Гуманізовані антитіла, способи їх продукування, спосіб лікування хвороби крона, спосіб лікування розсіяного склерозу, фармацевтична композиція

1. Гуманиз ированн ое антител о, имеюще е аминокисло тную последо вательн ость, включа ющую гипервари абельн ые участки (CDR) монокло нальног о антител а, которое обладае т специф ичность ю к выбран ной субпопу ляции Тклеток, экспрес сирующих вариабе льную область Vp5 2 или Vp*5.3 бетацепи Тклеточн ого рецепто ра антипзи а, в сочетании с выбранными вариабельными каркасными остатками также происходящими из указанного моноклонального антитела, в котором гуманизированное антитело содержит аминокислотную последовательность ТМ27 Vk (SEQ (О Na: 2): пи Т-клеточного рецептора антигена в сочетании с выбранными вариабельными каркасными остатками, также происходящими из указанного моноклонального антитела, где гуманизированное антитело включает в себя аминокислотную последовательность ТМ29 Vk: 50 100 нены на аланин (А) и метионин (М). соответственно, а аминокислотный остаток 95 заменен на тирозин (Y) (SEQ ID № 46) 3 Гуманизированное антитело по пункту 1 или 2, что представляет собой изотип IgG (2a) 4 Гуманизированное антитело по пункту 3, отли чающееся тем, что один или более остатков в СМ О Ф Of) CM < э З!" 29494 константных доменах Ig были подвергнуты изменению с целью изменения иэотипа указанного Ig 5 Гуманизированное антитело по пункту 3, отли чающееся тем, что указанный изотипический подкласс представляет собой lgG1 6 Гуманизированное антитело или его связы вающая часть по любому из пп 1 или 2, отли чающееся тем. что продуцировано с помощью техники рекомбинантных ДНК 7 Гуманизированное антитело по пункту 1, отли чающееся тем, что указанное гуманизированное антитело способно к связыванию с указанными выбранными сублопуляциями Т-клеток с аффин ностью связывания, по крайней мере, сравнимой с аффинностью связывания, которой обладает указанное моноклональное антитело 8 Гуманизированное антитело по пункту 2, отли чающееся тем, что указанное гуманизированное t 51 101 антитело способно связываться с указанными выбранными субпопуляциями Т-клеток с аффинностью связывания, по крайней мере, сравнимой с аффинностью связывания, которую проявляет указанное моноклональное антитело. 9 Гуманизированное антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая содержит гипервариабельные участки (CDR) моноклонального антитепа, обладающего специфичностью к выбранной субпопуляции Т-клеток, экспрессирующих вариабельную область VP 5 2 или VP 5 3 бета-цепи Т-клеточного рецептора антигена, в сочетании с выбранными вариабельными каркасными остатками, также происходящими из указанного моноклонального антитела, где гуманизированное антитело включает в себя аминокислотную последовательность ТМ29 Vk (SEQ ID № 2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ GTKLQIT 107, 50 100 и аминокислотную последовательность ТМ27 VH (SEQ ID № 4) 1 51 101 QVQLQESGPGLVRPSOTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNOKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV TATLYAMDYWGQGSIVTYSS120 10 Гуманизированное антитело, имеющее аминокислотную последовательность, включающую гипервариабельные участки (CDR) моноклонального антитела, обладающего специфичностью к выбранной субпопуляции Т-клеток, экспрессирующих вариабельную область Vp 8 1 бета-цепи 1 5І 101 50 100 Т-клеточного рецептора антигена в сочетании с выбранными вариабельными каркасными остатками, также происходящими из указанного моноклонального антитела, гдегуманизированное антитело включает в себя аминокислотную последовательность ТМ29 Vk' DIQMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG TKLQIT 106 (SEQ ID № 1), 50 t00 и аминокислотную последовательность ТМ29 VH: 1 51 101 EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG EGAMDYWGQGTPVTVSS 117 (SEQ ID № 3) 11 Гуманизированное антитело или его связы вающий белок по любому из пп 1 или 2 для ис пользования в терапевтических целях 12 Гуманизированное антитело или его связы вающий белок по любому из пп 1 или 2 в произ водстве лекарственного средства, предназначен ного для лечения болезни Крона 13 Гуманизированное антитело или его связы вающий белок по любому из пп 1 или 2 в произ водстве лекарственного средства, предназначен ного для лечения рассеянного склероза 14 Способ продуцирования гуманизированного антитела белка по пункту 1, отличающийся тем что включает выделение первой ДНК-последо вательности, кодирующей, по крайней мере, один CDR из анти-Vp 5 2/Vp 5 3 мышиного монок лонального антитела, обладающего специфич ностью к выбранной субпопуляции Т-клеток, кло нирование указанной первой ДНК-последова тельности в подходящий вектор, введение выб 50 tOO ранных каркасных аминокислот человека посредством мутагенеза, в результате чего образуется конструкция с привитым CDR, трансформацию клетки-хозяина с использованием указанной конструкции с привитым CDR, и культивирование трансформированной таким образом клетки-хозяина с получением указанного гуманизированного антитела или его связывающего белка 15 Способ продуцирования гуманизированного антитела белка по пункту 2, отличающийся тем, что включает выделение первой ДНК-последовательности, кодирующей, по крайней мере, один CDR из анти-Vp 8 1 мышиного моноклонального антитела, обладающего специфичностью к выбранной субпопуляции Т-клеток, клонирование указанной первой ДНК-последовательности в подходящий вектор, введение выбранных каркасных аминокислот человека посредством мутагенеза, в результате чего образуется конструкция с привитым CDR, трансформацию клетки 29494 хозяина с использованием указанной конструкции с привитым CDR, и культивирование трансформированных таким образом клеток хозяев с получением указанного гуманизированного антитела или его связывающего белка 16 Способ по л 14 или пункту 15 отличающий ся тем, что клетка-хозяин представляет собой С НО-клетку 17 Способ лечения болезни Крона, предусмат ривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества гума низированного антитела или его связывающего белка по любому из пп 1 или 2 18 Способ лечения рассеянного склероза, пре дусматривающий введение пациенту нуждающе муся в таком лечении эффективного количества гуманизированного антитела или его связываю щего белка по любому из лл 1 или 2 19 Фармацевтическая композиция, отличаю щаяся тем что содержит гуманизированное ан титело по любому из пунктов 1, 2, 8 или 9 в ком бинации с фар маце этически приемлемым напол нителем Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам и к связывающим их белкам, способным связываться с Т-клетками, обнаруживающими специфические вариабельные бета-цепи, и в особенности с их субпопуляциями, представляющими экспрессию человеческих Vp 5,2 и/или 5,3, и V(i 8.1 Настоящее изобретение также относится к получению таких антител, к фармацевтическим составам, содержащим также антитела, и к терапевтическому применению этих антител, в частности, в лечении аутоиммунных заболеваний Т-клетки играют центральную роль в дифференциации и регуляции эффекторных механизмов в иммунной системе (Пол (Paul) и др, Наука, 195 1293-1300, 1987 г) Двойное распознавание антигена и главных молекул гистосовместимости Т-клеткой должно быть очень конкретным и регулироваться с абсолютной точностью, поскольку неадекватная иммунорегуляция способствует аутоиммунитету В некоторых лабораториях исследовались заболевания, в которых прослеживалась неадекватность иммунорегуляции, такие как аутоиммунитет и некоторые формы иммунодефицита, и исследователи подчеркивали роль Т-клеток в патогенезе таких заболеваний Существует ряд ситуаций, в которых отмечается клональная или олигокпональная экспансия структуры рецептора конкретной Т-клетки Наиболее очевидными примерами являются состояния злокачественных новообразований, которые приводят к Т-клеточной лейкемии или лимфоме При состояниях Т-клеточных лейкозов (лейкемий) и лимфом рецептор Т-клетки функционирует как олухолеспецифический маркер, поскольку рецептор Т-клетки устойчиво реаранжирован и репрезентирован на поверхности клетки Еще одной ситуацией, в которой усиливается роль структуры рецептора конкретной Т-клетки, является ситуация с реципиентом трансплантируемого органа, чьи Т-лимфоциты имеют рецепторы Т-клеток, делающие их агрессивными по отношению к молекулам МНС (главного комплекса гистосовместимости) донора как, например, донора трансплантата костного мозга Что более важно, несколько групп исследователей отмечают избирательный характер использования V-гена рецептора антигена Т-клетки в определенных аутоиммунных состояниях Нап ример, Грюнвальд (Grunwald) и др отмечают предпочтительную экспрессию генного продукта Va 2,3 в СО4+-клетках при бронхиоальвеолярном лаваже в сравнении с лимфоцитами периферической крови пациентов с саркоидозом (Грюнвальд и др Европейский иммунологический журнал, 22 129, 1992г) При синдроме Кавасаки предпочтительная экспансия Т клеток Vp 2 и Vp 8 отмечалась на начальной стадии заболевания (Абэ (Abe) и др , Труды Национальной академии наук США, 89 4066, 1992 г ) Ревматоидный артрит также интенсивно изучался в этом плане Некоторые исследователи отмечают предпочтительную экспансию субпопуляций Т-клеток, и среди них, в частности Дерсимонян (DerSimontan) и др , Журнал экспериментальной медицины 177 1623,1993г (предпочтительная экспансия Т-клеток, несущих Va 1.2,1, в CDS* Т-лимфоцитзх периферической крови), Стаменкович (Stamenkovic) и др , Труды Национальной академии наук США, 85 1179, 1988г (инфильтрующиеся через синовиальную мембрану Т-клетки выращенные в IL2, были олигоклональными по результатам Саузерн-блоттинга), Пальяр (Paliard) и др , Наука, 253 34, 1991 г (гипотеза об активизации суперантигеном Vp 14* Тклеток, включая и автореактивные Т-клетки, кото* рые размножаются клонально и мигрируют в синовиальную жидкость пациентов с ревматоидным артритом), Хауэл (Howell) и др, Труды Национальной академии наук США, 88 10921, 1991г (отмечено, в частности, использование Vгена Т-клетки V|3 3 14 и 17 в IL 2Р*-клетках из синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом), Уэмацу (Uematsu) и др , Труды Национальной академии наук США, 88 8534, 1991 г (показано использование V-гена олигоклональной Т-клетки в Т-клетках синовиальной жидкости одного больного РА), и Международная заявка № W090/06758 (указывающая на присутствие Vp 3, 9 и 10 у больных ревматоидным артритом (РА)) Воспалительные заболевания кишечника также интенсивно изучаются Несколько групп исследователей отмечают экспансию популяций Т-клеток или предпочтительное использование V-гена рецептора Т-клетки, в частности Поснет (Posnett) и др, Журнал клинических исследований, 85 1770, 1990 г, Спенсер (Spencer) и др, Журнал клинической патологии, 44 915, 1991 г. Трейдосевич (Trejjdosiewicz) и др , Клиническая и 29494 экспериментальная иммунология, 84 440, 1991 г., и Ван Керкховен (Van Kerckhoven) и др , Журнал экспериментальной медицины, 175 57, 1992 г. Другие исследователи отмечают предпочтительное использование V-гена Т-к летки в Mecobacterium leprae (Взн Шоотен (Van Snooten) и др , Труды Национальной академии наук США, 8911244, 1992 г.; Ванг (Wang) и др . Труды Национальной академии наук США, 90 188, 1993 г.). У человека экспансия Т-клеток Vp 8,1 в очаге воспаления обнаружена в связи с несколькими аутоиммунными заболеваниями, включая болезнь Крона (Поснет и др., Журнал клинических исследований, 85 1770-1776, 1990г.), синдром Кавасаки (Абэ и др., Труды Национальной академии наук США, 89 4066-4070, 1992 г, и Абэ и др , Журнап экспериментальной медицины, 177:791-796, 1993 г), и ревматоидный артрит (Бреннан (Вгеппап) и др , Клиническая и экспериментальная иммунология, 73417-423, 1988 г.). Рассеянный (множественный) склероз (MS) - еще одно аутоиммунное заболевание, являющееся объектом интенсивного исследования. MS представляет собой вызванное расстройством иммунной системы заболевание, характеризуемое инфильтрацией мононуклеаров в центральную нервную систему и ее демиелинизацией. Хотя патогенез MS неизвестен, на процесс болезни оказывает воздействие как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Основные факторы генетической предрасположенности включают в свое число отмеченную связь заболевания с конкретными гаплотипами МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса II, в частности, HLA-DR21 и DQW1 (Терасаид (Terasaid) и др., Наука, 1933:1245-1247, 1976 г , Хо (Но) и др., Имму ноге нетика, 15.509-517, 1982 г.; Шпильман (Spielman) и др., Эпидемиологическое обозрение, 4:45-65, 1982 г.; Фрэнсис (Francis) и др., Ланцет, 1:211, 1986г.; Элиан (Elian) и др., Маркеры болезни, 5:89-99, 1987г.; Урбан (Urban) и др., Клетка, 54:577-592, 1988 г.; Вандербанк (Vanderbank) и др.. Природа, 341:541-544, 1989 г.; Хауэл и др., Наука, 246.668-670, 1989 г.). Было показано, что Т-клетки, выделенные из ликвора MS-больных, используют ограниченный набор V-генов Демонстрация активированных in vivo специфических по МБР (основному миелиновому белку) Т-клеток у MS-больных, указывает на роль МВР-реактивных клеток в патогенезе болезни (Вучерпфениг (Wucherpfennig) и др., Наука, 248.1016-1019, 1990г.). Когда использование VB рецептора Т-клетки (TCR) МВР-реактивных клеточных линий определяется посредством полимераэно-цепьевой реакции (PCR) амплификации кДНК с помощью vp-праймеров TCR, обнаруживается предпочтительное использование ограниченного числа vp-генов (Вучерпфениг и др., (см. выше) - VP 17 и в меньшей степени V£ 12 часто используются в распознавании области антигенной детерминанты МВР человеческого аутоантигена); Оксенберг (Okcenberg) и др , Природа, 362.68,1993 г.). Результаты некоторых исследований также свидетельствуют об ограниченной экспрессии Va -гена рецептора Т-клеток при MS-поражениях мозга (Оксенберг и др., Природа, 345:344-346, 1990 г). Анализ популяционной кар тины Т-клеток с использованием количественной PCR и окрашивания моноклонального антитепа (mAt) показывает, что Vp 5,2 и/или 5,3 преимущественно используются МВР-специфическими Т-клеткэми, выделенными у MS-больных, по сравнению с контрольной группой {Оксенберг и др. 1993 г, (см выше) - реаранжированные Vp 5,2-гены были обнаружены в мозговых тканях больных с определенным HLA-фенотипом), и Котзин (Kotzin) и др., Труды Национальной академии наук США, 889196, 1991 г. (смещение в сторону использования р-цепи, вариабельная область 5,2, и в меньшей степени Vp" 6,1 наблюдалось у МВР-специфических клонов от MS-бопьных) В настоящее время в практике неизвестны эффективные пути лечения MS (Гэррисоновские принципы лечения внутренних болезней, 12-ое издание, Вильсон и др., McGraw Hill Inc., 1991 г.). Усилия врачей направлены на уменьшение ин тенсивности обострений, предотвращение реци дивов или прогрессирования болезни, и на ос лабление симптомов. ' ч Однако экспрессия мышиного гена Vp вариабельной области 8,2, как было выявлено, коррелирует с экспериментальным аллергическим (аутоиммунным) энцефаломиелитом (ЕАЕ), мышиной моделью человеческого MS. Было продемонстрировано, что терапевтическое воздействие мышиным Vp 8,2 специфическим мАт может и предотвращать, и ослаблять заболевание (АчаОрбеа (Acha-Orbea) и др.. Клетка, 54.263,1988 г., и Урбан и др., Клетка, 54:577, 1988 г.). Таким образом, существует насущная потребность в создании антитела или "антителоподобной" молекулы, пригодной для лечения этого заболевания. Антитела обычно содержат две тяжелые цепи, соединенные вместе дисульфидными связями, и легкую цепь, ассоциированную с N-концевой областью каждой тяжелой цепи. Каждая тяжелая цепь имеет у своего N-терминального конца вариабельную область, сопровождаемую константной областью у другого ее конца. Вариабельные области каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающую рецепторную зону. Вариабельные области на легкой и тяжелых цепях имеют ту же общую структуру, и каждая область содержит остовную структуру из четырех зон с относительно фиксированной последовательностью, соединенных тремя гиперва- -, риабельными участками (hv-участками). Четыре остовные зоны принимают нечто подобное р-складчатой конформации, а hv-участки образуют петли, соединяющие р-складчатую конструкцию. hv-участки удерживаются в непосредственной близости (друг от друга) остовными зонами и способствуют формированию антигенсвязывающей рецепторной зоны (сайта), hv-участки и ос- . товные зоны антител могут определяться обращением к номенклатуре Кэбота (Кэбот (Kabat) и др., "Белковые последовательности, представляющие иммунологический интерес", 1987 г., Департамент здравоохранения США, издательство Правительства США) при использовании рентгенкристаллографии, как это изложено в Международной заявке № WO91/Q9967. 29494 С целью получения антитела, которое может иметь своей мишенью конкретный антиген, обычно используется методика Колера и Мильстайна (Kohler н др., Природа, 256.495-497, 1Э76 г.). Эта методика обычно предусматривает иммунизацию мыши антигеном, слияние клеток селезенки от иммунизированной мыши с мышиными миеломными клетками, и выбор из полученных таким образом гибридом одной или нескольких гибридом, которые секретируют моноклональное антитело (мАт), специфическое по отношению к антигену-мишени. Было бы желательным использовать такие мАт в терапии Однако такие мАт имеют по сути своей мышиную природу и поэтому сами являются антигенами по отношению к человеческому организму. Если такие мАт повторно вводятся в человеческий организм, иммунная система человека наращивает иммунную реакцию на мышиный мАт, нивелируя его действие Поэтому было предложено, первоначально Винтером (Winter) и его сотрудниками (см., например, Райхман (Reichmann) и др., Природа, 332:323-327, 1988г, и Верхоэйен (Verhoeyen) и др , Наука, 239:15341536, 1988г.), чтобы hv-участки мышиного мАт трансплантировались в человеческую остовную структуру с целью получения трансплантированного иа hv-учзсток антитела, обладающего связывающими свойствами мышиного мАт и совместимостью человеческой структуры-акцептора. Однако функциональные характеристики молекулы антитела зависят от ее трехмерной конфигурации, которая в свою очередь зависит от ее исходной аминокислотной последовательности. Изменение аминокислотной последовательности антитела может негативно сказаться на его активности. Аналогичным образом, фрагменты антитела могут не сохранять надлежащую трехмерную конфигурацию, необходимую для поддерживания связывающей способности. Более того, изменение в кодирующей ДНК-последовательности антитела может сказываться на способности ДНК-содержащей клетки осуществлять экспрессию, секретирование или сборку антитела. Конкретные остатки, составляющие hv-участки, трудны в определении и не обязательно соответствуют всем остаткам в гипервариабельных участках, определяемым номенклатурой Кэбота. Имеются также остатки остовной структуры критического характера, роль которых важна в позиционировании hv-участков для их взаимодействия с антигеном, либо которые вовлечены во взаимодействие между тяжелыми и легкой цепями. Может быть необходимым изменить некоторые из структурных остатков таким образом, чтобы они соответствовали донорским остаткам в определенных позициях, придавая трансплантированному на hv-участок антителу менее "человеческий" характер. В публикациях содержатся различные предложения по идентифицированию остатков hv-участка и человеческой остовной структуры, которые должны быть преобразованы в донорские остатки с целью получения применимого трансплантированного на hv-участок антитела (см. например, Квин (Queen) к др , WO90/07861; Керп (Kurrle) и др . ЄР-А-0403153; Эдер (Adair) И др . WO91/09967, Квин и др , WO92/11018; и Бендиг (Bertdig) и др . WO92/01568 Из этих публикаций можно сделать вывод, что задача получения работоспособного трансплантированного на hvучасток (CDR-трансплантированного) антитела в любом конкретном случае не имеет простого решения Несмотря на проблемы, связанные с получением специфического CDR-трансплэнтированного антитепа, и предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения авторам удалось получить CDR-транспламтированное антигело. базирующееся на человеческих остовных областях и имеющее антигенсвяэывающий сайт. специфический по вариабельным областям бетацепи, присущим определенным субпопуляциям Т-клеток Что удивительно, гуманизированные антитела по настоящему изобретению проявляют столь же хорошее и даже более высокое связывающее сродство по отношению к Т-клеткам-мишеням по сравнению с их мышиными прототипами Заявляемые в настоящем документе антитела или их фрагменты обладают тем дополнительным преимуществом, что они менее иммуногенны, чем их мышиные прототипы, что таким образом снижает неблагоприятную реакцию пациента при их терапевтическом применении Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам, имеющим избирательную специфику саязызания по отношению к определенным субпопуляциям Т-клеток, при этом указанные антитела обладают высокой чувствительностью в своем связывании с этими субпопуляциями и проявляют специфичность и аффинность в ходе этого связывания, сопоставимые, если даже не превосходящие эти же характеристики мАт-прототипов, являющихся источниками происхождения большей части их hv-участков Настоящее изобретение также относится к способам получения таких гуманизированных антител с использованием нового кДНК-кодирования определенных гипервариабельных и остовных остатков и трансплантирования их в основные структуры человеческой тяжелой цепи и человеческой легкой цепи. Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к фармацевтическим составам и терапевтическим методам, использующим эти антитепа. В одном из наиболее предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения мышиное мАг (16G8). которое осуществляет распознавание чеповеческого Vp 8,1, гуманизировали CDR-трансплантировэнием определенных hv-участков и отобранных остатков остовной структуры от мышиного мАт в остовные структуры тяжелой цепи (KOL) и легкой цепи (REI). кДНК, кодирующі9 гуманизированные тяжелую (IgGi) и легкую ( Т75 в 10%ной сыворотке - к > ЗхТ75 в 5%-ной сыворотке - к > 3x2 л-флаконам в 1%-ной сыворотке) (стр. 64024). Эти двухлитровые флаконы засевали в первый день и подпитывали (заменяя половину объема свежей средой с 1%-ной сывороткой) на 2й, 5-й и 8-й дни Первый сбор выполняли на десятый день, второй - на двенадцатый день, и третий - на пятнадцатый день. Собранные супернатанты центрифугировали и хранили при -20°С до очистки. Очистка антитела на колонке с А-белком. Супернатанты от копоний культуры 2В2 объединяли (общий объем 2,7 литра) и фильтровали через 0,22-микронную мембрану из нейлона. ELlSA-тестирование на человеческий IgGi свидетельствовало о том, что общее количество исходного материала составляло 1090 мг. Антитело очищали на колонке с Prosep-A (А-белок), элюируя 0.1М цитратом при рН 5,0, 4,0 и 3,0. Элюаты диализировали в ЗФР, Количественные показатели очищенного антитела в элюированных фракциях измеряли ELISA-тестированием на человеческий IgGi. Фракция с рН 3,0 содержала основную (большую) часть очищенного антитела, тогда как во фракции с рН 4,0 было найдено лишь небольшое количество материала. ELISAтестирование на человеческий IgGi повторяли для получения более точных замеров концентрации. Общий выход ТМ27 (фракции рН 3,0 и рН 4,0) составил 960 мг. А-белковая очистка антител из супернатантов культур NSO-трансфектантов. 24 29494 тестированием на человеческий IgGi. Три клона с самой высокой продуктивностью по результатам каждого анализа рассеаали в матрасы Т75, и затем замораживали в жидком азоте В это время из среды убирали Geneticm, устраняя, таким образом, избирательность по пео1 Избирательность по DHFR сохранялась Супернатанты обследовали ELISA-тестированием на человеческий IgGi Клон 1В1-С7 продуцировал 4,69 мг/106 клеток в день Клон 2В2-Н9 продуцировал 2,65 мг/106 клеток в день Поэтому изолпт С7 был отобран в качестве конечного клона, а иэолят Н9 был отобран в качестве альтернативного клона Подготовка замороженных клеточных линий Конечный клон, отобранный выше, размножали в 5 матрасах Т225 с целью получения достаточного количества клеток, чтобы сформировать банк замороженных клеточных линий Клетки с этих матрасов собирали и объединяли Объединенная суспензия содержала 98 3% жизнеспособных клеток Общий счет жизнеспособных клеток составил 1,58 х 10", достаточное количество для подготовки желаемого числа в 72 ампулы с 2х106 клеток на ампулу Клетки замораживали и маркировали как "TM27L-662-35" Дополнительно, альтернативный клон Н9 размножали в одном матрасе Т225 с целью формирования небольшого банка замороженных клеток Собранные с этого матраса клетки были жизнеспособными на 97,3% Суспензия содержала достаточное количество клеток для подготовки 9,7 ампул с 2x106 клеток на ампулу {стр 662-89) Клетки замораживали в жидком азоте и маркировали как "TM27L-662-89" Тестирование клеток, восстановленных из замороженного материала Проверка жизнеспособности и микоплаэматического загрязнения Одну ампулу замороженного клеточного материала TM27L-662-35 оттаивали и восстанавливали в ctMEM Жизнеспособность клеток определили в 88% окрашиванием с помощью трипанового синего Сливающиеся культуры, выращенные из этой ампулы, тестировали на микоплазматическое заражение с использованием набора от Bionique Testing Laboratones Анализ не выявил никакого загрязнения Дополнительно, оттаивали одну ампулу замороженного клеточного материала TM27L-662-89 Окрашиванием с помощью трипанового синего жизнеспособность клеток была определена в 93,8% Сливающиеся культуры, выращенные из этой ампулы, тестировали на микоплазматическое заражение, как изложено выше Анализ не выявил никакого загрязнения Обе культурь» были рассеяны в матрасы Т75, и супернатанты щеточных культур обследовались ELISA-тестированием на человеческий IgGi Клон TM?7L-662-35 продуцировал 3,24 мг/106 клеток в день, а клон TM27L-662-89 продуцировал 2,52 ц.г/106 клеток в день Во втором анализе, клон ТМ2Г.-662-35 продуцировал 3,03 цг/1Ов клеток в деі-t, а клон TM27L-662-89 продуцировал 2,74 цг/ю' і леток в день Антитела из культуральных супернатантов NSO-трансфектантов очищали на колонке с Абелком в целом как описано выше Дискриминирование между антителом ТМ27 и миеломными клеточными линиями NSO Моноклонапьное антитело ТМ27, очищенное из культурных супернатантов NSO-трансфектантов с использованием хроматографии на колонке с А-белком, использовали для окрашивания клеток HPB-ALL (Vp 5,2) и клеток Джурката (Vp 8,1) в качестве отрицательного контроля в сравнении с мышиным мАт, ТМ23, и химерным ТМ27 ТМ27 давало положительное окрашивание на HPB-ALL, но не окрашивало клетки Джурката Для определения специфичности ТМ27 обычные Т-клетки PBL окрашивали с помощью ТМ27 в сравнении с мАт ТМ27 И ТМ27, и ТМ23 окрашивали примерно 3,0% всех человеческих PBL Т-клеток Был выполнен конкурентный анализ, в котором фиксированную концентрацию ФИТЦ-меченного мАт ТМ23 добавляли в различные концентрации помеченного 4Н11 или ТМ27 Смеси антител затем использовались для окрашивания HPB-ALL-клеток И немеченный ТМ23, и ТМ27 блокировали окрашивание посредством ФИТЦ-меченного ТМ23 Для определения того, может ли ТМ27 со-модулироваться с атигенном CD3, клетки HPB-ALL инкубировали с различными концентрациями мАт ТМ27 и ТМ23 до следующего дня и затем окрашивали с помощью антиCD3 мАт Результаты анализа свидетельствовали о том, что ТМ27, равно как и ТМ23, могут вызывать эндоцитоз комплекса TCR/CD3 Анализ Скэтчарда выполняли для измерения связывающего сродства ТМ27 по отношению к клеткам HPB-ALL И в анализе Скэтчарда, и в конкурентном (с мАт ТМ23) анализе результаты свидетельствовали о том, что ТМ27 сохранял примерно один и тот же уровень аффинности (Kd=2,0 x 10* М"1) и хорошо конкурировал с мАт 4Н11 Было также выполнено сравнение TM27L/NSO и TM27L/CHO в конкурентном анализе с 4Н11, результаты которого приведены на фиг. 3 Результаты приведенного анализа Скэтчарда показаны на фиг 4. Второй посев СНО-трансфектантов методом конечного разведения Посев методом конечного разведения выполняли, как изложено выше Содержимое лунок обследовали ELISA-тестированием на человеческий IgGi Клетки из шести лунок от каждого планшета (1В1-С7 и 2В2-Н9) рассевали в 24-луночные планшеты и затем обследовали ELISAтестированием на человеческий IgGi Два клона с самой высокой продуктивностью по результатам каждого анализа размножали и замораживали в жидком азоте Клоны с самой высокой производительностью от каждой партии отбирали для заключительного цикла субклонирования Третий посев СНО-трансфектантов методом конечного разведения Посев методом конечного разведения выполняли, как изложено выше Содержимое лунок обследовали ELISA-тестированием на человеческий IgGi Клетки из шести лунок от каждого планшета (1В1-С7 и 2В2-Н9) рассевали в 24-луночные планшеты и затем обследовали ELISA Экспрессия TM27L п62-35 в масштабах роплер-фла онов для очиики антитела 25 29494 Культуру TM27L-662-35 размножали с целью получения достаточного количества материала для очистки антитела TM27L Клетки переносили в двухлитровые роллер-флаконы и адаптировали к пониженным концентрациям сыворотки (через Т25 в 10%-ной сыворотке к Т75 в 10%-ной сыворотке к ЗхТ75 в 5%-ной сыворотке к 3x2 лфлаконам в 1%-ной сыворотке). Эти двухлитровые флаконы засевали в первый день и подпитывали (заменяя половину объема свежей средой с 1%-ной сывороткой) на 2-й, 5-й, 7-й и 9-й дни Первый сбор выполняли на двенадцатый день, второй - на четырнадцатый день и третий - на шестнадцатый день. Собранные супернатанты центрифугировали, фильтровали и хранили при 70еС до очистки. Очистка антитела на колонке с А-белком. Супернатанты от культур TM27L-662-35 объединяли в общий объем в 5,1 литра Антитело связывали в колонке с Prosep-A (А-белком) и элюировапи 0,1 М цитрата при рН 5,0 и 3,0. Элюат с рН 3,0 диализировали в ЗФР. Величины содержания антитела в исходном материале и в элюированных фракциях измеряли ELlSA-тестированием на человеческий lgGi/каппа. Фракция с рН 3,0 содержала примерно 3,9 мг антитела в 25 мл. Материал концентрировали на концентраторе Centriprep-ЗО (фирма Amicon) и повторяли ELISA-тестирование на человеческий lgGi/каппа. Общий выход TM27L составил примерно 3,2 мг при концентрации в 1,6 мг/мл. Предварительные характеристики очищенного антитела Проточную цитометрию выполняли примерно на 2,5 мг материала от каждой из фракций (рН 3,0 и рН 4,0) и ТМ27, очищенного из NSO-клеток. Интенсивность окрашивания на НРВ-клетках, как видно из показателей флуоресценции среднего канала, была следующей: 283,46 для фракции с рН 3,0; 321,98 для фракции с рН 4,0; 506,79 для ТМ27 от NSO На клетках Джурката окрашивание было на уровне фона для всех проб. Пример 2. Последовательности CDRтрансплантиро ванных антител ТМ27 в сравнении с кластерами человеческой остовной структуры ТМ27 VK 1 DIQMTQSPSSISASVGDRVTITCSASQG1SNYLNWYQQTPGKAPKLUYY pcrj ________________________.______________ r\ ____ г»— Ik" ____ — ____________________ с ПСІ — ===—=~=== ----- =:===—=:====—_г===1^:=| ГЧ ==:=;_====:;__====:~=[; _ Q ______ „_ ________ \ f __________________A = == О == = _ = = == = _ f t= = = = — _ == = = ft TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ A==N=QA-==-====r===-=:====-===-=====-======:=QS==Y-:=== 100 ___________________ o i ______ м _ с ____________ _ _ ___________ _, ______ *•» = = —_ = = == = ; =: _= = = __ = = = =_^ L = = 1 4= _ = = _= == = = = = == = = == = = = = = \j ТМ23 ===_==TT-=:====L======S===-:==-======-==K-DGTV=-==-WAL * 107 51 REI TM23 Dpi WAL GTKLQIT 101 50 _______ TM23 ====E=:K ' WAL ==R=E=K TM27 VH I* QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGRGLEWLGM NEWM HIL 51 ==K=VQA=G=V=Q=GRS=R=S=IA===TFSN==MH====A==K~==VAV IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV TM23 ====-=======:-==l HIL =_YN=S=Y=GDSV=G=F=ISR=N==RTLYMZMN=LRTE==-=======PD R 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS NEW MAGCIDV =-==-==-=-TM23 ====-=====-==TS=-== LJIl II 100 120 _*rOC ——__ \/l _____ " HuHV имеет L в поз. 48. цепи. TM27L с лейцином в позиции 48 тяжелой ТМ27І с изо лейцином в позиции 48 тяжелой цепи. ТМ27.1 с изменениями FS на VF (78-79). ТМ27.2 с изменениями VTMUT на LSIS/N (66-69/73). ТМ27.3 с изменениями V на R (92). Пример 3. Анализ Скэтчарда для ТМ23. Эксп. Kd Рецепторы/клетка 617:096 3,27е-8 М 3,04е5 617:115 2,30е-8М 2,43е5 617:119 2,46е-8М 2,46е5 Средние значения: Kd = 2,52 (±0,67)е-8 М Рецепторы/клетка - 2.64е5 Анализ Скэтчарда для ТМ27 Эксп. Kd Рецепторы/клетка 3,31е4 2,47е4 613:78 1.48е-8М 613:82 1,14е-8 М Средние значения: Kd =1,31 (±0,24)е-8М Рецепторы/клетка = 2,89е4 Пример 4. Краткое изложение работы по TM27I TM27I (48) с COS/CHO: 26 29494 * Подготовка кДНК из CDR-трансплантированных V-областей HSO-продуцентной линии, PCR-амплификация, секвенировакие * Клонирование ДНК-фрагментов в pTCSLNeo в кДНК-конфигурации * Котрансфецирование плазмиды с PTCSLDHFRTM27K в COS и СНО * Положительные результаты ELISA-тестирования экспрессии человеческого IgGi/к от суТяжелая цепь 10 20 TTRAP пернатантов COS-кпеток показали, что концентрации плазмид правильны * Отбор, размножение и клонирование СНО-клеточных трансфектантов Клетки были заморожены в жидком азоте после одного клонирования Пример 5. Данные аминокислотной последователь ности, полученные от кДНК 16G8 30 40 50 HRPLT MDSRL NLVFL VLILK GVQCD 70 80 QCD VQLVE 90 VQPGG SRKLS CAASG FTFSN FGMHW VRQAP DKGLE 110 120 130 WVAYI SSGSS • * • 140 DTLKG RFTIS RDNPK NTLFL QMTSL RSEDT AMYYC * ARRGE GAMDY 160 170 SVTVS RSSHS VISTE 60 SAKTT PPSVY Легкая цепь KFXYT MDFQV 60 30 QIFSF VTMSC RASSS VNYIY TRFSG SGSGN 110 SYSLT TIYYA 150 WGQGT PLAPG 10 20 ISQGT SGGGL 100 ISSME GEDAA TYYCQ 153 LLISI 70 120 40 SWMS RGENV LTQSP 80 90 WYQQK SDASP KLWIY 130 QFTSS PFTFG SGTKL YTSNL 50 AIMSA APGVP 150 140 EIKRA SLGEK 100 DAAPT VSIFP PSS Данные секвенирования белков bbDVQLVE'GGGLVQPG UENVLTQ Пример 6. Краткое изложение работы по ТМ29 * Подготовка гибридом, в существенной степени как изложено в примере 1, и выделение КДНК (описана в примере 5) * Клонирование изолированных кДНК (Н и к) (из шбридомы 16G8) в векторы М 13 * Введение человеческой остовной структу ры (VHKOI/VKREI) посредством мутагенеза * Клонирование CDR-трансплантированных V-областей в миеломные векторы экспрессии * Очистка гуманизированных антител (при мерно 1мг каждого) из NSO-трансфектантов для Предварительной оценки Были получены четыре различных ТМ29 ТМ29 ТМ29 1 с изменениями SS на АА (23-24) ТМ29 2 с изменением S на Р (75) ТМ29 3 с изменениями GV/F на AM/Y {9293/95) Подробное описание хода эксперимента ТМ29. Выделение константной области человеческой каппа-цепи с помощью PCR-метода Используя непереваренную плазмиду pSV184AH-Neo/DNS-VKCK (pSVHuk, которая содержит константную область человеческой каппа-цепи), выполняли PCR с двумя праймерами (одним прямым и одним обратным) для изолирования указанной константной области Олигомеры (праймеры) были получены от фирмы "Орегон". Реактивы для реакции PCR были взяты из набора ДНК-амплификационных реактивов "GeneAmp" с "AmpliTaq" ( Perktn-Elmer Cetus") PCR-реакции осуществлялись при трех различных концентрациях Мд2* Аликвоты PCR-продуктов анализировали на 1%-ном агарозном геле Был выбран продукт от первой пробы Мд2* (концентрация 1,5 мМ) Праймеры, фланкирующие С-область были рассчитаны на содержание рестрикционноферментных сайтов для целей клонирования Таким образом, амплифицированную ДНК переваривали с EcoRI (у конца З1) Сайт у конца 5' (Pvull) не переваривали Переваренный ДНК-фрагмент затем прогоняли на 1%-ном агароэном геле, и зону в 300 п/о эксцизировали ДНК экстрагировали из геля, и небольшую аликвоту анализировали на 1%-ном агарозном геле для определения качества и оценки количества Полоска в 300 п/о оказалась чистой, и общее количество ДНК по оценке составило примерно 140 нг Клонирование константной области человеческой каппа-цепи в вектор pBS KS+ и секвенирование EcoRI-переваренный ДНК-фрагмент константной области человеческой каппа-цепи вставляли в вектор pBS KS* переваренный с Smal и EcoRI используя ДНК-лигазу Т4 Эту лигационную смесь использовали для трансформирования ОН5а-компетентных клеток Е coli Были соб 27 29494 раны единичные колонии, которые использовались для инокуляции 24 суспендированных культур. От каждой из культур подготавливали ДНК. Каждая проба ДНК переваривалась с Pvull (конец 5' Ск) и EcoRI (конец 3' С„) и анализировалась на 2%-ном агарозном геле. Из-за сложности в отделении полос нижнего ранга (300 п/о) ДНК-пробы переваривались только с Pvull. После анализа на 2%-ном агарозном геле 19 из 24 проб оказались эерными для Ск-инсерций Пробы №№1-5 (из 19 давильных проб) были выбраны для секвенирозания, с использованием праймеров Т7 и ТЗ ^последовательности в векторе, фланкирующие эставку). Другие реактивы для секвенирования 5ыли взяты из набора "Секвеназа, версия 2.0" USB). Проба № 5 показала наличие правильной госледовательности для константной области іеловеческой каппа-цепи. Клонирование константной области чепоіеческой каппа-цепи в вектор экспрессии млекоіитающих - pTCSLDHFR* для преобразования »го в pTCLCDHFR*. Константную область человеческой каппа-*епи изолировали от вектора pBS KS* (проба Js5), используя рестрикционные ферменты Pvull і EcoRI. Однако из-за уже знакомой проблемы в тделении полос второй перевар был выполнен конструкцией pBS/человеческая С*. Второе пе-еваривание задействовало EcoR! и ХЬа( (распоюженный 5' к сайту Pvull) и дало фрагмент приіерно в 300 п/о. Этот фрагмент затем очищали элем и подвергали Pvull-перевариванию с цел-ю удаления остающихся небольших фрагмен-ов вектора у конца 5' Си. Этот конечный фраг-іент очищали гелем и анализировали на 1%-ном га розном геле с целью определения качества и ценки количества. Было выяснено, что Ск-ДНК редставляет собой чистую полоску с -280 п/о и общим количеством по оценке примерно 135 иг. Из-за наличия трех EcoRI-сайтов в векторе кспрессии, pTCSLDHFR*, было определено, что юнирование лучше всего осуществлять в сайт vull. Поскольку Ск-ДНК была подготовлена певвариванием с Pvuil-EcoRl, для EcoRl-конца выолняли репарацию (формируя "тупой" конец), спользуя фрагмент Кленова. Восстановленную «-ДНК с "тупым" концом лигировали с вектором TCSLDHFR*, переваренным с Pvull и обрабоанным фосфатазой (с использованием фосфаэзы, полученной из тонкого кишечника телят), ту лигационную смесь использовали для трансформирования ОН5а-компетентных клеток Е. coli. циничные колонии собирали и использовали для чокуляции 24 суспендированных культур. Из каж-эй была подготовлена ДНК. Все ДНК-пробы пеэваривали с Pvull и HindHl и анализировали на Уо-ном агарозном геле. Было определено, что 1ть проб из двадцати четырех содержали С*-всівку в правильной ориентации. Проба № 7 была гобрана для дальнейшей работы. Замещение мутантного DHFR'-гена DHFRіном "дикого" типа. Для экспрессии вектора pTCLCDHFR* в ІМҐ) DUX В11-клвтках CHOf DHFR* -ген замеали DHFR-геном. ДНК от pTCLCDHFR'- пробы і 7, а также pSV2-DHFR (плаэмиду, полученную ' д-ра Пола Берга, см. выше), переваривали с рестрикционными ферментами Hindlll и Bgilt, изолируя соответствующие генные фрагменты. По результатам анализа было определено, что дополнитель ный BgHI-сайт в векторе pTCLC*DHFR" также удалял часть сайта polyA, что могло бы помешать векторной функции. Поэтому переваривание повторяли, используя Hindlll и BamHI. Часть (DHFR*) pTCSLCK вектора обрабатывали фосфатазой. Затем оба изолированных фрагмента (pTCSLC» и DHFR) очищали гелем и анализировали на 1%-ном агарозном геле для определения качества и оценки количества. Обе полоски по результатам анализа были чистыми и, по оценке, имели сходную концентрацию - примерно 40-50 нг/мл. DHFR-ген лигировали с вектором pTCSLCK, используя ДНК-лигазу Т4. Лигационную смесь использовали для трансформирования DH5ct-компетентных клеток Е. coli. Единичные колонии собирали и использовали для инокуляции 24 суспендированных культур. Из каждой приготавливали ДНК. ДНК анализировали перевариванием с рестрикционными ферментами Hindlll и BamHI. 23 из 24 культур давапи правильные полоски, указывающие на инсорцию DHFR-гена в вектор pTCSLCn. Пробу № 22 отбирали для дальнейшего использования. Клонирование PCR-изолированной V-области человеческой каппа-цепи в СНО-вектор pTCSLCDHFR. кДНК для V-области каппа-цепи для 16G8 очищали гелем и переваривали с соответствующими рестрикционными ферментами. Небольшую аликвоту ДНК-пробы анализировали на 1%-ном агарозном геле для оценки количества и проверки качества. Лишняя (контаминантная) полоска наблюдалась примерно у 800 п/о; концентрация по оценке составила 1,25 иг/мл. V-область лигировали с вектором pTCSLC^DHFR, переваренным с рестрикционными ферментами Xhol и Pvull и обработанным фосфатазой. Лигационную смесь использовали для трансформирования компетентных ОН5а-клеток Е. coli. Выход транс- . формантных колоний был очень низким. Единичные колонии собирали и использовали для инокуляции двенадцати суспендированных культур. Из каждой подготавливали ДНК, которую переваривали с Xhol и Pvull и анализировали на 1%-ном агарозном геле. Четыре пробы были положительными: № 1, № 4, № 7 и № 10. Каждую из положительных проб секвенировали. PCR-иэолированпую V-область гамма-цепи ТМ29 клонировали в СНО-вектор pTCSLCgi NeoApa. Двухцепочечное секвенирование V-области человеческой каппа-цепи. Четыре пробы от 16G8 (NeNei, 4, 7 и 10) секвенировали для обеих цепочек. Обратную цепочку секвенировали полностью, через рестрикционноферментные сайты (3'-5'; Pvull-Xhol). используя праймер HUCK5PR. Обе пробы № 1 и № 4 давали правильные последовательности, проба № 7 не секвенировэлась, а проба № 10 имела неправильную последовательность. Для проб № 1 и Ne 4 последовательность прямой цепочки определяли, используя два различных праймера, PTCSFOR и PTCSFWD. Последовательность по всей длине через рестрикционноферментные сайты (5'-3'; Xhol-Pyull) получали, объединяя пос 28