Спосіб вакцинації свині проти високопатогенного репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (hp prrs)

Реферат: Винахід належить до способу вакцинації свиней від захворювання під впливом форми PRRS, що відрізняється високою температурою і викликається вірусом HP PRRS, який полягає у введенні свині імуногенної композиції, що містить в ефективній кількості ослаблену форму вірусу PRRS типу II, штам якого зареєстрований під № АТСС VR-2332. UA 106475 C2 (12) UA 106475 C2 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перелік послідовностей У дану заявку входить перелік послідовностей у паперовій версії й електронній версії, сутність і зміст яких включені у даний опис як посилання. Передумови створення винаходу Область техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься у цілому до вакцин проти інфекційних хвороб. Більше конкретно він відноситься до вакцин проти високопатогенного репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (HP PRRS), вірусного захворювання, що вражає свиней. Опис відомого рівня техніки Репродуктивно-респіраторний синдром свиней (PRRS) являє собою серйозне захворювання свиней, і воно характеризується або розладом органів відтворення поросних свиней, або порушенням дихального шляху, насамперед у поросят-сисунців. Це вірусне захворювання було вперше виявлене у Сполучених Штатах у 1987 р., потім воно було виявлене в Європі й ідентифіковане в Азії на початку 1990-х років. До теперішнього часу PRRS поширився по всьому світу, характеризуючись ендемічністю для країн, в яких вирощують свиней, приводячи щороку до значних економічних втрат. Збудником PRRS є вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), що поряд із вірусом підвищення рівня лактатдегідрогенази мишей (LDEV), вірусом артеріїту коней (EAV) і мавп'ячим вірусом геморагічної лихоманки (SHFV) належить до сімейства Arteriviridae загону Nidovirales. PRRSV, що є представником невеликих покритих оболонкою вірусів, має геном, що представлений одним позитивним ланцюгом (ssРНК) розміром приблизно 15,1-15,5 т.п.н., що містить щонайменше 8 відкритих рамок зчитування (ВРЗ), які кодують приблизно 20 передбачуваних білків. Геном містить також дві нетрансльовані області (UTR) на 5′- і на 3′кінцях. Так, ВРЗ1 (ВРЗ1a і ВРЗ1b) локалізована у прямому напрямку відносно 5′- UTR і на її частку доводиться більше 2/3 повного генома. ВРЗ1a транслюється безпосередньо, у той час як ВРЗ1b транслюється зі зрушенням рибосомної рамки зчитування, що приводить до утворення великого поліпротеїну ВРЗ1ab, з якого у результаті протеолітичного розщеплення утворюються продукти, пов'язані з системою транскрипції й реплікації вірусу. ВРЗ 2-7, локалізовані у зворотньому напрямку відносно 3′-UTR, кодують ряд вірусних структурних білків, асоційованих з віріоном, таких як оболонковий білок (E) і нуклеокапсидний білок (N). Всі ці білки транслюються з 3′-котермінального блоку субгеномних мРНК (sgmРНК). Філогенетичний аналіз ізолятів PRRSV з різних географічних регіонів у світі чітко продемонстрував наявність двох основних генотипів: тип I представлений європейським прототипом (вірус Лелістада, (LV), а тип II представлений північно-американським штамом ATCC VR2332 (геномна послідовність VR2332 перебуває у GenBank, реєстраційний № AY150564) як прототип (Murtaugh та ін., Arch Virol. 140, 1995, сс. 1451-1460). Крім того, у деяких дослідженнях установлено, що ВРЗ5 і ген (nsp2), що кодує неструктурний білок 2 (NSP2), можуть являти собою найбільше генетично варіабельні області у геномі PRRSV (див. SwissProt, реєстраційний № Q9WJB2 або SEQ ID NO:2, в якій представлена послідовність NSP2 VR2332). Відомо також, що штами PRRSV значно відрізняються за патогенністю. У 2006 р. відбувся великомасштабний спалах, що не має собі рівних, раніше невідомого, але позначеного у цілому як "як супроводжується сильною лихоманкою (відрізняється високою температурою) форма" захворювання з симптомами PRRS, що поширилася більше ніж у 10 провінціях і вразила понад 2000000 свиней, з яких загинуло приблизно 400000. На відміну від типової форми PRRS "формою, що відрізняється високою температурою" уражалося також багато дорослих свиней. Ця пандемія атипового PRRS спочатку була ідентифікована як захворювання свиней, що нагадує холеру, для якого характерні неврологічні симптоми (наприклад, тремтіння), висока температура (40–42 °C), ериматозна зникаюча висипка тощо. Аутопсії у сполученні з імунологічними аналізами чітко продемонстрували ураження високопатогенними PRRSV багатьох органів, в яких були виявлені серйозні патологічні зміни (Tian та ін., PLoS ONE., 2(6), 2007, e526). Аналіз усього генома виділених вірусів дозволив установити, що ці ізоляти PRRSV відносяться до типу II і мають високий рівень гомології з HB-1, китайським штамом PRRSV (ідентичність на рівні нуклеотидної послідовності 96,5 %) і з JX143 (Yuan та ін., International PRRS Symposium, Chicago, (Міжнародний симпозіум по PRRS, Чикаго) 2007 р.). Геномна послідовність JX143 представлена у SEQ ID NO:1 або в EMBL/GenBank, реєстраційний № EU708726. Встановлено також, що ці вірусні ізоляти містять унікальну молекулярну відмітну ознаку, а саме переривчасту делецію 30 амінокислот у неструктурному білку 2 (NSP2) (Tian та ін., PLoS ONE., 2(6), 2007, e526). Форму PRRS, "що відрізняється високою температурою", у цей час позначають також як "високопатогенний PRRS" або HP PRRS. 1 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Виділення вірусу PRRS (PRRSV) і виготовлення вакцин проти PRRS, які містять або модифікований живий (ослаблений), або інактивований PRRSV, описане у численних публікаціях (WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356). Зокрема, у WO 93/03760 описані методи виділення, культивування, ослаблення вірусу PRRS, а також виготовлення відповідних вакцин і, насамперед ізоляту прототипу PRRS типу II ATCC VR-2332. У WO 96/36356 описано, зокрема, придатне для застосування ослаблене потомство вищевказаного ізоляту, отримане шляхом серійних пасажів у клітинах мавп, що депоновано під реєстраційним номером ATCC VR-2495. Відповідний продукт у вигляді модифікованої живої вакцини (MLV) надходить у продаж від фірми Boehringer Ingelheim під маркою Ingelvac® PRRS MLV. Інша MLV-вакцина на основі ізоляту типу II надходить у продаж під маркою Ingelvac® PRRS ATP. Придатною стратегією попередження PRRS є вакцинація. Однак поки не відомо, чи буде мати ефективність вакцинація проти HP PRRS, і який тип вакцини можна застосовувати. Опис винаходу При створенні винаходу зненацька було встановлено, що ослаблені штами вірусу PRRS типу II можна застосовувати для вакцинації й захисту свиней від форм хвороби, що відрізняються високою температурою, які асоційовані з репродуктивно-респіраторним синдромом свиней. Ідентифікація профілактичних властивостей ослаблених штамів вірусів PRRS типу II може дозволити лікувати свиней, що мають високий ризик зараження, наприклад, HP PRRS. Зазначена програма вакцинації або лікування може сприяти зниженню ймовірності виникнення інших спалахів HP PRRS, аналогічних тому, який розорив свинарство Китаю у 2006 р. і привів до відбраковування грубо 20 мільйонів свиней, або зниженню їх впливу. Одним із об'єктів даного винаходу є спосіб профілактичного захисту свиней від впливу форми хвороби, що відрізняється високою температурою, який полягає у тому, що вводять свині, яка має потребу у цьому, імуногенну композицію, що містить в ефективній кількості вірус PRRS типу II, переважно ослаблений вірус PRRS типу II. Композиція може містити також фармацевтично прийнятний носій. Композиція може містити також ад'ювант. Спосіб можна застосовувати в якості превентивної або лікувальної міри. Крім того, введення в ефективній кількості такої імуногенної композиції приводить до зниження коефіцієнта захворюваності або серйозності клінічних симптомів форм захворювання PRRS, що відрізняються високою температурою. У винаході запропонований також спосіб вакцинації свиней від форми хвороби, що відрізняється високою температурою, який полягає у тому, що вводять свині імуногенну композицію, що містить в ефективній кількості вірус PRRS типу II, переважно ослаблений вірус PRRS типу II. Композиція може містити також фармацевтично прийнятний носій. Композиція може містити також ад'ювант. Крім того, введення в ефективній кількості такої імуногенної композиції приводить до зниження коефіцієнта захворюваності або серйозності клінічних симптомів форми захворювання PRRS, що відрізняється високою температурою. Хвороба, що відрізняється високою температурою, може являти собою форму, асоційовану з репродуктивно-респіраторним синдромом свиней. Репродуктивно-респіраторний синдром свиней може являти собою високопатогенний ("HP PRRS"). HP PRRS або форму хвороби, що відрізняється високою температурою, можна виявляти у свині за наявністю одного або декількох наступних клінічних симптомів: гіперемія шкіри, плями крові, петехіальний крововилив, ериматозна зникаюча висипка й папули, часто присутні у вухах, ротовій порожнині, носовій порожнині, на спині й внутрішній поверхні стегон. Інші звичайні симптоми можуть включати високу температуру (температура більше 40 °C), депресію, анорексію, кашель, астму, кульгавість, тремтіння, порушення дихального шляху й діарею. HP PRRS викликається вірусом HP PRRS. Іншим об'єктом винаходу є спосіб профілактичного захисту свині від інфекції, що викликається вірусом HP PRRS, який полягає у тому, що вводять свині, що має потребу у цьому, імуногенну композицію, що містить в ефективній кількості вірус PRRS типу II, переважно ослаблений вірус PRRS типу II. Присутність вірусу HP PRRS, відкритого у 2002 р. у Китаї як представника генотипу 2 PRRS, корелює з так званою формою хвороби, що відрізняється високою температурою. Після цього було встановлено, що вірус HP PRRS став домінантним у деяких провінціях Китаю, що свідчить про його виборчу перевагу при поширенні в уражених популяціях свиней у порівнянні з іншими вірусами PRRS. Поняття "вірус HP PRRS" означає (але, не обмежуючись тільки ними) штам вірусу PRRS, що має нуклеотидну послідовність, практично ідентичну послідовності, представленій у SEQ ID NO: 1. Переважно вірус HP PRRS являє собою штам вірусу PRRS, що має нуклеотидну 2 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність, практично ідентичну послідовності, представленій у SEQ ID NO: 1. Практично ідентична послідовності, представленій у SEQ ID NO: 1, означає, що нуклеотидна послідовність штаму вірусу PRRS переважно містить послідовність, ідентичну на 85-100 % послідовності, представленій у SEQ ID NO: 1, переважно за умови, що вірус HP PRRS не являє собою вірус PRRS типу II, зазначений у даному описі, наприклад, нуклеотидна послідовність ВРЗ5 менше ніж на 91 %, переважно менше ніж на 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % гомологічна послідовності ВРЗ5 VR2332, референс-ізоляту вірусу. Нуклеотидна послідовність штаму вірусу HP PRRS переважно більше ніж на 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % або 89 % ідентична послідовності, представленій у SEQ ID NO: 1, також за умови, що вірус HP PRRS не являє собою вірус PRRS типу II, зазначений у даному описі, наприклад, нуклеотидна послідовність ВРЗ5 менше ніж на 91 %, переважно менше ніж на 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % гомологічна послідовності ВРЗ5 VR2332, референс-ізоляту вірусу. Ще більше переважно нуклеотидна послідовність штаму вірусу PRRS більше ніж на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або більше 99 % ідентична послідовності, представленій у SEQ ID NO: 1, переважно за умови, що вірус HP PRRS не являє собою вірус PRRS типу II, зазначений у даному описі, наприклад, нуклеотидна послідовність ВРЗ5 менше ніж на 91 %, переважно менше ніж на 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % гомологічна послідовності ВРЗ5 VR2332, референс-ізоляту вірусу. Поняття "вірус HP PRRS" може означати також будь-які штами вірусу PRRS, які мають певну модифікацію у білку NSP2. Відповідно до цього визначення штам вірусу HP PRRS являє собою штам вірусу PRRS, що кодує білок NSP2, в якому амінокислота, що відповідає лейцину у положенні 482 амінокислотної послідовності, представленої у SEQ ID NO: 2, вилучена у результаті делеції, і який викликає клінічний симптом у вигляді високої температури. Як альтернатива або у доповнення до делеції лейцину у зазначеному положенні в амінокислотній послідовності, представленій у SEQ ID NO: 2, амінокислоти, що відповідають амінокислотам 534-562 послідовності, представленій у SEQ ID NO: 2, можуть бути вилучені у результаті делеції з білка NSP2, що кодується вірусом PRRS. У цьому контексті послідовність, представлену у SEQ ID NO: 2, варто розглядати як приклад, і поняття білок NSP2 не обмежене білком NSP2, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 2. На основі зазначених вище відомостей фахівець у даній області може легко ідентифікувати будь-яку відповідну модифікацію у штамах вірусу PRRS, які мають послідовність білка NSP2, що відрізняється від послідовності, представленій у SEQ ID NO: 2, але мають таку ж модифікацію, тобто делецію лейцину, що відповідає лейцину у положенні 482 послідовності, представленій у SEQ ID NO: 2, і/або делецію амінокислот, що відповідають амінокислотам 534-562 послідовності, представленій у SEQ ID NO: 2. Крім того, вірус HP PRRS може означати також штам вірусу PRRS, що має нуклеотидну послідовність, практично ідентичну послідовності, представленій у SEQ ID NO: 1 (як вона описана вище) і кодує білок NSP2, в якому амінокислота, що відповідає лейцину у положенні 482 амінокислотної послідовності, представленої у SEQ ID NO: 2, і/або амінокислоти, що відповідають амінокислотам послідовності, представленої у 534-562 SEQ ID NO: 2, вилучені у результаті делеції з білка NSP2, що кодується вірусом PRRS. Крім того, поняття "вірус HP PRRS" відноситься до вірусу HP PRRS, який являє собою штам вірусу PRRS, що має нуклеотидну послідовність, яка практично ідентична послідовності, представленій у SEQ ID NO: 1, за умови, що вірус HP PRRS не являє собою вірус PRRS типу II, зазначений у даному описі, наприклад, нуклеотидна послідовність ВРЗ5 менше ніж на 91 %, переважно менше ніж на 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % гомологічна послідовності ВРЗ5 VR2332, референс-ізоляту вірусу (як описано вище), і кодує білок NSP2, в якому амінокислота, що відповідає лейцину у положенні 482 амінокислотної послідовності, представленої у SEQ ID NO: 2, і/або амінокислоти, що відповідають амінокислотам 534-562 послідовності, представленої у SEQ ID NO: 2, вилучені у результаті делеції з білка NSP2, що кодується вірусом PRRS. Крім того, поняття "вірус HP PRRS" відноситься до вірусу HP PRRS, який являє собою штам вірусу PRRS, що має нуклеотидну послідовність, яка практично ідентична послідовності, представленій у SEQ ID NO: 1, за умови, що вірус HP PRRS не являє собою вірус PRRS типу II, зазначений у даному описі, наприклад, нуклеотидна послідовність ВРЗ5 менше ніж на 91 %, переважно менше ніж на 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % гомологічна послідовності ВРЗ5 VR2332, реферес-ізоляту вірусу (як описано вище), і кодує білок NSP2, при цьому антитіла, що мають реактивність до пептидів, що відповідають амінокислотам (ак) у положеннях 536-550 або 546-560, або 476-490, не мають до нього реактивність. Крім того, відомо, що зазначені нижче ізоляти вірусу PRRS являють собою штами вірусу HP 3 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 PRRS. Таким чином, поняття "штам вірусу HP PRRS" у контексті даного опису повинно включати також будь-які зі зазначених штамів вірусів, а також будь-яке їхнє потомство: штам вірусу HP PRRS AH-1; AHCFSH; AHCFZC; BB07; BD-8; BQ07; CL07; CX07; CZ07; FY060915; FY080108; GC-2; GCH-3; GD1; GD2; GD2007; GD3; GD4; GDSD1; GDY1-2007; GDY2-2007; GDYF1; GS2008; GXHZ12; GXHZ13; GXHZ14; GXHZ16; GXHZ19; GXHZ2; GXHZ21; GXHZ4; GXLZ5; GXLZ7; GY; GZCJ; GZDJ; GZHW1; GZHW2; GZHX; GZJS; GZKB; GZKY; GZLJ1; GZWB; GZWM; GZZB; Hainan-1; Hainan-2; HB1; HB2; HB3; HB-Tsh1; HB-Xt1; HEN46; HeN-KF; HeN-LH; HeN-LY; HLJDF; HLJMZ1; HLJMZ2; HLJMZ3; HLJZY; HM-1; HN2; HN2007; HN3; HNld; HNly; HNLY01; HNNX01; HNPJ01; HNsp; HNXT1; HNyy; HNyz; HQ-5; HQ-6; HUB; HuN; HUN1; HUN11; HUN15; HUN16; HUN17; HUN2; HUN3; HUN4; HUN5; HUN6; HUN7; Hunan-1; Hunan-2; Hunan-3; HUNH2; HUNH4; HuNhl; HUNL1; HUNX4; HZ061226; HZ070105; Jiangsu-1; Jiangsu-2; Jiangsu-3; Jiangxi-2; Jiangxi-4; JLYS; JN; JX1; JX143; JX2; JX-2; JX2006; JX3; JX4; JX5; JXA1; KS06; LC07; LJ; LS06; LS-4; LY07; NB070319; SC07; SD; SD14; SDWF2; SH02; ST-7; SX2007; SY0608; TJDMJ; TJZHJ2; TJZHJ3; TQ; TQ07; TWO7; WF07; XJ07; XL2008; YN2008; YNBS; YNDL; YNMG; YNWS; YNYS; YNYX1; YNYX3; ZJ06; ZJCJ; ZJWL; ZX07; ZS070921. Поняття "потомство" не повинно бути обмежене ізолятом вірусу, отриманим з будь-якого батьківського вірусу, зазначеного вище, і що має нуклеотидну послідовність, яка ідентична більше ніж на 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % і 99 % нуклеотидної послідовності відповідного батьківського штаму вірусу. Поняття "вірус PRRS типу II" означає (але, не обмежуючись тільки ним) штам вірусу PRRS, практично ідентичний ізоляту вірусу, що депонований як ATCC-VR2332, або будь-якому потомству ізоляту вірусу, що депонований як ATCC-VR2332. Практично ідентичний у контексті даного опису означає, що нуклеотидна послідовність, яка кодує білок ВРЗ5, ідентична на 85100 % нуклеотидної послідовності ізоляту вірусу, що депонований як ATCC-VR2332, і представленої у SEQ ID NO: 3. Нуклеотидна послідовність ВРЗ5 переважно більше ніж на 86 %, 87 %, 88 % або 89 % ідентична послідовності, представленій у SEQ ID NO: 3. Ще більше переважно нуклеотидна послідовність ВРЗ5 більше ніж на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або більше ніж на 99 % ідентична послідовності, представленій у SEQ ID NO: 3. Переважно вірус PRRS типу II у контексті даного опису означає штам вірусу PRRS, який практично ідентичний ізоляту вірусу, що депонований як ATCC-VR2332, або будь-якому потомству ізоляту вірусу, що депонований як ATCC-VR2332 (описаному вище), але в якому відсутня делеція у гені NSP2, який кодує амінокислоту, що відповідає амінокислотам 534-562 послідовності, представленої у SEQ ID NO: 2. Повна послідовність вірусу PRRS ATCC-VR2332 перебуває у GenBank під реєстраційним номером U87392. Поняття "вірус PRRS типу II" повинно також включати будь-який ослаблений вірус, отриманий з кожного з перерахованих вище штамів вірусу PRRS типу II. Наприклад, поняття "вірус PRRS типу II" повинно також включати ослаблений вірус PRRS типу II, що депонований як ATCC-VR2495. Крім того, ослаблений вірус PRRS типу II може являти собою будь-яке ослаблене потомство ізоляту вірусу, що депонований як ATCC-VR2332. У деяких кращих варіантах вірус PRRS типу II у сполученні з фармацевтично прийнятними носіями може являти собою вакцину Ingelvac® PRRS MLV (серійний № JA-A64A-149) фірми Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. (Сент-Джозеф, шт. Міссурі). Поняття "вірус PRRS типу II" може включати також ізоляти, позначені як HB-1; BJ-4; CH-1a; CH-1R; CH-1R01; HB-2; HN1; HT06; HZ07; LS05; LY03; NH04; PL97-1; S1; SH061130; SX071226; TW07-1; WF03; XX03; ZJJ04; ZJJ05; ZJJ07, які не являють собою штами HP PRRS китайського походження. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб профілактики зараження свиней HP PRRS, який полягає у тому, що вводять свині, яка має потребу у цьому, імуногенну композицію, що містить в ефективній кількості вірус PRRS типу II, переважно ослаблений вірус типу PRRS типу II, де вірус PRRS типу II являє собою штам вірусу PRRS, який практично ідентичний ізоляту вірусу, що депонований як ATCC-VR2332, або будь-якому потомству ізоляту вірусу, що депонований як ATCC-VR2332. Переважно вірус PRRS типу II не несе делецію в амінокислотах, що кодуються геном NSP2, які відповідають амінокислотам 534-562 послідовності, представленої у SEQ ID NO: 2. Ще більше переважно вірус PRRS типу II являє собою ослаблений вірус PRRS типу II, що депонований як ATCC-VR2495. Крім того, вірус PRRS типу II являє собою вакцину Ingelvac® PRRS MLV (серійний № JA-A64A-149). Ефективна кількість вірусу PRRS типу II може являти собою кількість вірусу, що викликає або має здатність викликати імунну відповідь у тварини, якій вводять вірус в ефективній дозі. Кількість, що є ефективною, може залежати від інгредієнтів вакцини й схеми введення. Якщо застосовують препарат інактивованого вірусу або модифікованого живого вірусу, то можна 2,0 9,0 рекомендувати застосовувати вакцину у кількості, що містить від 10 до приблизно 10 TCID50 4 UA 106475 C2 3,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (середня цитопатогенна доза (що інфікує 50 % клітин)), більше переважно від 10 до приблизно 4,0 4,0 8,0 10 TCID50 і ще більше переважно від приблизно 10 до приблизно 10 TCID50 на дозу. Згідно з даним описом вірус PRRS типу II можна застосовувати у вигляді інактивованого повністю вбитого вірусу або у вигляді ослабленої форми вірусу PRRS типу II з метою профілактики свині для захисту від форми хвороби, що відрізняється високою температурою, зазначеної у даному описі. Крім того, субодиниці, включаючи імуногенні фрагменти або фракції вірусу PRRS типу II, можна застосовувати також з метою профілактики свині для захисту від форми хвороби, що відрізняється високою температурою. Згідно з даним описом ослаблений вірус PRRS типу II можна застосовувати також у вигляді модифікованої живої вакцини (MLV), що містить один або декілька зазначених вище живих штамів у фармацетично прийнятному носії. В іншому або додатковому варіанті інактивований вірус можна застосовувати для одержання вбитої вакцини (KV), описаної вище. Можна 1 7 використовувати препаративні форми MLV, які дозволяють вводити від 10 до 10 вірусних 3 5 4 5 часток, переважно від 10 до 10 часток на дозу, більше переважно від 10 до 10 часток на дозу. Препаративні форми KV можна створювати на основі титру до інактивації, що становить 3 10 4 9 5 8 6 7 від 10 до 10 , від 10 до 10 , від 10 до 10 або від 10 до 10 вірусних часток на дозу. Вірус PRRS типу II, переважно ослаблений вірус PRRS типу II, можна вводити свині перед обробкою свині штамом вірусу PRRS, який викликає HP PRRS, у вигляді профілактичної міри, одночасно з обробкою свині штамом вірусу PRRS, який викликає HP PRRS, або після обробки досліджуваної свині штамом вірусу PRRS, який викликає HP PRRS. Досліджувана свиня може мати одну або декілька клінічних ознак або загальних симптомів HP PRRS або форми хвороби, що відрізняється високою температурою, які описані вище. Досліджувана свиня може мати дуже високу чутливість до форми хвороби, що відрізняється високою температурою, яка асоційована з HP PRRS. Досліджувана свиня може мати дуже високу чутливість до HP PRRS. Досліджувана свиня може мати чутливість до HP PRRS через імунодефіцит. Досліджувана свиня може мати чутливість до HP PRRS залежно від того, на якій фермі вона вирощується. Чутлива свиня може вирощуватися на фермі у Китаї. Чутлива свиня може вирощуватися в провінції у Китаї, такій як провінція Цзянси, провінція Хебей або у місті Шанхай (див. Tian та ін., PloS ONE, 2(6), 2007, e526, зміст зазначеної публікації включений у даний опис як посилання). Ослаблений вірус PRRS типу II можна вводити шляхом ін'єкції, інгаляції або за допомогою імплантата, при цьому ін'єкція є кращою. Залежно від необхідної тривалості й ефективності вакцинації або обробки вірус PRRS типу II, переважно ослаблений вірус PRRS типу II, можна вводити один або декілька разів, а також періодично, наприклад, на добовій основі протягом декількох днів, тижнів або місяців і у різних дозах. При цьому кращим є введення однієї дози. Ін'єкцію можна здійснювати у периферичну або центральну вену у необхідній кількості або в іншому варіанті застосовують безперервну інфузію. Вірус PRRS типу II, переважно ослаблений вірус PRRS типу II можна вводити орально, парентерально, підшкірно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, під'язиково, трансдермально, ректально, через слизову оболонку, місцево або шляхом інгаляції, за допомогою трансбуккального введення або використовувати їх комбінацію. Вірус PRRS типу II, переважно ослаблений вірус PRRS типу II, можна застосовувати також у формі імплантата, що може забезпечувати повільне вивільнення ослабленого вірусу. Для внутрішньо- м'язового введення можна використовувати об'єм, що становить від 0,5 до 3 мл, більше переважно від 1 до 2,5 мл, ще більше переважно від 1,5 до 2 мл. Найбільше кращим є внутрішньом'язове введення 2 мл. Для внутрішньошкірного введення застосовують об'єм, що становить від 0,05 до 1 мл, більше переважно від 0,1 до 0,8 мл, ще більше переважно від 0,1 до 0,5 мл, ще більше переважно від 0,2 до 0,4 мл. Найбільше переважно для внутрішньошкірної ін'єкції можна використовувати 0,2 мл вірусу PRRS типу II можна використовувати об'єми, що становлять від 0,5 до 5 мл, більше переважно від 1 до 4 мл, ще більше переважно від 2 до 3 мл. Для внутрішньоносового введення найбільше переважно варто використовувати об'єм, що становить 3 мл. Фармацевтично прийнятний носій може являти собою будь-який і всі такі агенти, як розчинники, диспергуючі середовища, матеріали для нанесення покриття, стабілізатори, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні й протигрибкові засоби, агенти для надання ізотонічності, агенти, що сповільнюють адсорбцію, тощо. "Ад'юванти" у контексті даного опису можуть являти собою гідроксид алюмінію й фосфат алюмінію, сапоніни, наприклад, Quil A, QS-21 (фірма Cambridge Biotech Inc., Кембрідж, шт. Массачусетс), GPI-0100 (фірма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бірмінгем, шт. Алабама), емульсію типу вода-у-маслі, емульсію типу масло-у-воді, емульсію типу вода-у-маслі-у-воді. Основою емульсії може бути легке рідке парафінове масло (типу тих масел, які входять в Європейську фармакопею); ізопреноїдне масло, таке як скваланове або скваленове масло, 5 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отримане у результаті олігомеризації алкенів, зокрема ізобутену або децену; ефіри кислот або спиртів, що містять лінійну алкільну групу, більше переважно рослинні масла, етилолеат, ди(каприлат/капрат) пропіленгліколя, три(каприлат/капрат) гліцерину або діолеат пропіленгліколя; ефіри розгалужених жирних кислот або спиртів, зокрема, ефір ізостеаринової кислоти. Для одержання емульсії масло застосовують у сполученні з емульгаторами. Емульгатори переважно являють собою неіонні поверхнево-активні речовини, зокрема, ефіри сорбітану, маніду (наприклад, ангідроманітолеат), гліколя, полігліцерину, пропіленгліколя й олеїнової, ізостеаринової, рицинолової або гідроксистеаринової кислоти, які необов'язково є етоксильованими, і блок-співполімери поліоксипропілену-поліоксіетилену, зокрема продукти типу Pluronic, насамперед L121 (див. Hunter та ін., The Theory and Practical Application of Adjuvants, під ред. Stewart-Tull D. E. S., вид-в JohnWiley and Sons, NY, 1995, сс. 51-94 і Todd та ін., Vaccine 15, 1997, сс. 564-570). Наприклад, можна застосовувати емульсію фірми SPT, що описана на с. 147 у "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", під ред. M. Powell і M. Newman, вид-в Plenum Press, 1995, та емульсію MF59, описану на с. 183 у цій же книзі. Іншим прикладом ад'юванту є сполука, вибрана з полімерів акрилової й метакрилової кислоти й співполімерів малеїнового ангідриду й похідного алкенілу. Кращими ад'ювантами є зшиті полімери акрилової й метакрилової кислоти, що насамперед зшиті з простими поліалкеніловими ефірами цукрів або поліспиртів. Ці сполуки відомі за назвою карбомер (Phameuropa, т. 8, №. 2, червень 1996 р.). Фахівці у даній області можуть ознайомитися також з US 2909462, в якому описані такі акрилові полімери, що зшиті з полігідроксильованою сполукою, що має щонайменше 3 гідроксильні групи, переважно не більше 8, атоми водню щонайменше трьох гідроксилів можуть бути заміщені ненасиченими аліфатичними радикалами, які мають щонайменше 2 атоми вуглецю. Кращими є радикали, які містять від 2 до 4 атомів вуглецю, наприклад, вініли, аліли й інші ненасичені етиленом групи. Ненасичені радикали можуть самі включати замісників, таких як метил. Найбільше прийнятними є продукти, що надходять у продаж під назвою Карбопол; (фірма BF Goodrich, шт. Огайо, США). Вони зшиті з алілсахарозою або з алілпентаеритритолом. Серед них варто згадати Карбопол 974P, 934P і 971P. Найбільше переважно застосовують Карбопол 971P. Зі співполімерів малеїнового ангідриду й алкенільного похідного варто згадати співполімери EMA (фірма Monsanto), які являють собою співполімери малеїнового ангідриду й етилену. Розчинення цих полімерів у воді приводить до одержання кислого розчину, який треба нейтралізувати, переважно до фізіологічного значення pH, для одержання розчину ад'юванту, в який можна включати імуногенну, імунологічну композицію або саму композицію вакцини. Крім того, прийнятними ад'ювантами серед багатьох інших є (але, не обмежуючись тільки ними), ацетат α-токоферолу, система ад'ювантів RIBI (фірма Ribi Inc.), блок-співполімер (CytRx, Атланта, шт. Джорджія), SAF-M (Хірон, Емеривілль, шт. Каліфорнія), монофосфорил ліпіду A, ад'ювант на основі ліпіду авридину-аміну, термолабільний ентеротоксин з E. coli (рекомбінатний або будь-який інший), холерний токсин, IMS 1314 або мурамілдипептид. Переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Ще більше переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Ще більше переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 500 мкг до приблизно 5 мг на дозу. Ще більше переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 750 мкг до приблизно 2,5 мг на дозу. Найбільше переважно ад'ювант додають у кількості приблизно 1 мг на дозу. Винахід відноситься також до способу одержання ослабленого вірусу PRRS типу II, який можна застосовувати для лікування або імунізації досліджуваної свині від HP PRRS. Спосіб може полягати у тому, що здійснюють одну або декілька наступних стадій: (а) здійснюють пасаж ATCC-VR2332 або будь-якого вірусу PRRS типу II, практично ідентичного ATCC-VR2332, відповідно до описаного нижче процесу для модифікації вірусу й надання йому авірулентності й здатності імунізувати досліджувану свиню проти HP PRRS, (б) збирають отримані клітини або клітинну культуру вірусу, (в) додають стабілізатор в отриману культуру вірусу; і/або (г) ліофілізують отриману культуру вірусу. Пасаж вірусу може передбачати застосування класичних методів розмноження й селекції; наприклад, тривале розмноження у прийнятних клітинах-хазяїнах для посилення ослабленого фенотипу. Пасажі можуть приводити до одержання вірусного штаму, що несе придбані мутації, багато хто з яких можуть не змінювати істотно властивості батьківського штаму. Ослаблений вірус PRRS типу II можна одержувати на основі ATCC-VR2332 або будь-якого іншого вірусу PRRS типу II, практично ідентичного ATCCVR2332, пасажі якого у клітини-хазяїні здійснювали щонайменше 60, 65, 70, 75, 80 або більше разів. Ослаблений вірус PRRS типу II можна одержувати з ATCC-VR2332 або будь-якого вірусу 6 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 PRRS типу II, практично ідентичного ATCC-VR2332, після пасажів у клітині-хазяїні від 50 до 100 разів, від 60 до 90 разів, від 70 до 80 разів або від 65 до 75 разів. Ослаблений вірус PRRS типу II можна одержувати з ATCC-VR2332 або будь-якого вірусу PRRS типу II, практично ідентичного ATCC-VR2332, після пасажів у клітині-хазяїні від 70 до 75 разів. Прийнятна клітина-хазяїн може являти собою мавпячу клітинну лінію, клітини Vero або альвеолярні свинячі макрофаги. Кращою мавпячою клітинною лінією є MA-104. Клітина-хазяїн може являти собою культуру клітин. Клітинна лінія може бути заражена вірусом, що підлягає пасируванню. При здійсненні кожного пасажу може вимагатися інкубація клітинної лінії, що утворилася зараженою вірусом, або культури клітин при температурі від 34 °C до 40 °C, більше переважно від 35 °C до 39 °C, ще більше переважно від 36 °C до 38 °C і ще більше переважно від 35 °C до 37 °C. Найбільше переважно при здійсненні кожного пасажу може вимагатися інкубація клітинної лінії, що утворилася зараженою вірусом, або культури клітин при температурі 37 °C. Стадія збору може включати заморожування зараженої вірусом клітинної культури. Ліофілізація може включати сублімацію вологи із замороженого зразка зараженої вірусом клітинної культури. Для одержання ослабленого вірусу PRRS типу II можна використовувати також модифікацію вірусу й для цієї мети можна застосовувати спрямовану мутацію нуклеотидної послідовності штаму вірусу за допомогою придатних методів генної інженерії. Зазначені методи можна застосовувати для створення повнорозмірної нуклеотидної копії вірусного геному, що може бути модифікований за допомогою методів рекомбінації нуклеїнових кислот і маніпуляції ними. У таких методах можна застосовувати сайтнаправлений мутагенез. Потім можна модифікувати антигенні центри або ферментативні властивості вірусних білків. Винахід відноситься також до набору, призначеному для здійснення будь-якого з вищевказаних методів. Набір може включати контейнер, імуногенну композицію, що переважно містить ослаблений вірус PRRS типу II, фармацевтично прийнятний носій, ад'ювант та інструкції з введення імуногенної композиції тварині, що має потребу у цьому, з метою зниження коефіцієнта захворюваності або серйозності клінічних симптомів або впливів зараження PRRS і переважно форм PRRS або HP-PRRS, що відрізняються високою температурою. Набір може містити також засоби для здійснення ін'єкції й/або засоби для інших форм введення. Набір може містити також розчинник. Вакцину на основі ослабленого вірусу можна сушити виморожувановим та її можна відновлювати за допомогою розчинника, одержуючи розчин, призначений для ін'єкції й/або інгаляції. Розчинник може являти собою воду, фізіологічний розчин, буфер або розчин ад'юванту. Набір може включати різні контейнери для ослабленого вірусу, розчинника й/або фармацевтично прийнятного носія. Інструкції можуть являти собою листівку й/або етикету, прикріплену до одного або декількох контейнерів. Короткий опис креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 - схема, відповідно до якої здійснювали бальну оцінку стану легенів і визначали відсоток площі легені, що має видимі неозброєним оком ознаки пневмонії; на фіг. 2 - графік, на якому представлене порівняння ректальної температури свиней у вакцинованих і невакцинованих групах; на фіг. 3 - графік, на якому представлене порівняння середніх значень співвідношення S/P для свиней у вакцинованих і невакцинованих групах; середнє значення S/P, визначене методом ELISA, застосовували як критерій серологічної відповіді відповідній групі на PRRSV; на фіг. 4 - графік, на якому продемонстроване порівняння групових середніх клінічних балів у свиней у вакцинованих і невакцинованих групах при реєстрації балів респіраторного захворювання у свиней у вакцинованих і невакцинованих групах; на фіг. 5 - графік, на якому продемонстроване порівняння середнього добового приросту маси (тіла) (ADG) свиней у вакцинованих і невакцинованих групах; на фіг. 6 - графік, на якому продемонстрований сумарний відсоток PRRSV-позитивної за даними ЗТ-ПЛР сироватки у вакцинованих MLV свиней і невакцинованих/підданих контрольному зараженню свиней. Докладний опис винаходу Визначення Застосовувана у контексті даного опису термінологія дана тільки з метою опису конкретних варіантів здійснення винаходу й не спрямована на обмеження його обсягу. У даному описі й у прикладеній формулі винаходу згадування поняття в однині має на увазі також його вживання у множині, якщо з контексту ясно не випливає інше. При вказівці чисельних діапазонів мається на увазі, що кожне чисельне значення, яке перебуває всередині діапазону характеризується тим же самим ступенем точності. Наприклад, під діапазон значень 6-9 підпадають крім 6 і 9 чисельні значення 7 і 8, і очевидно, що під 7 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 діапазон значень 6,0-7,0 підпадають чисельні значення 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 і 7,0. У контексті даного опису поняття "ослаблений вірус" може означати авірулентний вірус, який не викликає клінічних симптомів захворювання PRRS, але має здатність індукувати імунну відповідь у досліджуваного ссавця, і воно може означати також, що клінічні симптоми знижені за частотою або серйозністю у тварин, заражених ослабленим вірусом, у порівнянні з "контрольною групою тварин", заражених неослабленим вірусом PRRS і не підданих впливу ослабленого вірусу. У цьому контексті "знижен/знижений" означає, що зниження становить щонайменше 10 %, переважно 25 %, ще більше переважно 50 %, найбільше переважно більше 100 % у порівнянні з контрольними групами, зазначеними вище. У контексті даного опису "імуногенний фрагмент" може означати частину пептиду або поліпептиду або нуклеотидної послідовності вірусу PRRS типу II, що може формувати імунну відповідь у хазяїна, включаючи клітинно- і/або антитіло-опосередковану імунну відповідь на PRRSV. У контексті даного опису поняття "ідентичні" або "ідентичність" двох або більшої кількості поліпептидних або нуклеотидних послідовностей можуть означати, що послідовності мають певний відсоток однакових залишків або нуклеотидів у конкретній області. Відсоток можна розраховувати шляхом оптимального вирівнювання двох послідовностей, порівняння двох послідовностей у конкретній області з визначенням кількості положень, в яких перебувають ідентичні залишки в обох послідовностях, одержання кількості співпадаючих положень, розподілу кількості співпадаючих положень на загальну кількість положень у конкретній області й множення результату на 100, одержуючи тим самим відсоток ідентичності послідовностей. У випадку, коли дві послідовності мають різну довжину або коли у результаті вирівнювання одержують один або декілька виступаючих кінців, і конкретна область, для якої здійснюють порівняння, включає тільки одну послідовність, то при розрахунку залишки однієї послідовності включають у знаменник, але не у чисельник дробу. Ізолят PRRS ATCC VR-2332 депонований відповідно до Будапештського договору в Американській колекції типових культур, Роквілл, шт. Меріленд 7 липня 1992 р. і йому привласнений реєстраційний № ATCC VR-2332. Ізолят PRRS VR-2495 депонований відповідно до Будапештського договору в Американській колекції типових культур, Роквілл, шт. Меріленд 28 січня 1995 р. і йому привласнений реєстраційний № ATCC VR-2495. У контексті даного опису "імуногенна композиція" або "вакцина" означає композицію, що містить вірус PRRS типу II (MLV або вбитий вірус) або його будь-який імуногенний фрагмент або фракцію, переважно ослаблений вірус PRRS типу II, таку як Ingelvac PRRS MLV або Ingelvac PRRS ATP, що викликає "імунологічну відповідь" у хазяїна, включаючи клітинно- і/або антитілоопосередковану імунну відповідь на PRRSV. Переважно зазначена імуногенна композиція може забезпечувати захисний імунітет проти зараження PRRSV і асоційованих із ним клінічних симптомів. У контексті даного опису поняття "викликає імунологічну відповідь або імунну відповідь" означає здатність викликати будь-який клітинно- і/або антитіло-опосередковану імунну відповідь на імуногенну композицію або вакцину, введену тварині, яку обробляють імуногенною композицією або вакциною. Як правило "імунна відповідь" включає (але, не обмежуючись тільки ними) одну або декілька з наступних реакцій: виробництво або активацію антитіл, B-клітин, Tклітин-хелперів, T-клітин-супресорів і/або цитотоксичних T-клітин і/або γδ-T-клітин, специфічно спрямованих на антиген або антигени, включений(і) у композицію, що представляє інтерес, або вакцину. Переважно хазяїн повинен виробляти або терапевтичну, або захисну імунологічну (вторинну імунну) відповідь так, щоб підвищувалася стійкість до нової інфекції й/або знижувалася клінічна серйозність захворювання у порівнянні з контрольними тваринами, яким не вводили імуногенну композицію або вакцину. Таку захисну дію можна виявляти або за зниженням ймовірності або серйозності захворювання, аж до відсутності симптомів, асоційованих із зараженням хазяїна, як описано вище. У контексті даного опису "захисний імунітет" означає стійкість групи тварин до зараження PRRS, переважно HP PRRS, може бути підвищена у порівнянні з контрольною групою тварин, заражених HP PRRS, але не оброблених імуногенною композицією або вакциною, що містить вірус PRRS, переважно вірус PRRS типу II. У контексті даного опису поняття "підвищена стійкість" означає, що менше ніж у 10 %, переважно менше ніж у 20 %, ще більше переважно менше ніж у 30 %, ще більше переважно менше ніж у 40 %, ще більше переважно менше ніж у 50 %, ще більше переважно менше ніж у 75 %, ще більше переважно менше ніж у 100 % тварин, яких обробляли імуногенною 8 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 композицією або вакциною, запропонованою у винаході, розвився один або декілька клінічних симптомів, асоційованих із формою захворювання, що відрізняється високою температурою, переважно викликаною HP PRRS, як зазначено у даному описі, у порівнянні з групою тварин, заражених PRRS, але не оброблених імуногенною композицією або вакциною. У контексті даного опису поняття "практично комплементарна" означає, що перша послідовність щонайменше на 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентична комплементу другої послідовності в області, що складається з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 або більшої кількості нуклеотидів, або що дві послідовності гібридизуються у суворих умовах гібридизації. У контексті даного опису "практично ідентичні" означає, що перша й друга послідовність ідентичні щонайменше на 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або 99 % в області, що складається з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 або більшої кількості нуклеотидів або амінокислот, або відносно нуклеїнових кислот, якщо перша послідовність практично комплементарна комплементу другої послідовності. "Свиня", "молода свиня" і "порося" у контексті даного опису застосовують взаємозамінно. "Вакцинація" відноситься до введення імуногенної композиції або вакцини, представленої у даному описі, перед впливом форм захворювання PRRS або HP-PRRS, що відрізняються високою температурою. "Захищати" або "захист" відноситься до зниження серйозності або зустрічальності клінічних симптомів зараження HP-PRRS або форм захворювання PRRS, що відрізняються високою температурою, у результаті введення імуногенної композиції, запропонованої у даному винаході. Зниження серйозності або зустрічальності оцінюють у порівнянні з твариною або групою тварин, яку(их) не обробляли імуногенною композицією, запропонованою у даному винаході. Кращі варіанти здійснення винаходу Нижче у прикладах представлені кращі матеріали й процедури, застосовувані у даному винаході. Хоча при втіленні на практиці й перевірці даного винаходу можна застосовувати будьякі матеріали й методи, аналогічні або еквівалентні представленим у даному описі, нижче описані кращі методи, пристрої й матеріали. Однак варто розуміти, що ці приклади дані тільки з метою ілюстрації й не спрямовані на обмеження загального обсягу винаходу. Приклади Нижче у прикладах проілюстрована високовірулентна природа ізоляту PRRSV JX143. У свиней, яких вакцинували за допомогою Ingelvac® PRRS MLV, виявлена 100 %-а виживаність та істотна більше висока гуморальна імунна відповідь, більше низьке співвідношення клінічних симптомів PRRS і віремії, менше серйозне ураження легенів, менша кількість, більше слабкі й більше короткі клінічні симптоми й більше короткий період наявності високої ректальної температури у порівнянні з невакцино- ваними свинями після з контрольного зараження високовірулентним штамом PRRSV. Матеріали й методи 1.1. Вакцини й вірус Вакцину Ingelvac® PRRS MLV (серійний № JA-A64A-149) одержували від фірми Boehringer Ingelheim Vetmedica. Високовірулентний ізолят PRRSV JX143 був виділений у Шанхайському дослідницькому інституті ветеринарії (Shanghai Veterinary Research Institute). Для інокуляції свиней тканинну культуру, що містить PRRSV JX143 (105,2 TCID50/мл) розводили у п'ять разів за допомогою середовища DMEM. 1.2. Праймери й реагенти Полімеразу, що ініціює зворотну транскрипцію, і ДНК-сходи купували у компанії Tiangen biotechnology. Дворазову (2×) ПЛР-суміш купували у компанії Dongsheng. Використовували Trizol® і праймери компанії Invitrogen. Таблиця 1 Праймери, що застосовують для ЗТ-ПЛР-ампліфікації Назва праймера SF14413 SR15497 Qst Послідовність 5’-CTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTG–3" (SEQ ID NO: 4) 5’-CAATTAAATCTTACCCCCACACGGTCG-3" (SEQ ID NO: 5) 5’-gagtgacgaggactcgagcgcattaaTTTTTTTTTTTTTT-3" (SEQ ID NO: 6) 9 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 1.3 Джерело використовуваних тварин і їх поділ на групи П'ятдесят (50) свиней 29-денного віку купували для досліду на племінній свинарській фермі Henan Muyuan. За допомогою ЗТ-ПЛР (для PRRSV і PCV2) і ELISA (набір анти-PRRSV, фірма IDEXX Laboratory, Inc.) шляхом трикратного аналізу зразків сироватки, зібраних у момент прибуття, було підтверджено, що тварини були PRRSV- і PCV2-негативними. Свиней зважували й довільно розділяли на групи 1, 2 і 3, у кожну з яких входило 22, 14 і 14 свиней відповідно. Потім кожну групу свиней тримали окремо у різних приміщеннях. 1.4 Вакцинація й контрольне зараження вірусом У день 0 22 свині у групі 1 (V/C) вакцинували внутрішньом'язово однією дозою вакцини Ingelvac® PRRS MLV в об'ємі 2 мл. 14 свиням у групі 2 (не-V/C) ін'єкували по 2 мл ЗФР у день 0. Контрольне зараження свиней з групи 1 і групи 2, що здійснювали у день 28, проводили шляхом внутрішньоносового введення 3 мл розведеного штаму PRRSV JX143. Свиней у групі 3 (неV/не-C) не вакцинували й не піддавали контрольному зараженню, вони являли собою суворий негативний контроль, їм ін'єкували по 3 мл середовища DMEM у день 28. По дві свині з кожної групи піддавали аутопсії у день 14 і 42 відповідно для проведення обстеження. Інших свиней піддавали аутопсії у день 49. 1.5 Ректальна температура Ректальну температуру визначали в один й той же час щодня у період від дня 0 до дня 49 (21 день після контрольного зараження). 1.6 Серологічне обстеження Зразки сироватки всіх свиней одержували у дні 0, 7, 14, 21, 28, 32, 42 і 49 і аналізували відносно антитіла до PRRSV за допомогою набору IDEXX PRRSV ELISA. 1.7. Клінічне обстеження У період від дня 0 і по день 49 здійснювали щоденний моніторинг свиней і оцінювали у балах серйозність змін поводження (зовнішніх реакцій) і клінічні респіраторні показники, включаючи подих і кашель. Бальна система оцінки клінічних симптомів представлена у таблиці 2. Таблиця 2 Бальна система клінічних симптомів Серйозність клінічних симптомів Норма Слабкий Серйозний Смерть Подих* 1 2 3 4 Бальна оцінка Поводження (зовнішні реакції)* 1 2 3 4 Кашель* 1 2 3 4 *Подих: Бал 2 (слабкий) відповідає поверхневому подиху, виділенням із носа, абдомінальному "важкому (гучному)» подиху при стимуляції. Бал 3 (серйозний) відповідає швидкому й поверхневому подиху, виділенням із носа, подиху відкритим ротом, абдомінальному "важкому (гучному)» подиху. *Поводження: 1. На шкірі ротової порожнини, носа, вух і внутрішньої частини ніг з'являються червоність, гіперемія, червоні точки, папули 2. Депресія, грубий волосяний покрив. 3. Анорексія 4. Кульгавість, тремор, конвульсії 5. Виснаження. Бал 2 відповідає наявності одного або двох з описаних вище симптомів. Бал 3 відповідає наявності трьох або більшої кількості з описаних вище симптомів. *Кашель: Бал 2 відповідає непродуктивному кашлю. Бал 3 відповідає продуктивному кашлю. 30 35 1.8 Оцінка продуктивності Масу всіх свиней оцінювали у день 0 (перед вакцинацією), день 28 (перед контрольним зараженням), день 49 (через 21 день після контрольного зараження). 1.9 Ефективність Ingelvac® PRRS MLV оцінювали, визначаючи клінічні симптоми, бал ураження легенів і ректальну температуру після контрольного зараження вакцинованих свиней у порівнянні з контрольною групою, що піддавали контрольному зараженню, і групою, що представляє собою негативний контроль. Свиней розглядали як таких, що мають ознаки клінічного ураження PRRS у тих випадках, коли: 1) висока ректальна температура (41 °C) 10 UA 106475 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зберігалася протягом більше 3 днів, 2) виявлена депресія, анорексія, кон'юнктивіт, кашель, респіраторне захворювання, і 3) виявлена пневмонія. 1.10 Ураження легені Аутопсію здійснювали у день 49 (через 21 день після контрольного зараження PRRSV). У легені кожної свині оцінювали методом наосліп відсоток площі (від 0 до 100 %), ураженої сильними видимими ознаками пневмонії (набряк, гіперемія, крововилив, м'ясиста і тверда фіброзна структура). 1.11 Виявлення й кількісна оцінка РНК PRRSV Одержували зразки сироватки у свиней групи 1 (V/C) у дні 0, 7, 14, 21, 28, 32, 35, 42 і у свиней групи 2 (не-V/C) у дні 28, 32, 35 і 42. Екстракцію РНК з індивідуальних зразків сироватки об'ємом 140 мкл здійснювали за допомогою міні-набору для вірусної РНК QIAamp (фірма QIAGEN). Потім здійснювали ЗТ-ПЛР за допомогою комбінації праймерів-зондів (фірма Invitrogen) (таблиця 1), специфічних для консервативної області РНК PRRSV (Genbank). Для кожної ВД-реакції використовували 12,5 мкл РНК-матриці, 4 мкл дНТФ, 2 мкл 10×буфера, 0,5 мкл праймера Qst і 1 мкл зворотної транскриптази Quant. Суміш інкубували при 37 °C у водяній лазні протягом 1 год. і зберігали при -20 °C. Потім здійснювали ПЛР, використовуючи 1 мкл суміші для ВД-реакції, по 1 мкл праймерів SF14413 і SR1549, 2 мкл 10×буфера, 2 мкл дНТФ, 5 од. rTaq-полімерази й воду до доведення загального об'єму до 20 мкл. У реакційному планшеті проводили послідовну реакцію з використанням ідентифікуючої системи у специфічних умовах (94 °C протягом 5 хв; потім 40 циклів при 94 °C протягом 30 с, 65 °C протягом 30 с, 72 °C протягом 75 с, 40 циклів; і нарешті при 72 °C протягом 10 хв). Ампліфікований ПЛР-фрагмент розділяли на агарозному гелі, і виявлення проводили в ультрафіолетовому світлі. 1.12 Імуногістохімічний аналіз для виявлення антигену PRRSV Імуногістохімічний аналіз із метою виявлення специфічного для PRRSV антигену здійснювали на фіксованих у формаліні й залитих у парафін зрізах тканини легені, які готували у період часу до 48 год. після здійснення аутопсії з використанням моноклонального антитіла до N-білка PRRSV (SR30 або SDOW17) і вторинного кон'югованого антитіла. 2. Результати 2.1. Зміна ректальної температури після контрольного зараження Після інокуляції високовірулентним штамом PRRSV JX143 ректальна температура у свиней як у вакцинованій, так і у невакцинованій групі швидко підвищувалася. Найбільше висока температура становила 41 °C і у 75 % свиней виявлена лихоманка відразу ж після інокуляції застосовуваним для контрольного зараження вірусом. У вакцинованих тварин ректальна температура знижувалася до рівнів, що мали місце до контрольного зараження, через 10 днів, у той час як для групи не-V/C був характерний більше тривалий період лихоманки, і підвищена ректальна температура зберігалася протягом істотно більше тривалого періоду (фіг. 2). 2.2. Серологічна реакція. Середнє значення величини S/P у групі, визначене за даними ELISA, застосовували як міру серологічної реакції відповідної групи на PRRSV (фіг. 3). Застосовувані як негативний контроль свині залишалися негативними відносно антитіл до PRRSV протягом дослідження. У V/C-групі антитіло вперше виявлене через 10-14 днів після вакцинації й співвідношення S/P становило ≥0,4 через 14 днів після інокуляції (p.i.), при цьому у V/C-групі 8 з 20 свиней виявилися позитивними, а через 21 день p.i., 13 з 20 свиней виявилися позитивними. Найбільше високе значення співвідношення S/P у V/C-групі виявлено після контрольного зараження й зберігалося на високому рівні до кінця досліду (ELISA, S/P≈2). У свиней у не-V/C-групі видозміна серологічної специфічності після контрольного зараження відбувалася швидко; через 7 днів після p.i. 9 з 12 свиней виявилися позитивними, при цьому співвідношення S/P становило ≥0,4. 2.3. Клінічні симптоми Оцінювали у балах респіраторне захворювання для V/C-групи й не-V/C-групи (фіг. 4). Після контрольного зараження 5 з 20 свиней у V/C-групі мали клінічні симптоми респіраторного захворювання й кашель, а у 2 свиней виявлений абдомінальний "важкий (гучний)» подих. Вісім з 12 свиней у не-V/C-групі загинули до 21 дня p.i., а свині, що залишилися, у не-V/C-групі мали симптоми серйозного респіраторного захворювання й кашель з абдомінальним "важким (гучним)» подихом. У свиней у не-V/C-групі бал, що перевищує 6, виявлений протягом 10 днів і найвищий бал досягав 7. Свині у V/C-групі не мали виражених клінічних симптомів і найбільше високий бал, що характеризує захворювання, досягав 4-5 протягом 7 послідовних днів. У застосовуваних як суворо негативний контроль свиней не-V/не-C-групи не було виявлено клінічних симптомів і середній бал для них становив 3 (норма). 2.4. Середній добовий приріст маси до й після контрольного зараження 11 UA 106475 C2 5 10 Дані про середній добовий приріст маси (ADG) узагальнені на фіг. 5. З дня 0 по день 28 не виявлено істотного розходження у величині ADG між вакцинованими свинями (0,3301±0,0414 кг) і невакцинованими свинями (0,3008±0,0653 кг). З дня 28 (перед днем контрольного зараження) до дня 49 величина ADG для вакцинованих свиней була аналогічна величині для контрольних свиней з не-V/не-C-групи (0,3373±0,0800 кг проти 0,3484±0,0890 кг), у той час як у свиней з неV/C-групи була виявлена істотно більше низька величина ADG (0,0392±0,2398 кг). 2.5. Ефективність вакцинації Після контрольного зараження у вакцинованих MLV свиней виявлені клінічні симптоми відразу після контрольного зараження, при цьому середній клінічний бал становив 5, і більше ніж у 3 свиней виявлена висока ректальна температура (41 °C) і ушкодження у легенях. Відповідно до критеріїв, викладених у розділі "Методи", 25 % (5/20) вакцинованих MLV свиней мали PRRS, а 75 % (15/20) свиней виявилися захищеними від хвороби. На противагу цьому всі невакциновані свині мали PRRS після контрольного зараження й 8 свиней загинули до здійснення аутопсії. 15 Таблиця 3 Ефективність MLV-вакцинації Група MLV-V Невакциновані/ піддані контрольному зараженню 20 25 Піддані контрольному зараженню свині 20 Загиблі свині Хворі свині 0 5 (25 %) Результат контрольного зараження Виживаність 100 % 8 12 (100 %) Виживаність 33 % 12 2.6 Макроскопічні ушкодження При аутопсії чотирьох свиней, що вижили, з не-V/C-групи виявлені макроскопічні ушкодження, такі як недостатність/колапс легенів, рудувато-коричнева плямистість, гіперемія, збільшення лімфатичних залоз у паховій області, у щелепній області, набряк і гіперемія брижі й у деяких випадках некроз печінки. Деякі свині у V/C-групі мали подібні, але менше серйозні ушкодження. У контрольній не-V/не-C групі у свиней не виявлені макроскопічні ушкодження. 2.7 Ступінь макроскопічних ушкоджень легенів Ступінь ушкодження легенів у вакцинованих MLV свиней була істотно меншою, ніж у свиней з не-V/C-групи, це дозволяє припустити, що MLV забезпечує надійний захист при інокуляції високопатогенним штамом PRRSV (таблиця 4, в якій ступінь макроскопічних ушкоджень легенів оцінювали у відсотках від 0 до 100 %). Таблиця 4 Порівняння серйозності макроскопічних ушкоджень легенів у свиней з різних груп День після вакцинації 14 42 49 30 35 40 Група не-V/C 0,30±2,30 75,25±7,27 69,6±12,97 MLV-V/C 0,500±2,00 28,58±16,15 19,12±8,37 не-V/не-C 0,25±1,00 0,30±0,50 2.8 Визначення віремії Дані про відсоток позитивної у відношенні PRRSV сироватки, отримані за допомогою ЗТПЛР, узагальнені на фіг. 6. Віремія виявлена у 60 % вакцинованих MLV свиней через 7 днів після вакцинації, вона знижувалася до 20 % перед контрольним зараженням. Після контрольного зараження у 70 % вакцинованих свиней виявлена віремія, що знижувалася до 60 % до дня 7 p.i., і у 20 % свиней виявлена віремія до дня 21 p.i. На відміну від цього віремія виявлена у 100 % свиней з не-V/C-групи після контрольного зараження, віремія зберігалася на високому рівні після контрольного зараження, і у 70 % свиней з не-V/C-групи віремія виявлена через 21 день після контрольного зараження. 2.9 Виявлення антигену за допомогою імуногістохімічного аналізу Під мікроскопом оцінювали мікроскопічні ушкодження легенів. Інфіковані PRRSV клітини 12 UA 106475 C2 5 виявлені у всіх підданих контрольному зараженню свиней. У свиней з MLV-V/C-групи виявлена менша кількість інфікованих PRRSV клітин. Загальну кількість клітин і кількість інфікованих PRRSV клітин визначали у різних областях. Рівень інфікованих клітин істотно різнився між групами: 23,34±4,691 у свиней з не-V/C-групи, 9,36±8,069 у свиней з V/C-групи й 0,24±0,114 у свиней з не-V/не-C-групи (таблиця 5). Таблиця 5 Кількість інфікованих PRRSV клітин за даними імуногістохімічного аналізу залитих у парафін блоків легень свиней Рівень інфікованих PRRSV клітин % MLV-V 9,36±8,069 Групи не-V/контрольне зараження 23,34±4,691 13 не-V/не-С 0,24±0,114 UA 106475 C2 14 UA 106475 C2 15 UA 106475 C2 16 UA 106475 C2 17 UA 106475 C2 18 UA 106475 C2 19 UA 106475 C2 20 UA 106475 C2 21 UA 106475 C2 22 UA 106475 C2 23 UA 106475 C2 24 UA 106475 C2 25 UA 106475 C2 26 UA 106475 C2 27 UA 106475 C2 28