПЛР аналіз проводився на ДНК із клітин, інфікованих MVA-mBN175B або MVA-BN®, з використанням вставка-специфічних або фланк-специфічних праймерних пар, зображених на Фіг. 4В і С. ПЛР А з праймерами A1/A2, що є специфічними для повнорозмірного F гена, детектувала смугу розміром 663 нуклеотидні пари (по) у клітинах, інфікованих MVA-mBN175B, і в специфічному плазмідному позитивному контролі, як і очікувалося. Ця смуга, як і очікувалося, була відсутня в клітинах, інфікованих MVA-BN® або у водному контролі (Фіг. 4А). ПЛР В з праймерами В1/В2, що є специфічними для заміщеного, зрізаного F гена, детектувала смугу розміром 625 по в клітинах, інфікованих MVA-mBN175B, і в специфічному плазмідному позитивному контролі, як і очікувалося. Ця смуга, як і очікувалося, була відсутня в клітинах, інфікованих MVA-BN® або у водному контролі (Фіг. 4А). ПЛР С з праймерами С1/С2, що детектують вставки в сайті IGR88/89, детектувала смугу розміром 2047 по в клітинах, інфікованих MVA-mBN175B, і в специфічному плазмідному позитивному контролі, як очікувалося. Ця смуга, як очікувалося, відсутня у клітинах, інфікованих порожнім векторним контролем MVA-BN®, замість цього смуга 161 по вказує на ситуацію дикого типу в IGR88/89 у MVA-BN® (Фіг. 4А). ПЛР D із праймерами D1/D2, що детектують вставки в сайті IGR148/149, детектувала смугу розміром 2062 по в клітинах, інфікованих MVA-mBN175B, і в специфічному плазмідному позитивному контролі, як очікувалося. Ця смуга, як очікувалося, відсутня у 13 UA 105193 C2 5 10 15 20 25 30 клітинах, інфікованих порожнім векторним контролем MVA-BN®, замість цього смуга 360 по вказує на ситуацію дикого типу в IGR88/89 у MVA-BN® (Фіг. 4А). Рекомбінація між генами F привела б до гібридного F гену, що має частини F гена дикого типу і частини зрізаного F гена (Фіг. 5А). Для визначення наявності яких-небудь рекомбінантів був проведений ПЛР аналіз на ДНК із клітин, інфікованих MVA-mBN175B або MVA-BN®, з використанням праймерних пар A1/B2 (Фіг. 5B), яким відповідає продукт 613 по, специфічний для рекомбінантного гена F. Результати цієї ПЛР не показали детектовних рекомбінантів (Фіг. 6). Ці результати означають, що був одержаний стабільний двічі рекомбінантний MVA, і рекомбінація між двома копіями F гена була обмежена. Приклад 6 Одержання рекомбінантних генів глікопротеїну (GP) трьох різних штамів вірусу Ебола (EBOV) Було бажаним одержання рекомбінантного MVA, що експресує три глікопротеїни (GP) вірусу Ебола (EBOV). Штами EBOV, використовувані тут, були EBOV-B (Bundibugyo), EBOV-S (Судан) і EBOV-Z (Заїр), усі приналежні до вірусних штамів, що високо летальні для інфікованих людей. Названі три GP мають загальну ідентичність 48,5%, що означає, що практично кожна друга амінокислота в GP білках є ідентичною для всіх трьох штамів, тоді як процентна ідентичність на всьому протязі повнорозмірної білкової послідовності в порівнянні комбінацій двох штамів знаходиться між 57,0 і 64,2% (Фіг. 7). Для мінімізації наявності довгих ділянок ідентичних нуклеотидів у трьох EBOV GP генах, кодони в трьох нуклеотидних послідовностях були заміщені, зі збереженням кодованої амінокислотної послідовності трьох GP генів. Уникали використання рідких для ссавців і курчат кодонів, також як і уникали замін, що можуть ввести в нуклеїнову кислоту сигнали. Такі сигнали уключали внутрішні TATA-бокси, chi-сайти і сайти зв'язування рибосоми; АТ-багаті і GC-багаті ділянки послідовності; ARE, INS і CRS елементи послідовності; повторювані послідовності і РНК вторинні структури; (неявні) донорні й акцепторні сайти сплайсингу, сайти розгалуження; і сигнали термінації для коров'ячої віспи (TTTTTNT). G після ATG старт-кодона передбачає сильну експресію і є присутнім в оригінальній кодуючий послідовності усіх трьох EBOV GP генів, і він був збережений. Хоча від 23,3 до 24,9% нуклеотидів у кожній з 3 оптимізованих EBOV GP кодуючих послідовностей були замінені (див. таблицю А), загальна ідентичність між трьома GP кодуючими послідовностями змінилася несуттєво (таблиця В). У двох випадкахпопарне порівняння показало навіть незначно більш високу ідентичність після оптимізації кодуючих послідовностей, як показано нижче в таблиці В. 35 Таблиця А Нуклеотидні заміни в трьох оптимізованих EBOV GP генах. Таблиця показує кількість змінених нуклеотидів у відповідних позиціях в оптимізованих GP кодуючих послідовностях (опт) у порівнянні з неоптимізованою (неопт) послідовністю різних штамів EBOV, на основі загальної кількості нуклеотидів у [%]. Загальна кількість по - 1147 EBOV-B неопт:EBOV-B опт EBOV-S неопт:EBOV-S опт EBOV-Z неопт:EBOV-Z опт змінені нуклеотидні позиції в оптимізованих GP кодуючих послідовностях у порівнянні з неоптимізованими послідовностями [%] 23,3 24,9 23,9 Таблиця В Ідентичні нуклеотидні позиції трьох EBOV GP кодуючих послідовностей. Таблиця показує кількість ідентичних нуклеотидів у відповідних позиціях у двох кодуючих послідовностях різних штамів EBOV, на основі загальної кількості нуклеотидів у [%] попарне порівняння GP генів EBOV-B:EBOV-S EBOV-B:EBOV-Z EBOV-S:EBOV-Z ідентичність нуклеотидів у неоптимізованих генах [%] 57,0 64,2 57,6 14 ідентичність нуклеотидів в оптимізованих генах [%] 57,3 61,1 60,4 UA 105193 C2 5 10 Попарні порівняння GP кодуючих послідовностей трьох штамів EBOV EBOV-B, -S і -Z показало ідентичність нуклеотидних позицій і розподіл ідентичностей (Фіг. 9). Відповідно, спосіб за даним винаходом привів до укорочення ділянок нуклеотидної ідентичності в EBOV GPпослідовностях. При розгляді довгих ділянок ідентичних послідовних нуклеотидів очевидно, що розмикання або укорочення таких ділянок ідентичності є важливою частиною стратегії для запобігання рекомбінації між послідовностями, що мають деякий рівень нуклеотидної ідентичності. У таблиці С (див. нижче) показана кількість ділянок послідовних ідентичних нуклеотидів з попарного порівняння GP кодуючих послідовностей. Перед оптимізацією є ділянки довгої до 23 по, і сумарно є 41 ділянка з 10 або більше ідентичних нуклеотидів. В оптимізованій версії GP генів знайдена тільки одна ділянка довжиною 13 по, і можуть бути знайдені 7 ділянок довжиною 10 або більше ідентичних нуклеотидів. Таблиця С Довгі ділянки послідовних ідентичних нуклеотидів. Таблиця показує кількість ділянок послідовних ідентичних нуклеотидів визначеної довжини в попарному порівнянні EBOV GP кодуючих послідовностей перед (неопт) і після (опт) оптимізації. Кількість попарних порівнянь підсумовано в колонку «загальна кількість». Найдовша ділянка в неоптимізованому порівнянні складається з 23 послідовних ідентичних нуклеотидів, тоді як в оптимізованих генах він зменшений до максимум 13 нуклеотидів. Показані тільки ділянки довжиною 10 або більше нуклеотидів довжина 23 нт 20 нт 17 нт 16 нт 14 нт 13 нт 12 нт 11 нт 10 нт 15 20 25 30 35 EBOV-B:EBOV-S неопт опт EBOV-B:EBOV-Z неопт опт 1 2 EBOV-S:EBOV-Z неопт опт 1 1 10 1 2 2 2 1 2 4 2 1 2 1 1 1 8 1 2 загальна кількість неопт опт 1 2 1 2 4 2 1 3 22 3 4 3 Приклад 7 Одержання рекомбінантних MVA-BN® вірусів з GP генами штамів EBOV Три EBOV GP гени були синтезовані GeneArt (Regensburg, Germany) і клоновані в рекомбінантні вектори, з огляду на інтеграцію в MVA-BN®. Був одержаний рекомбінантний вірус, що містить три оптимізованих послідовності гомологічних GP генів із трьох різних штамів EBOV. Транскрипція трьох інтегрованих GP кодуючих послідовностей контролювалася різними окремими ранній-пізній промоторами. Специфічні ПЛР реакції для трьох оптимізованих EBOV-GP послідовностей показали наявність трьох окремих генів у рекомбінантному MVA-BN®. Приклад 8 Одержання плазміди, що містить RSV-F гени Дві версії RSV-F гена, використовувані в прикладах 1-5 і показані на Фіг. 1, були клоновані в одну плазміду і поміщені в E.coli TZ101 (Trenzyme Gmb, Konstanz, Germany) з використанням стандартних технік клонування. Плазміда (див. карту плазміди на Фіг. 10) була виділена і розщеплена рестрикційними ферментами Ale I, Dra III і Spe I, і розділена в 1% TAE агарозному гелі (див. Фіг. 10). Патерн смуг для pMISC210, що кодує повнорозмірний RSV-F білок і білок RSV-F_trunc (доріжка 1), також як і контрольна плазміда pMISC209, що кодує тільки білок RSVF_trunc (доріжка 2) був порівняний з патернами, очікуваними після результатів аналізу електронної послідовності плазмід. Очікуваний розмір смуг для pMISC210 був 404, 573, 809, 1923 і 4874 по, тоді як для pMISC209 був очікуємо патерн смуг з розмірами 573, 661, 809 і 4874 по. Експериментально були виявлені всі очікувані смуги і ніякі додаткові смуги. У випадку проходження рекомбінації між варіантами RSV-F у pMISC210, один або більше найбільш дрібних фрагментів були б утрачені, у залежності від сайта рекомбінації. У даному експерименті такого однозначно не було знайдено. Таким чином, результати показують, що плазміда рMISC210 із двома генами RSV-F (RSV-F і RSV-F_trunc) є стабільною в E.coli. 15 UA 105193 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Вектор, який містить дві нуклеотидні послідовності довжиною 300 нуклеотидів, що кодують кожна 100 амінокислот, де 100 амінокислот, кодованих кожною з двох нуклеотидних послідовностей, мають щонайменше 75 % амінокислотної ідентичності, і де одна з двох нуклеотидних послідовностей має щонайменше 75 нуклеотидів, що відрізняються від іншої нуклеотидної послідовності, де відмінні нуклеотиди не змінюють ідентичні амінокислоти, кодовані зазначеними двома нуклеотидними послідовностями. 2. Вектор за п. 1, де вектор є вірусним вектором, переважно поксвірусним вектором. 3. Вектор за п. 2, де поксвірус є вірусом коров'ячої віспи, переважно модифікованим vaccinia Ankara (MVA) вірусом. 4. Вектор за будь-яким з пп. 1-3, де заміщені щонайменше 75 різних нуклеотидів. 5. Вектор за будь-яким з пп. 1-4, де дві нуклеотидні послідовності є генами респіраторносинцитіального (RSV) вірусу, особливо генами RSV-F і/або RSV-G, або двома, переважно трьома, генами філовірусу, особливо генами філовірусного глікопротеїну (GP). 6. Спосіб одержання вектора за п. 1, де зазначений спосіб включає стадії: а) одержання першої нуклеотидної послідовності довжиною 300 нуклеотидів, що кодує 100 амінокислот; б) одержання другої нуклеотидної послідовності довжиною 300 нуклеотидів, що кодує 100 амінокислот, де 100 амінокислот, кодованих кожною з двох нуклеотидних послідовностей, мають щонайменше 75 % амінокислотної ідентичності, і де одна з двох нуклеотидних послідовностей має щонайменше 75 нуклеотидів, що відрізняються від іншої нуклеотидної послідовності, де відмінні нуклеотиди не змінюють ідентичні амінокислоти, кодовані зазначеними двома нуклеотидними послідовностями; і в) інтеграції двох відмінних нуклеотидних послідовностей у вектор. 7. Спосіб за п. 6, де вектор є вірусним вектором, переважно поксвірусним вектором. 8. Спосіб за п. 7, де поксвірус є вірусом коров'ячої віспи, переважно модифікованим vaccinia Ankara (MVA) вірусом. 9. Спосіб за будь-яким з пп. 6-8, де заміщені щонайменше 75 різних нуклеотидів. 10. Спосіб за будь-яким з пп. 6-9, де дві нуклеотидні послідовності є генами респіраторносинцитіального (RSV) вірусу, особливо генами RSV-F і/або RSV-G, або двома, переважно трьома, генами філовірусу, особливо генами філовірусного глікопротеїну (GP). 11. Спосіб зниження внутрішньомолекулярної рекомбінації у векторі, що містить дві нуклеотидні послідовності довжиною 300 нуклеотидів, що кодують кожна 100 амінокислот, де 100 амінокислот, кодованих кожною з двох нуклеотидних послідовностей, мають щонайменше 75 % амінокислотної ідентичності, де зазначений спосіб включає заміну нуклеотидів в одній або обох нуклеотидній(их) послідовності(ях) для одержання двох відмінних послідовностей, що мають відмінність щонайменше в 75 нуклеотидів, де відмінні нуклеотиди не змінюють ідентичні амінокислоти, кодовані зазначеними двома нуклеотидними послідовностями. 12. Спосіб за п. 11, де вектор є вірусним вектором, переважно поксвірусним вектором. 13. Спосіб за п. 12, де поксвірус є вірусом коров'ячої віспи, переважно модифікованим vaccinia Ankara (MVA) вірусом. 14. Спосіб за будь-яким з пп. 11-13, де заміщені щонайменше 75 різних нуклеотидів. 15. Спосіб за будь-яким з пп. 11-14, де дві нуклеотидні послідовності є генами респіраторносинцитіального (RSV) вірусу, особливо генами RSV-F і/або RSV-G, або двома, переважно трьома, генами філовірусу, особливо генами філовірусного глікопротеїну (GP). 16. Спосіб одержання вірусу, переважно поксвірусу, що містить дві гомологічні нуклеотидні послідовності, де зазначений спосіб включає стадії: а) одержання вірусу, що містить нуклеотидну послідовність довжиною 300 нуклеотидів, що кодує 100 амінокислот, і б) інтеграції другої нуклеотидної послідовності довжиною 300 нуклеотидів, що кодує 100 амінокислот, у вірус; де 100 амінокислот, кодованих кожною з двох нуклеотидних послідовностей, мають щонайменше 75 % амінокислотної ідентичності; і де одна з двох нуклеотидних послідовностей має щонайменше 75 нуклеотидів, що відрізняються від іншої нуклеотидної послідовності, 16 UA 105193 C2 5 де відмінні нуклеотиди не змінюють ідентичні амінокислоти, кодовані зазначеними двома нуклеотидними послідовностями. 17. Спосіб за п. 16, де поксвірус є вірусом коров'ячої віспи, переважно модифікованим vaccinia Ankara (MVA) вірусом. 18. Спосіб за будь-яким з пп. 16-17, де заміщені щонайменше 75 різних нуклеотидів. 19. Спосіб за будь-яким з пп. 16-18, де дві нуклеотидні послідовності є генами респіраторносинцитіального (RSV) вірусу, особливо генами RSV-F і/або RSV-G, або двома, переважно трьома, генами філовірусу, особливо генами філовірусного глікопротеїну (GP). 17 UA 105193 C2 18 UA 105193 C2 19 UA 105193 C2 20 UA 105193 C2 21 UA 105193 C2 22 UA 105193 C2 23 UA 105193 C2 24 UA 105193 C2 25 UA 105193 C2 26 UA 105193 C2 27 UA 105193 C2 28