Способи продукування аполіпопротеїнів у трансгенних рослинах

1. Спосіб експресії аполіпопротеїну у рослинах, що передбачає (а) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, що містить у 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти (i) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах рослин; і (ii) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; і (ііі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує (1) націлюючий сигнал, здатний направляти аполіпопротеїн в ендоплазматичний ритикулум (ЕР) або похідну від ЕР запасаючу везикулу, або (2) сигнальний пептид, який здатний направляти поліпептид аполіпопротеїну в апопласт, і стабілізуючий поліпептид; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; і (с) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, де рослина експресує аполіпопротеїн. 2. Спосіб за п. 1, де послідовність химерної нуклеїнової кислоти вводять у клітину рослини в умовах ядерної геномної інтеграції. 3. Спосіб за п. 1 або п. 2, де вказана клітина рослини являє собою клітину насіння рослини. 4. Спосіб за пп. 1, 2 або 3, де послідовність нуклеїнової кислоти, здатна контролювати експресію у клітинах рослини, являє собою переважний для насіння промотор. 5. Спосіб за п. 4, де переважний для насіння промотор являє собою фазеоліновий промотор. 6. Спосіб за п. 1 або п. 2, де послідовність нуклеїнової кислоти, здатна контролювати експресію у клітинах рослини, являє собою конститутивний промотор. 7. Спосіб за п. 6, де вказаний конститутивний промотор являє собою убіквітиновий промотор. 8. Спосіб за п. 1, де вказаний стабілізуючий поліпептид є рослиноспецифічним. 9. Спосіб за п. 1, де вказаний стабілізуючий поліпептид є нерослиноспецифічним. 10. Спосіб за п. 8, де вказаний рослиноспецифічний стабілізуючий поліпептид являє собою білок UA (21) a200606611 (22) 15.11.2004 (24) 25.03.2011 (86) PCT/CA2004/001960, 15.11.2004 (31) 60/519,606 (32) 14.11.2003 (33) US (31) 60/579,733 (32) 16.06.2004 (33) US (46) 25.03.2011, Бюл.№ 6, 2011 р. (72) МОЛОНІ МОРІС М., CA, РЕЙД АЛЕКСАНДРА, FR (73) СЕМБАЙОСІЗ ДЖИНЕТІКС ІНК., CA, ЮТІАЙ ЛІМІТЕД ПАРТНЕРШИП, CA (56) US A 2002088025, 04.07.2002 SCHMIDT H.H. ET AL.: 'In vivo kinetics as a sensitive method of testing physiologically intact human recombinant apolipoprotein A-I: comparison of three defferent expression system.' CLIN.CHIM.ACTA. vol. 268, no. 1-2, December 1997, pages 41 - 60 STOFFEL W. AND BINCZEK ET AL.: 'Transient expression of wild type and mutant human apolipoprotein AI in COS cells.' CHEMICAL ABSTRACTS. vol. 115, no. 13, July 1991, page 303 PARMENTER D.L. ET AL.: 'Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning.' PLANT MOLEC. BIOL. vol. 29, no. 6, 01 January 1995, pages 1167 - 1180 CONRAD U. ET AL.: 'Hight-level and stable accumulation of single chain Fv antibodies in plant storage organs.' J. PLANT PHYSIOL. vol. 152, no. 6, June 1998, pages 708 - 711 CHAUDHARY S. ET AL.: 'Transgenic Brassica carinata as a vehicle for the production of recombinant proteins in seeds.' PLANT CELLS REPORTS. vol. 17, no. 3, January 1998, pages 195 200 GIDDINGS G. ET AL.: 'Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals.' NATURE BIOTECHNOLOGY. vol. 18, no. 11, November 2000, pages 1151 - 1155 2 (19) 1 3 масляного тіла або тіоредоксин або його фрагмент. 11. Спосіб за п. 10, де вказаний білок масляного тіла вибраний з групи, що складається з олеозину, калеозину і стеролеозину. 12. Спосіб за п. 11, де вказаний олеозин, калеозин і стеролеозин одержані з Arabidopsis thalania. 13. Спосіб за п. 10, де вказаний тіоредоксин кодується послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 56. 14. Спосіб за п. 9, де вказаний нерослиноспецифічний стабілізуючий поліпептид являє собою зелений флуоресцентний білок або одноланцюжкове антитіло або його фрагмент. 15. Спосіб за п. 9, де вказаний нерослиноспецифічний стабілізуючий поліпептид являє собою кодон, оптимізований для оптимальної експресії у рослинах. 16. Спосіб за п. 14, де вказаний зелений флуоресцентний білок кодується послідовностю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 57. 17. Спосіб за п. 14, де вказане одноланцюжкове антитіло здатне полегшувати очищення аполіпопротеїну, експресованого у насінні. 18. Спосіб за п. 14, де вказане одноланцюжкове антитіло здатне специфічно асоціюватися з білком масляного тіла. 19. Спосіб за п. 14, де вказане одноланцюжкове антитіло являє собою одноланцюжкове антитіло Fv, здатне специфічно асоціюватися з олеозином, одержаним з Arabidopsis thalania, масою 18 кДа (D9scFv). 20. Спосіб за п. 14, де вказане одноланцюжкове антитіло являє собою SEQ ID NO: 240. 21. Спосіб за п. 1, де вказаний стабілізуючий поліпептид зв'язаний з аполіпопротеїном за допомогою розщеплюваного лінкеру. 22. Спосіб за п. 21, де вказаний лінкер, що розщеплюється, являє собою пропослідовність хімозину. 23. Спосіб за п. 22, де вказана пропослідовність хімозину кодується послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 143. 24. Спосіб за п. 1, де вказана запасаюча везикула, що є похідною ER, являє собою масляне тіло, і вказана націлююча послідовність кодує білок масляного тіла. 25. Спосіб за п. 1, де вказаний націлюючий сигнал містить С-кінцевий ER-вмісний мотив. 26. Спосіб за п. 25, де вказаний С-кінцевий ERвмісний мотив являє собою KDEL. 27. Спосіб за п. 1, де вказаний сигнальний пептид являє собою сигнальну послідовність білка, що відноситься до патогенезу тютюну (PR-S). 28. Спосіб за п. 27, де вказана сигнальна послідовність PR-S являє собою SEQ ID NO: 58. 29. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-28, де послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, вибирають з групи послідовностей нуклеїнових кислот, що складається з аполіпопротеїну людини, проаполіпопротеїну людини, свинячого аполіпопротеїну, свинячого проаполіпопротеїну, бичачого аполіпопротеїну і бичачого проаполіпопротеїну. 30. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-29, де послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпоп 93853 4 ротеїн, оптимізована для використання рослинного кодону. 31. Спосіб одержання насіння рослини, що містить аполіпопротеїн, який передбачає (а) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, що містить у 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти (i) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах насіння рослин; і (ii) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; і (ііі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує (1) націлюючий сигнал, здатний направляти аполіпопротеїн в ЕР або похідну від ЕР запасаючу везикулу, або (2) сигнальний пептид, який здатний направляти поліпептид аполіпопротеїну в апопласт, і стабілізуючий поліпептид; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; і (с) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, і одержання тканини з вказаної рослини, де насіння містить аполіпопротеїн; і (d) одержання насіння вказаної рослини, де насіння містить аполіпопротеїн. 32. Рослина, яка містить послідовність химерної нуклеїнової кислоти, що містить у 5'-3' напрямі транскрипції (а) першу послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у насінні рослини, функціонально зв'язану з (b) другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну, де рослина містить аполіпопротеїн; і (с) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує (1) націлюючий сигнал, здатний направляти аполіпопротеїн в ЕР або похідну від ЕР запасаючу везикулу, або (2) сигнальний пептид, який здатний направляти поліпептид аполіпопротеїну в апопласт, і стабілізуючий поліпептид. 33. Рослина за п. 32, де послідовність химерної нуклеїнової кислоти інтегрована в ядерний геном рослини. 34. Рослина за пп. 1-33, де використовувана рослина являє собою Arabidopsis або сафлор красильний. 35. Насіння рослини, що містить послідовність химерної нуклеїнової кислоти, що містить у 5'-3' напрямі транскрипції (а) першу послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у насінні рослини, функціонально зв'язану з (b) другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; і (с) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує (1) націлюючий сигнал, здатний направляти аполіпопротеїн в ЕР або похідну від ЕР запасаючу везикулу, або (2) сигнальний пептид, який здатний направляти поліпептид аполіпопротеїну в апопласт, і стабілізуючий поліпептид. 36. Композиція, що містить по суті чисті масляні тіла, які містять аполіпопротеїн, одержаний з рослин, одержаних способом за п. 1. 37. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, зв'язана з послідовністю нуклеїно 5 93853 6 вої кислоти, що містить нуклеїнову кислоту, здатну контролювати експресію у клітині рослини, і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує (1) націлюючий сигнал, здатний направляти аполіпопротеїн в ЕР або похідну від ЕР запасаючу везикулу, або (2) сигнальний пептид, який здатний направляти поліпептид аполіпопротеїну в апопласт, і стабілізуючий поліпептид. 38. Послідовність нуклеїнової кислоти за п. 37, де вказана клітина рослини являє собою клітину насіння. 39. Послідовність нуклеїнової кислоти за п. 38, де вказана послідовність нуклеїнової кислоти, здатна контролювати експресію у клітині рослини, являє собою переважний для насіння промотор. 40. Нуклеїнова кислота за п. 39, де вказаний переважний для насіння промотор являє собою фазеоліновий промотор. 41. Послідовність нуклеїнової кислоти за п. 40, де вказана послідовність нуклеїнової кислоти, здатна контролювати експресію у насінні рослини, являє собою конститутивний промотор. 42. Послідовність нуклеїнової кислоти за п. 41, де вказаний промотор являє собою убіквітиновий промотор. 43. Рекомбінантний вектор експресії, придатний для експресії у клітині рослини, що містить послідовність нуклеїнової кислоти за пп. 1-42. 44. Спосіб одержання по суті чистого аполіпопротеїну, що передбачає (а) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, що містить у 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти (i) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах насіння рослин; і (ii) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; і (ііі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує (1) націлюючий сигнал, здатний направляти аполіпопротеїн в ЕР або похідну від ЕР запасаючу везикулу, або (2) сигнальний пептид, який здатний направляти поліпептид аполіпопротеїну в апопласт, і стабілізуючий поліпептид; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; (с) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, і (d) одержання насіння вказаної рослини, де насіння містить аполіпопротеїн; і (е) відділення аполіпопротеїну від компонентів насіння рослини для одержання по суті чистого аполіпопротеїну. 45. Застосування рослини, одержаної за пп. 32-34, для одержання по суті чистого аполіпопротеїну. Даний винахід відноситься до методів генної інженерії рослин і продукування аполіпопротеїнів. Більш конкретно, даний винахід відноситься до способів продукування рекомбінантних аполіпопротеїнів у трансгенних рослинах. У здоровому організмі людини існує баланс між надходженням і виведенням холестерину. Коли у людей спостерігається високий рівень ліпопротеїну низької щільності (LDL) і низький рівень ліпопротеїну високої щільності (HDL), дисбаланс приводить до більшого осадження холестерину в артеріях, ніж до його видалення (van Dam, M. J. et al. 2002, Lancet 359: 37-42). Атеросклероз, звуження або блокування артерій, є наслідком повторного осадження холестерину, що називається бляшками (Major, A. S. et al. 2001, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 21: 1790-1795). Ліпопротеїни можуть бути розділені на атерогенні і вазопротекторні ліпопротеїни. Звичайно, атерогенні ліпопротеїни всі являють собою аполіпопротеїн (Аро) В-вмісний ліпопротеїн, такий як ліпопротеїн дуже низької щільності (VLDL), проміжної щільності (IDL), низької щільності (LDL) або ліпопротеїн (Lp(a)), тоді як вазопротекторні ліпопротеїни являють собою Аро АІ вмісні, такі як HDL. Аро АІ, основний білок-компонент HDL, грає вирішальну роль у гомеостазі холестерину. Клінічні дослідження і статистичні дослідження населення продемонстрували чудову зворотну кореляцію між серцево-судинними захворюваннями і рівнями HDL у плазмі крові, дозволяючи припустити, що Аро АІ і HDL допомагають виконувати захи сну роль проти атерогенезу (Rubins, Η. В. et al. 1993, Am. J. Cartiol. 71: 45-52). Дослідження трансгенних мишей (Rubin, Ε. Μ. et al. 1991, Nature 353: 265-267) і кроликів (Duverger, N. et al. 1996, Circulation 94: 713-717), схильних до атеросклерозу, показали, що експресія Аро АІ людини інгібує розвиток атеросклерозу. Ця дія може бути пов'язана з ефективним промотуванням виведення холестерину з клітин (Castro, G. et al. 1997, Biochemistry 36: 2243-2249), першою стадією процесу «зворотного транспорту холестерину» (RCT) (Glomset, J. Α. 1968, J. Lipid Res. 9:155-167). Apo AI модулює даний процес, являючись переважним акцептором клітинного холестерину (Rothblat, G. Η. et al. 1999, J. Lipid Res. 40: 781-796), збільшуючи активність лецитин-холестеринацилтрансферази (LCAT) в етерифікації HDLзв'язаного холестерину на декілька порядків (Jonas, А. 1991, Biochim. Biophys. Acta 1084: 205220; Mahley, R. W. et al. 1984, J. Lipid Res. 25: 1277-1294) і транспортуючи складні ефіри холестерину - похідні LCAT у печінку (Morrison, J. R. et al. 1992, J. Biol. Chem. 267: 13205-13209). На відміну від синтетичних антигіперліпідеміків, таких як LIPITOR® (аторвастатин кальцію), дія яких полягає у зниженні рівня ліпідів в організмі за рахунок інгібування синтезу холестерину (Alaupovic, P. et al. 1997, Atherosclerosis 133: 123133), інфузія очищеного Apo ΑΙ стимулює виведення холестерину з тканин у плазму крові (Navab, Μ. et al. 2002, Circulation 105: 290-292). Це дозволяє припустити, що Apo AI стимулює виведення 7 холестерину з ксантомних клітин у стінці артерії та індукує повернення на більш ранню стадію розвитку атеросклеротичних бляшок, ефективно «очищаючи» артерії. У людей Аро АІ синтезується у печінці і клітинах кишечнику у вигляді неглікозильованого перед-про-білка (Gordon, J. I. et al. 1983, J. Biol. Chem. 258:4037-4044). Передсегмент, що складається з 18 амінокислот, видаляється перед тим, як білок покидає клітину, і пpο-сегмент з 6 амінокислот відщеплюється після виділення за допомогою невідомої протеази, залишаючи зрілий білок, що складається з 243 амінокислот (Saku, K. et al. 1999, Eur. J. Clin. Invest. 29: 196-203). Аполіпопротеїн A-IMilano (Apo AI-M) являє собою перший описаний молекулярний варіант Аро АІ людини (Franceschini, G. et al. 1980, J. Clin. Invest. 66: 892-900). Він характеризується заміщенням Arg173 на Cys (Weisgraber, Κ. Η. et al. 1983, J. Biol. Chem. 258: 2508-2513). Мутантний аполіпопротеїн передається у спадок у вигляді аутосомальної домінантної характерної риси, і було виявлено 8 поколінь носіїв (Gerli, G. С. et al. 1984, Hum. Hered. 34: 133-140). Статус індивідуального носія Аро АІ-М характеризується значним зниженням рівня HDLхолестерину. Незважаючи на це, суб'єкти, на яких здійснювався вплив, очевидно, не демонструють підвищеного ризику артеріального захворювання, дійсно, при дослідженні генеалогічного дерева виявляється, що дані суб'єкти можуть бути «захищені» від атеросклерозу. Механізм можливої захисної дії Аро АІ-М на його носіїв очевидно пов'язаний з модифікацією структури мутантного аполіпопротеїну з втратою однієї альфа-спіралі і підвищеним впливом гідрофобних залишків (Franceschini, G. et al. 1985, J. Biol. Chem. 260: 16321-16325). Втрата жорсткої структури множини альфа-ланцюгів приводить до підвищеної гнучкості молекули, яка більш легко зв'язується з ліпідами у порівнянні зі звичайним АІ. Більш того, комплекси аполіпопротеїн/ліпід більш схильні до денатурації, таким чином дозволяючи припустити, що доставка ліпідів також поліпшується у випадку мутантів. Терапевтичне застосування Аро АІ і мутанта Аро АІ-М у наш час обмежене відсутністю способу, який дає можливість одержання вказаних аполіпопротеїнів у достатній кількості і у відповідному вигляді. Зокрема, було показано, що рекомбінантне продукування Аро АІ є дуже важким внаслідок його амфіфільного характеру, автоагрегації і розкладання (Schmidt, Η. Η. et al. 1997, Protein Expr. Purif. 10: 226-236). До моменту створення даного винаходу Аро АІ був експресований in vitro у двох системах еукаріотів: трансфектованих бакуловірусом клітинах Spodoptera fragiperda (Sf9) (Sorci-Thomas, M. G. et al. 1996, J. Lipid Res. 37: 673-683) і стабільно трансфектованих клітинах яєчників китайського хом'ячка (СНО) (Forte, Τ. Μ. et al. 1990, Biochim. Biophys. Acta 1047: 11-18; Mallory, J. B. et al. 1987, J. Biol. Chem. 262: 4241-4247). У системі бакуловірусу після того як клітини були успішно трансфектовані, є ретельний процес скринінгу перед використанням клітин з правильною конструк 93853 8 цією для експресії. Аналогічно, колонії клітин СНО повинні піддаватися процесу скринінгу для виявлення стабільно трансфектованих колоній з високою експресією. Додатково, для обох таких типів клітин потрібний відносно тривалий період часу перед досягненням значної експресії і набагато більш високий рівень підтримки, ніж для бактерій. Рекомбінантна експресія білків у бактеріальних системах звичайно є привабливою, оскільки вона здатна швидко і економічно продукувати великі кількості чистого білка. Є декілька повідомлень про експресію Аро АІ у трансформованих Escherichia coli (Е. соlі); однак, хоча нещодавно були зроблені деякі поліпшення загального рівня експресії (Ryan, R.O. et al. 2003, Protein Expr. Purif. 27: 98-103), дані способи дають відносно низькі виходи або небажану присутність тагів або сигналів секреції з чужорідною афінністю (Bergeron, J. et al. 1997, Biochim. Biophys. Acta 1344: 139-152; Li, Η. Η. et al. 2001, J. Lipid Res. 42: 2084-2091; McGuire, K. A. et al. 1996, J. Lipid Res. 37:15191528). Більш того, відомо, що ендотоксини Ε. coli утворюють відносно міцні комплекси з аполіпопротеїнами (Emancipator et al. (1992) Infect. Immun. 60: 596-601). Вельми бажане зниження або виключення токсичності, пов'язаної з такими ендотоксинами Е. coli, у фармацевтичних препаратах аполіпопротеїнів. Видалення цих ендотоксинів, хоча технічно здійсненне, включає складні і дорогі методології очищення білка (патент США 6506879), не виключаючи повністю ризик для здоров'я людини. Застосування рослин як біореакторів для великомасштабного продукування рекомбінантних білків відоме у даній галузі, і численні білки, включаючи білки для лікування людини, були продуковані таким чином. Наприклад, у патентах США 4956282, 5550038 і 5629175 розкрито продукування -інтерферону у рослинах, у патентах США 5650307, 5716802 і 5763748 детально описано продукування сироваткового альбуміну людини у рослинах, і патенти США 5202422, 5639947 і 5959177 відносяться до продукування антитіл у рослинах. Однією з істотних переваг, що пропонуються системами продукування рекомбінантних білків на основі рослин, є те, що у міру збільшення площі землі під вирощуваними рослинами продукування білка може бути необмежено масштабоване для забезпечення великих кількостей білка. Навпаки, вимоги до систем ферментування і культивування клітин включають великий простір, обладнання і витрати енергії, приводячи до підвищення вартості масштабування виробництва. Однак, незважаючи на те, що застосування рослин як біореакторів детально документоване і незважаючи на згадані вище терапевтичні застосування аполіпопротеїнів, у попередньому рівні розвитку даної галузі відсутні способи продукування аполіпопротеїну у рослинах. Для того, щоб запропонувати практичну альтернативу системам на основі ферментування і культивування клітин, важливо, щоб рослини залишалися здоровими, і щоб аполіпопротеїни накопичувалися у рослинах у значних рівнях. З точки зору властивої аполіпопротеїнам властивості утворювати асоціати з ліпідами, аполіпопротеїни, 9 що рекомбінантно експресуються, можуть утворювати асіоціати з ендогенними рослинними ліпідами і таким чином заважати метаболізму ліпідів у рослинах. Таким чином, рекомбінантна експресія аполіпопротеїнів може впливати на здоров'я рослини. Альтернативно, аполіпопротеїн, що рекомбінантно експресується, може не накопичуватися на ефективних рівнях, оскільки захисні механізми можуть приводити до розкладання аполіпопротеїну. Таким чином, залишається незрозумілим, як і до якої міри може використовуватися синтетична здатність рослин для досягнення комерційного виробництва аполіпопротеїну у рослинах. Таким чином, з точки зору недоліків, пов'язаних зі способами рекомбінантного продукування аполіпопротеїнів за попереднім рівнем даної галузі, існує необхідність удосконалення способів продукування аполіпротеїнів. Даний винахід відноситься до способів продукування аполіпопротеїну у рослинах. Зокрема, даний винахід відноситься до способів продукування аполіпопротеїну у насінні рослин. Відповідно, даний винахід відноситься до способу експресії аполіпопротеїну у рослинах, що передбачає (a) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, що містить в 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти: (і) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах рослин; і (іі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; і (c) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, здатну експресувати аполіпопротеїн. Відповідно до даного винаходу було встановлено, що насіння рослин є особливо придатним для продукування аполіпопротеїну. Відповідно, даний винахід відноситься до способу експресії аполіпопротеїну у насінні рослин, що передбачає: (а) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, що містить в 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти: (і) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах рослин; і (іі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; і (c) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, здатну давати урожай насіння, де насіння експресує аполіпопротеїн. У наступному переважному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти, здатна контролювати експресію у клітині насіння рослин, являє собою промотор, переважний для насіння, такий як фазеоліновий промотор. У переваленому варіанті здійснення щонайменше 0,25% загального білка насіння являє собою аполіпопротеїн. У переважних варіантах здійснення даного винаходу послідовність химерної нуклеїнової кислоти додатково містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує стабілізуючий поліпептид, зв'язаний у рамці зчитування з послідовністю нуклеї 93853 10 нової кислоти, що кодує аполіпопротеїн. Переважно, стабілізуючий поліпептид являє собою поліпептид, який легко може бути експресований за відсутності аполіпопротеїну і стабільно накопичується у рослинній клітині. Стабілізуючий білок може бути рослино-специфічним або не рослиноспецифічним. Рослино-специфічні стабілізуючі поліпептиди, які можуть використовуватися відповідно до даного винаходу, включають білки масляного тіла і тіоредоксини. Рослино-неспецифічні стабілізуючі поліпептиди, які можуть використовуватися відповідно до даного винаходу, включають зелений флуоресцентний білок (GFP) і одноланцюжкові антитіла або їх фрагменти. Рослиноспецифічний або не рослино-специфічний стабілізуючий поліпептид може бути зв'язаний з аполіпопротеїном за допомогою лінкеру, який може бути відщеплений, вивільняючи аполіпопротеїн у його вільній природній формі. Додатково, послідовність химерної нуклеїнової кислоти переважно містить націлюючий сигнал таким чином, що поліпептид аполіпопротеїну акумулюється у рослинній клітині в ендоплазматичній сітці (ER) або у зв'язаній з нею запасаючій везикулі, що є похідною ER, наприклад, у масляному тілі. Відповідно, конструкція химерної нуклеїнової кислоти додатково може містити послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який здатний направляти поліпептид аполіпопротеїну в ER або у запасаючу везикулу, що є похідною ER. Послідовності нуклеїнових кислот, які можна використовувати для націлювання аполіпопротеїну в ER, включають, наприклад, послідовності нуклеїнових кислот, що кодують послідовності KDEL, HDEL, SDEL. Послідовності нуклеїнових кислот, які можна використовувати для направлення аполіпопротеїну у масляне тіло, включають послідовності нуклеїнових кислот, що кодують білки масляного тіла, такі як олеозини. Крім того, відповідно до даного винаходу аполіпопротеїн може бути направлений у масляне тіло шляхом експресії аполіпопротеїну таким чином, що аполіпопротеїн не містить націлюючого сигналу, але за умови, що послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує аполіпопротеїн, містить пропептид аполіпопротеїну. В іншому переважному варіанті здійснення химерна нуклеїнова кислота містить націлюючий сигнал таким чином, що аполіпопротеїн акумулюється в апопласті. Відповідно, у такому варіанті здійснення конструкція химерної нуклеїнової кислоти переважно додатково містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який здатний направляти аполіпопротеїн в апопласт. У ще одному наступному переважному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, експресується таким чином, що аполіпротеїн акумулюється у цитоплазмі. У такому варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти не містить націлюючого сигналу. У наступному переважному варіанті здійснення конструкцію химерної нуклеїнової кислоти вводять у клітину рослини в умовах ядерної геномної інтеграції. За таких умов послідовність химерної нуклеїнової кислоти стабільно інтегрується у геном рослини. 11 Ще в одному додатковому переважному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, оптимізована для використання рослинного кодона. Перевалені послідовності нуклеїнових кислот, що використовуються відповідно до даного винаходу, кодують людський, бичачий або свинячий аполіпопротеїн А-І і проаполіпопротеїн А-І. У наступному аспекті даний винахід відноситься до способу одержання насіння рослин, що містить аполіпопротеїн. Відповідно, розроблений відповідний до даного винаходу спосіб одержання насіння рослин, що передбачає (а) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, яка містить в 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти: (і) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах тканин рослин; і (іі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; (c) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, здатну давати насіння; і (d) одержання насіння вказаної рослини, де насіння включає аполіпопротеїн. Насіння можна використовувати для одержання популяції прогенних рослин, кожна з яких містить множину насіння, що експресує аполіпопротеїн. Даний винахід також відноситься до рослин, здатних давати насіння, що експресує аполіпопротеїн. У переважному варіанті здійснення винаходу рослини, здатні давати насіння, містять послідовність химерної нуклеїнової кислоти, що містить у 5'-3' напрямі транскрипції (a) першу послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у рослині, функціонально зв'язану з (b) другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну, де клітина містить аполіпопротеїн. У переважному варіанті здійснення послідовність химерної нуклеїнової кислоти інтегрована в ядерний геном рослини. У наступному переважному варіанті здійснення даного винаходу використовувана рослина являє собою рослину Arabidopsis, і в особливо переважному варіанті здійснення рослина являє собою сафлор красильний. Ще в одному аспекті даний винахід відноситься до насіння рослин, що експресує аполіпопротеїн. У переважному варіанті здійснення даного винаходу насіння рослини містить послідовність химерної нуклеїнової кислоти, що містить у 5'-3' напрямі транскрипції (a) першу послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у рослині, функціонально зв'язану з (b) другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну. Насіння являє собою джерело, звідки бажаний поліпептид аполіпопротеїну, який синтезований клітинами насіння, може бути екстрагований і одержаний у більш або менш чистому вигляді. Аполі 93853 12 попротеїн можна використовувати для лікування судинних захворювань. Інші відмітні особливості і переваги даного винаходу стануть очевидними з подальшого докладного опису. Однак, потрібно розуміти, що докладний опис і конкретні приклади, хоча і представляють переважні варіанти здійснення винаходу, наведені тільки як ілюстрація, оскільки фахівцям у даній галузі з даного докладного опису будуть очевидні різні зміни і модифікації, не відступаючи від суті і об'єму винаходу. Винахід тепер буде описаний у зв'язку з малюнками, на яких Фіг.1.(А). Послідовність нуклеотидів (SEQ ID NO: 1) і виведена послідовність амінокислот (SEQ ID NO: 2) аполіпопротеїну ΑΙ Homo sapiens (Apo ΑΙ) (люб'язно надана Dr. Norman Wong, Calgary Alberta) (інвентарний номер NM-000039). Виділені жирним шрифтом залишки представляють сигнальний пептид перед-послідовності, підкреслені залишки показують πpο-послідовність. (В). Послідовність нуклеотидів (SEQ ID NO: 3) і виведена послідовність амінокислот (SEQ ID NO: 4) природного варіанту Apo AIMilano (R173C). Залишки, позначені ліпідним шрифтом/кирилицею, представляють мутовану амінокислоту. (С) Послідовність нуклеотидів (SEQ ID NO: 5) і виведена послідовність амінокислот (SEQ ID NO: 6) природного варіанту Apo AI Paris (R151C). Залишки, позначені жирним шрифтом/кирилицею, представляють мутовану амінокислоту. Фіг.2. Схематичне зображення всіх бінарних конструкцій, створених для експресії аполіпопротеїну Apo AI у трансгенних рослинах Arabidopsis. (A) Конструкції, які направлені у цитозолі у рослинних клітинах. (В). Конструкції, які направлені у масляні тіла у рослинній клітині. (С). Конструкції, які направлені по секреторному шляху. (D і Е) Конструкції можуть містити додаткові послідовності KDEL для збереження в ендоплазматичній сітці. (D) Конструкції, що містять про-послідовність Apo AI або зрілу Apo AI. (E) Конструкції, які містять послідовність, що розщеплюється, для вивільнення pro-Apo AI або зрілого Apo AI. У підписі вказаний тип промотору, сигнального пептиду і кодуючої послідовності, які містяться у кожній конструкції. Фіг.3(А). Схематичне зображення стратегії клонування для GFP кодуючої області для використання в Apo AI-GFP трансляційних злитих конструкціях. Фіг.3(В). Схематичне зображення стратегії клонування для про- і зрілої кодуючих областей трансляційних злитих конструкцій Аро АІ і специфічного для насіння Аро AI-GFP. Фіг.3(С). Схематичне зображення стратегії клонування для створення бінарних векторів, що використовуються для трансформації клітин Agrobacterium ЕНА101 з метою специфічного для насіння направлення Аро AI-GFP у цитозолі і масляне тіло. Аро10 і Apo11, що містять зрілий і proApo AI-GFP, відповідно, направлені у цитозоль. Аро12 і Аро13, що містять про- і зрілий Аро AI-GFP злитий трансляційний білок, відповідно, націлювали у масляні тіла. 13 Фіг.3(D). Схематичне зображення стратегії клонування для створення бінарних векторів, що використовуються для трансформації клітин Agrobacterium ЕНА101 з метою специфічного для насіння націлювання Аро AI-GFP по секреторному шляху. Аро15 і Аро16, що містять зрілий і pro-Аро AI-GFP трансляційний злитий білок, відповідно, націлювали по секреторному шляху. Фіг.4(А). Схематичне зображення стратегії клонування для створення бінарних векторів, що використовуються для трансформації клітин Agrobacterium ЕНА101, для конститутивного цитозольного націлювання Аро AI-GFP. Аро17 і Аро18а, що містять зрілий і pro-Apo AI-GFP трансляційний злитий білок, відповідно, націлювали у цитозоль. Фіг.4(В). Схематичне зображення стратегії клонування для конститутивного націлювання Аро AI-GFP у цитозолі. Аро18b, що містить трансляційний злитий білок, націлювали у цитозоль. Фіг.5(А). Схематичне зображення стратегії клонування для про- і зрілої області кодування Аро АІ і конститутивної експресії Аро AI-GFP трансляційного злитого білка. Фіг.5(В). Схематичне зображення стратегії клонування для створення бінарних векторів, що використовуються для трансформації клітин Agrobacterium ЕНА101, для конститутивного націлювання Аро AI-GFP по секреторному шляху. Аро19 і Аро20, що містять зрілий і pro-Аро AI-GFP трансляційний злитий білок, відповідно, націлювали по секреторному шляху. Фіг.6. Схематичне зображення стратегії клонування для зрілої форми області кодування Аро АІ. Аро21 з метою специфічного для насіння націлювання у цитозоль, Аро23 з метою специфічного для насіння націлювання у масляні тіла, Аро25 з метою специфічного для насіння націлювання у масляні тіла і очищення з використанням послідовності, що розщеплюється, klip8 і Аро29 з метою специфічного для насіння націлювання по секреторному шляху. Фіг.7. Схематичне зображення стратегії клонування для проформи області кодування Аро АІ. Аро22 з метою специфічного для насіння націлюванняу цитозоль, Аро24 з метою специфічного для насіння націлювання у масляні тіла. Аро30 з метою специфічного для насіння націлювання у масляні тіла і Аро26 з метою специфічного для насіння націлювання у масляні тіла і очищення з використанням послідовності, що розщеплюється, klip8. Фіг.8(А). Схематичне зображення стратегії клонування для проформи області кодування Аро АІ з видаленими внутрішніми сайтами Xhol, що містить сигнальний пептид KDEL. Аро27 з метою специфічного для насіння націлювання у масляні тіла як злитий з олеозином у рамці зчитування. Обидва Аро31 і Аро35 направлені по секреторному шляху, разом з Аро31 і Аро35 злитими у рамці зчитування з антитілом D9 олеозину, і Аро35, накопичується в ендоплазматичній сітці завдяки сигнальному пептиду KDEL. Фіг.8(В). Схематичне зображення стратегії клонування для проформи області кодування Аро 93853 14 АІМіlano. Аро27М з метою специфічного для насіння націлювання Аро АІМіlano у масляні тіла як злитий у рамці зчитування з олеозином. Фіг.9. Схематичне зображення стратегії клонування для проформи області кодування Аро АІ з видаленими внутрішніми сайтами Xhol. Apo28, направлений у масляні тіла і здатний розщеплюватися по послідовності klip8, Аро32, який націлює Аро АІ по секреторному шляху, злитий у рамці зчитування з антитілом D9 олеозину. Фіг.10. Схематичне зображення стратегії клонування для про- і зрілої форм області кодування Аро АІ з видаленими внутрішніми сайтами Xhol, що містять додатковий Met залишок на початку області кодування. Аро34 (pro-Аро АІ) і Аро33 (зрілий Аро АІ), які направлені по секреторному шляху і злиті у рамці зчитування з антитілом D9 олеозину. Фіг.11. Схематичне зображення стратегії клонування для проформи області кодування Аро АІ з внутрішніми сайтами Xhol, що містить сигнальний пептид KDEL. Аро36, направлений по секреторному шляху і злитий у рамці зчитування з антитілом D9 олеозину, накопичується в ендоплазматичній сітці завдяки сигнальному пептиду KDEL. Фіг.12. Схематичне зображення стратегії клонування для про- і зрілої форм області кодування Аро АІ з видаленими внутрішніми сайтами Xhol, що містять додатковий Met залишок на початку області кодування і сигнальний пептид KDEL. Аро38 і Аро37, які направлені по секреторному шляху і злиті у рамці зчитування з антитілом D9 олеозину, накопичуються в ендоплазматичній сітці завдяки сигнальному пептиду KDEL. Фіг.13. Схематичне зображення стратегії клонування для про- і зрілої форм області кодування Аро АІ і протеазного сайту розщеплення. Аро43, Аро44, Аро39 і Аро40, направлені по секреторному шляху, злиті у рамці зчитування з антитілом D9 олеозину. Аро43 і Аро44 будуть накопичуватися в ендоплазматичній сітці завдяки сигнальному пептиду KDEL. Фіг.14. Схематичне зображення стратегії клонування для про- і зрілої форм області кодування Аро АІ, що містять додатковий Met залишок на початку області кодування і протеазний сайт розщеплення. Аро42, Аро46, Аро41 і Аро45 направлені по секреторному шляху, злиті у рамці зчитування з антитілом D9 олеозину. Аро46 і Аро45 будуть накопичуватися в ендоплазматичній сітці завдяки сигнальному пептиду KDEL. Фіг.15. Схематичне зображення стратегії клонування для зрілої форми області кодування Аро АІ, що містить додатковий Met залишок на початку області кодування і протеазний сайт розщеплення. Аро47 злитий у рамці зчитування з олеозином маїсу для націлювання у масляні тіла. Фіг.16. Вестерн-блоти для загального білка листя (А) (25мкг) і загального білка насіння (В) (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. Аро17 являє собою конструкцію ubimat-Apo AI-GFP. Білок листя (25мкг) і насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. 15 Фіг.17. Вестерн-блоти для загального білка листя (А) (25мкг) і загального білка насіння (В) (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. Аро 18а являє собою конструкцію ubi-pro-Apo AI-GFP. Білок листя (25мкг) і насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.18. Вестерн-блоти для загального білка листя (А) (25мкг) і загального білка насіння (В) (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. Аро19 являє собою конструкцію ubiPRS-mat-Apo AI-GFP. Білок листя (25мкг) і насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.19. Вестерн-блоти для загального білка листя (А) (25мкг) і загального білка насіння (В) (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. Аро20 являє собою конструкцію ubiPRS-pro-Apo AI-GFP. Білок листя (25мкг) і насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.20. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти GFP. (А) Аро 10 являє собою конструкцію pha-mat-Аро AI-GFP. (В) Apo11 являє собою конструкцію pha-pro-Apo AI-GFP. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 200нг очищеного білка GFP використовували як позитивний контроль. Фіг.21. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти GFP. (А) Аро 12 являє собою конструкцію pha-олеозин-mat-Apo AI-GFP. (В) Аро 13 являє собою конструкцію pha-олеозин-рrо-Аро AIGFP. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 200нг очищеного білка GFP використовували як позитивний контроль. Фіг.22. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти GFP. (А) Аро 15 являє собою конструкцію pha-PRS-mat-Apo AI-GFP. (В) Аро 16 являє собою конструкцію pha-PRS-pro-Apo AI-GFP. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 200нг очищеного білка GFP використовували як позитивний контроль. Фіг.23. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро21 являє собою конструкцію pha-mat-Apo ΑΙ. (В) Аро22 являє собою pha-pro-Apo ΑΙ. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.24. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро23 являє собою phaoleo-mat-Apo ΑΙ. (В) Аро24 являє собою pha-oleopro-Apo ΑΙ. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. 93853 16 Фіг.25. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро25 являє собою phaoleo-klip8-mat-Аро АІ(+Меt). (В) Аро26 являє собою pha-oleo-klip8-pro-Apo AI(+Met). Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.26. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро28 являє собою phaoleo-klip8-pro-Аро АІ. (В) Аро29 являє собою phaPRS-mat-Apo ΑΙ. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.27. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро30 являє собою phaPRS-pro-Apo ΑΙ. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.28. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро32 являє собою phaPRS-D9 scFv-pro-Apo ΑΙ. (Β) Аро33 являє собою pha-PRS-D9 scFv-mat-Apo AI (+met). Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.29. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро34 являє собою phaPRS-D9 scFv-pro-Apo AI(+met). (В) Аро35 являє собою pha-PRS-D9 scFv-mat-Apo AI KDEL. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.30. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро36 являє собою phaPRS-D9 scFv-pro-Apo AI-KDEL. (В) Аро37 являє собою pha-PRS-D9 scFv-mat-Apo AI(+met) KDEL. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.31. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро38 являє собою phaPRS-D9 scFv-pro-Apo AI(+met)-KDEL. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. (В) Аро29 являє собою pha-PRS-D9 scFv-klip8-Apo ΑΙ. Насіння дикого типу використовували як негативний контроль і 3мкг Аро АІ людини, одержаного зі звичайної плазми крові людини (US Biologicals) використовували як позитивний контроль. Фіг.32. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро40 являє собою phaPRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo ΑΙ. (Β) Αpο41 являє собою pha-PRS-D9 scFv-klip8-mat-Apo AI(+met). Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негатив 17 ний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.33. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро42 являє собою phaPRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI(+met). Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.34. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро44 являє собою phaPRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI-KDEL. (В) Аро45 являє собою pha-PRS-D9 scFv-klip8-mat-Apo AI(+met). Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.35. Вестерн-блоти для загального білка насіння (50мкг) з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ. (А) Аро46 являє собою phaPRS-D9 scFv-k!ip8-pro-Apo AI(+met)-KDEL. Білок насіння (50мкг) с24 використовували як негативний контроль і 0,5мкг білка сироватки крові людини використовували як позитивний контроль. Фіг.36. Дослідження асоціації ненаправленого і направленого у масляне тіло Аро AI-GFP зі специфічними клітинними фракціями насіння. Вестерн-блот аналіз з використанням поліклонального антитіла проти Аро АІ і приблизно рівних кількостей загального білка (50мкг), виділеного з водної фракції (AQ), фосфатних (PW) і сечовинних (UW) промивань масляного тіла (РО і UO, відповідно, з використаними приблизно 20мкг загальних масляних тіл) і мікросомальної (ER) фракції зі зрілого насіння. Забарвлювання імуноблоту за допомогою Ponceau-S показує відносні кількості білка, навантажені на гель (верхня панель). Сироватку крові людини (0,5мкг) використовували як позитивний контроль для експресії Аро АІ. (А) Аро10 являє собою Аро AI-GFP. Apo11 являє собою pro-Apo AIGFP. (В) Аро12 являє собою олеозин-Аро AI-GFP і Аро13 являє собою олеозин-pro-Apo AI-GFP. Фіг.37. Дослідження асоціації такого, що секретується, про- і зрілого Аро AI-GFP зі специфічними клітинними фракціями насіння. Вестерн-блот аналіз з використанням анти-Аро АІ антитіла і приблизно рівних кількостей загального білка (50мкг), виділеного з водної фракції (AQ), фосфатних (PW) і сечовинних (UW) промивань масляного тіла (РО і UO, відповідно, з використаними приблизно 20мкг загальних масляних тіл) і мікросомальної (ER) фракції зі зрілого насіння. Забарвлювання імуноблоту за допомогою Ponceau-S показує відносні кількості білка, навантажені на гель (верхня панель). Сироватку крові людини (0,5мкг) використовували як позитивний контроль для експресії Аро АІ. Аро 15 являє собою PRS-Apo AI-GFP. Аро 16 являє собою PRS-pro-Apo AI-GFP. Фіг.38. Конститутивна експресія Аро AI-GFP трансляційних злитих конструкцій у листі. Вестернблот аналіз з використанням анти-GFP антитіла і приблизно рівних кількостей загального білка (50мкг), виділеного з листя. Забарвлювання імуноблоту за допомогою Ponceau-S показує відносні 93853 18 кількості білка, навантажені на гель (верхня панель). Рослини дикого типу (с24) використовували як негативний контроль для експресії GFP. Очищений білок GFP (200нг) використовували як позитивний контроль для експресії GFP. UG-14 і UR2 включені як позитивний контроль накопичення білка GFP у листі. Очікувана маса наступна: Аро17=55,4кДа; Аро18=56,4кДа; Аро19=58,3кДа; Аро20=59,3кДа; UG-14=26,8кДа; UR2=50кДа. Фіг.39. Специфічна для насіння експресія ненаправленого і секретованого Аро АІ у насінні. Вестерн-блот аналіз з використанням анти-Аро АІ антитіла і приблизно рівних кількостей загального білка (50мкг), виділеного зі зрілого насіння. Забарвлювання імуноблоту за допомогою Ponceau-S показує відносні кількості білка, навантажені на гель (верхня панель). Рослини дикого типу (с24) використовували як негативний контроль для експресії Аро АІ. Сироватку крові людини (0,5мкг) використовували як позитивний контроль для експресії Аро АІ. Очікувана маса наступна: Аро21=28,3кДа; Аро22=29,32кДа; Аро23=46,9кДа; Аро24=47,8кДа; Аро25=51,5кДа; Аро26=52,5кДа; Аро27=51,3кДа; Аро28=52,3кДа; Аро29=31,3кДа; Аро30=32,2кДа. Фіг.40. Дослідження субклітинних фракцій Аро22-3 (ненаправлений рrо-Аро АІ) Т3 генерації насіння. Вестерн-блот аналіз з використанням анти-Аро АІ антитіла і приблизно рівних кількостей загального білка (50мкг), виділеного з водної фракції (AQ), фосфатних (PW) і сечовинних (UW) промивань масляного тіла (РО і UO, відповідно, з використаними приблизно 20мкг загальних масляних тіл) зі зрілого насіння. Забарвлювання імуноблоту за допомогою Ponceau-S показує відносні кількості білка, навантажені на гель (верхня панель). Для експресії Аро АІ як позитивний контроль використовували сироватку крові людини (0,5мкг). Величина молекулярної масивказана зліва. Фіг.41. Конфокальні мікрографії специфічних для насіння конструкцій Аро AI-GFP у пізній сім'ядольній стадії ембріональних клітин, забарвлених Nile червоним. (А-С) Аро 10 являє собою ненаправлений зрілий Аро АІ, злитий з GFP. (D-F) Аро 11 являє собою ненаправлений рrо-Аро АІ, злитий з GFP. (G-I) Аро12 являє собою зрілий Аро АІ, злитий з GFP, направлений у масляні тіла з використанням молеозину. (Колонка 1) Зелений канал. (Колонка 2) Червоний канал. (Колонка 3) Канали, що злилися. Смуга=5мкм. Фіг.42. Конфокальні мікрографії специфічних для насіння конструкцій Аро AI-GFP у пізній сім'ядольній стадії ембріональних клітин, забарвлених Nile червоним. (А-С) Аро13 являє собою рrо-Аро АІ, злитий з GFP, направлений у масляні тіла з використанням олеозину. (D-F) Аро 15 являє собою зрілий Аро АІ, злитий з GFP, направлений у секреторний шлях. (G-I) Аро 16 являє собою proАро АІ, злитий з GFP, направлений у секреторний шлях. (Колонка 1) Зелений канал. (Колонка 2) Червоний канал. (Колонка 3) Канали, що злилися. Смуга=5мкм. Фіг.43. Конфокальні мікрографії конститутивно експресованого ненаправленого і секретованого Аро AI-GFP у пізній сім'ядольній стадії ембріона 19 льних клітин, забарвлених Nile червоним. (А-С) Аро17 являє собою ненаправлений зрілий Аро АІ, злитий з GFP. (D-F) Аро18 являє собою ненаправлений pro-Apo АІ, злитий з GFP. (G-H) Аро19 являє собою зрілий Аро АІ, злитий з GFP, направлений у секреторний шлях. (J-L) Аро20 являє собою рrоАро АІ, злитий з GFP і направлений у секреторний шлях. (Колонка 1) Зелений канал. (Колонка 2) Червоний канал. (Колонка 3) Канали, що злилися. Смуга=5мкм. Фіг.44. Конфокальні мікрографії Аро AI-GFP конститутивних конструкцій, експресованих в епідермальних клітинах листя. (А-С) Аро17 являє собою ненаправлений зрілий Аро АІ, злитий з GFP. (D-F) Аро18 являє собою ненаправлений рrоАро АІ, злитий з GFP. (G-H) Аро 19 являє собою зрілий Аро АІ, злитий з GFP, направлений у секреторний шлях. (J-L) Аро20 являє собою рrо-Аро АІ, злитий з GFP і направлений у секреторний шлях. (Колонка 1) Зелений канал. (Колонка 2) Червоний канал. (Колонка 3) Канали, що злилися. Смуга=5мкм. Фіг.45. Очищення Аро25, Аро26 і Аро28 хроматографією з оберненою фазою. (А) ВЕРХ контур стандарту Аро АІ. (В) ВЕРХ контур Аро25. (С) ВЕРХ контур Аро26. (D) ВЕРХ контур Аро28. Окремі використані довжини хвиль включали 214, 254, 280 і 326нм. Як зазначено раніше, даний винахід відноситься до способів продукування аполіпопротеїну у трансгенних рослинах. У даному винаході несподівано було встановлено, що продукування аполіпопротеїнів у рослинах не тільки реально здійсненне, але також має істотні переваги у порівнянні з загальноприйнятими методологіями. Вихідні матеріали для продукування на основі рослин є більш стабільними, зокрема, оскільки білок продукується у насінні рослин і, більш того, воно не містить бактеріальних ендотоксинів. Таким чином, даний винахід забезпечує безпечне джерело для виробництва аполіпопротеїнів. Також було виявлено, що рекомбінантна експресія аполіпопротеїну може давати природний аполіпопротеїн у більш або менш чистому вигляді на рівнях, які дають можливість виробництва аполіпопротеїнів у комерційному масштабі. Відповідно, згідно з даним винаходом розроблений спосіб експресії послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн у рослинах, де спосіб передбачає: (a) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, що містить у 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти: (і) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах рослин; і (іі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; і (c) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, що експресує аполіпопротеїн. У даному винаході було встановлено, що високі рівні експресії аполіпопротеїну можуть досягатися шляхом експресії рекомбінантного білка у насінні рослин. Відповідно, даний винахід відно 93853 20 ситься до способу експресії аполіпопротеїну у насінні рослин, що передбачає: (a) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, що містить у 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти: (і) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах насіння рослин; і (іі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; і (c) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, здатну давати насіння, де насіння експресує аполіпопротеїн. Терміни і визначення Якщо не вказано інакше, всі технічні і наукові терміни, використані у даному описі, мають ті ж самі значення, як це звичайно розуміється фахівцем у даній галузі, до якої належить винахід. Де це припустимо, всі патенти, заявки, опубліковані заявки та інші публікації, включаючи послідовності нуклеїнових кислот і поліпептидів з GenBank, SwissPro та інших баз даних, що згадуються у даному описі, включені шляхом посилання у всій своїй повноті. Термін «послідовність нуклеїнової кислоти», як він використаний у даному описі, відноситься до послідовності нуклеозидів або нуклеотидних мономерів, що складається з природних основ, цукру і міжцукрових (скелетних) зв'язувальних фрагментів. Термін також включає модифіковані або заміщені послідовності, які містять не існуючі у природі мономери або їх частини. Послідовності нуклеїнових кислот за даним винаходом можуть являти собою послідовності дезоксирибонуклеїнових кислот (ДНК) або послідовності рибонуклеїнових кислот (РНК) і можуть містити природні основи, включаючи аденін, гуанін, цитозин, тимідин і урацил. Послідовності можуть також містити модифіковані основи, включаючи аза- і деаза-аденін, гуанін, цитозин, тимідин і урацил; і ксантин і гіпоксантин. Терміни «послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн» і «послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну», які у даному описі можуть використовуватися взаємозамінно, відносяться до будь-яких і до всіх послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують поліпептид аполіпопротеїну, включаючи будь-який поліпептид аполіпопротеїну ссавця, і до будь-яких послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують про-аполіпопротеїн і пре-про-аполіпопротеїн. Як використано у даному описі, термін «проаполіпопротеїн» відноситься до поліпептиду аполіпопротеїну, який включає поліпептид, що відщеплюється після трансляції. У природному аполіпопротеїні людини πpο-пептид складається з поліпептидного ланцюга, що включає 6 залишків амінокислот. Термін «пре-про-аполіпопротеїн» відноситься до молекули про-аполіпопротеїну, що додатково містить N-кінцеву сигнальну послідовність, яка полегшує внутрішньоклітинний транспорт поліпептидного ланцюга. Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують поліпептид аполіпопротеїну, додатково містять будь-які і всі 21 послідовності нуклеїнових кислот, які (і) кодують поліпептиди, що по суті ідентичні вказаним у даному описі послідовностям поліпептидів аполіпопротеїну; або (іі) гібридизуються з будь-якими вказаними у даному описі послідовностями нуклеїнових кислот щонайменше при помірно строгих умовах гібридизації, або які будуть гібридизуватися з ними при помірно строгих умовах гібридизації, але для застосування синонімічних кодонів. Під терміном «по суті ідентичний» мається на увазі, що дві послідовності поліпептидів переважно щонайменше на 70% ідентичні, більш переважно щонайменше на 85% ідентичні і найбільш переважно щонайменше на 95% ідентичні, наприклад, ідентичні на 96%, 97%, 98% або 99%. Для визначення процента ідентичності між двома поліпептидними послідовностями, послідовності амінокислот у цих двох послідовностях вистроюють у ряд, використовуючи, наприклад, вирівнюючий метод Needleman і Wunsch (J. Моl. Віоl., 1970, 48: 443), модифікований Smith і Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482), так що одержують найбільш високий порядок зіставлення між двома послідовностями і визначають число ідентичних амінокислот у двох послідовностях. Способи розрахунку процента ідентичності двох послідовностей амінокислот загальноприйняті у даній галузі і включають, наприклад, методи, описані Саrіllо і Lipton (SIAM J. Applied Math., 1988, 48: 1073), і методи, описані в Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects. Звичайно, для таких розрахунків будуть використовуватися комп'ютерні програми. Комп'ютерні програми, які можна використовувати для даних цілей, включають, але не обмежуються вказаним, GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387) BLASTP, BLASTN і FASTA (Altschul et al., J. Molec. Biol., 1990: 215: 403). Особливо переважний метод визначення процента ідентичності між двома поліпептидами включає алгоритм Clustal W. (Thompson, J.D., Higgines, D.G. and Gibson T.J., 1994, Nucleic Acid Res 22 (22): 4673-4680) разом з матрицею обчислення BLOSUM 62 (Henikoff S. & Henikoff, J.G., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1091510919), з використанням інтервалу, що відкриває помилку, який дорівнює 10, та інтервалу розширення помилки, який дорівнює 0,1, так що одержують найбільш високий порядок зіставлення двох послідовностей, де щонайменше 50% загальної довжини однієї з двох послідовностей включено у вирівнювання. Під терміном «щонайменше помірно строгі умови гібридизації» мається на увазі, що вибирають умови, які промотують селективну гібридизацію між двома комплементарними молекулами нуклеїнових кислот у розчині. Гібридизація може відбуватися для всієї або для частини молекули послідовності нуклеїнової кислоти. Гібридизована частина звичайно складає щонайменше 15 (наприклад, 20, 25, 30, 40 або 50) нуклеотидів у довжину. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що стабільність здвоєних нуклеїнових кислот, або гібридів, визначається за допомогою величини Тт, 93853 22 яка в натрій-вмісних буферах є функцією концентрації іонів натрію і температури (Tm=81,5°C-16,6 (Log10[Na+])+0,41 (%(G+C)-600/1), або аналогічне рівняння). Відповідно, параметри умов промивання, які визначають стабільність гібрида, являють собою концентрацію іона натрію і температуру. Для того, щоб ідентифікувати молекули, які є подібними, але не ідентичними, для відомої молекули нуклеїнової кислоти можна допустити 1% невідповідності, що приводить до зниження Тm приблизно на 1°С; наприклад, якщо передбачається, що молекули нуклеїнових кислот мають >95% ідентичність, кінцева температура промивання буде знижена приблизно на 5°С. На основі цих міркувань фахівці у даній галузі легко виберуть відповідні умови гібридизації. У переважних варіантах здійснення вибирають строгі умови гібридизації. Як приклад, для досягнення строгої гібридизації можна використовувати наступні умови: гібридизація при 5× хлорид натрію/цитрат натрію (SSC)/5×розчин Денхардта (Denhardt)/1,0% SDS при Тm (на основі згаданого вище рівняння -5°С, з подальшим промиванням з використанням 0,2×SSC/0,1% SDS при 60°С. Помірно строгі умови гібридизації включають стадію промивання в 3×SSC при 42°С. Однак потрібно розуміти, що еквівалентна точність може досягатися з використанням альтернативних буферів, солей і температури. Додаткові вказівки, що стосуються умов гібридизації можна знайти в: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1.-6.3.6; і в: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol.3. Як використано у даному описі, терміни «аполіпопротеїн» і «поліпептид аполіпопротеїну» відносяться до будь-якої і до всіх поліпептидних послідовностей аполіпопротеїну, включаючи всі поліпептиди аполіпопротеїну ссавців і поліпептид, що містить послідовність залишків амінокислот, яка (і) по суті ідентична послідовностям амінокислот, що складають будь-які поліпептиди аполіпротеїну, вказані у даному описі, або (іі) кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, здатною до гібридизації в, щонайменше, відносно строгих умовах з будь-якою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, наведеною у даному описі або здатною до гібридизації в, щонайменше, помірно строгих умовах з будь-якою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, наведеною у даному описі, але для використання синонімічних кодонів. Терміни «аполіпопротеїн» і «поліпептид аполіпопротеїну» включають поліпептиди про-аполіпопротеїну. Поліпептиди аполіпопротеїну переважно мають людське, свиняче і бичаче походження. У переважних варіантах здійснення дані аполіпопротеїни включають, але не обмежуються вказаним, аполіпопротеїн А-І (Аро АІ), аполіпопротеїн A-IV (Apo AIV), аполіпопротеїн A-V (Apo AV) і аполіпопротеїн Ε (Аро Ε). Термін «химерний», як він використаний у даному описі у контексті послідовностей нуклеїнових кислот, відноситься до, щонайменше, двох зв'язаних послідовностей нуклеїнових кислот, які не зв'язані за природою. Химерні послідовності нук 23 леїнових кислот, включають зв'язані послідовності нуклеїнових кислот різного природного походження. Наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, що складає рослинний промотор, зв'язана з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн людини, розглядається як химерна. Химерні послідовності нуклеїнових кислот також можуть містити послідовності нуклеїнових кислот одного і того ж природного походження за умови, що вони не є природно зв'язаними. Наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, що складає промотор, одержана від конкретного типу клітини, може бути зв'язана з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, одержаний від того ж клітинного типу, але звичайно не зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти, що складає промотор. Химерні послідовності нуклеїнових кислот також включають послідовності нуклеїнових кислот, що містять будь-яку природно існуючу послідовність нуклеїнової кислоти, зв'язану з будь-якою не існуючою у природі послідовністю нуклеїнової кислоти. Одержання рекомбінантних векторів експресії, що містять послідовності химерних нуклеїнових кислот, що кодують аполіпопротеїн, і послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у рослинній клітині Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують аполіпопротеїн, які можуть використовуватися відповідно до способів і композицій, розроблених у даному винаході, можуть являти собою будь-яку послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну, включаючи будь-який про-аполіпопротеїн і перед-про-аполіпопротеїн. Існує ряд різних аполіпопротеїнів, які виявлені у плазмі крові людини, і вони можуть діяти як сигнали, які викликають дію ліпопротеїнів на визначені тканини або активують ферменти, які діють на дані ліпопротеїни (Lehninger, A. et al. Principles of Biochemistry, друге видання, New York, Worth Publishers, 1993). Дані білки включають, але не обмежуються вказаним, алелі та ізоформи аполіпопротеїну А-І (Аро АІ) (див., наприклад, Sharpe CR et al., Nucleic Acids Res. 12 (9), 3917-3932 (1984)), Apo All (див., наприклад, Sharpe CR et al., Nucleic Acids Res. 12 (9), 3917-3932 (1984)), Apo AIV (див., наприклад, Elshourbagy N.A. et al, J. Biol. Chem. 261 (5), 1998-2002 (1986)), Apo AV (див., наприклад, Hubacek et al., Physiol. Res. 2004, 53: 225-228), Apo B-100 (див., наприклад, Law S.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (21), 8142-8146 (1986)), Apo B-48 (див., наприклад, Powell L.M. et al., Cell 50(6), 831-840 (1987)), Apo C-II (див., наприклад, Sharpe CR. et al., Nucleic Acids Res. 12(9), 3917-3932 (1984)), Apo C-III (див., наприклад, Sharpe CR. et al., Nucleic Acids Res. 12(9), 39173932 (1984)), Apo C-IV (див., наприклад, Allan CM. et al., Genomics 28(2), 291-300 (1995)), Apo D (Drayna D. et al. J. Biol. Chem. 261(35), 1653516539 (1986)), Apo Ε (див., наприклад, Brewslow J.L. et al., J. Biol. Chem. 257(24), 14639-14641 (1982)), Apo F (див., наприклад, Day J.R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 203 (2), 11461151 (1994)), Apo Η (див., наприклад, Mehdi, Η., et al., Gene 108(2), 293-298 (1991) і Apo L (див., наприклад, Duchateau, P. N., et al., J. Biol. Chem. 93853 24 272(41), 25576-25582 (1997)). Ілюстративні послідовності нуклеїнових кислот, що кодують аполіпопротеїн, добре відомі у даній галузі і звичайно легко доступні з множини різних джерел, що мають походження від ссавців, включаючи людину (див. вище), свиню (див., наприклад, Trieu V.N. et al., Gene 134(2), 267-270 (1993)), бика (див., наприклад, Yang, Y. W., et al. J. Моl. Evol. 32(6), 469-475 (1991)), вівцю (див., наприклад, Robertson, J. A. et al., J. Steroid Biochem. Моl. Biol. 67(4), 285-292 (1998)) і тому подібні. Послідовності, що кодують аполіпопротеїн людини, які можна використовувати, включають ті, що кодують поліпептидні ланцюги, які вказані як послідовності, представлені SEQ ID NO: 1, 7 і 8. Додаткові послідовності, що кодують аполіпопротеїн, який не є аполіпопротеїном людини, які можна використовувати відповідно до даного винаходу, вказані як послідовності, представлені SEQ ID NO: 9-55 і 241-251. Відповідні послідовності нуклеїнових кислот, що кодують поліпептидні ланцюги аполіпопротеїну, легко можуть бути ідентифіковані за допомогою каталожних ідентифікаційних номерів, наведених у таблиці 1. З використанням даних послідовностей нуклеїнових кислот за допомогою методів, відомих фахівцям у даній галузі, легко можна ідентифікувати додаткові нові послідовності нуклеїнових кислот, що кодують аполіпопротеїн. Наприклад, можна провести скринінг бібліотек, таких як бібліотеки експресії, кДНК і геномні бібліотеки, і можна провести пошук по базах даних, що містять інформацію про послідовності по проектах секвенування. Можна використовувати альтернативні способи виділення додаткових послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують поліпептиди аполіпопротеїну, і нові послідовності можуть бути відкриті і використані відповідно до даного винаходу. У переважних варіантах здійснення послідовності нуклеїнових кислот, що кодують аполіпопротеїн, являють собою аполіпопротеїн людини, свині і бика. Відповідно до попереднього рівня даної галузі відомі численні аналоги аполіпопротеїну (див., наприклад, Cheung Μ.С. et al., Biochim Biophys Acta. 1988 May 2; 960(1): 73-82 і Strobl W. et al., Pediatr Res. 1988 Aug.; 24 (2): 222-8), і вони можуть використовуватися відповідно до даного винаходу. Аналоги, які можна використовувати, включають молекули аполіпопротеїну людини, де була відкрита множина природних і синтетичних мутацій і модифікацій, включаючи, але не обмежуючись вказаним, точкові мутації, мутації з делецією, мутації зі зсувом рамки зчитування і хімічні модифікації. Відповідно до даного винаходу у переважному варіанті здійснення використовується природний варіант, відомий як Аро АІ-М. Приклади мутацій і модифікацій, які можна використовувати відповідно до даного винаходу, включають, але не обмежуються вказаним, ті, які наведені у таблиці 2. У переважних варіантах здійснення використовувана послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує аполіпопротеїн, являє собою проаполіпопротеїн. Для одержання аналогів аполіпопротеїну зміни у послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує 25 аполіпопротеїн, можуть бути зроблені з використанням множини способів модифікації нуклеїнових кислот, відомих фахівцям у даній галузі, включаючи, наприклад, сайт-направлений мутагенез, направлений мутагенез, випадковий мутагенез, додання органічних розчинників, генне тасування або поєднання даних або інших способів, відомих фахівцям у даній галузі (Shraishi et al., 1988, Arch. Biochem. Biophys, 358: 104-115; Gallon et al.. 1997, Protein Eng. 10: 687-690; Carago et al., 1997, Proteins 28: 10-28; Hurley et al., 1996, Biochem., 35: 5670-5678; Holmberg et al., 1999, Protein Eng. 12: 851-856). Відповідно до викладеного, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, зв'язана з послідовністю нуклеїнової кислоти, здатною контролювати експресію поліпептиду аполіпопротеїну у рослинній клітині. Відповідно, даний винахід також відноситься до послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, зв'язаної з промотором, здатним контролювати експресію у рослинній клітині. Послідовності нуклеїнових кислот, здатні контролювати експресію у клітинах рослин, які можна використовувати у даному винаході, включають будь-який, одержаний з рослини промотор, здатний контролювати експресію поліпептидів у рослинах. Звичайно, будуть використовуватися промотори, одержані з видів дводольних рослин, коли дводольна рослина вибрана відповідно до винаходу, хоча промотор однодольної рослини буде використовуватися, коли вибирають рослину однодольних видів. В одному варіанті здійснення використовується промотор, який приводить до експресії поліпептиду аполіпопротеїну у цілій рослині. Конститутивні промотори, які можуть використовуватися, включають, наприклад, промотор 35S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) (Rothstein et al., 1987, Gene 53: 153-161), актиновий промотор рису (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163-171; патент США 6429357), убіквітиновий промотор, такий як убіквітиновий промотор кукурудзи (патенти США 5879903; 5273894), і убіквітиновий промотор петрушки (Kawalleck, P. et al., 1993, Plant Моl. Biol. 21: 673-684). В особливо переважних варіантах здійснення даного винаходу аполіпопротеїн продукується у насінні рослин. Продукування у насінні рослин дає гнучкість зберігання і перевезення аполіпопротеїну у вигляді сирого матеріалу, оскільки аполіпопротеїн зберігає свою активність при екстракції з насіння, що зберігається. Крім того, кількість біомаси, яку необхідно піддавати екстракції, обмежується завдяки відносно низькому вмісту води, присутньому у насінні. Відповідно, у переважному варіанті здійснення даного винаходу клітина рослини являє собою клітину насіння і рослину вирощують у зрілу рослину, здатну давати насіння, де насіння експресує аполіпопротеїн. У наступному переважному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти, здатна контролювати експресію у рослинній клітині, являє собою переважний для насіння промотор, такий як фазеоліновий промотор. У такому варіанті здійснення використовують промотор, який приводить до переважної експресії поліпептиду аполіпопротеїну у тканині насіння. Термін 93853 26 «переважні для насіння промотори» у даному відношенні відноситься до промоторів, які контролюють експресію рекомбінантного білка (тобто аполіпопротеїну) таким чином, що переважно щонайменше 80% загальної кількості рекомбінантного білка, присутньої у зрілій рослині, знаходиться у насінні. Більш переважно, щонайменше 90% загальної кількості рекомбінантного білка, присутньої у зрілій рослині, знаходиться у насінні. Найбільш переважно, щонайменше 95% загальної кількості рекомбінантного білка, присутньої у зрілій рослині, знаходиться у насінні. Переважні для насіння промотори, які можна використовувати у даному відношенні, включають, наприклад, фазеоліновий промотор бобів (Sengupta-Gopalan et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3320-3324); олеозиновий промотор Arabidopsis масою 18кДа (патент США 5792922) або олеозиновий промотор льону (WO 01/16340); легуміно-подібний промотор запасаючого білка льону (линин) (WO 01/16340); промотор запасаючого білка 2S льону (WO 01/16340); і ендосперм-переважний промотор, такий як промотор Amy32b (Rogers and Milliman, J. Biol. Chem., 1984, 259: 12234-12240), промотор Amy6-4 (Kursheed and Rogers, J. Biol. Chem., 1988, 263: 18953-18960) або промотор Алеураїну (Aleurain) (Whittier et al., 1987, Nucleic Acids Res., 15: 2515-2535) або арцеліновий промотор бобів (Jaeger GD, et al., 2002, Nat.Biotechnol. Dec; 20: 1265-8). Постійно відкриваються нові промотори, що використовуються у багатьох рослинах. Численні приклади рослинних промоторів можна знайти у публікації Ohamuro et al. (Biochem. of Pints., 1989, 15: 1-82). У переважних варіантах здійснення даного винаходу послідовність химерної нуклеїнової кислоти додатково містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує стабілізуючий поліпептид, зв'язаний у рамці зчитування з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн. Стабілізуючий поліпептид використовується для полегшення складання білка і/або посилення стабільного накопичення аполіпопротеїну у клітинах рослин. Додатково стабілізуючий поліпептид можна використовувати для націлювання у бажане місцеположення у клітині рослини і/або полегшення очищення аполіпопротеїну. Переважно стабілізуючий поліпептид являє собою поліпептид, який за відсутності аполіпопротеїну легко може експресуватися і стабільно накопичується у клітинах трансгенних рослин. Стабілізуючий поліпептид може являти собою рослино-специфічний або рослинонеспецифічний поліпептид. Рослино-специфічні стабілізуючі поліпептиди, які можна використовувати відповідно до даного винаходу, включають білки масляного тіла (див. нижче) і тіоредоксини, наприклад, тіоредоксин. представлений SEQ ID NO: 56. Рослино-неспецифічні стабілізуючі поліпептиди, які можна використовувати відповідно до вказаного у даному описі, включають зелений флуоресцентний білок (GFP) (Davis and Vierstra, 1996, Weeds World 3 (2): 43-48) (SEQ ID NO: 57) і одноланцюжкові антитіла або їх фрагменти. Переважно рослино-неспецифічні стабілізуючі поліпеп 27 тиди являють собою кодон, оптимізований для оптимальної експресії у рослинах. Одноланцюжкові антитіла або антитіла, які переважно використовуються у даному винаході, включають одноланцюжкові антитіла або їх фрагменти, які полегшують очищення аполіпопротеїну. Відповідно до цього, наприклад, можна використовувати одноланцюжкове антитіло або його фрагмент, що здатне до специфічної асоціації з масляним тілом або білком масляного тіла, що дає можливість співочищення аполіпопротеїну з фракцією масляного тіла, де фракція масляного тіла легко може бути одержана з насіння рослин. Переважно одноланцюжкове антитіло здатне до асоціації з білком масляного тіла, що одержують з насіння, в якому експресується аполіпопротеїн, тобто у варіанті здійснення винаходу, в якому використовуються клітини рослини Arabidopsis, вибирають одноланцюжкове антитіло або його фрагмент, здатне до асоціації з білком масляного тіла Arabidopsis. У наступному переваленому варіанті здійснення одноланцюжкове антитіло являє собою одноланцюжкове антитіло Fv, здатне специфічно утворювати асоціати з олеозином, одержаним з Arabidopsis thalania, масою 18кДа (D9scFv). У найбільш переважному варіанті здійснення одноланцюжкове антитіло представлене послідовністю SEQ ID NO: 240. Термін «фрагмент одноланцюжкового антитіла» (scFv) або «фрагмент антитіла», як він використаний у даному описі, означає поліпептид, що містить варіабельний домен легкого ланцюга (VL), зв'язаний з варіабельним доменом важкого ланцюга (VH) пептидним лінкером (L), представлений як VL-L-VH. Порядок доменів VL і VH може бути зворотним для одержання поліпептидів, представлених як VH-L-VL. «Домен» (область) являє собою сегмент білка, який виконує окрему функцію, таку як зв'язування антигену або розпізнавання антигену. Фрагменти одноланцюжкових антитіл для використання у даному винаході можуть бути одержані з варіабельних областей легкого і/або важкого ланцюга будь-якого антитіла. Переважно варіабельні області легкого і важкого ланцюгів є специфічними відносно одного і того ж антигену. Найбільш переважно, антиген являє собою білок масляного тіла. Фрагменти індивідуального антитіла, які зв'язані з утворенням мультивалентного одноланцюжкового антитіла, можуть бути направлені проти одного і того ж антигену або можуть бути направлені проти різних антигенів. Методології створення одноланцюжкових антитіл добре відомі у даній галузі. Наприклад, одноланцюжкові антитіла можуть бути створені шляхом скринінгу одноланцюжкових (scFv) бібліотек фагового дисплея. Методології створення одноланцюжкових антитіл з бібліотек фагового дисплея добре відомі у даній галузі. McCarrerty et al. (Nature 348: 552-554) продемонстрував застосування системи фагового дисплея, в якій фрагменти антитіл експресувалися у вигляді злитого білка з вектором fd фагу, даючи можливість експресії одноланцюжкових антитіл на поверхні фагу. Продукування бібліотеки фагового дисплея одноланцюжкового антитіла може досягатися з використанням, наприклад, системи реком 93853 28 бінантного фагового антитіла (Recombinant Phage Antibody System), розробленої Amersham Biosciences і Cambridge Antibody Technology. Більш докладний протокол доступний від Amersham Biosciences, який продається у вигляді 3 частин, включаючи молекулу мишачого scFV, модуль експресії і модуль виявлення. Коротко, протокол продукування одноланцюжкових антитіл полягає у наступному. Месенджерна РНК може бути одержана або з гібридоми миші, або з клітин селезінки миші, одержаної від миші, імунізованої антигеном, що представляє інтерес. Мишача гібридома являє собою найбільш багате джерело гена антитіла для клонування, оскільки вона експресує гени важкого і легкого ланцюгів для окремого антитіла, але антитіла також можуть бути клоновані з використанням клітин селезінки від імунізованої миші. мРНК перетворюють у кДНК з використанням зворотної транскриптази і вибраних навздогад гексамерних праймерів. Застосування випадкових гексамерів буде приводити до молекул кДНК, які достатні за довжиною для клонування варіабельних областей молекул важкого і легкого ланцюгів. Після створення молекул кДНК проводять первинні ПЛР реакції для ампліфікації окремо важкої і легкої варіабельних областей. Праймери розробляють для ампліфікації варіабельних областей важкого або легкого ланцюга шляхом гібридизації протилежних кінців ланцюга. Після ампліфікації варіабельних областей ПЛР реакції піддають електрофорезу на агарозному гелі і очищають на гелі для видалення праймерів і будь-яких сторонніх ПЛР продуктів. Після очищення варіабельних областей важкого і легкого ланцюга їх збирають в єдиний ген з використанням лінкеру. Область лінкеру конструюється таким чином, щоб гарантувати те, що підтримується коректна рамка зчитування між важким і легким ланцюгами. Наприклад, варіабельний важкий (VH) і варіабельний легкий (VL) ланцюги можуть бути зв'язані з використанням лінкеру (Gly4Ser3) для одержання фрагмента одноланцюжкового антитіла (scFv), що має у довжину приблизно 750 пар основ. Після того, як важкий і легкий ланцюги зібрані разом за допомогою лінкеру, проводять другу ПЛР реакцію для ампліфікації scFv фрагментів ДНК. Для введення сайтів рестрикції повинні бути розроблені праймери, щоб дати можливість клонування у фагомідні вектори експресії. Наприклад, сайти Sfil і NotI можуть бути додані в 5' і 3' кінці даного scFv гена для клонування у вектор pCANTAB 5 Ε (Amersham Biosciences). Після завершення ПЛР, фрагменти ДНК повинні бути очищені для видалення не введених праймерів і dNTP. Це може бути здійснено з використанням очищення на скрученій колонці. Після того як фрагменти ДНК були очищені і оцінені кількісно, фрагменти розщеплюють з використанням відповідних рестрикційних ферментів, щоб мати можливість клонування у відповідний вектор експресії. Фрагменти ДНК згодом лігують у вектор експресії, наприклад, pCANTAB 5 Ε (Amersham Biosciences) і вводять у відповідні клітини Е.соіі. Клітини потрібно вирощувати на відповідному селекційному середовищі, щоб гарантувати, що будуть рости тільки клітини, 29 що містять вектор експресії (тобто з використанням визначеного джерела вуглецю і селекції за антибіотиком). Після вирощування клітин Е.соіі, фагомід-вмісні колонії інфікують хелперним фагом М13 (тобто КО7 - Amersham Biosciences), одержуючи рекомбінантний фаг, який відображає фрагменти scFv. Фаг М13 буде ініціювати реплікацію фагу, і повні частинки фагів будуть продукуватися і вивільнятися з клітин, експресуючи різновиди scFv на їх поверхні. Фагове відображення коректних антитіл scFv ідентифікують шляхом пенінгу з використанням специфічного антигену. Для виключення неспецифічного фагу культура рекомбінантного фагу може бути перенесена на покриту антигеном підкладку (тобто колбу або пробірку) і промита. Тільки фаги, що відображають коректний scFv, будуть зв'язуватися з підкладкою. Сприйнятливий штам Е.соlі згодом інфікують фагом, зв'язаним з покритою антигеном підкладкою. Фаг може бути збагачений «порятунком» за допомогою хелперного фагу і з подальшим багаторазовим пенінгом проти антигену, або він може бути безпосередньо розміщений на твердому середовищі без додаткового збагачення. Розміщують клітини Е.соlі, які були інфіковані фагом, відібрані відносно відповідного антигену, і збирають індивідуальні колонії. Фаг з індивідуальних колоній потім аналізують з використанням, наприклад, аналізу ELISA (твердофазовий імуноферментний аналіз). Фагові антитіла, які є позитивними при використанні аналізу ELISA, потім можуть бути використані для інфікування клітин НВ2151 Е.соlі для продукування розчинних рекомбінантних антитіл. Після відбору відповідних клонів послідовність гена антитіла scFv може бути ідентифікована і використана у цілях даного винаходу. Стабілізуючий білок може бути зв'язаний з аполіпопротеїном за допомогою лінкеру, який може відщеплюватися для вивільнення аполіпопротеїну в його вільному природному вигляді. Лінкери, які можуть бути включені для цієї мети, включають послідовності пептидів, розпізнаваніфактором Ха, протеазою IgA або ентерокіназою. В особливо переважному варіанті здійснення лінкер кодує пропослідовність хімозину, яка може розщеплюватися за допомогою зрілого хімозину, як вказано у патентній заявці РСТ WO 98/49326. У переважних варіантах здійснення послідовність химерної нуклеїнової кислоти додатково містить «націлюючий сигнал». Термін «націлюючий сигнал», як він використаний у даному описі, означає будь-яку послідовність амінокислот, здатну направляти поліпептид аполіпопротеїну, коли він експресується, у бажане місцеположення всередині клітини рослини. Відповідні націлюючі сигнали, які можна використовувати у цьому випадку, включають ті, які здатні направляти поліпептид аполіпопротеїну в ендоплазматичну сітку або везикули зберігання, одержані з ендоплазматичної сітки, такі як масляне тіло, і в апопласт. Для досягнення накопичення аполіпопротеїну в ER або у везикулі зберігання, похідній ER, поліпептид, що кодує поліпептид, який кодує аполіпопротеїн, зв'язаний з націлюючим сигналом, який викликає збереження аполіпопротеїну в ER або у 93853 30 везикулі зберігання, похідній ER. У переважному варіанті здійснення даного винаходу націлюючий сигнал, який здатний зберігати аполіпопротеїн в ER, містить С-кінцевий мотив ER-утримання. Приклади таких С-кінцевих мотивів ER-утримання включають послідовності KDEL, HDEL, DDEL, ADEL і SDEL. Інші приклади включають HDEF (Lehmann et al., 2001, Plant Physiol. 127 (2): 436439), або два залишки аргініну, близько розташовані до N-кінця у положеннях 2 і 3, 3 і 4 або 4 і 5 (Abstract from Plant Biology 2001 Program, ASPB, July 2001, Providence, Rhode Island, USA). Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують Скінцевий мотив утримання, переважно зв'язані з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн таким чином, що поліпептид, здатний утримувати аполіпопротеїн в ER, зв'язаний з Скінцем поліпептиду аполіпопротеїну. У варіантах здійснення даного винаходу, в яких аполіпопротеїн зберігається в ER, послідовність химерної нуклеїнової кислоти додатково може містити нуклеїнову послідовність, яка націлює послідовність нуклеїнової кислоти в ендомембранну систему («сигнальний пептид»). У варіантах здійснення даного винаходу, в яких аполіпопротеїн зберігається в ER з використанням послідовності, такої як поліпептид KDEL, HDEL або SDEL, особливо бажано включати послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує сигнальний пептид. Ілюстративні сигнальні пептиди, які можуть використовуватися у цьому випадку, включають сигнальну послідовність білка, зв'язаного з патогенезом тютюну (PRS) (SEQ. ID NO: 58) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221), сигнальну послідовність лецитину (Boehn et al., 2000, Transgenic Res, 9(6): 477-86), сигнальну послідовність гідроксипролін-збагаченого глікопротеїну з Phaseolus vulgaris (Yan et al., 1997, Plant Phyiol. 115 (3): 915-24, і Corbin et al., 1987, Моl. Cell. Biol. 7(12): 4337-44), сигнальну послідовність пататину картоплі (Iturriaga, G. et al., 1989, Plant Cell 1: 381-390, і Bevan et al., 1986, Nuc. Acids Res. 41: 4625-4638) і сигнальну послідовність альфа-амілази ячменю (Rasmussen and Johansson, 1992, Plant Моl. Biol. 18(2): 423-7). Приклад №3 у даному описі ілюструє акумуляцію аполіпопротеїну в ER. У наступному переважному варіанті здійснення поліпептид аполіпопротеїну зв'язаний з поліпептидом, який здатний утримувати поліпептид аполіпопротеїну у везикулі зберігання, похідній ER. У переважному варіанті здійснення везикула зберігання, похідна ER, являє собою масляне тіло, і аполіпопротеїн зв'язаний з білком масляного тіла. Білки масляного тіла, які можуть використовуватися для даної мети, включають будь-який білок, який зв'язаний у природі з масляним тілом (див., SEQ ID NO: 59-137 в таблиці 3). Відповідні послідовності нуклеїнових кислот, що кодують поліпептидні ланцюги білків масляного тіла, легко можуть бути ідентифіковані за допомогою ідентифікаційних інвентарних номерів, наведених у таблиці 3. З використанням даних послідовностей нуклеїнових кислот легко можуть бути ідентифіковані з використанням методів, відомих фахівцям у даній галузі, додаткові нові білки масляного тіла, що кодують 31 послідовності нуклеїнових кислот. Наприклад, може бути проведений скринінг бібліотек, таких як бібліотеки експресії, кДНК і геномні бібліотеки, і може бути проведений пошук аналогічних послідовностей по базах даних, що містять інформацію щодо проектів секвенування. Можна використовувати альтернативні способи виділення додаткових послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують поліпептиди білків масляного тіла, і нові послідовності можуть бути відкриті і використані відповідно до даного винаходу. Білки масляного тіла, які є особливо переважними, являють собою олеозини, наприклад, олеозин кукурудзи (Bowman-Vance et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 11275-11279; Qu et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 2238-2243 або Brassica (Lee et al., 1991, Plant Physiol. 96: 1395-1397), калеозини, див. наприклад, Genbank інвентарний номер AF067857) і стеролеозини (Lin et al., 2002 Plant Physiol. 128 (4): 1200-11). У наступному переважному варіанті здійснення білок масляного тіла являє собою рослинний олеозин і розділяє подібність послідовності з іншими рослинними олеозинами, такими як олеозин, виділений з Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 138) або Brassica napus (SEQ ID NO: 139). В іншому варіанті здійснення білок масляного тіла являє собою калеозин або кальцій-зв'язувальний білок, одержаний з рослини, гриба або інших джерел, і розділяє гомологію послідовності з рослинними калеозинами, такими як калеозин, виділений з Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 140 і SEQ ID NO: 141). В іншому переважному варіанті здійснення білок масляного тіла являє собою стеролеозин (SEQ ID NO: 142), стерол-зв'язувальна дегідрогеназа (Lin L-J et al., (2002) Plant Physiol 128: 1200-1211). Цей варіант здійснення даного винаходу проілюстрований у прикладі №3. Додатково, відповідно до даного винаходу аполіпопротеїн може бути також направлений у масляне тіло шляхом експресії аполіпопротеїну, що відбувається таким чином, що аполіпопротеїн не містить націлюючий сигнал, однак за умови, що послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує аполіпопротеїн, містить про-пептид аполіпопротеїну. Даний варіант здійснення даного винаходу проілюстрований у прикладі №3. Поліпептиди, здатні утримувати аполіпопротеїн в ER або у везикулі зберігання, похідній ER, звичайно не розщеплюються, і аполіпопротеїн може накопичуватися у вигляді злитого білка, що типово, наприклад, у тому випадку, коли KDEL утримуючий сигнал використовується для утримання поліпептиду в ER, або коли білок масляного тіла використовується для утримання поліпептиду в масляному тілі. В іншому варіанті здійснення даного винаходу поліпептид аполіпопротеїну експресується таким чином, що поліпептид накопичується в апопласті. Для досягнення такого накопичення послідовність химерної нуклеїнової кислоти переважно включає націлюючу послідовність, здатну направляти поліпептид аполіпопротеїну в ER («сигнальний пептид»). Ілюстративні сигнальні пептиди, які молена використовувати у цьому випадку, включають відмічені вище сигнальну послідовність білка, зв'яза 93853 32 ного з патогенезом тютюну (PR-S) (SEQ. ID NO: 58) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221), сигнальну послідовність лецитину (Boehn et al., 2000, Transgenic Res, 9(6): 477-86), сигнальну послідовність гідроксипролін-збагаченого глікопротеїну з Phaseolus vulgaris (Yan et al., 1997, Plant Phyiol. 115 (3): 915-24, і Corbin et al., 1987, Моl. Cell. Biol. 7(12): 4337-44), сигнальну послідовність пататину картоплі (Iturriaga, G. et al., 1989, Plant Cell 1: 381-390, і Bevan et al., 1986, Nuc. Acids Res. 41: 4625-4638) і сигнальну послідовність альфаамілази ячменю (Rasmussen and Johansson, 1992, Plant Моl. Biol. 18(2): 423-7). Такі націлюючі сигнали можуть відщеплюватися in vivo від поліпептиду аполіпопротеїну, що, наприклад, звичайно у тому випадку, коли використовується апопластнацілюючий сигнал, такий як сигнальна послідовність білка, зв'язаного з патогенезом тютюну S(PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Інші сигнальні пептиди можуть бути спрогнозовані з використанням Веб-сервера SignalP World Wide Web server (http://www.cbs.dtu.dk/seiyices/SignalP/), який припускає присутність і розташування сайтів розщеплення сигнального пептиду у послідовностях амінокислот різних організмів. Звичайно є невелике збереження первинної послідовності амінокислот, хоча загальні фізикохімічні властивості певною мірою зберігаються. Загальна структура сигнальних пептидів має 3 області, коротку амінокінцеву «h-область», що містить позитивно заряджені залишки, центральну «h-область», що змінюється у розмірі від 7 до 15 амінокислот, і карбокси-кінцеву «с-область», що містить полярні амінокислоти і сайт-розщеплення, який розпізнається мембрано-зв'язаними сигнальними ферментами пептидази (Nakai K., 2000, Advances in Protein Chem 54: 277-344). Націлюючі сигнали, які також можна використовувати відповідно до цього, включають сигнальну послідовність природного аполіпопротеїну (18 амінокислот у довжину у випадку послідовності людини). У переважних варіантах здійснення даного винаходу, використовують розташовану на N-кінці послідовність, що націлює в апопласт, таку як вказана вище PR-S послідовність тютюну, у поєднанні з розташованою на С-кінці послідовністю утримання в ER, такою як послідовність KDEL. У ще одному наступному переважному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, експресується таким чином, що аполіпопротеїн накопичується у цитоплазмі. У такому варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти не містить націлюючого сигналу. Переважно, у такому варіанті здійснення аполіпопротеїн містить додатковий стабілізуючий поліпептид, такий як зелений флуоресцентний білок (GFP). Послідовність химерної нуклеїнової кислоти може також містити N- і/або С-кінцеві поліпептидні розширення. Такі розширення можна використовувати для стабілізації і/або сприяння складанню поліпептидного ланцюга аполіпопротеїну, або вони можуть полегшувати націлювання у відділ клітини, наприклад, масляне тіло. Поліпептидні розширення, які можна використовувати у цьому 33 випадку, включають, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує одноланцюжкове антитіло, або послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує зелений флуоресцентний білок (Davis and Vierstra, 1996, Weeds World 3 (2): 43-48), або комбінацію таких поліпептидів. Особливо бажані розширення одноланцюжкового антитіла включають ті, які дають можливість асоціації аполіпопротеїну з масляним тілом для полегшення очищення аполіпопротеїну, зв'язаного з фракцією масляного тіла. Такі розширення переважно включені у варіанти здійснення даного винаходу, в яких аполіпопротеїн експресується у насінні рослин і направляється у клітинах насіння в ER або в апопласт. У наступному варіанті здійснення сайт розщеплення може бути розташований вище N-кінця або нижче С-кінця пептиду аполіпротеїну А-І, даючи можливість поліпептиду аполіпротеїну А-І відщеплюватися від партнера злиття з одержанням таким чином виділеного аполіпротеїну А-І. Приклади таких сайтів розщеплення можна знайти у WO 98/49326 (Спосіб розщеплення злитих білків) і споріднених заявках і у публікації LaVallie et al. (1994), Enzymatic and chemical cleavage of fusion proteins In Current Protocols in Molecular Biology, pp 16.4.5-16.4.17, John Wiley and Sons, Inc., New York NY. У переважному варіанті здійснення сайт розщеплення являє собою KLIP 8 (SEQ ID NO: 143), який розщеплюється аспарагіновими протеазами, включаючи хімозин. У наступному переважному варіанті здійснення до N-кінця поліпептиду Аро АІ або поліпептиду про-Аро АІ додані додаткові метіонінові залишки. Винахід додатково відноситься до способів відділення гетерологічного білка від компонентів клітини-хазяїна шляхом розподілу фракції масляного тіла і подальшого вивільнення гетерологічного білка за допомогою специфічного розщеплення злитого білка гетерологічний білок-білок масляного тіла. Необов'язково сайт розщеплення може бути розташований вище N-кінця або нижче Скінця гетерологічного поліпептиду, даючи можливість злитому білку відщеплюватися і відділятися шляхом розділення фаз на компоненти пептидів. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, може бути видозмінена для поліпшення рівнів експресії, наприклад, шляхом оптимізації послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до застосування переважного кодону для конкретного типу рослинної клітини, яка вибрана для експресії поліпептиду аполіпопротеїну, або шляхом зміни відомих мотивів для дестабілізації мРНК (див., наприклад, патентну заявку РСТ 97/02352). Порівняння використання кодону послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну, і використання кодону типу рослинної клітини робить можливим ідентифікацію кодонів, які можуть бути змінені. Конструкція синтетичних генів шляхом зміни застосування кодону описана, наприклад, у патентній заявці РСТ 93/07278. У переважному варіанті здійснення використовувана послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн, представлена SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 5. 93853 34 У цьому випадку можна використовувати деякі генетичні елементи, здатні посилювати експресію поліпептиду аполіпопротеїну. Дані елементи включають лідерні послідовності, що не транслюються, деяких вірусів, такі як лідерна послідовність AMV (Jobling and Gehrke, 1987, Nature, 325: 622-625) та інтрон, зв'язаний з убіквітиновим промотором кукурудзи (патент СІЛА 5504200). Звичайно, послідовність химерної нуклеїнової кислоти будуть одержувати таким чином, щоб генні елементи, здатні посилювати експресію, були розташовані 5' відносно послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну. Відповідно до даного винаходу послідовності химерних нуклеїнових кислот, що містять промотор, здатний контролювати експресію у рослині, зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну, міг бути інтегрований у рекомбінантний вектор експресії, який гарантує хорошу експресію у клітині. Відповідно, даний винахід включає рекомбінантний вектор експресії, що містить в 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти: (і) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах рослин; і (іі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; де вектор експресії є придатним для експресії у рослинній клітині. Термін «придатний для експресії у рослинній клітині» означає, що рекомбінантний вектор експресії містить послідовність химерної нуклеїнової кислоти за даним винаходом, зв'язану з генетичними елементами, необхідними для досягнення експресії у рослинній клітині. Генетичні елементи, які можуть бути включені у вектор експресії у такому відношенні, включають область закінчення транскрипції, одну або декілька послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують маркерні гени, одне або декілька джерел реплікації і тому подібне. У переважних варіантах здійснення вектор експресії додатково містить генетичні елементи, необхідні для інтеграції вектора або його частини в ядерний геном клітини рослини, наприклад, Т-ДНК ліву або праву граничні послідовності, які полегшують інтеграцію в ядерний геном клітини рослини у варіантах здійснення винаходу, де клітини рослини трансформують з використанням Agrobacterium. У наступному переважному варіанті здійснення вказана рослинна клітина являє собою клітину насіння рослини. Як зазначено раніше, рекомбінантний вектор експресії звичайно містить термінатор транскрипції, який крім того, що він служить як сигнал для закінчення транскрипції, додатково може служити як захисний елемент, здатний продовжувати напівперіод життя мРНК (Guarneros et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:238-242). Термінатор транскрипції звичайно містить приблизно від 200 нуклеотидів до приблизно 1000 нуклеотидів, і вектор експресії одержують таким чином, що термінатор транскрипції розташований в 3' положенні послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн. Термінаторні послідовності, які можна використовувати у цьому випадку, включають, наприклад, термінаторну область нопаліну (Bevan 35 et al., 1983, Nucl. Acids. Res., 11: 369-385), термінатор фазеоліну (van der Geest et al., 1994, Plant J. 6: 413-423), термінатор арцеліну (Jaeger GD, et al., 2002, Nat. Biotechnol. 20: 1265-8), термінатор для генів октопінсинтази Agrobacterium tumefaciens або інші аналогічно функціонуючі елементи. Термінатори транскрипції можуть бути одержані, як описано An (An, 1987, Methods in Enzym. 153: 292). Відповідно до даного винаходу вектор експресії може додатково містити маркерний ген. Маркерні гени, які можна використовувати відповідно до даного винаходу, включають всі гени, які дають можливість відрізняти трансформовані клітини від нетрансформованих клітин, включаючи всі ті, що селектуються, і скринабельні маркерні гени. Маркерний ген може являти собою маркер резистентності, такий як маркер резистентності до антибіотиків, наприклад, проти канаміцину (патент США 6174724), ампіциліну, G418, блеоміцину, гідроміцину, який дає можливість відбору характерної особливості за допомогою хімічних способів, або маркер толерантності проти хімічного агента, такий як звичайно фітотоксичний цукор маноза (Negrotto et al., 2000, Plant Cell Rep. 19: 798-803). Інші зручні маркери, які можна використовувати у даному винаході, включають маркери, здатні передавати резистентність проти гербіцидів, таких як гліфосат (патенти США 4940935; 5188642), фосфінотрицин (патент США 5879903) або сульфонілсечовини (патент США 5633437). Маркери резистентності, коли вони зв'язані поблизу послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну, можуть використовуватися для підтримки тиску відбору на популяцію клітин рослини або рослин, які не втратили послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну. Скринабельні маркери, які можуть використовуватися для ідентифікації трансформантів шляхом візуального огляду, включають β-глюкуронідазу (GUS) (патенти США 5268463 і 5599670) і зелений флуоресцентний білок (GFP) (Niedz et al., 1995, Plant Cell Rep., 14: 403). Рекомбінантні вектори, придатні для введення послідовностей нуклеїнових кислот у рослини, включають вектори на основі Agrobacterium і Rhizobium, такі як плазміди Ті і Ri, включаючи, наприклад, pBIN19 (Bevan, Nucl. Acid. Res., 1984, 22: 8711-8721), pGKB5 (Bouchez et al., 1993, CR Acad. Sci. Paris, Life Sciences, 316: 1188-1193), ряд бінарних векторів pCGN (McBride and Summerfelt, 1990, Plant Моl. Biol., 14: 269-276) та інші бінарні вектори (наприклад, патент США 4940838). Рекомбінантні вектори експресії за даним винаходом можуть бути одержані відповідно до методологій, добре відомих фахівцям у галузі молекулярної біології. Такі методи одержання звичайно будуть включати як проміжні хазяїни клонування види бактерій Escherichia coli. Одержання векторів Е. соlі, також як і векторів трансформації рослин, може бути здійснено з використанням звичайних відомих методів, таких як рестрикційне розщеплення, лігування, гелевий електрофорез, секвенування ДНК, полімеразна ланцюгова реакція (PCR) та інших методологій. Доступне велике число векторів клонування для здійснення необхідних ста 93853 36 дій, потрібних для одержання рекомбінантного вектора експресії. До числа векторів з системою реплікації, що функціонує в Е. соlі, відносяться такі вектори як pBR322, ряд векторів pUC, ряд векторів МІ3mр, pBluescript і т.д. Звичайно, дані вектори клонування містять маркер, що дає можливість відбору трансформованих клітин. Послідовності нуклеїнових кислот молена вводити у дані вектори, і вектори можуть бути введені в Е. соlі, що вирощуються у придатному середовищі. Рекомбінантні вектори експресії легко можуть бути виділені з клітин при їх збиранні і лізуванні. Далі, загальні вказівки, що стосуються одержання рекомбінантних векторів, молена знайти, наприклад, у довіднику Sambrook та ін., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol.3. Одержання рослин, що містять насіння, здатне експресувати аполіпопротеїн Відповідно до даного винаходу послідовність химерної нуклеїнової кислоти вводять у клітину рослини, і клітини вирощують у зрілі рослини, де рослини експресують поліпептид аполіпопротеїну. Відповідно до цього, можуть бути вибрані будь-який вид рослин або клітина рослини. Конкретні використовувані тут клітини включають клітини, одержані з Arabidopsis thaliana, бразильского горіха (Betholettia excelsa); рицини звичайної (Riccinus communis); кокосу (Cocus nucifera); коріандру (Coriandrum sativum); бавовни (Gossypium spp.); земляного горіха (арахісу) (Arachis Hypogaea); жожоба (Simmondsia chinensis); лляного насіння/льону (Linum usitatissimum); кукурудзи (Zea mays); гірчиці (Brassica spp. і Sinapis alba); олійної пальми (Elaeis guineeis); оливи (Olea eurpaea); рапсу (Brassica spp.); рису (Oryza sativa); сафлору (Carthamus tinctorius); сої (Glycine max); рослин сімейства гарбузових (Cucurbita maxima); ячменю (Hordeum vulgare); пшениці (Traeticum aestivum); ряски (Lemnaceae sp.) і соняшника (Helianthus annuus). Відповідно до цього у переважному варіанті здійснення винаходу використовують види рослин або клітини рослин з рослин з масляним насінням. Рослини з масляним насінням, що можуть використовуватися у даному винаході, включають арахіс (Arachis hypogaea); гірчицю (Brassica spp. і Sinapis alba); рапс (Brassica spp.); турецький горох (Cicer arietinum); сою (Glycine max); бавовну (Gossypium hirsutum); соняшник (Helianthus annuus); (Lentil Lens culinaris); лляне насіння/льон (Linum usitatissimum); білу конюшину (Trifolium repens); оливу (Olea eurpaea); олійну пальму (Elaeis guineeis); сафлор (Carthamus tinctorius) і віку сочевицеподібну (Vicia narbonesis). Відповідно до цього в особливо переважному варіанті здійснення винаходу використовують Arabidopsis, льон або сафлор. Методології для введення рослинних рекомбінантних векторів експресії у клітину рослини, що також згадується у даному описі як «трансформація», добре відомі у даній галузі і звичайно змінюються в залежності від вибраного типу рослини. Загальні способи введення рекомбінантних векторів експресії у клітини включають електропорацію; 37 хімічно опосередковані методи, наприклад, СаСl2 опосередковане поглинання нуклеїнової кислоти; бомбардування частинками (біолістикс (biolistics)); застосування природно інфікованих послідовностей нуклеїнових кислот, наприклад, одержаних з вірусів послідовностей нуклеїнових кислот або послідовностей, що є похідними Agrobacterium або Rhizobium, поглинання нуклеїнової кислоти, опосередковане поліетиленгліколем (ПЕГ), мікроін'єкцію і застосування крупинок карбіду кремнію. У переважних варіантах здійснення вибирають методологію трансформації, що дає можливість інтеграції послідовності химерної нуклеїнової кислоти у геном рослинної клітини і переважно геном ядра рослинної клітини. Відповідно, це вважається особливо бажаним, оскільки застосування такої методології буде приводити до перенесення послідовності химерної нуклеїнової кислоти у потомство рослин при статевому розмноженні. Методи трансформації, які можна використовувати у даному відношенні включають біолістикс і способи, опосередковані Agrobacterium. Методології трансформації для дводольних видів рослин добре відомі. Звичайно використовують трансформацію, опосередковану Agrobacterium, внаслідок її високої ефективності, а також загальної застосовності для багатьох, якщо не всіх, видів дводольних рослин. Трансформація з використанням Agrobacterium звичайно включає перенесення бінарного вектора, такого як один зі згаданих вище бінарних векторів, що включає послідовність химерної нуклеїнової кислоти за даним винаходом з Е. соlі, у відповідний штам Agrobacterium (наприклад, ЕНА101 і LBA4404) з використанням, наприклад, трьох-батьківської сполуки зі штамом Е. соlі, що несе рекомбінантний бінарний вектор, і штамом Е. соlі, що несе хелперну плазміду, здатну до мобілізації бінарного вектора до цільового штаму Agrobacterium, або шляхом трансформації ДНК штаму Agrobacterium (Hofgen et al., Nucl. Acids. Res., 1988, 16: 9877). Інші способи, які можна використовувати для трансформації клітин дводольних рослин, включають біолістикс (Sanford, 1988, Trends in Biotechn. 6: 299-302); електропорацію (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82: 5824-5828); опосередковане ПЕГ поглинання ДНК (Potrykus et al., 1985, Моl. Gen. Genetics, 199: 169-177); мікроін'єкцію (Reich et al., Bio/Techn., 1986, 4: 1001-1004); і частинки карбіду кремнію (Kaeppler et al., 1990, Plant Cell Rep., 9: 415-418), або у трансформації in planta використання, наприклад, методології занурення квіток (Clough and Bent, 1998, Plant J., 16:735-743). Види однодольних рослин можуть бути трансформовані з використанням множини методологій, включаючи бомбардування частинками (Christou et al., 1991, Biotechn. 9: 957-962; Weeks etal., Plant Physiol., 1993, 102: 1077-1084; GordonKamm et al., Plant Cell, 1990, 2: 5603-618); опосередковане ПЕГ поглинання ДНК (європейські патенти 0292435; 0392225) або опосередковану Agrobacterium трансформацію (Goto-Fumiyuki et al., 1999, Nature-Biotech. 17: 282-286). Конкретна методологія трансформації рослини може змінюватися у деякій мірі в залежності від 93853 38 виду рослини і типу рослинної клітини (наприклад, типів клітин, одержаних з насіння, такого як гіпокотиль (підсім'ядольне коліно) і сім'ядоля, або ембріональна тканина), яка вибрана як клітина-мішень для трансформації. Як зазначено вище, в особливо переважному варіанті здійснення використовують сафлор. Методологія одержання трансформантів сафлору доступна за публікаціює Baker і Dyer (Plant Cell Rep., 1996, 16: 106-110). Додаткові конкретні протоколи трансформації видів рослин можна знайти в: Biotechnology in Agriculture and Forestry 46: Transgenic Crops I (Y.P.S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, New York (1999), і Biotechnology in Agriculture and Forestry 47: Transgenic Crops II (Y.P.S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, New York (2001). Після трансформації клітини рослин вирощують і після появи диференційованої тканини, такої як пагони і коріння, регенерують зрілі рослини. Звичайно регенерують множину рослин. Методології регенерації рослин звичайно є залежними від виду рослини і типу клітини, і вони будуть відомі фахівцям у даній галузі. Подальші вказівки відносно культури рослинних тканин можна знайти, наприклад, в Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds., Kluwer Academic Publishers; і в Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111), 1999, Hall Eds., Humana Press. В одному аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання насіння рослин, що містить аполіпопротеїн. Відповідно, даний винахід відноситься до способу одержання насіння рослин, що включає аполіпопротеїн, який передбачає (а) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, що містить в 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти: (і) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах насіння рослин; і (іі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; (c) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, і (d) одержання насіння вказаної рослини, де насіння містить аполіпопротеїн. Насіння можна використовувати для одержання популяції потомства рослин, кожна з яких містить множину насіння, що експресує аполіпопротеїн. У переважному варіанті здійснення щонайменше приблизно 0,25% загального білка насіння являє собою аполіпопротеїн. Більш переважно, щонайменше приблизно 0,5% загального білка насіння являє собою аполіпопротеїн. Найбільш переважно, щонайменше приблизно 1,0% загального білка насіння являє собою аполіпопротеїн. У переважному варіанті здійснення множину трансформованих рослин одержують, вирощують і проводять для них скринінг на присутність бажаної послідовності химерної нуклеїнової кислоти, присутність якої у передбачуваних трансформантах може бути протестована за допомогою, наприклад, вирощування на вибраному середовищі, де використовуються маркери гербіцидної резистент 39 ності, шляхом безпосереднього нанесення гербіцидів на рослини або шляхом саузерн-блотингу. Якщо присутність послідовності химерної нуклеїнової кислоти виявлена, трансформовані рослини можуть бути відібрані для утворення потомства і зрештою зрілих рослин, що містять множину насіння, що включає послідовність бажаної химерної нуклеїнової кислоти. Таке насіння можна використовувати для виділення аполіпопротеїну, або воно може бути висіяне для утворення двох або більше наступних поколінь. Звичайно, буде бажано посіяти множину трансгенного насіння для одержання популяції трансгенних рослин, кожна з яких містить насіння, що включає послідовність химерної нуклеїнової кислоти, що кодує аполіпопротеїн. Крім того, звичайно буде бажано гарантувати гомозиготність у рослинах для того, щоб гарантувати постійне успадкування рекомбінантного поліпептиду. Способи селекції гомозиготних рослин добре відомі фахівцям у даній галузі. Способи одержання гомозиготних рослин, які можна використовувати, включають одержання і трансформацію гаплоїдних клітин або тканин з подальшою регенерацією гаплоїдних сходів і подальшим перетворенням у диплоїдні рослини, наприклад, шляхом обробки колхіном або іншими агентами, що розривають мікроканальці. Рослини можуть бути вирощені відповідно до інших звичайних методів сільського господарства. В іншому аспекті, даний винахід також відноситься до рослин, здатних давати насіння, що експресує аполіпопротеїн. У переважному варіанті здійснення винаходу рослини, здатні давати насіння, містять послідовність химерної нуклеїнової кислоти, що містить в 5'-3' напрямі транскрипції (a) першу послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах насіння рослин, функціонально зв'язану з (b) другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; де насіння містить аполіпопротеїн. У переваленому варіанті здійснення послідовність химерної нуклеїнової кислоти стабільно інтегрована в ядерний геном рослини. Ще в одному аспекті даний винахід відноситься до насіння рослин, що експресують аполіпопротеїн. У переважному варіанті здійснення даного винаходу насіння рослин містить послідовність химерної нуклеїнової кислоти, що містить в 5'-3' напрямі транскрипції (a) першу послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах насіння рослин, функціонально зв'язану з (b) другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну. Поліпептид аполіпопротеїну може бути присутнім у множині різних типів клітин насіння, включаючи, наприклад, гіпокотилі (підсім'ядольні коліна) і ембріональні осі, включаючи ембріональне коріння і ембріональне листя, і де однодольні види рослин, включаючи злакові і зернові рослини, використовуються у тканині ендосперму. Коли рослини одержані, білок аполіпопротеїну може бути екстрагований і виділений з рослин у більш або менш чистій формі. 93853 40 Відповідно, даний винахід відноситься до способу одержання по суті чистого аполіпопротеїну, що передбачає (а) створення конструкції химерної нуклеїнової кислоти, що містить в 5'-3' напрямі транскрипції як функціонально зв'язані компоненти: (і) послідовність нуклеїнової кислоти, здатну контролювати експресію у клітинах насіння рослин; і (іі) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид аполіпопротеїну; (b) введення конструкції химерної нуклеїнової кислоти у клітину рослини; (c) вирощування клітини рослини у зрілу рослину, і одержання насіння вказаної рослини, де насіння містить аполіпопротеїн; і (d) відділення аполіпопротеїну від компонентів насіння рослини для одержання по суті чистого аполіпопротеїну. Для відділення аполіпопротеїну від компонентів насіння, насіння рослин може бути подрібнене з використанням будь-якого способу подрібнення, що приводить до істотного руйнування мембран клітин насіння і клітинних стінок. Молена використовувати умови як сухого, так і вологого помелу (патент США 3971856; Lawhon et al., 1977, J. Am. Oil Chem. Soc, 63: 533-534). Придатне у даному відношенні обладнання для помелу включає колоїдні млини, дискові млини, ІКА млини, промислові гомогенізатори і тому подібне. Вибір обладнання для подрібнення буде залежати від типу насіння і вимог продуктивності. Тверді компоненти насіння, такі як лушпиння насіння, волокнисті матеріали, нерозчинні вуглеводи, білки та інші не розчинні у воді складові, можуть бути видалені з фракції насіння з використанням, наприклад, методологій з виключенням за розміром, таких як фільтрування або процеси, що базуються на гравітації, такі як центрифугування. У перевалених варіантах здійснення застосування органічних розчинників, що звичайно використовуються для екстракції масла, таких як гексан, виключається, оскільки такі розчинники можуть пошкодити поліпептид аполіпопротеїну. Як зазначено раніше у даному описі, у переважних варіантах здійснення даного винаходу аполіпопротеїн одержують способом, який допускає асоціацію поліпептиду аполіпопротеїну з масляними тілами насіння. Відповідно, масляні тіла насіння, що включають аполіпопротеїн, можуть бути одержані після подрібнення насіння з використанням, наприклад, методології, детально описаної у патенті США 6146645. Таким чином, даний винахід також включає по суті чисті масляні тіла, що містять аполіпопротеїн, одержані з насіння рослин. Масляні тіла можна використовувати як очищену фракцію насіння рослин для подальшого очищення аполіпопротеїну. По суті чистий аполіпопротеїн може бути виділений з насіння з використанням множини додаткових методів очищення, таких як способи, що базуються на центрифугуванні; методології, що базуються на виключенні за розміром, включаючи, наприклад, мембранне ультрафільтрування і ультрафільтрування у поперечному потоці; і методи хроматографії, включаючи, 41 наприклад, іонообмінну хроматографію, хроматографію з виключенням за розміром, афінну хроматографію, високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ), швидку білкову рідинну хроматографію (ШБРХ), хроматографію гідрофобної взаємодії і тому подібні. Звичайно, поєднання таких методів буде використовуватися для одержання по суті чистого аполіпопротеїну. Переважна методологія одержання по суті чистого аполіпопротеїну в його природній формі з насіння трансгенних рослин детально описана у прикладі 6 даного опису. Таким чином, даний винахід також включає по суті чистий аполіпопротеїн, одержаний з рослини. Фармацевтичні препарати аполіпопротеїну можуть бути одержані з очищеного аполіпопротеїну, і такі препарати можна використовувати для лікування судинних захворювань. Звичайно, очищений аполіпопротеїн буде змішуватися з фармацевтично прийнятним носієм або розріджувачем у кількостях, достатніх для здійснення на пацієнта, який піддається лікуванню, терапевтично корисного впливу, за відсутності небажаних побічних дій. Для одержання композиції аполіпопротеїну зважену фракцію аполіпопротеїну розчиняють, суспендують, диспергують або яким-небудь іншим чином змішують з вибраним носієм або розріджувачем в ефективній концентрації, таким чином, щоб полегшувати стан при захворюванні, яке піддається лікуванню. Фармацевтичні препарати аполіпопротеїну перевалено одержують для введення одиничної дози. Терапевтично ефективні дози для парентеральної доставки аполіпопротеїну людини добре відомі у даній галузі. Коли використовуються аналоги аполіпопротеїну або інші способи доставки, терапевтично ефективні дози легко можуть бути визначені емпірично фахівцем у даній галузі з використанням відомих протоколів тестування або шляхом екстраполяції даних випробувань in vivo або in vitro. Однак, потрібно розуміти, що концентрації і дозування можуть змінюватися відповідно до серйозності стану, що піддається лікуванню. Додатково потрібно розуміти, для будь-якого конкретного суб'єкта визначені режими дозування можна регулювати з плином часу відповідно до індивідуальної думки суб'єкта, якому вводиться препарат, або для якого проводиться спостереження за введенням препарату. Фармацевтичні розчини або суспензії можуть включати, наприклад, стерильний розріджувач, такий як, наприклад, вода, лактоза, сахароза, дикальційфосфат або карбоксиметилцелюлоза. Носії, які можна використовувати, включають воду, фізіологічний розчин, водну декстрозу, гліцерин, гліколі, етанол і тому подібні, утворюючи, таким чином, розчин або суспензію. За бажанням, фармацевтичні композиції також можуть містити нетоксичні допоміжні речовини, такі як змочувальні агенти; емульгуючі агенти; солюбілізуючі агенти; антимікробні агенти, такі як бензиловий спирт і метилпарабени; антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота і бісульфіт натрію; хелатуючі агенти, такі як етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA); рН буферні агенти, такі як ацетатний, цитратний або фосфатні буфери і їх комбінації. 93853 42 Кінцевий склад препарату аполіпопротеїну звичайно буде залежати від способу доставки аполіпопротеїну. Аполіпопротеїн, одержаний відповідно до даного винаходу, може доставлятися будь-яким бажаним чином; однак парентеральні, пероральні і назальні форми доставки розглядаються як найбільш вірогідні. Парентеральні препарати можуть бути взяті в ампули, одноразові циліндри або однодозові або багатодозові ампули, виготовлені зі скла, пластику або інших придатних матеріалів. Приклади Наступні приклади пропонуються як ілюстрація, а не для обмеження. Приклад 1 Конструкція А-І клонів аполіпопротеїну Аро10 Apo10 (SEQ ID NO: 144) являє собою клон, розроблений для експресії специфічним для насіння чином, який конструюють, як подано на Фіг.3(А), 3(В) і 3(С). Як показано на Фіг.2, клон Аро10 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 145) зрілого Аро АІ і GFP. Для конструювання даного клону прямий праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') видаляв сайт Ncol зі стартової області GFP (матриця, одержана з вектора pVS-GFP). Зворотний праймер 1187 (SEQ ID NO: 147) (5'AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTAT AGTTC-3') додавав сайти PstI, Xbal і Hindlll після стоп-кодону. Фрагмент ПЛР лігували в EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи празміду G1 (Фіг.3(А)). Прямий праймер 1190 (SEQ ID NO: 148) (5'CCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') ампліфікує зрілу послідовність Аро АІ і додає сайт Ncol у початок гена. Зворотний праймер 1189 (SEQ ID NO: 149) (5'GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') видаляє стоп-кодон гена і додає сайт BamHI, щоб сприяти створенню трансляційного злиття з GFP у рамці зчитування (плазміда G1). Матриця для даних праймерів являла собою вектор на основі pKS+ (Strategene), що містить повну кодуючу послідовність гена Аро АІ людини. Фрагмент ПЛР лігували у сайт EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду М2. Плазміду М2, що містила зрілу послідовність Аро АІ, розрізали ферментами рестрикції Ncol і BamHI. Плазміда G'1 містить послідовність, що кодує GFP, і її відрізали за допомогою BamHI і Xbal (див. Фіг.3(В)). Фрагменти М2 і G'1 лігували разом у сайти Ncol і Xbal плазміди SBS2090 (див. Фіг.3(В)), для створення плазміди 2М4. Плазміду 2М4 відрізали за допомогою Ncol і Hindlll для видалення касети злиття Аро AI-GFP і фрагменти згодом використовували для клонування у сайти Ncol/Hindlll бінарного вектора pSBS4006 (див. Фіг.3(С)). Зазначимо, що плазміда містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901) і ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований 43 убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio. 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo11 Аро11 (SEQ ID NO: 150) являє собою клон, розроблений для експресії специфічним для насіння чином, який конструюють, як подано на Фіг.3(А), 3(В) і 3(С). Як показано на Фіг.2, клон Apo11 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 151) pro-Apo АІ і GFP. Для конструювання даного клону прямий праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') видаляв сайт Ncol зі стартової області GFP (матриця, одержана з вектора pVS-GFP). Зворотний праймер 1187 (SEQ ID NO: 147) (5'AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTAT AGTTC-3') додавав сайта PstI, Xbal і Hindlll після стоп-кодону. Фрагмент ПЛР лігували в EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду G1 (Фіг.3(А)). Прямий праймер 1191 (SEQ ID NO: 152) (5'CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') ампліфікує пpο-послідовність Аро АІ і додає сайт Ncol у початок гена. Зворотний праймер 1189 (SEQ ID NO: 149) (5'GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') видаляє стоп-кодон гена і додає сайт BainHI, щоб сприяти створенню трансляційного злиття з GFP у рамці зчитування (плазміда G1). Матриця для даних праймерів являла собою вектор на основі pKS+ (Strategene), що містить повну кодуючу послідовність гена Аро АІ людини. Фрагменти ПЛР, кожний окремо, лігували у сайт EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду Р2. Плазміду Р2, що містила послідовність рrо-Аро АІ, відрізали ферментами рестрикції Ncol і ВатНІ. Плазміда G'1 містить послідовність, що кодує GFP, і її відрізали за допомогою ВаmНІ і Xbal (див. Фіг.3(В)). Фрагменти Р2 і G'1 лігували разом у сайти Ncol і Xbal плазміди SBS2090 (див. Фіг.3(В)), для створення плазміди 2Р5. Плазміду 2Р5 відрізали за допомогою Ncol і Hindlll для видалення касети злиття pro-Apo AI-GFP і фрагменти згодом використовували для клонування у сайти Ncol/Hindlll бінарного вектора pSBS4006 (див. Фіг.3(С)). Зазначимо, що дана плазміда містить βфазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901) і ген pat, що додає рослиніхазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio. 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo12 Apo12 (SEQ ID NO: 153) являє собою клон, розроблений для експресії специфічним для насіння чином, який конструюють, як подано на Фіг.3(А), 3(В) і 3(С). Як показано на Фіг.2, клон Аро12 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 154) олеозину (van Rooijen, 93853 44 G. J., et al. Plant Моl. Biol. 18(6), 1177-1179 (1992)), зрілого Apo AI і GFP. Для конструювання даного клону прямий праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') видаляв сайт Ncol зі стартової області GFP (матриця, одержана з вектора pVS-GFP). Зворотний праймер 1187 (SEQ ID NO: 147) (5'AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTAT AGTTC-3') додавав сайта PstI, Xbal і Hindlll після стоп-кодону. Фрагмент ПЛР лігували в EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду G1 (Фіг.3(А)). Прямий праймер 1190 (SEQ ID NO: 148) (5'CCATGGrrCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') ампліфiкує зрілу послідовність Apo AI і додає сайт Ncol у початок гена. Зворотний праймер 1189 (SEQ ID NO: 149) (5'GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') видаляє стоп-кодон гена і додає сайт BamHI, щоб сприяти створенню трансляційного злиття з GFP у рамці зчитування (плазміда G1). Матриця для даних праймерів являла собою вектор на основі pKS+ (Strategene), що містить повну кодуючу послідовність гена Аро АІ людини. Фрагмент ПЛР лігували у сайт EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду М2. Плазміду М2, що містила послідовність зрілого Apo AI, відрізали ферментами рестрикції Ncol і BamHI. Плазміда G'1 містить послідовність, що кодує GFP, і її відрізали за допомогою BamHI і Xbal (див. Фіг.3(В)). Фрагменти М2 і G'l лігували разом у сайти Ncol і Xbal плазміди SBS2090 (див. Фіг.3(В)), для створення плазміди 2М4. Плазміду 2М4 відрізали за допомогою Ncol і Hindlll для видалення касети злиття Apo AIGFP і фрагменти згодом використовували для клонування у сайти Ncol/Hindlll бінарного вектора pSBS4008 (див. Фіг.3(С)). Зазначимо, що плазміда містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al., 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179) для злиття зі злитим білком Apo AI/GFP. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Аро13 Аро13 (SEQ ID NO: 155) являє собою клон, розроблений для експресії специфічним для насіння чином, який конструюють, як подано на Фіг.3(А), 3(В) і 3(С). Як показано на Фіг.2, клон Аро13 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 156) олеозину, pro-Apo AI і GFP. Для конструювання даного клону прямий праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') видаляв сайт Ncol зі стартової області GFP (матриця, одержана з вектора pVS-GFP). Зворотний праймер 1187 (SEQ ID NO: 147) (5'AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTAT AGTTC-3') додавав сайти PstI, Xbal і Hindlll після 45 стоп-кодону. Фрагмент ПЛР лігували в EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду G1 (Фіг.3(А)). Прямий праймер 1191 (SEQ ID NO: 152) (5'CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') ампліфікує пpο-послідовність Аро АІ і додає сайт Ncol у початок гена. Зворотний праймер 1189 (SEQ IDN0: 149) (5'GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') видаляє стоп-кодон гена і додає сайт BamHI, щоб сприяти створенню трансляційного злиття з GFP у рамці зчитування (плазміда G1). Матриця для даних праймерів являла собою вектор на основі pKS+ (Strategene), що містить повну кодуючу послідовність гена Аро АІ людини. Фрагменти ПЛР, кожний окремо, лігували у сайт EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду Р2. Плазміду Р2, що містила послідовність pro-Apo АІ, відрізали ферментами рестрикції Ncol і BamHI. Плазміда G'1 містить послідовність, що кодує GFP, і її відрізали за допомогою BamHI і Xbal (див. Фіг.3(В)). Фрагменти Р2 і G'1 лігували разом у сайти Ncol і Xbal плазміди SBS2090 (див. Фіг.3(В)), для створення плазміди 2Р5. Плазміду 2Р5 відрізали за допомогою Ncol і Hindlll для видалення касети злиття pro-Apo AI-GFP і фрагменти згодом використовували для клонування у сайти Ncol/Hindlll бінарного вектора pSBS4008 (див. Фіг.3(С)). Зазначимо, що дана плазміда містить βфазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al., 1992, Plant Моl. Biol. 18(6), 1177-1179) для злиття зі злитим білком Аро AI/GFP. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 2537), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo15 Apo15 (SEQ ID NO: 157) являє собою клон, розроблений для експресії специфічним для насіння чином, який конструюють, як подано на Фіг.3(А), 3(В) і 3(D). Як показано на Фіг.2, клон Аро15 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 158) зрілого Аро АІ і GFP. Злитий білок націлювали для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217221). Для конструювання даного клону прямий праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') видаляв сайт Ncol зі стартової області GFP (матриця, одержана з вектора pVS-GFP). Зворотний праймер 1187 (SEQ ID NO: 147) (5'AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTAT AGTTC-3') додавав сайти PstI, Xbal і Hindlll після стоп-кодону. Фрагмент ПЛР лігували в EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду G1 (Фіг.3 (А)). Прямий праймер 1190 (SEQ ID NO: 148) (5' 93853 46 CCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') ампліфікує зрілу послідовність Аро АІ і додає сайт Ncol у початок гена. Зворотний праймер 1189 (SEQ ID NO: 149) (5'GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') видаляє стоп-кодон гена і додає сайт BamHI, щоб сприяти створенню трансляційного злиття з GFP у рамці зчитування (плазміда G1). Матриця для даних праймерів являла собою вектор на основі pKS+ (Strategene), що містить повну кодуючу послідовність гена Аро АІ людини. Фрагмент ПЛР лігували у сайт EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду М2. Плазміду М2, що містила зрілу послідовність Аро АІ, відрізали ферментами рестрикції Ncol і BamHI. Плазміда G'1 містить послідовність, що кодує GFP, і її відрізали за допомогою BamHI і Xbal (див. Фіг.3(В)). Фрагменти М2 і G'1 лігували разом у сайти Ncol і Xbal плазміди SBS2090 (див. Фіг.3(В)), для створення плазміди 2М4. Плазміду 2М4 відрізали за допомогою Ncol і Hindlll для видалення касети злиття Аро AI-GFP і фрагменти згодом використовували для клонування у сайти Ncol/Hindlll бінарного вектора pSBS4011 (див. Фіг.3(C)). Зазначимо, що плазміда містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), злитий з сигнальним пептидом PRS. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Аро16 Аро16 (SEQ ID NO: 159) являє собою клон, розроблений для експресії специфічним для насіння чином, який конструюють, як подано на Фіг.3(А), 3(В) і 3(D). Як показано на Фіг.2, клон Аро16 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 160) pro-Apo ΑΙ і GFP. Злитий білок націлювали для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструювання даного клону прямий праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') видаляв сайт Ncol зі стартової області GFP (матриця, одержана з вектора pVS-GFP). Зворотний праймер 1187 (SEQ ID NO: 147) (5'AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTAT AGTTC-3') додавав сайти PstI, Xbal і Hindlll після стоп-кодону. Фрагмент ПЛР лігували в EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду G1 (Фіг.3(А)). Прямий праймер 1191 (SEQ ID NO: 152) (5'CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') ампліфікує пpο-послідовність Аро АІ і додає сайт Ncol у початок гена. Зворотний праймер 1189 (SEQ ID NO: 149) (5'GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') видаляє стоп-кодон гена і додає сайт BamHI, щоб сприяти створенню трансляційного злиття з GFP 47 (плазміда G1). Матриця для даних праймерів являла собою вектор на основі pKS+ (Strategene), що містить повну кодуючу послідовність гена Аро АІ людини. Фрагменти ПЛР, кожний окремо, лігували у сайт EcoRI вектора клонування Торо (Invitrogen), створюючи плазміду Р2. Плазміду Р2, що містила послідовність pro-Аро АІ, відрізали ферментами рестрикції Ncol і BamHI. Плазміда G'1 містить послідовність, що кодує GFP, і її відрізали за допомогою BamHI і Xbal (див. Фіг.3(В)). Фрагменти Р2 і G'1 лігували разом у сайти Ncol і ХbаІ плазміди SBS2090 (див. Фіг.3(В)), для створення плазміди 2Р5. Плазміду 2Р5 відрізали за допомогою Ncol і Hindlll для видалення касети злиття pro-Apo AI-GFP і фрагменти згодом використовували для клонування у сайти Ncol/Hindlll бінарного вектора pSBS4011 (див. Фіг.3(C)). Зазначимо, що плазміда містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), злитий з сигнальним пептидом PRS. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo17 Apo17 (SEQ ID NO: 161) являє собою клон, розроблений для експресії конститутивним чином, який конструюють, як подано на Фіг.4(А). Як видно на Фіг.2, клон Аро17 складається з конститутивного промотору і термінатору (убіквітину), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 162) Аро ΑΙ і GFP. Для конструювання даного клону плазміду 2М4 (див. Фіг.3(В)) відрізали за допомогою Ncol і Hindlll для видалення касети злиття Аро AI-GFP і фрагменти лігували у сайти Ncol і PstI плазміди рKUO3' для створення плазміди KU2M4. Плазміда рKUO3' містить ген олеозину Brassica napus, який видаляють, коли вектор відрізають за допомогою Ncol і PstI, приводячи до утворення злитої конструкції Аро AI/GFP під контролем убіквітинового промотору і убіквітинового термінатору петрушки (Kawalleck, P. et al., 1993, Plant Моl. Biol. 21: 673684). Плазміду KU2M4 відрізали з використанням KрnІ і лігували у сайт KрnІ бінарного вектора SBS3000 (Фіг.4). Зазначимо, що плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Клон Аро17 містить трансляційний злитий білок зрілий Аро AIGFP і направлений у цитозоль. Аро18а Аро18а (SEQ ID NO: 163) являє собою клон, розроблений для експресії конститутивним чином, який конструюють, як подано на Фіг.4. Як видно на Фіг.2, клон Аро18а складається з конститутивного промотору і термінатору (убіквітину), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 164) pro-Аро ΑΙ і GFP. Для конструювання даного клону плазміду 2Р5 (див. Фіг.3(В)) відрізали за допомогою Ncol і 93853 48 PstI для видалення касети злиття pro-Apo AI-GFP і фрагменти лігували у сайти Ncol і PstI плазміди рKUО3' для створення плазміди KU2P5. Плазміда рKUО3' містить ген олеозину Brassica napus, який видаляють, коли вектор відрізають за допомогою Ncol і PstI, приводячи до утворення злитої конструкції pro-Apo AI/GFP під контролем убіквітинового промотору і убіквітинового термінатору петрушки (Kawalleck, P. et al., 1993, Plant Моl. Biol. 21: 673-684). Плазміду KU2P5 відрізали з використанням KрnІ і лігували у сайт KрnІ бінарного вектора SBS3000 (Фіг.4). Зазначимо, що плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Клон Аро18а містить трансляційний злитий білок pro-Apo AIGFP і направлений у цитозоль. Аро18b Apo18b (SEQ ID NO: 163) являє собою клон, розроблений для експресії конститутивним чином, який конструюють, як подано на Фіг.4(В). Як видно на Фіг.2, клон Аро18b складається з конститутивного промотору і термінатору (убіквітину), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 164) proApo ΑΙ і GFP. Зазначимо, що обидва клони Аро18а і Аро18b містять конститутивний промотор (убіквітин), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 164) pro-Apo ΑΙ і GFP. Різниця між двома клонами полягає у тому, що Аро18а вставляють у сайт KрnІ бінарного вектора pSBS3000 (який містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium). Навпаки, Apol8b вставляють у сайт KрnІ бінарного вектора pSBS5001, який містить ген рmі (Miles et al., 1984, Gene 21: 41-48), що кодує фосфоманозаізомеразу, яка дає можливість позитивної селекції на середовищі, що містить манозу, для вибірки. Ген рmі знаходиться під контролем убіквітинового промотору/термінатору з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Для конструювання даного клону бінарний вектор Аро18а відрізали за допомогою KрnІ для видалення касети злиття proApo AI-GFP і фрагменти лігували у сайт KрnІ плазміди SBS5001 для експресії в Agrobacterium. Клон Аро18b містить трансляційний злитий білок proApo AI-GFP і направлений у цитозоль. Аро19 Аро19 (SEQ ID NO: 165) являє собою клон, розроблений для експресії конститутивним чином, який конструюють, як подано на Фіг.5(А) і 5(В). Як видно на Фіг.2, клон Аро19 складається з конститутивного промотору і термінатору (убіквітина), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 166) Аро ΑΙ і GFP. Злитий білок націлювали для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, 49 Bio/technology, 8: 217-221). Для конструювання даного клону Аро15 використовують як матрицю. Прямий праймер 1177 (SEQ ID NO: 167) (5'GCAGCATTCATGAACTTCCTTAAGTCTTTCC-3') ампліфікує початок рослинної передпослідовності (PRS), яка містить сайт BspHI як стартовий кодон. Зворотний праймер 1178 (SEQ ID NO: 168) (5'GGTGGTGGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGT G-3') видаляє стоп-кодон гена і додає сайт BamHI, що сприяє створенню трансляційного злиття з GFP у рамці зчитування. Додаткові основи залишають на кінцях обох праймерів для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Плазміду G1 (див. Фіг.3(А)) розкладають за допомогою BamHI і PstI для лігування в pubiP+iS3', який містить убіквітиновий промотор і термінатор Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684). Фрагмент ПЛР PRS-Apo Al розщеплюють за допомогою BspHI і BamHI і лігують разом з фрагментом G1 у плазміду pubiP+iS3', для утворення плазміди 19-6. Плазміду 19-6 розщеплювали за допомогою EcoRI для видалення касети експресії і касету потім лігували у плазміду рKUО3'K (Фіг.4(А)) між сайтами EcoRI (видаляючи існуючу касету), створюючи касету KU19-6. KU19-6 розщеплювали за допомогою KрnІ і фрагмент лігували у сайти KрnІ плазміди SBS3000 (Фіг.5(В)). Зазначимо, що дана плазміда містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispura (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Клон Аро19 містить, відповідно, зрілий трансляційний злитий білок Аро AI-GFP, направлений по секреторному шляху. Аро20 Аро20 (SEQ ID NO: 169) являє собою клон, розроблений для експресії конститутивним чином, який конструюють, як подано на Фіг.5(А) і 5(В). Як видно на Фіг.2, клон Аро20 складається з конститутивного промотору і термінатору (убіквітину), що керує експресією злитого білка (SEQ ID NO: 170) pro-Apo ΑΙ і GFP. Злитий білок націлювали для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструювання даного клону Ароіб використовують як матрицю. Прямий праймер 1177 (SEQ ID NO: 167) (5'GCAGCATTCATGAACTTCCTTAAGTCTTTCC-3') ампліфікує початок рослинної передпослідовності (PRS), яка містить сайт BspHI як стартовий кодон. Зворотний праймер 1178 (SEQ ID NO: 168) (5'GGTGGTGGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGT G-3') видаляє стоп-кодон гена і додає сайт BamHI, що сприяє створенню трансляційного злиття з GFP у рамці зчитування. Додаткові основи залишають на кінцях обох праймерів для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Плазміду G1 (див. Фіг.3(А)) розкладають за допомогою BamHI і PstI для лігування у pubiP+iS3', який містить убіквітиновий промотор і термінатор Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684). Фрагмент ПЛР PRS-pro-Apo 93853 50 Al розщеплюють за допомогою BspHI і BamHI і лігують разом з фрагментом G1 у плазміду pubiP+iS3', для утворення плазміди 20-11. Плазміду 20-11 розщеплювали за допомогою EcoRI для видалення касети експресії і касету потім лігували у плазміду pKUO3'K (Фіг.4(А)) між сайтами EcoRI (видаляючи існуючу касету), створюючи касету KU20-11. KU20-11 розщеплювали за допомогою KрnІ і фрагмент лігували у сайти KрnІ плазміди SBS3O00 (Фіг.5(В)). Зазначимо, що дана плазміда містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Клон Аро20 містить, відповідно, трансляційний злитий білок рrо-Аро AI-GFP, направлений по секреторному шляху. Аро21 Аро21 (SEQ ID NO: 171) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.6. Як показано на Фіг.2, клон Аро21 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією Аро АІ (SEQ ID NO: 172). Для конструювання даного клону прямий праймер 1203 (SEQ ID NO: 173) (5'GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCT G-3') додає сайт Ncol у початок зрілого Аро АІ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5і для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Фрагмент ПЛР розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у плазміду SBS2090, створюючи плазміду 5-3 (Фіг.6). Плазміду 5-3 розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент Аро АІ лігували у сайти Ncol/Hindlll SBS4006 (Фіг.3(С)). SBS4006 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901) і ген pat, що додає рослиніхазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo21 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання Аро АІ у цитозоль. Аро22 Аро22 (SEQ ID NO: 175) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.7. Як показано на Фіг.2, клон Аро22 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією pro-Аро АІ (SEQ ID NO: 176). Для конструювання даного клону прямий праймер 1201 (SEQ ID NO: 177) (5'GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGA TG-3') додає сайт Ncol у початок pro-Аро ΑΙ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA 51 GTGTACTCC-3') додає сайт HindlH після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Фрагмент ПЛР розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у плазміду SBS2090 (Фіг.3(В)), створюючи плазміду 4-2 (Фіг.7). Плазміду 4-2 розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент pro-Αρο АІ лігували у сайти Ncol/Hindlll SBS4006 (Фіг.3(С)). SBS4006 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901) і ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo22 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання pro-Αρο АІ у цитозоль. Аро23 Аро23 (SEQ ID NO: 178) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.6. Як показано на Фіг.2, клон Аро23 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією олеозин/Аро АІ (SEQ ID NO: 179). Для конструювання даного клону прямий праймер 1203 (SEQ ID NO: 173) (5'GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCT G-3') додає сайт Ncol у початок зрілого Аро АІ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Фрагмент ПЛР розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у плазміду SBS2090, створюючи плазміду 5-3 (Фіг.6). Плазміду 5-3 розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент Аро АІ лігували у сайти Ncol/Hindlll SBS4008 (Фіг.3(С)). SBS4008 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo23 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання олеозин/Аро АІ у масляні тіла. Аро24 Аро24 (SEQ ID NO: 180) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.7. Як показано на Фіг.2, клон Аро24 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією 93853 52 олеозин/pro-Apo АІ (SEQ ID NO: 181). Для конструювання даного клону прямий праймер 1201 (SEQ ID NO: 177) (5'GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGA TG-3') додає сайт Ncol у початок pro-Apo АІ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Фрагмент ПЛР розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у плазміду SBS2090, створюючи плазміду 4-2 (Фіг.7). Плазміду 4-2 розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент pro-Apo АІ лігували у сайти Ncol/Hindlll SBS4008 (Фіг.3(С)). SBS4008 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo24 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання олеозин/pro-Apo АІ у масляні тіла. Аро25 Аро25 (SEQ ID NO: 182) являє собою перевалений для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.6. Як показано на Фіг.2, клон Аро25 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією олеозин/klр8/mеt/Аро АІ (SEQ ID NO: 183). Дана конструкція містить послідовність, що розщеплюється, klip8 (SEQ ID NO: 143) для полегшення відщеплення злитого білка за допомогою хімозину. Для конструювання даного клону прямий праймер 1203 (SEQ ID NO: 173) (5'GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCT G-3') додає сайт Ncol у початок зрілого Аро АІ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Фрагмент ПЛР розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у плазміду SBS2090 (Фіг.3(В)), створюючи плазміду 5-3 (Фіг.6). Плазміду 5-3 розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент Аро АІ лігували у сайти Ncol/Hindlll SBS4010 (Фіг.7). SBS4010 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і сайт розщеплення klip8. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промото 53 ром/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo25 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання олеозин/klір8/mеt/Аро АІ у масляні тіла і очищення з використанням послідовності, що розщеплюється, klip8. Аро26 Аро26 (SEQ ID NO: 184) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.7. Як показано на Фіг.2, клон Аро26 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією олеозин/klір8/mеt/рrо-Аро АІ (SEQ ID NO: 185). Дана конструкція містить послідовність, що розщеплюється, klip8 (SEQ ID NO: 143) для полегшення відщеплення злитого білка за допомогою хімозину. Для конструювання даного клону прямий праймер 1201 (SEQ ID NO: 177) (5'GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGA TG-3') додає сайт Ncol у початок pro-Apo АІ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Фрагмент ПЛР розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у плазміду SBS2090 (Фіг.3(В)), створюючи плазміду 4-2 (Фіг.7). Плазміду 4-2 розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент pro-metАро АІ лігували у сайти BspHI/Hindlll SBS4010 (Фіг.7). SBS4010 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і сайт розщеплення klip8. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo26 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання олеозин/klір8/mеt/рrо-Аро АІ в масляні тіла і очищення з використанням послідовності, що розщеплюється, klip8. Аро27 Аро27 (SEQ ID NO: 186) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.8(А). Як показано на Фіг.2, клон Аро27 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією олеозин/klір8/Аро АІ (SEQ ID NO: 187). Аро27 націлювали для експресії у масляних тілах з використанням послідовності олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і він має послідовність, що розщеплюється, klip8 (SEQ ID NO: 143) для полегшення відщеплення злитого білка за допомогою хімозину. Для конструювання даного клону прямий праймер 1200 (SEQ ID NO: 188) (5'GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCA 93853 54 AGA-3') додає сайт Xhol і додаткові нуклеотиди для полегшення клонування у рамці зчитування у послідовність, що розщеплюється, klip8 (SEQ ID NO: 143) для початку pro-Αρο АІ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Матрицею для даних праймерів була плазміда Аро33, яка містить проформу Аро АІ без внутрішніх сайтів Xhol і додаткового залишку Met. Фрагменти ПЛР відрізали з використанням Xhol і лігували у сайти XhoI/EcoRV pKS+, створюючи плазміду 6-3. Плазміду 6-3 відрізали з використанням Xhol і Hindlll і лігували у сайти Xhol/Hindlll бінарного вектора SBS4010 (Фіг.7). Зазначимо, що SBS4010 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 18971901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і сайт розщеплення klip8. Плазміда також містить ген pat, що додає рослиніхазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo27 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання Аро АІ у масляні тіла і очищення з використанням послідовності, що розщеплюється, klip8. Аро27М Аро27М (SEQ ID NO: 189) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.8(В). Як показано на Фіг.2, клон Аро27М складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією олеозин/klір8/mеt/Аро АІ-М (SEQ ID NO: 190). Дана конструкція містить послідовність, що розщеплюється, klip8 (SEQ ID NO: 143) для полегшення відщеплення злитого білка за допомогою хімозину. Для конструювання даного клону прямий праймер 1202 (5іGCAGCACTCGAGcaagttcGATGAACCCCCCCA GAGCCC-3') (SEQ ID NO: 191) додає сайт Xhol і додаткові нуклеотиди для полегшення клонування у рамці зчитування і послідовність, що розщеплюється, klip8 (SEQ ID NO: 143) для початку mat-Apo ΑΙ. Прямий праймер 1225 (5'CGCCAGtGCTTGGCCGCGCGCCTTG-3') (SEQ ID NO: 192) являє собою тупокінцевий праймер, який здійснює мутацію пари основ від С до Τ для зміни залишку Arg на залишок Cys. Зворотний праймер 1206 (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') (SEQ ID NO: 174) додає сайт Hindlll після стоп-кодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містять додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Матрицею для даних праймерів була плазміда Р-10, яка вже містила мутовані сайти Xhol. Двониткову матрицю видаляли розщепленням з використанням DpnI. Фрагмент ПЛР відрізали з 55 використанням Xhol і Hindlll і лігували у сайти Xhol/Hindlll плазміди pKS+, створюючи плазміду АроМ. АроМ розщеплювали за допомогою Xhol і Hindlll і фрагмент лігували у сайти Xhol/Hindlll плазміди SBS4010 (Фіг.7). SBS4010 містить βфазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і сайт розщепленняklip8. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo27M являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання олеозин/klір8/mеt/Аро АІ-М у масляні тіла і очищення з використанням послідовності, що розщеплюється, klip8. Аро28 Аро28 (SEQ ID NO: 193) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.9. Як показано на Фіг.2, клон Аро28 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією олеозин/klір8/рrо-Аро Al (SEQ ID NO: 194). Для конструювання даного клону прямий праймер 1200 (SEQ ID NO: 188) (5'GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCA AGA-3') додає сайт Xhol і додаткові нуклеотиди для полегшення клонування у рамці зчитування у послідовність, що розщеплюється, klip8 для початку pro-Apo AI. Прямий праймер 1205 (SEQ ID NO: 195) (5'-CCAAGCCCGCGCTaGAGGACCTCCG-3') являє собою тупокінцевий праймер, який додає мутацію, що мовчить, для видалення першого сайту Xhol. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містять додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Матриця для даних праймерів являла собою вектор на основі pKS+ (Stratagene), що містить повну кодуючу послідовність гена Аро АІ людини. Двониткову матрицю видаляли розщепленням з використанням DpnI. Фрагмент ПЛР відрізали з використанням Xhol і Hindlll і лігували у сайти Xhol/Hindlll плазміди pKS+, створюючи плазміду Р-10. Р-10 розщеплювали за допомогою Xhol і Hindlll і фрагмент лігували у сайти Xhol/Hindlll плазміди SBS4010 (Фіг.7). Зазначимо, що SBS4010 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 18971901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і сайт розщеплення klip8. Плазміда також містить ген pat, що додає рослиніхазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum 93853 56 (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo28 являє собою клон pro-Apo ΑΙ, направлений у масляні тіла і здатний відщеплюватися по послідовності klip8. Аро29 Аро29 (SEQ ID NO: 196) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.6. Як показано на Фіг.2, клон Аро29 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією PRS-Apo ΑΙ (SEQ ID NO: 197). Apo29 націлювали для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструювання даного клону прямий праймер 1203 (SEQ ID NO: 173) (5'GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCT G-3') додає сайт Ncol у початок зрілого Аро АІ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Фрагмент ПЛР розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у плазміду SBS2090, створюючи плазміду 5-3 (Фіг.6). Плазміду 5-3 розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент Аро АІ лігували у сайти Ncol/Hindlll SBS4011 (Фіг.30). SBS4011 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і сигнальний пептид PRS (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37). керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo29 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання Аро АІ по секреторному шляху. Аро30 Аро30 (SEQ ID NO: 198) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.7. Як показано на Фіг.2, клон Аро30 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією PRS-pro-Apo ΑΙ (SEQ ID NO: 199). pro-Apo АІ був направлений для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструювання даного клону прямий праймер 1201 (SEQ ID NO: 177) (5'GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGA TG-3') додає сайт Ncol у початок pro-Apo ΑΙ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видален 57 ня другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Фрагмент ПЛР розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у плазміду SBS2090, створюючи плазміду 4-2 (Фіг.7). Плазміду 4-2 розщеплювали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент Аро АІ лігували у сайти Ncol/Hindlll pSBS4011 (Фіг.30). SBS4011 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію гена олеозину Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant Моl. Biol. 18 (6), 1177-1179), і сигнальний пептид PRS (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. АроЗО являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання pro-Apo AI по секреторному шляху. Аро31 Аро31 (SEQ ID NO: 200) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.8(А). Як показано на Фіг.2, клон Аро28 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка PRS/D9 scFV/Apo AI (SEQ ID NO: 201). D9 scFV/Apo AI націлювали для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструювання даного клону прямий праймер 1200 (SEQ ID NO: 188) (5'GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCA AGA-3') додає сайт Xhol у початок pro-Apo ΑΙ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Матрицею для даних праймерів була плазміда Аро33, яка містить проформу Аро АІ без внутрішніх сайтів Xhol і додаткового залишку Met. Фрагмент ПЛР відрізали з використанням Xhol і лігували у сайти XhoI/EcoRV плазміди pKS+, створюючи плазміду 6-3. Плазміду 6-3 відрізали за допомогою Xhol і Hindlll і лігували у сайти Xhol/Hindlll бінарного вектора SBS4055 (Фіг.9). Зазначимо, що SBS4055 містить βфазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію PRS сигнальної послідовності, злитої у рамці зчитування з вставкою D9 scFV/Apo AI. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinura crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Аро31 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання pro-Apo AI по секреторному шляху і 93853 58 очищення з використанням антитіла олеозину D9 scFV. Аро32 Аро32 (SEQ ID NO: 202) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.9. Як показано на Фіг.2, клон Аро32 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією D9 scFV/pro-Apo ΑΙ (SEQ ID NO: 203). Для конструювання даного клону прямий праймер 1200 (SEQ ID NO: 188) (5'GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCA AGA-3') додає сайт Xhol у початок pro-Apo АІ. Прямий праймер 1205 (SEQ ID NO: 195) (5'CCAAGCCCGCGCTaGAGGACCTCCG-3') являє собою тупокінцевий праймер, який додає мутацію, що мовчить, для видалення першого сайту Xhol. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Матриця для даних праймерів являла собою вектор на основі pKS+ (Stratagene), що містить повну кодуючу послідовність гена Аро АІ людини. Двониткову матрицю видаляли розщепленням з використанням DpnI. Фрагмент ПЛР відрізали з використанням Xhol і Hindlll і лігували у сайти Xhol/Hindlll плазміди pKS+, створюючи плазміду Р-10. Р-10 розщеплювали за допомогою Xhol і Hindlll і фрагмент лігували у сайти Xhol/Hindlll плазміди SBS4055 (Фіг.9). Зазначимо, що SBS4055 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 18971901), що контролює експресію PRS сигнальної послідовності, злитої у рамці зчитування з антитілом D9 scFV. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Клон Аро32 являє собою клон, що націлює рrо-Аро АІ, по секреторному шляху, злитий у рамці зчитування з антитілом олеозину D9 scFV, для полегшення очищення. Аро33 Аро33 (SEQ ID NO: 204) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.10. Як показано на Фіг.2, клон Аро33 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка PRS/D9 scFV/met/Apo ΑΙ (SEQ ID NO: 205). D9 scFV/met/Apo ΑΙ направлений для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструювання даного клону прямий праймер 1203 (SEQ ID NO: 173) (5'GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCT G-3') додає сайт Ncol у початок зрілого Аро АІ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5' 59 GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Матрицею для даних праймерів була плазміда Р-10 (Фіг.9), яка містить проформу Аро АІ без внутрішніх сайтів Xhol. Фрагмент ПЛР відрізали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у сайти NcoI/HindlH pSBS2090, створюючи плазміду 20-2. Плазміду відрізали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент лігували у сайти BspHI/Hindlll вектора pSBS4010, створюючи плазміду 4010+20-2. Плазміду відрізали за допомогою Xhol і Hindlll і фрагмент лігували у сайти Xhol/Hindlll бінарного вектора SBS4055 (Фіг.10). Зазначимо, що SBS4055 містить βфазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію PRS сигнальної послідовності, злитої у рамці зчитування з антитілом D9 scFV. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 2537), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Аро33 являє собою специфічний для насіння клон, який націлює Аро АІ по секреторному шляху і злитий у рамці зчитування з антитілом олеозину D9, для того, щоб сприяти очищенню. Аро34 Аро34 (SEQ ID NO: 206) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.10. Як показано на Фіг.2, клон Аро34 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка PRS/D9 scFV/met/pro-Apo AI/(SEQ ID NO: 207). D9 scFV/met/pro-Apo AI направлений для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструювання даного клону прямий праймер 1201 (SEQ ID NO: 177) (5'GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGA TG-3') додає сайт Ncol у початок pro-Apo АІ. Зворотний праймер 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTA GTGTACTCC-3') додає сайт Hindlll після стопкодону і додає мутацію, що мовчить, для видалення другого сайту Xhol. Обидва праймери містили додаткові основи на кінцях 5' для полегшення розщеплення ферментами рестрикції. Матрицею для даних праймерів була плазміда Р-10 (Фіг.9), яка містить проформу Аро АІ без внутрішніх сайтів Xhol. Фрагмент ПЛР відрізали з використанням Ncol і Hindlll і лігували у сайти Ncol/Hindlll SBS2090 (Фіг.3(В)), створюючи плазміду 19-2. Плазміду відрізали з використанням Ncol і Hindlll і фрагмент лігували у сайти BspHI/Hindlll вектора SBS4010, створюючи плазміду 4010+19-2. Плазміду відрізали за допомогою Xhol і Hindlll і фрагмент лігували у сайти Xhol/Hindlll бінарного вектора SBS4055 93853 60 (Фіг.10). Зазначимо, що SBS4055 містить βфазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію PRS сигнальної послідовності, злитої у рамці зчитування з антитілом D9 scFV. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 2537), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobactenum. Apo34 являє собою специфічний для насіння клон, який націлює met/pro-Аро АІ по секреторному шляху і злитий у рамці зчитування з антитілом олеозину D9, для того, щоб сприяти очищенню. Аро35 Аро35 (SEQ ID NO: 208) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.8. Як показано на Фіг.2, клон Аро35 складається зі специфічного для насіння промотору і термінатору (фазеоліну), що керує експресією злитого білка PRS/D9 scFV/Apo AI/KDEL (SEQ ID NO: 209). D9 scFV/Apo AI направлений для експресії по секреторному шляху з використанням сигнального пептиду послідовності, зв'язаної з патогеном тютюну (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221), і сигнал збереження KDEL (Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907) використовували для збереження поліпептиду в ER. Для конструювання даного клону прямий праймер 1200 (SEQ ID NO: 188) (5'GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCA AGA-3') додає сайт Xhol в початок pro-Apo АІ. Зворотний праймер 1208 (SEQ ID NO: 210) (5'AAGCTTTC AtagctcatctttCTGGGTGTTG AGCTTCTTAG-3') додає послідовність KDEL перед стоп-кодоном і сайт Hindlll після стоп-кодону. Матрицею для даних праймерів була плазміда Аро33, яка містить проформу Аро АІ без внутрішніх сайтів Xhol і додаткового залишку Met. Фрагменти ПЛР відрізали з використанням Xhol і лігували у сайти XhoI/EcoRV pKS+, створюючи плазміду 8-5. Плазміду 8-5 відрізали за допомогою Xhol і Hindlll і лігували у сайти Xhol/Hindlll бінарного вектора SBS4055 (Фіг.9). Зазначимо, що SBS4055 містить β-фазеоліновий промотор/термінатор з Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901), що контролює експресію PRS сигнальної послідовності, злитої у рамці зчитування з вставкою D9 scFV. Плазміда також містить ген pat, що додає рослині-хазяїну стійкості до фосфінотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37), керований убіквітиновим промотором/термінатором з Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Моl. Bio., 21: 673-684) для трансформації в Agrobacterium. Apo35 являє собою клон з метою специфічного для насіння націлювання Аро АІ по секреторному шляху зі збереженням в ER і очищення з використанням антитіла олеозину D9 scFV. Аро36 Аро36 (SEQ ID NO: 211) являє собою переважний для насіння клон, який конструюють, як показано на Фіг.11. Як показано на Фіг.2, клон Аро36