Способи генетичного контролю ураження рослин комахами і композиції, застосовані для цього

Реферат: Винахід належить до виділених полінуклеотидів дволанцюгових молекул РНК для інгібування експресії одного або більше генів-мішеней в твердокрилого паразита, що призводить до інгібування однієї або більше біологічних функцій зазначеного твердокрилого паразита. Винахід також належить до трансгенних рослин та їх насіння, що містять зазначені дволанцюгові молекули РНК, які забезпечують стійкість до твердокрилих шкідників. Винахід також належить до способу одержання трансгенних рослин, які експресують зазначені дволанцюгові молекули РНК для їх застосування в захисті рослин від ураження шкідниками. UA 98445 C2 (12) UA 98445 C2 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Перелік послідовностей представлений на одному компакт-диску (Копія 1), разом з його дублікатом (Копія 2), кожний з яких створений 15 вересня 2006, і кожний з яких містить один файл розміром 669 КБ, що має ім'я "MNDE002.APP.TXT". Матеріал, що міститься на компактдиску, особливим чином наведений тут як посилання. Ця заявка вимагає пріоритет Попередньої заявки США Сер. № 60/718034, поданої 16 вересня 2005, яка наведена тут як посилання в повному об'ємі. Даний винахід належить в основному до генетичного контролю ураження паразитами. А саме, даний винахід належить до технологій рекомбінантної ДНК для посттранскрипційного репресингу або інгібування експресії заданих кодуючих послідовностей в клітинах паразитів для забезпечення захисного ефекту від паразитів. Навколишнє середовище, в якому живуть люди, насичене паразитами. Паразити, включаючи комах, павукоподібних, ракоподібних, грибки, бактерії, віруси, нематоди, плоских черв'яків, круглих черв'яків, гостриків, анкілостоми, стрічкових черв'яків, трипаносоми, шистосоми, оводів, бліх, коростяних кліщів, кліщів і вошей і т. п., поширені в середовищі, оточуючому людину. У спробі контролю над ураженнями цими паразитами застосовували множину засобів. Композиції для контролю над ураженнями мікроскопічними паразитами, такими як бактерії, грибки і віруси, надавали у формі антибіотичних композицій, противірусних композицій і протигрибкових композицій. Композиції для контролю над ураженнями паразитами великих розмірів, такими як нематоди, плоскі черв'яки, круглі черв'яки, гострики, серцеві черв'яки, солітери, трипаносоми, шистосоми і т. п., звичайно мали форму хімічних композицій, які можна наносити на поверхні, на яких присутні паразити, або вводити ураженим тваринам у формі гранул, порошків, таблеток, паст або капсул і т. п. В галузі техніки існує велика потреба в поліпшенні цих способів і особливо в способах, які будуть надавати сприятливий вплив на навколишнє середовище в порівнянні з попередніми способами. Комерційні зернові культури часто є об'єктами ураження комахами. У останні декілька десятиріч досягнутий суттєвий прогрес в розробці більш ефективних способів і композицій для керування ураженням рослин комахами. Хімічні пестициди були дуже ефективними в ліквідації уражень паразитами. Однак, існує ряд недоліків застосування хімічних пестицидних агентів. Хімічні пестицидні агенти є неселективними. При застосуванні хімічних пестицидів, призначених для контролю над безхребетними паразитами, такими як твердокрилі комахи, включаючи види кукурудзяних жуків, які згубні для різних зернових культур і інших рослин, також виявляється вплив на фауну, яка не є мішенню, що часто ефективно стерилізуючи область на період часу, протягом якого застосовуються пестицидні агенти. Хімічні пестицидні агенти персистують в навколишньому середовищі і в основному повільно піддаються метаболізму, якщо це загалом має місце. Вони акумулюються в ланцюгу живлення, і особливо у видів вищих хижаків. Акумулювання цих хімічних пестицидних агентів приводить до розвитку стійкості до агентів, і у видів, що знаходяться вище на еволюційних сходинках, агенти можуть діяти як мутагени і/або канцерогени, викликаючи незворотні і згубні генетичні модифікації. Таким чином дуже довго існує потреба в нешкідливих для навколишнього середовища способах контролю або викорінювання паразитування комах на або в рослинах, тобто в способах, які є селективними, інертними до навколишнього середовища, нестійкими і біорозкладаними, і які добре придатні для схем менеджменту стійкості паразитів. Композиції, що містять бактерії Bacillus thuringiensis (Bt), були комерційно доступні і застосовувалися як екологічно безпечні і прийнятні інсектициди протягом більше тридцяти років. Інсектицидний ефект бактерій Bt не зберігається в навколишньому середовищі, бактерії високоселективні відносно уражених видів-мішеней, виявляють свої ефекти тільки при прийомі всередину паразитом-мішенню, і, як показано, є безпечними для рослин і інших організмів, для яких вони не призначені, включаючи людей. Трансгенні рослини, що містять один або більше генів, які кодують інсектицидний білок Bt, також доступні в галузі техніки і помітно ефективні в контролі ураження комахами-паразитами. Реальним результатом застосування рекомбінантних рослин, експресуючих інсектицидні білки Bt, є помітне зменшення кількості хімічних пестицидних агентів, які застосовуються в навколишньому середовищі для контролю ураження паразитами на полях з сільськогосподарськими культурами в областях, в яких застосовують подібні трансгенні зернові культури. Зменшення застосування хімічних пестицидних агентів привело до більш чистих ґрунтів і більш чистої води, що стікає з ґрунту в навколишні струмки, ріки, ставки і озера. На доповнення до цих переваг відносно навколишнього середовища, спостерігалося значне збільшення числа корисних комах на полях з сільськогосподарськими культурами, на яких виростають трансгенні сільськогосподарські культури, стійкі до комах, внаслідок зменшення застосування хімічних інсектицидних агентів. 1 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антисмислові способи і композиції описані в галузі техніки і, як вважають, надають ефекти за допомогою синтезу одноланцюгової молекули РНК, яка, в теорії, гібридизується in vivo з утворенням в основному комплементарного смислового ланцюжка молекули РНК. Антисмислову технологію було важко застосовувати в багатьох системах через три основні причини. По-перше, антисмислова послідовність, експресована в трансформованій клітині, є нестійкою. По-друге, нестійкість антисмислової послідовності, експресованої в трансформованій клітині, одночасно створює ускладнення в доставці послідовності хазяїну, типу клітини, або біологічній системі, що знаходиться на відстані від трансгенної клітини. По-третє, ускладнення, пов'язані з нестійкістю і доставкою антисенсорної послідовності, створюють ускладнення в спробі надання в межах рекомбінантної клітини, експресуючої антисенсорну послідовність, дози, яка може ефективно модулювати рівень експресії заданої смислової нуклеотидної послідовності. Існують нечисленні поліпшення в технологіях модулювання рівня експресії генів в клітинах, тканинах або організмі, і, зокрема, не вистачає розроблених технологій для затримання, репресингу або іншого ослаблення експресії специфічних генів із застосуванням технології рекомбінантної ДНК. Крім того, як наслідок непередбачуваності цих підходів, не доступні ніякі комерційно прийнятні засоби для модулювання рівня експресії специфічного гена в еукаріотичному або прокаріотичному організмі. Раніше демонструвалася дволанцюгова РНК, що опосередковує інгібування специфічних генів у різних паразитів. Підходи до генетичного контролю, опосередковані длРНК, тестували на плодових мушках Drosophila melanogaster (Kennerdell і Carthew, 1998; Kennerdell i Carthew, 2000). Kennerdell і Carthew (1998) описують спосіб доставки длРНК, який включає створення трансгенних комах, які експресують дволанцюгові молекули РНК, або введення розчинів длРНК в організм комахи або в захисну оболонку яйця до або під час ембріонального розвитку. Раніше дослідники довели, що супресії генів, опосередкованої дволанцюговою РНК, можна досягнути у нематод або за допомогою годування, або за допомогою витримування нематод в розчинах, що містять дволанцюгові або малі інтерферуючі молекули РНК, і за допомогою введення молекул длРНК. Rajagopal і ін. (2002) описали невдалі спроби супресії ендогенного гена у личинок комахи-паразита Spodoptera litura за допомогою годування або витримування новонароджених личинок в розчинах, що містять длРНК, специфічну для заданого гена, але успішну супресію після введення в гемолімфу личинкам 5-тої вікової стадії длРНК, застосовуючи мікроаплікатор. Зовсім нещодавно, Yadav і ін. (2006) повідомили, що вироблена хазяїном длРНК, утворювана в рослинах, може захищати такі рослини від інфікування нематодами. Точно так само в опублікованій заявці на патент США № 2003/0150017 описаний переважний локус інгібування личинок лускокрилого Helicoverpa armigera за допомогою доставки длРНК в личинки за допомогою поїдання рослини, трансформованої для продукції длРНК. Згідно з положеннями WO 2005/110068, в харчовому раціоні кукурудзяного жука (CRW) забезпечується наявність CRW-специфічної длРНК, направленої на життєво важливі гени CRW. длРНК надається в харчовому раціоні CRW in vitro і in planta, що в результаті приводить до сповільнення росту личинок CRW або їх загибелі після поїдання продуктів з харчового раціону, і цей ефект був продемонстрований для декількох різних генів. Таким чином, існує потреба у виявленні ефективних нуклеотидних послідовностей для застосування в поліпшених способах модуляції експресії генів за допомогою репресингу, затримання або іншого ослаблення експресії генів у конкретного твердокрилого паразита з метою контролю ураження паразитом або для привнесення нових фенотипічних ознак. У одному аспекті винахід надає спосіб інгібування експресії гена-мішені у твердокрилого паразита. У деяких варіантах здійснення спосіб включає модуляцію або інгібування експресії одного або більше генів-мішеней у твердокрилого паразита, що спричиняє припинення харчової активності, росту, розвитку, репродукції і/або інфекційності, і зрештою приводить до загибелі комахи. Спосіб включає введення частково або повністю стабілізованої дволанцюгової РНК (длРНК), включаючи її модифіковані форми, такі як послідовності малої інтерферуючої РНК (siРНК), в клітини або у позаклітинний простір, наприклад, в середню кишку, в організмі твердокрилого паразита, де длРНК надходить в клітини і інгібує експресію принаймні одного або більше генів-мішеней, і при цьому інгібування надає згубний ефект на твердокрилого паразита. Способи і супутні композиції можуть застосовуватися для обмеження або усунення паразитування твердокрилого паразита в організмі або на поверхні будь-якого хазяїна паразита, симбіонта паразита або в навколишньому середовищу, в якому присутній паразит, за допомогою забезпечення наявності в дієті паразита однієї або більше композиції, що включають длРНК молекули, описані тут. Спосіб буде мати, зокрема, перевагу в захисті рослин від ураження комахами. У одному варіанті здійснення, паразит визначається як такий, що має рН 2 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 травної системи в межах діапазону від приблизно 4,5 до приблизно 9,5, від приблизно 5 до приблизно 9, від приблизно 6 до приблизно 8 і приблизно 7,0. У іншому аспекті даний винахід надає зразкові композиції нуклеїнової кислоти, які є гомологічними принаймні частині однієї або більше нативних послідовностей нуклеїнової кислоти у паразита-мішені. У деяких варіантах здійснення, паразит вибраний з числа Diabrotica sp. включаючи Західного кукурудзяного жука (WCR, Diabrotica virgifera або Diabrotica virgifera virgifera), Південного кукурудзяного жука (SCR, Diabrotica undecimpunctata howardi), Мексиканського кукурудзяного жука (MCR, Diabrotica virgifera zea), Бразильського кукурудзяного жука (BZR, Diabrotica balteata, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa), Північного кукурудзяного жука (NCR, Diabrotica barberi), Diabrotica undecimpunctata; а також картопляного колорадського жука (СРВ, Leptinotarsa decemlineata), хрущака капітанового (RFB, Tribolium castaneum) і мексиканську зернівку бобову (Epilachna varivestis). У інших варіантах здійснення паразит вибраний з числа лускокрилих комах, включаючи Метелика кукурудзяного (ЕСВ, Ostrinia nubilalis), Чорну совку (BCW, Agrotis ipsilon), Совку бавовняну (CEW, Helicoverpa zea), совку трав'яну (FAW, Spodoptera frugiperda), бавовняного довгоносика (BWV, Anthonomus grandis) шовковичного шовкопряда (Bombyx mori) і Manduca sexta, і з двокрилих комах, включаючи Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae i Aedes aegypti. Специфічні приклади таких нуклеїнових кислот, що надаються відповідно до винаходу, дані в прикладеному переліку послідовностей з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906. У ще одному аспекті, винахід надає спосіб супресії експресії гена у твердокрилого паразита, такого як кукурудзяний жук, або у родинних видів, який включає крок забезпечення в харчовому раціоні паразита в кількості, що викликає супресію гена, принаймні однієї молекули длРНК, транскрибованої від нуклеотидної послідовності, як описано тут, принаймні один сегмент якої є комплементарним послідовності мРНК в клітинах паразита. Спосіб може далі включати спостереження загибелі, інгібування, зупинення росту або припинення харчової активності паразита. Молекула длРНК, включаючи її модифіковану форму, таку як молекула siPHК, згодовувана паразиту відповідно до винаходу, може бути принаймні від приблизно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або приблизно 100% ідентичною молекулі РНК, транскрибованій від нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, що включає з SEQ ED NO:1 по SEQ ID NO:906. У окремих варіантах здійснення нуклеотидна послідовність може бути вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO:697, SEQ ID NO:813-819, SEQ ID NO:841 і SEQ ID NO:874. Відповідно, в іншому аспекті даного винаходу надається набір ізольованих і очищених нуклеотидних послідовностей, як указано з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906. Даний винахід надає стабілізовану длРНК молекулу або експресію однієї або більше miPHКs для інгібування експресії гена-мішені у твердокрилого паразита, що експресується від цих послідовностей і їх фрагментів. Стабілізована молекула длРНК, включаючи mіРНК або siPHК, може включати принаймні дві кодуючі послідовності, які розташовані в смисловій і антисмисловій орієнтації відносно принаймні одного промотору, при цьому нуклеотидна послідовність, яка включає смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг, зв'язує або з'єднує за допомогою спейсерної послідовності принаймні від приблизно п'яти до приблизно однієї тисячі нуклеотидів, при цьому смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг можуть бути різної довжини, і при цьому кожна з двох кодуючих послідовностей має принаймні 80% ідентичність послідовності, принаймні 90%, принаймні 95%, принаймні 98% або 100% ідентичність послідовності будь-якій одній або більше нуклеотидним послідовностям, вказаним з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906. Далі винахід надає фрагмент або конкатемер послідовності нуклеїнової кислоти, вибраної з групи, що включає від SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906. У специфічних варіантах здійснення, нуклеотидна послідовність може включати фрагмент або конкатемер послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO:697, SEQ ID NOs:813-819, SEQ ID NO:841, і SEQ ID NO:874. Фрагмент може бути визначений як такий, що викликає загибель, інгібування, зупинення росту або припинення харчової активності паразита при експресії у вигляді длРНК і наданні паразиту. Фрагмент може, наприклад, включати принаймні приблизно 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 або більше суміжних нуклеотидів з будь-якої однієї або більше послідовностей з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, або їх комплементів. Один корисний сегмент ДНК для застосування в даному винаході має довжину принаймні від приблизно 19 до приблизно 23 або від приблизно 23 до приблизно 100 нуклеотидів, до приблизно 2000 нуклеотидів або більше. Особливо ефективними будуть послідовності длРНК, що включають від приблизно 23 до приблизно 300 нуклеотидів, гомологічних заданій послідовності паразита. Винахід також надає рибонуклеїнову кислоту, що експресується від будь-якої з таких послідовностей, включаючи длРНК. Послідовність, вибрана для застосування в експресії агента супресії гена, може бути створена з 3 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 однієї послідовності, одержаної від одного або більше паразитів-мішеней і призначеної для застосування в експресії РНК, яка бере участь в супресії одного гена або сімейства генів в одному або більше паразитах-мішенях, або ця послідовність ДНК може бути створена у вигляді химери з множини послідовностей ДНК. У ще одному аспекті винахід надає рекомбінантні конструкти ДНК, включаючи молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує описану тут молекулу длРНК. длРНК може бути сформована за допомогою транскрипції одного ланцюга молекули длРНК від нуклеотидної послідовності, яка є принаймні від приблизно 80% до приблизно 100% ідентичною нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що включає від SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906. Такі рекомбінантні конструкти ДНК можуть бути визначені як продукуючі молекули длРНК, здатні інгібувати експресію ендогенного гена(ів)-мішені(ей) в клітині паразита після прийому всередину. Конструкт може включати нуклеотидну послідовність винаходу, операбельно зв'язану з промоторною послідовністю, яка функціонує в клітині хазяїна. Такий промотор може бути тканеспецифічним і може, наприклад, бути специфічним до типу тканини, яка є об'єктом ураження паразитом. Наприклад, у випадку жуків, що паразитують на корінні рослин, може бути бажаним застосування промотору, який забезпечує коренеспецифічну експресію. Конструкти нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу можуть включати принаймні одну нуклеотидну послідовність не природного походження, яка може бути транскрибована в одноланцюгову РНК, здатну до утворення молекули длРНК in vivo за допомогою гібридизації. Такі послідовності длРНК збираються самостійно і можуть забезпечуватися в харчовому раціоні твердокрилого паразита для досягнення бажаного інгібування. Рекомбінантний конструкт ДНК може включати дві різні послідовності не природного походження, які при експресії in vivo у вигляді послідовності длРНК і знаходженні в харчовому раціоні твердокрилого паразита, інгібують експресію принаймні двох різних генів-мішеней в клітині твердокрилого паразита. У деяких варіантах здійснення в клітині або рослині, що включає клітину, продукуються принаймні 3, 4, 5, 6, 8 або 10 або більше різних длРНК, які мають ефект інгібування паразита. длРНК може експресуватися від множини конструктів, включених в різні об'єкти трансформації, або може бути включена в одиночну молекулу нуклеїнової кислоти. длРНК можуть експресуватися за допомогою одиночного промотору або множини промоторів. У деяких варіантах здійснення винаходу продукуються одиночні длРНК, які включають нуклеїнові кислоти, гомологічні множині локусів у паразита. У ще одному аспекті винахід надає рекомбінантні клітини хазяїна, що мають в своєму геномі принаймні одну рекомбінантну послідовність ДНК, яка транскрибується для продукції принаймні однієї молекули длРНК, яка після прийняття всередину твердокрилим паразитом здійснює інгібування експресії гена-мішені у паразита. Молекула длРНК може бути закодована будь-якою з нуклеїнових кислот, описаних тут і вказаних в переліку послідовностей. Даний винахід також надає трансформовану клітину рослини, яка має в своєму геномі принаймні одну описану тут рекомбінантну послідовність ДНК. Також надаються трансгенні рослини, які включають таку трансформовану клітину рослини, включаючи потомство рослин будь-якого покоління, насіння і продукти рослин, кожне з яких включає рекомбінантну ДНК. Способи і композиції даного винаходу можуть бути застосовні до будь-якої однодольної і дводольної рослини, залежно від бажаного контролю твердокрилого паразита. Зокрема, до рослин належать, не обмежуючись ними, люцерна, кріп, яблуко, абрикоса, артишок, рукола, спаржа, авокадо, банан, ячмінь, боби, буряк, ожина, чорниця, броколі, брюссельська капуста, капуста кочанна, канола, канталупа, морква, маніока, цвітна капуста, селера, вишня, кінза, цитрусові, климентині, кава, кукурудза, бавовна, огірки, Дугласова ялиця, баклажан, ендивій, ескаріоль, евкаліпт, фенхель, фікус, гарбуз, виноград, грейпфрут, диня мускатна біла, хікама, ківі, салат-латук, цибуля-порей, лимон, лайм, сосна ладанна, манго, диня, гриби, горіх, овес, окра, цибуля, апельсин, декоративні рослини, папайя, петрушка, горох, персик, арахіс, груша, перець, хурма, сосна, ананас, банан, слива, гранат, тополя, картопля, гарбуз, айва, сосна промениста, радикіо, редька, малина, рис, жито, сорго звичайне, південна сосна, соя, шпинат, патисон, суниці, цукровий буряк, цукровий очерет, соняшник, солодка картопля, амброве дерево, мандарин, чай, тютюн, томати, дерен, виноградна лоза, гарбуз, пшениця, ямс і цукіні. Таким чином, винахід також надає рослину, трансформовану за допомогою рекомбінантної послідовності ДНК, як указано з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, або її конкатемеру, фрагмента або комплементу, який транскрибується для продукції принаймні однієї молекули длРНК, яка після прийому всередину твердокрилим паразитом приводить до інгібування експресії генамішені у паразита. У специфічних варіантах здійснення, рекомбінантна послідовність ДНК може бути вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO:697, SEQ ID NO:813-819, SEQ ID NO:841, і SEQ ID NO:874 або їх фрагмента, комплементу або конкатемеру. 4 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід також надає комбінації способів і композицій для контролю ураження твердокрилими паразитами. Тоді як в методах надається спосіб длРНК, як описано тут, для захисту рослини від ураження комахою нарівні з одним або більше інсектицидними агентами, який має властивості, відмінні від властивостей, характерних для способів і композицій длРНК. Наприклад, один або більше Bt білків можна включити в харчовий раціон комах-паразитів в комбінації з однією або більше длРНК, як описано тут. Композицію, сформульовану для місцевого нанесення або одержувану за допомогою трансгенного підходу, який об'єднує способи і композиції длРНК з Bt, можна застосовувати для забезпечення синергій, які раніше не були відомі в галузі техніки для контролю ураження комахами. При цьому, синергія є скороченням рівня експресії, необхідної або для длРНК, або для білка(ів) Bt. При об'єднанні разом, для контролю шкідників може застосовуватися найменша ефективна доза кожного агента. Вважають, що інсектицидні білки Bt створюють вхідні пори, через які молекули длРНК здатні більш ефективно проникати в місця, що знаходяться на відстані від кишечнику комахипаразита, або більш ефективно проникати в клітини, що знаходяться поблизу ділянок пошкодження, створених білками Bt, таким чином потрібна менша кількість або Bt, або длРНК для досягнення бажаного інсектицидного результату або бажаного інгібування або супресії заданої біологічної функції у паразита-мішені. Таким чином, даний винахід надає композицію, яка містить два або більше різні пестицидних агентів, кожний з яких є токсичним для одного і того ж виду паразита або комахи, принаймні один з яких включає описану тут длРНК. У деяких варіантах здійснення, другий агент може бути агентом, вибраним з групи, що складається з пататину, інсектицидного білка Bacillus thuringiensis, інсектицидного білка Xenorhabdus, інсектицидного білка Photorhabdus, інсектицидного білка Bacillus laterosporous, інсектицидного білка Bacillus sphaericus і лігніну. Інсектицидний білок Bacillus thuringiensis може бути будь-яким з множини інсектицидних білків, включаючи, але не обмежуючись ними, Cry1, Сrу3, ТІС851, CryETTO, Cry22, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, бінарний інсектицидний білок СrуЕТ33 і СrуЕТ34, бінарний інсектицидний білок CryETSO і СrуЕТ76, бінарний інсектицидний білок TIC100 і TIC101, бінарний інсектицидний білок PS149B1, інсектицидний білок VIP, TIC900 або родинний білок або комбінації інсектицидних білків ЕТ29 або ЕТ37 з інсектицидними білками ТІС810 або ТІС812, і інсектицидними химерами будь-якого з вищезгаданих інсектицидних білків. Рибонуклеїнову кислоту, яку вносять в харчовий раціон, можна вносити в штучний харчовий субстрат, складений для забезпечення специфічних потреб в поживних речовинах для утримання паразита на такому харчовому субстраті. Харчовий субстрат може бути підкріплений контролюючою паразита кількістю РНК, очищеної від системи окремої експресії, для визначення кількості композиції РНК, контролюючого паразита, або визначення міри супресивної активності після прийому всередину підкріпленого харчового субстрату паразитом. Харчовий субстрат може також бути рекомбінантної клітиною, перетвореною за допомогою послідовності ДНК, створеної для експресії агента, РНК або агента супресії гена. Після прийому всередину паразитом однієї або більше таких трансформованих клітин, спостерігається бажаний фенотипічний результат, який вказує на те, що агент функціонує, інгібуючи експресію заданої нуклеотидної послідовності, яка присутня в клітинах паразита. Ген, на який направлена супресія, може кодувати життєво необхідний білок, визначена функція якого вибрана з групи, що включає утворення м'язів, утворення ювенільних гормонів, ювенільну гормональну регуляцію, іонну регуляцію і транспорт, синтез і транспорт білка, синтез травних ферментів, підтримання мембранного потенціалу клітини, біосинтез амінокислот, розпад амінокислот, утворення чоловічих статевих клітин, синтез феромонів, чутливість до феромонів, утворення щупалець, утворення крил, утворення кінцівок, розвиток і диференціювання, утворення яєць, дозрівання личинок, утворення травних ферментів, синтез гемолімфи, підтримання гемолімфи, передачу нервових імпульсів, розподіл клітини, енергетичний метаболізм, дихання, невідому функцію і апоптоз. Інший аспект даного винаходу також надає способи підвищення розміру врожаю, одержуваного від сільськогосподарської культури, підданої ураженню комахами-паразитами, вказаний спосіб включає кроки а) введення полінуклеотиду, що включає послідовність, вибрану від SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906, або її комплемент, або конкатемер, або фрагмент, у вказану сільськогосподарську культуру; і b) вирощування сільськогосподарської культури, для можливості експресії вказаного полінуклеотиду, при цьому експресія полінуклеотиду інгібує поїдання комахами-паразитами і втрату врожаю внаслідок ураження паразитами. У деяких варіантах здійснення експресія полінуклеотиду приводить до утворення молекули РНК, яка викликає супресію принаймні першого гена-мішені у комахи-паразита, який поїдав частину вказаної сільськогосподарської рослини, при цьому ген-мішень виконує принаймні одну 5 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 суттєву функцію, вибрану з групи, що включає харчову функцію паразита, життєздатність паразита, апоптоз клітин паразита, диференціювання і розвиток паразита або будь-якої клітини паразита, статеве розмноження паразита, утворення м'язів, збудження м'язів, скорочення м'язів, утворення і/або зменшення вмісту ювенільних гормонів, ювенільну гормональну регуляцію, іонну регуляцію і транспорт, підтримання мембранного потенціалу клітини, біосинтез амінокислот, розпад амінокислот, утворення чоловічих статевих клітин, синтез феромонів, чутливість до феромонів, утворення щупалець, утворення крил, утворення кінцівок, утворення яєць, дозрівання личинок, утворення травних ферментів, синтез гемолімфи, підтримання гемолімфи, передачу нервових імпульсів, перехід в личинкову стадію, заляльковування, вихід зі стану заляльковування, розподіл клітин, енергетичний метаболізм, дихання, синтез і підтримання структури цитоскелета, метаболізм нуклеотидів, азотистий обмін, споживання води, затримання води і сенсорне сприйняття. У інших варіантах здійснення, комаха-паразит є кукурудзяним жуком паразитом, вибраним з групи, що включає Diabrotica undecimpunctata howardi (Південний кукурудзяний жук (SCR)), Diabrotica virgifera virgifera (Західний кукурудзяний жук (WCR)), Diabrotica barberi (Північний кукурудзяний жук (NCR)), Diabrotica virgifera zea (Мексиканський кукурудзяний жук (MCR)), Diabrotica balteata (Бразильський кукурудзяний жук (BZR)), Diabrotica viridula (Бразильський кукурудзяний жук (BZR)) і Diabrotica speciosa (Бразильський кукурудзяний жук (BZR)). Також надаються способи поліпшення стійкості до засухи сільськогосподарської культури, одержаної з сільськогосподарської культури, підданої ураженню комахою-паразитом, вказаний спосіб включає кроки а) включення полінкулеотидної послідовності, вибраної з SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906, або їх фрагмента у вказану сільськогосподарську культуру; і b) культивування сільськогосподарської культури для можливості експресії вказаного полінуклеотиду, при цьому експресія полінуклеотиду інгібує поїдання комахами-паразитами і втрату стійкості до засухи внаслідок ураження паразитом. Ще один аспект винаходу далі надає агрономічно і комерційно важливі продукти і/або хімічні композиції, включаючи, але не обмежуючись ними, корм для тварин, сировину, продукти і побічні продукти, які призначені для застосування як їжа для споживання людиною або для застосування в композиціях і сировинних продуктах, які призначені для споживання людиною, включаючи, але не обмежуючись ними, кукурудзяний порошок, кукурудзяне борошно, кукурудзяну патоку, кукурудзяну олію, кукурудзяний крохмаль, попкорн, кукурудзяну макуху, зернові продукти і т. п. Такі композиції можуть бути визначені як такі, що містять кількості, що піддаються виявленню, наведеної тут нуклеотидної послідовності і таким чином також є діагностичними для будь-якого трансгенного об'єкта, що містить такі нуклеотидні послідовності. Ці продукти корисні принаймні тому, що їх передбачається одержувати з сільськогосподарських культур, вирощених з меншою кількістю пестицидів і органофосфатів, внаслідок включення в них нуклеотидів даного винаходу, для контролю ураження рослин твердокрилими паразитами. Така сировина і сировинні продукти можуть бути одержані з насіння, одержаного від трансгенних рослин, при цьому трансгенна рослина експресує РНК від одного або більше суміжних нуклеотидів даного винаходу або нуклеотидів одного або більше твердокрилих паразитів і їх комплементів. Така сировина і сировинні продукти можуть також бути ефективні в контролі твердокрилих паразитів такої сировини і сировинних продуктів, такому як наприклад, контроль борошняного хрущака, завдяки наявності в сировині або сировинному продукті РНК, що пригнічує ген паразита, яка експресується з генної послідовності, зазначеної в даному винаході. Також надається спосіб одержання такого сировинного продукту, який включає одержання рослини, трансформованої за допомогою полінуклеотиду, що включає послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906 або їх конкатемер, або фрагмент, або комплемент, і одержання сировинного продукту з рослини або її частини. Далі, іншим аспектом винаходу є спосіб виготовлення харчового або кормового продукту, який включає одержання рослини, трансформованої за допомогою полінуклеотиду, вибраного з групи, що включає SEQ ID NO:1 До SEQ ID NO:906 або їх фрагмент або частину, і виготовлення харчового або кормового продукту з вказаної рослини або її частини. Винахід також надає машиночитаний носій із записаними на нього однією або більше нуклеотидними послідовностями, вказаними в SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906, або їх комплементами, для застосування в множині комп'ютерних додатків, включаючи, але не обмежуючись, пошук ідентичності і подібності ДНК, пошук ідентичності і подібності білка, визначення характеристик транскрипційного профілювання, проведення порівняння між геномами і дослідження штучної гібридизації. 6 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 1: Біоаналіз рослинних об'єктів кукурудзи F1, трансформованих за допомогою pMON98503 (SEQ ID N0:820), і обстежених на наявність Західного кукурудзяного жука (WCR). Фіг. 2: Біоаналіз рослинних об'єктів кукурудзи F1, трансформованих за допомогою pMON98504, що включають конкатемер СІ (SEQ ID NO:821), і обстежених на наявність Західного кукурудзяного жука (WCR). Фіг. 3: Вибір фрагментів Dv49 і Dv248, і схематична структура конкатемеру С38 Dv49-Dv248. Фіг. 4: длРНК F1-F13, синтезовані на основі конкатемеру С38. Фіг. 5: Дозозалежна реакція на конкатемер 38 DV49-DV248 (Фрагменти FIFO). Фіг. 6: Дозозалежна реакція на конкатемер 38 DV49-DV248 (Фрагменти F7-F10). Фіг. 7: Дозозалежна реакція на конкатемер 38 DV49-DV248 (Фрагменти F11-F13). Далі представлений докладний опис винаходу для допомоги фахівцям в галузі техніки в здійсненні даного винаходу. Звичайний фахівець в галузі техніки може вносити модифікації і зміни в описані тут варіанти здійснення, не відступаючи від суті або об'єму даного винаходу. Даний винахід надає способи і композиції для генетичного контролю ураження паразитами. Наприклад, даний винахід надає технології рекомбінантної ДНК для посттранскрипційного репресингу або інгібування експресії заданої кодуючої послідовності в клітині паразита, для забезпечення захисного ефекту від паразита, за допомогою згодовування паразиту однієї або більше молекул дволанцюгових або малих інтерферуючих рибонуклеїнових кислоти (РНК), зчитаних зі всієї або частини заданої кодуючої послідовності, таким чином контролюючи ураження. Тому, даний винахід належить до послідовність-специфічного інгібування експресії кодуючих послідовностей за допомогою двоспіральної РНК (длРНК), включаючи малу інтерферуючу РНК (siPHК), для досягнення заданих рівнів контролю паразита. Передбачається, що ізольовані і в основному очищені молекули нуклеїнової кислоти, включаючи, але не обмежуючись ними, нуклеотидні послідовності і рекомбінантні конструкції ДНК, що не зустрічаються в природі, для транскрипції молекул длРНК даного винаходу, викликають супресію або інгібування експресії ендогенної кодуючої послідовності або заданої кодуючої послідовності у паразита, при введенні в останнього. Також надаються трансгенні рослини, які (а) містять нуклеотидні послідовності, що кодують ізольовані і в основному очищені молекули нуклеїнової кислоти і рекомбінантні конструкції ДНК, що не зустрічаються в природі, для транскрипції молекул длРНК для контролю ураження рослини паразитами, і (b) виявляють стійкість і/або підвищену толерантність до ураження комахами. Також описані композиції, що містять длРНК нуклеотидні послідовності даного винаходу, для застосування у вигляді місцевого нанесення на рослини або на тварин, або внесення в середовище, що оточує тварину, для досягнення усунення або зменшення ураження паразитами. У даному винаході винахідники виявили, що всупереч положенням попереднього рівня техніки, згодовування композиції, що містить дволанцюгові молекули РНК, які складаються з послідовностей, що виявляються в одній або більше експресованих нуклеотидних послідовностях виду твердокрилих, видам, від яких були одержані нуклеотидні послідовності, приводить до інгібування однієї або більше біологічних функцій у виду твердокрилих. Зокрема, винахідники виявили, що згодовування описаних тут дволанцюгових молекул РНК видам паразитів сільськогосподарських культур, таким як кукурудзяні жуки, приводить до загибелі або інгібування розвитку і диференціювання комах паразитів, які поїдають ці композиції. Винахідниками визначені нуклеотидні послідовності, описані тут, як такі, що забезпечують ефекти захисту рослин від видів твердокрилих паразитів. Встановлені амінокислотні послідовності, закодовані послідовностями кДНК, і зроблене порівняння з відомими амінокислотними послідовностями. Встановлено, що багато які послідовності кодують білки, які мають деяку анотовану інформацію, пов'язану з ними. Анотована інформація, яка пов'язана зі специфічною нуклеотидною послідовністю і закодованою за допомогою неї послідовністю білка, заснована на гомології або подібності між амінокислотними послідовностями, встановленими за допомогою трансляції описаних тут кодуючих послідовностей, і амінокислотними послідовностями, які відомі в галузі техніки в загальнодоступних базах даних. Послідовності кДНК, що кодують білки або частини білків, необхідні для виживання, такі як амінокислотні послідовності, задіяні в різних метаболічних або катаболічних біохімічних шляхах, діленні клітини, репродукції, енергетичному метаболізмі, травленні, неврологічних функціях і т. п., були вибрані для застосування в одержанні дволанцюгових молекул РНК, які включалися в дієту твердокрилих паразитів. Як описано тут, поїдання паразитом-мішенню композицій, що містять одну або більше длРНК, принаймні один сегмент яких відповідає принаймні в основному ідентичному сегменту РНК, що продукується в клітинах паразита-мішені, приводить до загибелі, зупинення росту або іншого інгібування паразита-мішені. Ці результати вказують, що нуклеотидна послідовність або ДНК або РНК, одержана від твердокрилого паразита, може бути 7 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосована для створення рослинних клітин, стійких до ураження паразитом. Наприклад, хазяїн паразита може бути перетворений таким чином, що буде містити одну або більше нуклеотидних послідовностей, одержаних від твердокрилого паразита. Нуклеотидна послідовність, трансформована в паразита хазяїна або симбіонта може кодувати одну або більше PHКs, які перетворюються в послідовність длРНК в клітинах або біологічних рідинах в транформованому хазяїні або симбіонті, таким чином, забезпечуючи наявність длРНК в дієті паразита, якщо/коли паразит паразитує на трансгенному хазяїні або симбіонті, приводячи до супресії експресії одного або більше генів в клітинах паразита і зрештою загибелі, зупинення росту або іншого інгібування паразита. Даний винахід належить в основному до генетичного контролю ураження твердокрилими паразитами в організмі хазяїна. Конкретніше, даний винахід включає способи доставки агентів для контролю шкідників твердокрилому паразиту. Такі агенти для контролю шкідників викликають, прямо або непрямо, ослаблення здатності паразита підтримувати свою життєдіяльність, рости або, інакше, спричиняти ураження заданого хазяїна або симбіонта. Даний винахід надає способи включення стабілізованих молекул длРНК в харчовий раціон паразита як засобу для супресії генів-мішеней у паразита, таким чином досягаючи бажаного контролю над паразитуванням паразита всередині або навколо хазяїна або симбіонта, на якого націлений паразит. Для здійснення вищезгаданого, даний винахід надає спосіб інгібування експресії гена-мішені у твердокрилого паразита, включаючи наприклад, кукурудзяних жуків або інші види твердокрилих комах, що приводить до припинення харчової активності, росту, розвитку, репродукції, інфекційності і, зрештою, може привести до загибелі паразита. У одному варіанті здійснення спосіб включає включення частково або повністю стабілізованих дволанцюгових нуклеотидних молекул РНК (длРНК) в харчову композицію, на яку паразит покладається як на джерело їжі, і створення харчової композиції, придатної для поїдання паразитом. Прийом всередину харчової композиції, що містить дволанцюгові або siPHК молекули, приводить до захоплення молекул клітинами паразита, приводячи до інгібування експресії принаймні одного гена-мішені в клітинах паразита. Інгібування гена-мішені надає негативний вплив на паразита. У деяких варіантах здійснення молекули длРНК, що надаються винаходом, включають нуклеотидні послідовності, комплементарні послідовності, наведеній в будь-якій з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, інгібування яких в організмі паразита приводить до зменшення вмісту або видалення білка або агента з нуклеотидної послідовності, який необхідний для росту і розвитку або іншої біологічної функції паразитів. Вибрана нуклеотидна послідовність може мати від приблизно 80% принаймні до приблизно 100% ідентичність послідовності до однієї з нуклеотидних послідовностей, вказаних з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, як указано в переліку послідовностей, включаючи їх комплементи. Таке інгібування може бути описане як специфічне в тому відношенні, що нуклеотидна послідовність від частини гена-мішені вибрана з тієї, з якої зчитана інгібуюча длРНК або siPHК. Спосіб ефективний в інгібуванні експресії принаймні одного гена-мішені і може застосовуватися для інгібування багатьох різних типів генів-мішеней у паразита. У конкретних варіантах здійснення, нуклеотидна послідовність може бути вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO:697, SEQ ID NO:813-819, SEQ ID NO:841 і SEQ ID NO:874. Послідовності, ідентифіковані як такі, що мають захисний ефект від паразита, можуть легко експресуватися як молекули длРНК за допомогою створення відповідних конструктів для експресії. Наприклад, такі послідовності можуть експресуватися у вигляді шпильки і стебла і петльової структури за допомогою використання першого сегмента, відповідного послідовності, вибраній від SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906 або їх фрагмента, зв'язування цієї послідовності зі спейсерною областю другого сегмента, який не є гомологічним або комплементарним першому сегменту, і зв'язуючи її з третім сегментом, який зчитує РНК, при цьому, принаймні частина третього сегмента в основному комплементарна першому сегменту. Така конструкція формує структуру стебла і петлі за допомогою гібридизації першого сегмента з третім сегментом, а структура петлі формується так, що включає другий сегмент (W0 94/01550, WO 98/05770, США 2002/0048814А1 і США 2003/0018993А1). А. Композиції нуклеїнових кислот і конструкти Винахід надає рекомбінантні конструкти ДНК для застосування в досягненні стійкої трансформації конкретних мішеней паразита хазяїна або симбіонта. Трансформована мішень паразита хазяїна або симбіонта може експресувати ефективні пестицидні рівні переважних молекул длРНК або siPHК з рекомбінантних конструктів ДНК і забезпечувати наявність молекул в харчовому раціоні паразита. Пари ізольованих і очищених нуклеотидних послідовностей можуть бути надані з матеріалів бібліотеки кДНК і/або геномної бібліотеки. Пари нуклеотидних послідовностей можуть бути одержані від будь-якого переважного твердокрилого паразита для 8 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування як праймерів теплової ампліфікації, для створення матриці ДНК для одержання молекул длРНК і siPHК даного винаходу. Застосовуваний тут термін "нуклеїнова кислота" належить до одно- або дволанцюгового полімеру дезоксирибонуклеотидної або рибонуклеотидної основ, зчитуваних від 5’ до 3’ кінця. "Нуклеїнова кислота" може також необов'язково включати нуклеотидні основи не природного походження або змінені, які дозволяють правильно їх зчитувати за допомогою полімерази і не ослабляють експресію поліпептиду, закодованого цією нуклеїновою кислотою. Термін "нуклеотидна послідовність" або "послідовність нуклеїнової кислоти" належить як до смислової, так і до антисмислових ланцюжків нуклеїнової кислоти у вигляді або окремих одиночних ланцюжків, або подвійних спіралей. Термін "рибонуклеїнова кислота" (РНК) включає РНКі (інгібіторна РНК), длРНК (дволанцюгова РНК), siPHК (мала інтерферуюча РНК), мРНК (месенджерна РНК), miPHК (мікро-РНК), tPHК (трансферна РНК, або навантажена, або розвантажена від відповідної ацильованої амінокислоти), і сРНК (комплементарна РНК), і термін "дезоксирибонуклеїнова кислота" (ДНК) включає кДНК і геномну ДНК і гібриди ДНК-РНК. Словосполучення "сегмент нуклеїнової кислоти", "сегмент нуклеотидної послідовності", або більш узагальнено "сегмент", повинні розумітися фахівцями в галузі техніки як функціональні терміни, які включають як геномні послідовності, так і послідовності рибосомальної РНК, послідовності трансферної РНК, послідовності месенджерної РНК, оперонні послідовності і менші сконструйовані нуклеотидні послідовності, які експресують або можуть бути адаптовані для експресії білків, поліпептидів або пептидів. Згідно з винаходом надаються нуклеотидні послідовності, експресія яких приводить до послідовності РНК, яка в основному гомологічна молекулі РНК направленого гена у комахи, яка включає послідовність РНК, закодовану нуклеотидною послідовністю в геномі комахи. Таким чином, після поїдання стабілізованої послідовності РНК, може бути досягнута знижувальна регуляція нуклеотидної послідовності гена-мішені в клітинах комахи, що приводить до шкідливого впливу на підтримання життєдіяльності, життєздатність, проліферацію, репродукцію і здатність комахи до паразитування. Застосовуваний тут термін "в основному гомологічна" або "значна гомологія", відносно послідовності нуклеїнової кислоти, включає нуклеотидну послідовність, яка гібридизує в умовах великої напруженості до кодуючої послідовності, вказаної в будь-якій із з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, як указано в переліку послідовностей, або її комплементи. Послідовності, які гібридизують в умовах великої напруженості до будь-якої із з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, як указано в переліку послідовностей, або їх комплементи належать до тих, які дозволяють, щоб між цими двома послідовностями відбувалося антипаралельне вирівнювання, і дві послідовності здатні в умовах великої напруженості формувати водневі зв'язки з основами на протилежному ланцюгу для формування подвійної молекули, яка є досить стійкою в умовах великій напруженості, щоб піддаватися виявленню за допомогою способів, відомих в галузі техніки. В основному гомологічні послідовності мають переважно приблизно від 70% до приблизно 80% ідентичність послідовності, або більш переважно від приблизно 80% до приблизно 85% ідентичність послідовності, або найбільш переважно від приблизно 90% до приблизно 95% ідентичність послідовності, приблизно до 99% ідентичності послідовності порівняльним нуклеотидним послідовностям, вказаним в будь-якій із з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, як указано в переліку послідовностей, або їх комплементам. Застосовуваний тут термін "ідентичність послідовності", "подібність послідовності" або "гомологія" служить для опису спорідненості між двома або більше нуклеотидними послідовностями. Процентний показник "ідентичності послідовності" двох послідовностей визначають за допомогою порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей у вікні порівняння, при цьому частина послідовності у вікні порівняння може включати вставки або делеції (тобто, розриви), на відміну від контрольної послідовності (яка не включає вставки або делеції), для оптимального вирівнювання цих двох послідовностей. Процент розраховують за допомогою визначення числа позицій, в яких ідентична основа нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок зустрічається в обох послідовностях, для одержання числа відповідних позицій, ділення числа відповідних позицій на загальне число позицій у вікні порівняння, і множення результату на 100, для одержання процентного показника ідентичності послідовності. Послідовність, яка при порівнянні з контрольною послідовністю є ідентичною ній в кожній позиції, вважають ідентичною контрольній послідовності і навпаки. Першу нуклеотидну послідовність при розгляді в напрямі від 5' до 3', називають "комплементом", або комплементарною другій або контрольній нуклеотидній послідовності, що розглядається в напрямі від 3' до 5', якщо перша нуклеотидна послідовність повністю комплементарна контрольній або другій послідовності. Застосовуваний тут термін "молекули послідовності 9 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нуклеїнової кислоти" служить для позначення "повної комплементарності", коли кожний нуклеотид однієї з послідовностей, що читається від 5' до 3', є комплементарним кожному нуклеотиду іншої послідовності, що читається від 3' до 5'. Нуклеотидна послідовність, яка є комплементарною контрольній нуклеотидній послідовності, буде мати послідовність, ідентичну зворотній комплементарній послідовності контрольної нуклеотидної послідовності. Ці терміни і описи добре відомі в галузі техніки і легко зрозумілі фахівцям в галузі техніки. Застосовуваний тут термін "вікно порівняння" належить до концептуального сегмента принаймні з 6 суміжних позицій, звичайно від приблизно 50 до приблизно 100, частіше від приблизно 100 до приблизно 150, по яких послідовність порівнюється з контрольною послідовністю з того ж числа суміжних позицій після оптимального вирівнювання цих двох послідовностей. Вікно порівняння може включати вставки або делеції (тобто розриви) в кількості приблизно 20% або менше в порівнянні з контрольною послідовністю (яка не включає вставки або делеції), для оптимального вирівнювання цих двох послідовностей. Для докладного обговорення аналізу послідовності фахівцям в галузі техніки необхідно звернутися до деталізованих способів, що застосовуються для вирівнювання послідовності в Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA), або звернутися до Ausubel і ін. (1998). Даний винахід надає послідовності ДНК, здатні до експресії у вигляді РНК в клітині або мікроорганізмі, для інгібування експресії гена-мішені в клітині, тканині або органі комахи. Послідовності включають молекулу ДНК, що кодує одну або більше різних нуклеотидних послідовностей, при цьому кожна з різних нуклеотидних послідовностей включає смислову нуклеотидну послідовність і ангисмислову нуклеотидну послідовність, зв'язані спейсерною послідовністю, що кодує молекулу длРНК даного винаходу. Спейсерна послідовність складає частину смислової нуклеотидної послідовності або антисмислової нуклеотидної послідовності і формується в межах длРНК молекули між смисловою і антисмисловою послідовностями. Смислова нуклеотидна послідовність або антисмислова нуклеотидна послідовність в основному ідентичні нуклеотидній послідовності гена-мішені або його похідному, або комплементарній йому послідовності. Молекула дцДНК може бути операбельно поміщена під контролем промоторної послідовності, яка функціонує в клітині, тканині або органі хазяїна, експресуючого дцДНК, для продукції молекул длРНК. У одному варіанті здійснення послідовність ДНК може бути одержана з нуклеотидної послідовності як указано з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906 в переліку послідовностей. Винахід також надає послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка після експресії ДНК до РНК і поїдання паразитом-мішенню, викликає супресію гена-мішені в клітині, тканині або органі комахи-паразита. длРНК включає принаймні одну або множину послідовностей структурних генів, в яких кожна з послідовностей структурних генів включає смислову нуклеотидну послідовність і антисмислову нуклеотидну послідовність, зв'язані спейсерною послідовністю, яка формує петлю в межах комплементарних і антисмислових послідовностей. Смислова нуклеотидна послідовність або антисмислова нуклеотидна послідовність в основному ідентичні нуклеотидній послідовності гена-мішені, його похідному, або комплементарній йому послідовності. Одну або більше послідовностей структурних генів операбельно помішують під контролем однієї або більше промоторних послідовностей, принаймні одна з яких є операбельною, в клітину, тканину або орган прокаріотичного або еукаріотичного організму, особливо рослини. Генна послідовність або фрагмент для контролю паразитів згідно з винаходом можуть бути клоновані між двома тканеспецифічними промоторами, наприклад, двома коренеспецифічними промоторами, які є операбельними в трансгенній рослинній клітині, і експресовані в ній для продукції мРНК в трансгенній рослинній клітині, які утворюють в ній молекули длРНК. Молекули длРНК, що містяться в тканинах рослини, поглинаються комахою так, що досягається задана супресія експресії гена-мішені. Нуклеотидна послідовність, що надається даним винаходом, може включати інвертований повтор, відділений "спейсерною послідовністю". Спейсерна послідовність може бути представлена областю, що включає будь-яку послідовність нуклеотидів, яка полегшує формування вторинної структури між кожним повтором, де це потрібно. У одному варіанті здійснення даного винаходу, спейсерна послідовність є частиною смислової або антисмислової кодуючої послідовності для мРНК. У альтернативному варіанті спейсерна послідовність може включати будь-яку комбінацію нуклеотидів або їх гомологів, які здатні ковалентно зв'язуватися з молекулою нуклеїнової кислоти. Спейсерна послідовність може включати послідовність нуклеотидів з принаймні приблизно 10-100 нуклеотидів в довжину, або в альтернативному 10 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанті з принаймні приблизно 100-200 нуклеотидів в довжину, з принаймні приблизно 200-400 нуклеотидів в довжину або з принаймні приблизно 400-500 нуклеотидів в довжину. Молекули нуклеїнової кислоти або фрагмент молекул нуклеїнової кислоти, або інші молекули нуклеїнової кислоти в переліку послідовностей здатні специфічно гібридизуватися з іншими молекулами нуклеїнової кислоти при визначених умовах. Вважається, що застосовувані тут дві молекули нуклеїнової кислоти здатні специфічно гібридизуватися одна з одною, якщо дві молекули здатні до утворення антипаралельної, дволанцюгової структури нуклеїнової кислоти. Вважається, що молекула нуклеїнової кислоти є комплементом іншої молекули нуклеїнової кислоти, якщо вони виявляють повну комплементарність. Вважається, що дві молекули є "мінімально комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною з достатньою стійкістю, що дозволяє їм залишатися зв'язаними одна з одною принаймні при звичайних умовах зниженої жорсткості. Подібним чином вважають, що молекули є комплементарними, якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною з достатньою стійкістю, що дозволяє їм залишатися зв'язаними одна з одною при звичайних суворих умовах. Звичайні суворі умови описані Sambrook, і ін. (1989), і Haymes і ін. (1985). Тому відхилення від повної комплементарності допустимі, поки такі відхилення повністю не перешкоджають здатності молекул формувати дволанцюгову структуру. Таким чином, щоб виконувати функцію праймера або зонда, молекула нуклеїнової кислоти або фрагмент молекули нуклеїнової кислоти повинні тільки мати достатньо комплементарну послідовність, щоб бути здатними формувати стійку дволанцюгову структуру в присутності конкретного розчинника і при використовуваних концентраціях солі. Відповідні умови суворості, сприяючі гібридизації ДНК, наприклад, 6,0хлорид натрію/цитрат натрію (SSC) при приблизно 45°С, з подальшим промиванням 2,0SSC при 50°С, відомі фахівцям в галузі техніки або можуть бути знайдені в Сучасних Протоколах Молекулярної Біології (1989). Наприклад, концентрація солі в кроці промивання може бути вибрана від низької суворості, що складає приблизно 2,0SSC при 50°С, до високої суворості, що складає приблизно 0,2SSC при 50°С. Крім того, температура в кроці промивання може бути збільшена від умов низької суворості з кімнатною температурою приблизно 22°С, до умов високої суворості з температурою приблизно 65°С. І температура і сіль можуть розрізнюватися, чи або температура, або концентрація солі можуть підтримуватися на постійному рівні, тоді як інший показник буде змінюватися. При таких умовах, нуклеїнова кислота, що застосовується в даному винаході, може специфічно гібридизуватися з однією або більше молекулами нуклеїнової кислоти від WCR або їх комплементами. Переважно, нуклеїнова кислота, що застосовується в даному винаході, має принаймні від приблизно 80% або принаймні від приблизно 90%, або принаймні від приблизно 95%, або принаймні від приблизно 98%, або навіть приблизно 100% ідентичність послідовності з однією або більше молекулами нуклеїнової кислоти, вказаними з SEQ ID No:1 пo SEQ ID NO:906 в переліку послідовностей. Нуклеїнові кислоти даного винаходу можуть також бути синтезовані, або повністю або частково, особливо, коли бажано надати переважні для рослини послідовності, за допомогою способів, відомих в галузі техніки. Таким чином, всі або частина нуклеїнових кислот даного винаходу можуть бути синтезовані за допомогою кодонів, переважних для вибраного хазяїна. Переважні для виду кодони можуть бути визначені, наприклад, за допомогою кодонів, що використовуються найчастіше в білках, експресованих у хазяїна конкретного виду. Інші модифікації нуклеотидних послідовностей можуть привести до мутантів, що мають декілька змінену активність. Нуклеотидні послідовності длРНК або siPHК включають подвійні ланцюжки полімеризованого рибонуклеотиду і можуть включати модифікації або в фосфатно-цукрових бічних ланцюгах, або в нуклеозидах. Модифікації в структурі РЕК можуть бути розраховані для можливості специфічного генетичного інгібування. У одному варіанті здійснення, молекули длРНК можуть бути змінені внаслідок ферментативного процесу так, щоб було можливим створити молекули siPHК. siPHК може ефективно опосередкувати ефект знижувальної регуляції для деяких генів-мішеней у деяких комах. Цей ферментативний процес може бути здійснений за допомогою ферменту РНКаза III або ферменту DICER, присутнього в клітинах комахи, хребетної тварини, грибка або рослини в каскаді реакцій еукаріотичної РНКі (Elbashir і ін., 2002; Hamilton і Baulcombe, 1999). У цьому процесі може також використовуватися рекомбінантна DICER або РНКаза III, введена в клітини комахи-мішені за допомогою рекомбінантних технологій ДНК, які відомі фахівцеві в галузі техніки. І фермент DICER і РНКаза III, що утворюються в природі в комасі або одержані за допомогою рекомбінантних технологій ДНК, розщеплюють великі ланцюги длРНК на менші олігонуклеотиди. Фермент DICER специфічно розрізає молекули длРНК на частини siPHК, кожна з яких має довжину приблизно 19-25 11 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидів, в той час як фермент РНКаза III звичайно розщеплює молекули длРНК до siPHК з 12-15 пар основ. Молекули siPHК, одержані за допомогою будь-якого з ферментів, мають від 2 до 3 нуклеотидів на 3' "липкому" і 5' фосфатному, і 3' гідроксильному кінцях. Молекули siPHК, створені за допомогою ферменту РНКаза III, схожі зі створеними за допомогою ферментів DICER в каскаді реакцій еукаріотичної РНКі і отже потім направляються і розпадаються за допомогою природженого клітинного механізму розпаду РНК після їх послідовного розкручування, розділення на одноланцюгові РНК і гібридизації з послідовностями РНК, транскрибованими геном-мішенню. Цей процес приводить до ефективного розпаду або видалення послідовності РНК, закодованої нуклеотидною послідовністю гена-мішені, у комахи. В результаті пригнічується транскрипція направленої нуклеотидної послідовності в організмі комахи. Докладні описи ферментативних процесів можуть бути знайдені в Hannon (2002). Нуклеотидна послідовність даного винаходу може бути записана на машиночитаний носій. Застосовуваний тут термін "машиночитаний носій" належить до будь-якого матеріального носія експресії, який може бути зчитаний і доступний безпосередньо за допомогою комп'ютера. До таких носіїв належать, але не обмежуючись ними: магнітні носії даних, такі як гнучкі диски, жорсткий диск, носій даних і магнітна стрічка; оптичні носії даних, такі як CD-ROM; електричні носії даних, такі як RAM і ROM; комп'ютерні файли в форматі оптичного розпізнавання знаків, і гібриди цих категорій, такі як магнітні/оптичні носії даних. Фахівцеві ясно, що будь-який з відомих в цей час машиночитаних носіїв може бути застосований для створення виробництва, що включає машиночитаний носій із записом на ньому нуклеотидної послідовності даного винаходу. Застосовуваний тут термін "записаний" належить до процесу збереження інформації на машиночитаний носій. Фахівець може легко вибрати будь-який з відомих в цей час способів запису інформації на машиночитаний носій для створення носія, що включає інформацію про нуклеотидну послідовність даного винаходу. Для створення машиночитаного носія із записаною на нього нуклеотидною послідовністю даного винаходу фахівцеві доступна множина структур зберігання даних. Вибір структури зберігання даних в основному буде заснований на засобах, вибраних для доступу до збереженої інформації. Крім того, для зберігання інформації про нуклеотидну послідовність даного винаходу на машиночитаному носії, може застосовуватися множина програм процесора і форматів. Інформація про послідовність може бути представлена у вигляді текстового файла, форматованого під комерційно доступне програмне забезпечення, таке як WordPerfect і Microsoft Word, або представлена у вигляді текстового файла ASCII, збереженого в додатку для роботи з базами даних, такому як DB2, Sybase, Oracle, або подібному. Фахівець може легко пристосувати будь-який формат структурування процесорної інформації (наприклад, текстовий файл або базу даних) для одержання машиночитаного носія із записом на ньому інформації про нуклеотидну послідовність даного винаходу. Програмне забезпечення є публічно доступним, що дозволяє фахівцеві одержувати доступ до інформації про послідовність, надану на машиночитаному носії. Програмне забезпечення, яке підтримує алгоритми пошуку BLAST (Altschul і ін., 1990) і BLAZE (Brutlag, і ін., 1993) в системі Sybase, може застосовуватися для ідентифікації відкритих рамок зчитування (ORFs) в послідовностях, таких як Unigenes і EST's, які тут надані, і які містять гомологію до ORFs або білків від інших організмів. Такі ORFs є фрагментами, що кодують білок, в межах послідовностей даного винаходу і ефективні в продукції комерційно важливих білків, таких як ферменти, що застосовуються в біосинтезі амінокислот, метаболізмі, транскрипції, трансляції, процесингу РНК, розпаді нуклеїнових кислот і білка, модифікації білка і реплікації ДНК, рестрикції, модифікації, рекомбінації і відновленні. Даний винахід далі надає системи, зокрема машинні системи, які містять описану тут інформацію про послідовність. Такі системи розроблені для ідентифікації комерційно важливих фрагментів молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу. Застосовуваний тут термін "машинна система" належить до апаратних засобів, засобів програмного забезпечення і засобів зберігання даних, що застосовуються для аналізу інформації про нуклеотидну послідовність даного винаходу. Мінімальний апаратний засіб машинних систем даного винаходу включає центральний процесор (CPU), засоби для введення даних, засоби для виведення і засоби для зберігання даних. Фахівцеві ясно, що будь-яка з доступних в цей час машинних систем придатна для застосування в даному винаході. Застосовуваний тут термін "структурний мотив-мішень", або "мотив-мішень", належить до будь-якої раціонально вибраної послідовності або комбінації послідовностей, в яких послідовність або послідовності вибрані на основі тривимірної конфігурації, яка формується після укладання мотиву-мішені. Існує множина мотивів-мішеней, відомих в галузі техніки. До мотивів-мішеней білка належать, але не обмежуючись ними, активні сайти ферментів і 12 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сигнальні послідовності. До мотивів-мішеней нуклеїнових кислот належать, але не обмежуючись ними, промоторні послідовності, цис-елементи, шпилькоподібні структури і елементи індукованої експресії (послідовності, зв'язуючі білок). В. Рекомбінантні вектори і трансформація клітини-хазяїна Рекомбінантний вектор ДНК може, наприклад, бути представлений лінійною або закритою кільцевою плазмідою. Векторна система може бути представлена одиничним вектором або плазмідою або двома або більше векторами або плазмідами, які разом містять всю ДНК, яку необхідно ввести в геном бактеріального хазяїна. Крім того, бактеріальний вектор може бути вектором експресії. Молекули нуклеїнової кислоти, як указано з SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, або їх фрагменти і комплементи можуть, наприклад, бути відповідно вставлені у вектор під контролем відповідного промотору, який функціонує в одному або більше мікробних хазяїнах для запуску експресії зв'язаної кодуючої послідовності або іншої послідовності ДНК. Для цієї мети доступна множина векторів, і вибір відповідного вектора буде залежати головним чином від розміру нуклеїнової кислоти, яка буде вставлена у вектор, і конкретної клітини-хазяїна, яка буде трансформована за допомогою вектора. Кожний вектор містить різні компоненти, залежно від його функції (ампліфікація ДНК або експресія ДНК) і специфічної клітини-хазяїна, з якою він сумісний. Векторні компоненти для бактеріальної трансформації в основному включають, але не обмежуючись ними, один або більше з наступних компонентів: сигнальна послідовність, реплікатор, один або більше селектованих маркерних генів і індукований промотор, що допускає експресію екзогенної ДНК. Експресуючі і клонуючі вектори в основному містять ген селекції, також званий селектованим маркером. Цей ген кодує білок, необхідний для виживання або росту трансформованих клітин хазяїна, вирощеного в селективному культуральному середовищі. Типові гени селекції кодують білки, які (а) надають стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіциліну, неоміцину, метотрексату або тетрацикліну, (b) заповнюють ауксотрофний дефіцит, або (с) постачають критичні поживні речовини, не доступні в складних поживних середовищах, наприклад, ген, що кодує D-аланін рацемазу бацил. Ті клітини, які успішно трансформовані з гетерологічним білком або його фрагментом, продукують білок, який надає стійкість до лікарських засобів, що, таким чином, дозволяє виживати в режимі селекції. Вектор експресії для продукції мРНК може також містити індукований промотор, який розпізнається бактеріальним організмом хазяїна і операбельно зв'язується з кодуючою нуклеїновою кислотою, наприклад, молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує мРНК або цікавлячий її фрагмент у D. v. virgifera. До індукованих промоторів, придатних для застосування з бактеріальними хазяїнами, належать промотор -лактамази, Е. соlі  фаг PL і PR промотори і промотор галактози Е. соlі, промотор арабінози, промотор лужної фосфатази, промотор триптофану (кінцевого) і промотор лактозного оперону і його різновидів, і гібридні промотори, такі як tac промотор. Однак, інші відомі індуковані бактеріальні промотори є придатними. Термін "операбельно зв'язаний", застосовуваний в посиланні на регуляторну послідовність і структурну нуклеотидну послідовність, означає, що регуляторна послідовність викликає регульовану експресію зв'язаної структурної нуклеотидної послідовності. Терміни "регуляторні послідовності" або "елементи контролю" належать до нуклеотидних послідовностей, розташованих вище (5' некодуючі послідовності), в межах або нижче (3' нетрансльовані послідовності) структурної нуклеотидної послідовності, і які впливають на час і рівень або величину транскрипції, процесинг або стабільність РНК, або трансляцію зв'язаної структурної нуклеотидної послідовності. Регулюючі послідовності можуть містити промотори, лідерні послідовності трансляції, інтрони, підсилювачі, структури стебло-петля, послідовності, що зв'язують репресор, і послідовності розпізнавання поліаденілювання і т. п. У альтернативному варіанті, конструкти для експресії можуть бути інтегровані в бактеріальний геном з інтегруючим вектором. Інтегруючі вектори звичайно містять принаймні одну послідовність, гомологічну бактеріальній хромосомі, яка дозволяє вектору інтегруватися. Інтеграція є результатом рекомбінацій між гомологічною ДНК у векторі і бактеріальній хромосомі. Наприклад, інтегруючі вектори, створені з ДНК різних штамів бацил, інтегрують в хромосому бацили (Європейський патент 0 127328). Інтегруючі вектори можуть також складатися з бактеріофага або транспозонних послідовностей. Суїцидні вектори також відомі в галузі техніки. Для конструкції придатних векторів, що містять один або більше вищезазначених компонентів, використовуються стандартні рекомбінантні технології ДНК. Виділені плазміди або фрагменти ДНК розщеплюють, настроюють і повторно лігують у формі, бажаній для створення необхідних плазмід. Приклади доступних бактеріальних векторів експресії включають, але не обмежуючись ними, багатофункціональні вектори клонування і експресії Е. соlі, такі як 13 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Bluescript™ (Stratagene, La Jolla, CA), в яких, наприклад, білок D. v. virgifera або його фрагмент може бути лігований у вектор в рамці послідовностей для амінотермінали Met і подальших 7 залишків -галактозидази так, що одержують гібридний білок; pIN вектори (Van Heeke і Schuster, 1989); і т. п. Дріжджовий рекомбінантний конструкт може звичайно містити один або більш наступних компонентів: промоторну послідовність, послідовність для злиття з партнером, лідерну послідовність, послідовність термінації транскрипції, селектований маркер. Ці елементи можуть бути об'єднані в полігенний експресуючий кластер, який може міститися в репліконі, такому як позахромосомний елемент (наприклад, плазміди), здатний до стійкого збереження в хазяїні, такому як дріжджі або бактерії. Реплікон може мати дві системи реплікації, що, таким чином, дозволяє зберігатися йому, наприклад, в дріжджах для експресії і в прокаріотичному хазяїні для клонування і ампліфікації. Приклади таких шаттл-векторів бактерій-дріжджів включають YEp24 (Botstein і ін., 1979), рС1/1 (Brake і ін., 1984) і YRp17 (Stinchcomb і ін., 1982). Крім того, реплікон може бути в плазміді або з високим, або з низьким числом копій. Плазміда з високим числом копій буде в основному мати число копій в межах від приблизно 5 до приблизно 200 і звичайно від приблизно 10 до приблизно 150. Хазяїн, що містить плазміду з високим числом копій, буде переважно мати принаймні приблизно 10 і більш переважно принаймні приблизне 20 копій. Ефективна промоторна послідовність дріжджів може бути одержана з генів, які кодують ферменти в метаболічному шляху. Приклади таких генів включають алкогольдегідрогеназу (ADH) (ЕР 0 284044), енолазу, глюкокіназу, глюкозо-6-фосфатізомеразу, гліцеральдегід-3фосфатдегідрогеназу (GAP або GAPDH), гексокіназу, фосфофруктокіназу, 3фосфогліцератмутазу і піруваткіназу (РуК) (ЕР 0 3215447). Ген РН05 дріжджів, що кодує кислу фосфатазу, також надає ефективні промоторні послідовності (Myanohara і ін., 1983). Крім того, синтетичні промотори, які не зустрічаються в природі, також функціонують як промотори дріжджів. Приклади таких гібридних промоторів включають регуляторну послідовність ADH, зв'язану з областю активації транскрипції GAP (Патент США № 4876197 і 4880734). Приклади послідовностей термінатора транскрипції і інших розпізнаних у дріжджів послідовностей термінації, таких як кодуючі гліколітичні ферменти, відомі фахівцям в галузі техніки. У альтернативному варіанті, конструкти для експресії можуть бути інтегровані в геном дріжджів за допомогою інтегруючого вектора. Інтегруючі вектори звичайно містять принаймні одну послідовність, гомологічну хромосомі дріжджів, яка дозволяє вектору інтегруватися, і переважно містить дві гомологічних послідовності, які обмежують конструкт для експресії. Інтеграція є результатом рекомбінацій між гомологічною ДНК у векторі і хромосомі дріжджів (Orr-Weaver і ін., 1983). Інтегруючий вектор може бути направлений до специфічного локусу в дріжджах, за допомогою вибору придатної гомологічної послідовності для включення у вектор (див. Orr-Weaver і ін., вище). Один або більше конструктів для експресії можуть інтегрувати, можливо змінюючи рівні продукованого рекомбінантного білка (Rine і ін., 1983). У даному винаході також розглядається трансформація нуклеотидної послідовності даного винаходу в рослину для досягнення інгібуючих паразита рівнів експресії однієї або більше молекул длРНК. Вектор трансформації може бути легко виготовлений за допомогою способів, доступних в галузі техніки. Вектор трансформації включає одну або більше нуклеотидних послідовностей, які здатні піддаватися транскрипції до молекули РНК, і які в основному гомологічні і/або комплементарні одній або більше нуклеотидним послідовностям, закодованим геномом комахи, так що після накопичення РНК відбувається знижувальна регуляція експресії принаймні однієї з відповідних нуклеотидних послідовностей геному комахи. Вектор трансформації може іменуватися конструктом дцДНК і може також бути визначений як рекомбінантна молекула, агент контролю комах, генетична молекула або химерний генетичний конструкт. Химерний генетичний конструкт даного винаходу може включати, наприклад, нуклеотидні послідовності, які кодують один або більше антисмислових транскриптів, один або більше смислових транскриптів, один або більше кожного з вищезазначених, в якому весь або частина відповідного транскрипту гомологічна всій або частині молекули РНК, що включає послідовність РНК, закодовану нуклеотидною послідовністю в геномі комахи. У одному варіанті здійснення вектор трансформації рослини включає виділену і очищену молекулу ДНК, яка включає промотор, операбельно зв'язаний з однією або більше нуклеотидними послідовностями даного винаходу. Нуклеотидна послідовність вибрана з групи, що включає від SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906, як указано в переліку послідовностей. Нуклеотидна послідовність містить сегмент, який кодує всю або частину РНК, присутньої в межах транскрипту РНК паразита-мішені, і може включати інвертовані повтори всієї або частини РНК паразита-мішені. Молекула ДНК, що включає вектор експресії, може також містити 14 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функціональну послідовність інтрона, розташовану або вище кодуючої послідовності, або навіть в межах кодуючої послідовності, і може також містити п'ять первинних (5') нетрансльованих лідерних послідовностей (тобто, UTR або 5'-UTR), розташованих між промотором і точкою ініціації трансляції. Вектор трансформації рослини може містити послідовності від більше ніж одного гена, таким чином дозволяючи продукувати більше однієї длРНК для інгібування експресії двох або більше генів в клітинах паразита-мішені. Фахівцеві в галузі техніки ясно, що сегменти ДНК, послідовність яких відповідає присутній в різних генах, можуть бути об'єднані в єдиний композитний сегмент ДНК для експресії в трансгенній рослині. У альтернативному варіанті, плазміда даного винаходу, що вже містить принаймні один сегмент ДНК, може бути змінена за допомогою послідовної вставки додаткових сегментів ДНК між послідовностями підсилювача, промотору і термінатора. В агенті контролю комах даного винаходу, призначеному для інгібування численних генів, гени, які необхідно інгібувати, можуть бути одержані від тих же видів комах, щоб посилити ефективність агента контролю комах. У деяких варіантах здійснення, гени можуть бути одержані з різних комах, щоб розширити діапазон комах, проти яких агент є ефективним. Коли передбачається супресія або комбінація експресії і супресії декількох генів, поліцистронний елемент ДНК може бути виготовлений як ілюстровано і розкрито в Fillatti, Публікація заявки № US 2004-0029283. Промотори, які функціонують в різних видах рослин, також відомі в галузі техніки. До промоторів, ефективних для експресії поліпептидів в рослинах, належать ті, які є індукованими, вірусними, синтетичними або конститутивними, як описано Odell і ін. (1985), і/або промоторами, які піддаються тимчасовій регуляції, просторовій регуляції і просторово-часовій регуляції. Переважні промотори включають посилені промотори CaMVSSS і промотор FMV35S. Для даного винаходу, наприклад, для оптимального контролю видів, які харчуються корінням, може бути переважним досягнення найвищих рівнів експресії цих генів в корінні рослин. Множина промоторів з підвищеним вмістом в корінні ідентифікована і відома в галузі техніки (Lu і ін., 2000; Патенти США №№ 5837848 і 6489542). Вектор або конструкт з рекомбінантної ДНК даного винаходу будуть звичайно включати селектований маркер, який надає вибираний фенотип рослинним клітинам. Селектовані маркери можуть також застосовуватися для вибору рослин або рослинних клітин, які містять екзогенні нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди або білки даного винаходу. Маркер може кодувати стійкість до біоцидів, стійкість до антибіотиків (наприклад, канаміцину, G418 блеоміцину, гігроміцину і т. д.) або стійкість до гербіцидів (наприклад, гліфозату і т. д.). Приклади селектованих маркерів включають, але не обмежуючись ними, ген пео, який кодує стійкість до канаміцину і може бути вибраний для застосування канаміцину, G418 і т. д., ген bar, який кодує стійкість до біалафосу; мутантний ген синтази EPSP, який кодує стійкість до гліфосфату; ген нітрилази, який надає стійкість до бромоксинілу; мутантний ген ацетолактатсинтази (ALS), який надає стійкість до імідазоліну або сульфонілуреази; і ген стійкості до метотрексату DHFR. Приклади таких селектованих маркерів описані в патентах США №№ 5550318; 5633435; 5780708 і 6118047. Рекомбінантний вектор або конструкт даного винаходу може також містити скринований маркер. Скриновані маркери можуть застосовуватися для моніторингу експресії. Приклади скринованих маркерів включають ген -глюкуронідази або uidA (GUS), який кодує фермент, різні хромогенні субстрати якого відомі (Jefferson, 1987; Jefferson і ін., 1987); ген R-локусу, який кодує продукт, який регулює продукцію антоціанінових пігментів (червоний колір) в тканинах рослин (Dellaporta і ін., 1988); ген -лактамази (Sutcliffe і ін., 1978), ген, який кодує фермент, різні хромогенні субстрати якого відомі (наприклад, PAD AC, хромогенний цефалоспорин); ген люциферази (Ow і ін., 1986) ген xylE (Zukowsky і ін., 1983), який кодує катехолдіоксигеназу, яка може конвертувати хромогенні катехоли; ген сс-амілази (Ikatu і ін., 1990); ген тирозинази (Katz і ін., 1983), який кодує фермент, здатний окислювати тирозин до DOPA і допахінону, який в свою чергу конденсується до меланіну; -галактозидазу, яка каталізує хромогенний субстрат галактозу. До переважних векторів трансформації рослин належать одержані з Ті плазміди Agrobacterium tumefaciens (наприклад, Патенти США № 4536475, 4693977, 4886937, 5501967 і ЕР 0122791). Плазміди Agrobacterium rhizogenes (або "Ri") також ефективні і відомі в галузі техніки. До інших переважних векторів трансформації рослин належать ті, що розкриті наприклад, Herrera-Estrella (1983); Bevan (1983), Klee (1985) і в ЕР 0 120 516. В основному переважно включення функціональної рекомбінантної ДНК в неспецифічне місцеположення в геном рослини. У спеціальних випадках може бути ефективною вставка рекомбінантного конструкта ДНК за допомогою сайтспецифічної інтеграції. Існує декілька 15 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 систем сайтспецифічної рекомбінації, які відомі як функціонуючі імпланти, і до них належать crelox, розкритий в Патенті США 4959317, і FLP-FRT, розкритий в Патенті США 5527695. Вважають, що придатні способи для трансформації клітин хазяїна для застосування в даному винаході, включають фактично будь-який спосіб, за допомогою якого ДНК може бути введений в клітину, наприклад, за допомогою безпосередньої доставки ДНК, наприклад, за допомогою PEG-опосередкованої трансформації протопластів (Omirulleh і ін., 1993), десикаційно/інгібіторно-опосередкованого захоплення ДНК (Potrykus і ін., 1985), електропорації (Патент США 5384253), перемішування з кремнійкарбідними волокнами (Kaeppler і ін., 1990; Патент США № 5302523 і Патент США № 5464765), Agrobacterium-опосередкованої трансформації (Патент США № 5591616 і Патент США № 5563055) і прискорення покритих ДНК частинок (Патент США № 5550318; Патент США № 5538877 і Патент США № 5538880) і т. д. Застосовуючи технології, такі як ці, клітини фактично будь-яких видів можуть бути стійко трансформовані. У випадку багатоклітинних видів, трансгенні клітини можуть бути регенеровані в трансгенні організми. Способи створення трансгенних рослин і експресії гетерологічних нуклеїнових кислот в рослинах, зокрема, відомі і можуть застосовуватися з наданими тут нуклеїновими кислотами для одержання трансгенних рослин, які мають знижену сприйнятливість до поїдання організмом паразита-мішені, таким як кукурудзяний жук. Вектори для трансформації рослини можуть бути одержані, наприклад, за допомогою вставки розкритих тут нуклеїнових кислот, продукуючих длРНК, у вектори для трансформації рослини і введення їх в рослини. Одна відома векторна система була одержана за допомогою модифікації природної системи перенесення генів Agrobacterium tumefaciens. Природна система включає великі Ті(пухлиноіндукуючі)-плазміди, що включають великий сегмент, відомий як Т-ДНК, який переноситься в трансформовані рослини. Інший сегмент Ті-плазміди, область vir, відповідальний за перенесення Т-ДНК. Область Т-ДНК обмежена термінальними повторами. У модифікованих бінарних векторах пухлиноіндукуючі гени видалені, і функції області vir використовуються для перенесення чужорідної ДНК, обмежувальними послідовностями Т-ДНК. Т-область може також містити селектований маркер для ефективного відновлення трансгенних рослин і клітин, і ділянку багаторазового клонування для вставки послідовностей для перенесення, таких як кодуюча длРНК нуклеїнова кислота. Трансгенна рослина, сформована за допомогою способів трансформації Agrobacterium, звичайно містить окрему просту рекомбінантну послідовність ДНК, вставлену в одну хромосому, і називається трансгенним об'єктом. Такі трансгенні рослини можуть бути гетерозиготними для вставленої екзогенної послідовності. Трансгенна рослина, гомозиготна відносно трансгена, може бути одержана за допомогою самозапилення самостійної ізольованої трансгенної рослини для продукції насіння F1. Одна чверть одержаного насіння F1 буде гомозиготною відносно трансгена. Після проростання насіння F1 утворюються рослини, які можуть тестуватися на гетерозиготність або гомозиготність, звичайно за допомогою аналізу SNP або термічного аналізу ампліфікації, який враховує відмінність між гетерозиготами і гомозиготами (тобто, налізу зиготності). С. Експресія нуклеїнової кислоти і супресія гена-мішені Даний винахід надає, як приклад, трансформований організм хазяїна або симбіонта паразита-мішені, трансформовані рослинні клітини і трансформовані рослини і їх потомство. Трансформовані рослинні клітини і трансформовані рослини можуть бути сконструйовані для експресії однієї або більше описані тут послідовностей длРНК або siPHК, для забезпечення ефекту захисту від паразита. Ці послідовності можуть застосовуватися для генної супресії в організмі паразита, таким чином зменшуючи паразитування паразита на захищеному трансформованому організмі хазяїна або симбіонта. Застосовуваний тут вираз "генна супресія" належить до будь-якого відомого способу зменшення рівнів генної транскрипції до мРНК і/або подальшої трансляції мРНК. Генна супресія також призначена для позначення зменшення експресії білка від гена або кодуючої послідовності, включаючи посттранскрипційну генну супресію і транскрипційну супресію. Посттранскрипційна генна супресія опосередковується гомологією між всією або частиною мРНК, транскрибованої від гена або кодуючої послідовності, призначеної для супресії, і відповідної дволанцюгової РНК, що застосовується для супресії, і належить до реального і вимірного зменшення кількості доступної мРНК, доступної в клітині для зв'язування з рибосомами. Транскрибована РНК може мати смислову орієнтацію для ефекту, званого косупресією, антисмислову орієнтацію для ефекту, званого антисмисловою супресією, або обидві орієнтації, продукуючі длРНК для ефекту, званого інтерференцією РНК (РНКі). Транскрипційна супресія опосередковується присутністю в клітині агента супресії гена длРНК, що має послідовність, в основному ідентичну послідовності промотору ДНК або його 16 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 комплементу, для ефекту, який називається транссупресією промотору. Генна супресія може бути ефективною відносно природного гена рослини, пов'язаного з певною ознакою, наприклад, для надання рослин зі зниженими рівнями білка, який кодується природним геном, або з підвищеними або зниженими рівнями метаболіту, на який виявляється вплив. Генна супресія може також бути ефективною відносно генів-мішеней у паразитів рослин, які можуть поїдати або контактувати з рослинним матеріалом, що містить агенти супресії генів, специфічно розроблені для інгібування або пригнічення експресії однієї або більше гомологічних або комплементарних послідовностей в клітинах паразита. Посттранскрипційна генна супресія антисмислової або орієнтованої смислової РНК для регуляції експресії генів в рослинних клітинах розкрита в Патентах США № 5107065, 5759829, 5283184 і 5231020. Застосування длРНК для супресії генів в рослинах розкрите в WO 99/53050, WO 99/49029, публікації заявки на патент США № 2003/0175965 і 2003/0061626, заявці на патент США № 10/465800 і патентах США № 6506559 і 6326193. У корисному способі посттранскрипційної генної супресії в рослинах використовуються як орієнтована смислова, так і орієнтована антисмислова транскрибована РНК, яка є стабілізованою, наприклад, у вигляді структури шпильки, стебла і петлі. У переважному конструкті ДНК для здійснення посттранскрипційної супресії генів перший сегмент кодує РНК, що має антисмислову орієнтацію, в основному ідентичну сегменту гена, супресія якого передбачається, який зв'язаний з другим сегментом в смисловій орієнтації, кодуючим РНК, в основному комплементарну першому сегменту. Такий конструкт формує структуру стебло-петля за допомогою гібридизації першого сегмента з другим сегментом і структуру петлі з нуклеотидних послідовностей, зв'язуючих два сегменти (див. WO 94/01550, WO 98/05770, US 2002/0048814 і US 2003/0018993). Згідно з одним варіантом здійснення даного винаходу надається нуклеотидна послідовність, in vitro експресія якої приводить до транскрипції стійкої послідовності РНК, яка в основному гомологічна молекулі РНК заданого гена у комахи, яка включає послідовність РНК, закодовану нуклеотидною послідовністю в геномі комахи. Таким чином, після поїдання комахою стійкої послідовності РНК, включеної в харчовий раціон або розпиленої на поверхні рослини, запускається знижувальна регуляція нуклеотидної послідовності, відповідної гену-мішені в клітинах комахи-мішені. Інгібування гена-мішені за допомогою технології стійкої длРНК даного винаходу є послідовність-специфічним, оскільки нуклеотидні послідовності, відповідні двоспіральній області РНК, призначені для генетичного інгібування. РНК, що містить нуклеотидні послідовності, ідентичні частині гена-мішені, є переважною для інгібування. Встановлено, що послідовності РНК з вставками, делеціями і одиничними точковими мутаціями відносно заданої послідовності також ефективні для інгібування. При здійсненні даного винаходу переважно, щоб інгібіторна длРНК і частина гена-мішені мали принаймні приблизно від 80% ідентичність послідовності або приблизно від 90% ідентичність послідовності, або приблизно від 95% ідентичність послідовності, або приблизно від 99% ідентичність послідовності, або навіть приблизно 100% ідентичність послідовності. У альтернативному варіанті, двоспіральна область РНК може бути визначена функціонально як нуклеотидна послідовність, яка здатна гібридизуватися з частиною транскрипту гена-мішені. Послідовність з довжиною, меншою ніж повна довжина, що має велику гомологію, компенсує більш довгу, але менш гомологічну послідовність. Довжина ідентичних нуклеотидних послідовностей може складати принаймні приблизно 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 або принаймні приблизно 1000 основ. Звичайно, необхідно застосовувати послідовність, що складається з більше 20-100 нуклеотидів, хоч послідовність з більше ніж приблизно 200-300 нуклеотидів буде переважною, а послідовність з більше ніж приблизно 500-1000 нуклеотидів буде особливо переважною, залежно від розміру гена-мішені. Винахід має перевагу в тому, що допускає варіації послідовності, які можна чекати внаслідок генетичних мутацій, поліморфізму штаму або еволюційної дивергенції. Включена молекула нуклеїнової кислоти може не бути абсолютно гомологічною, може не мати повної довжини в порівнянні з первинним продуктом транскрипції або повністю обробленою мРНК гена-мішені. Тому, фахівець в галузі техніки повинен розуміти, що, як розкрито тут, 100% ідентичність послідовності між РНК і геноммішенню не є обов'язковою для здійснення даного винаходу. Інгібування експресії гена-мішені може бути визначено кількісно за допомогою визначення або ендогенної РНК-мішені, або білка, продукованого за допомогою трансляції РНК-мішені, і наслідки інгібування можуть бути підтверджені за допомогою вивчення зовнішніх властивостей клітини або організму. Технології кількісного визначення РНК і білків відомі фахівцям в галузі техніки. Доступні багаторазові селектовані маркери, які надають стійкість до ампіциліну, 17 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 блеоміцину, хлорамфеніколу, гентаміцину, гігроміцину, канаміцину, лінкоміцину, метотрексату, фосфінотрицину, пуроміцину, спектиноміцину, рифампіцину і тетрацикліну і т. п. У деяких варіантах здійснення експресія гена інгібується принаймні на 10%, переважно принаймні на 33%, більш переважно принаймні на 50% і ще більш переважно принаймні на 80%. У особливо переважних варіантах здійснення винаходу експресія гена інгібується принаймні на 80%, більш переважно принаймні на 90%, більш переважно принаймні на 95% або принаймні на 99% в клітинах комахи, таким чином має місце значне інгібування. Значне інгібування призначене належати до достатнього інгібування, яке приводить до фенотипічної зміни, що піддається виявленню (наприклад, припинення росту личинки, паралічу або загибелі і т. д.) або зменшення, що піддається виявленню, РНК і/або білка, відповідного інгібованому генумішені. Незважаючи на те, що в деяких варіантах здійснення винаходу інгібування відбувається в основному у всіх клітинах комахи, в інших переважних варіантах здійснення інгібування відбувається тільки в субпопуляції клітин, експресуючих ген. Наприклад, якщо ген, який необхідно інгібувати, грає важливу роль в клітинах травного тракту комахи, інгібування гена в цих клітинах достатньо, щоб надати негативний вплив на комаху. Молекули длРНК можуть синтезуватися або in vivo або in vitro. длРНК може бути сформована за допомогою одиничного самокомплементарного ланцюга РНК або з двох комплементарних ланцюгів РНК. Ендогенна РНК полімераза клітини може опосередковувати транскрипцію in vivo, або клонована РНК полімераза може застосовуватися для транскрипції in vivo або in vitro. Інгібування може направлятися за допомогою специфічної транскрипції в органі, тканині або типі клітин; стимуляції зовнішніх умов (наприклад, інфекції, стресу, температури, хімічних індукторів) і/або інженерної транскрипції на певній стадії розвитку або в певному віці. Ланцюги РНК можуть бути або можуть не бути поліаденільовані; ланцюги РНК можуть бути або можуть не бути здатні до трансляції в поліпептид за допомогою клітинного апарату трансляції. РНК, длРНК, siPHК або тіРНК даного винаходу може бути одержана хімічно або ферментативно фахівцем в галузі техніки за допомогою неавтоматичних або автоматизованих реакцій, або in vivo в іншому організмі. РНК може також бути одержана за допомогою часткового або повністю органічного синтезу; будь-який модифікований рибонуклеотид може бути включений за допомогою in vitro ферментного або органічного синтезу. РНК може бути синтезована за допомогою клітинної РНК полімерази або РНК полімерази бактеріофага (наприклад, Т3, Т7, SP6). Застосування і продукція конструкта для експресії відомі в галузі техніки (див., наприклад, WO 97/32016; Патенти США №№ 5593874, 5698425, 5712135, 5789214 і 5804693). У випадку хімічного синтезу або ферментного синтезу in vitro, РНК може бути очищена до введення в клітину. Наприклад, РНК може бути очищена від суміші за допомогою екстракції з розчинником або смолою, преципітації, електрофорезу, хроматографії або їх комбінації. У альтернативному варіанті, РНК може застосовуватися за відсутності або з мінімальним очищенням, щоб уникнути втрат внаслідок процесингу зразка. РНК може бути висушена для зберігання або розчинена у водному розчині. Розчин може містити буфери або солі для стимуляції ренатурації і/або стабілізації подвійних ланцюгів. Для транскрипції від трансгена in vivo або конструкта для експресії, може застосовуватися регуляторна область (наприклад, промотор, підсилювач, глушитель і область поліаденілювання) для транскрипції ланцюга РНК (або ланцюгів). Тому, в одному варіанті здійснення, нуклеотидні послідовності, призначені для застосування в одержанні молекул РНК, можуть бути операбельно зв'язані з однією або більше промоторними послідовностями, функціональними в мікроорганізмі, грибку або клітині-хазяїні рослини. У ідеалі, нуклеотидні послідовності помішують під контролем ендогенного промотору, звичайного компонента в геномі хазяїна. Нуклеотидна послідовність даного винаходу, під контролем операбельно зв'язаної промоторної послідовності, може далі бути обмежена додатковими послідовностями, які переважно впливають на транскрипцію і/або стабільність транскрипту, що утворюється в результаті. Такі послідовності в основному розташовуються вище операбельно зв'язаного промотору і/або нижче 3' кінця конструкта для експресії і можуть знаходитися як вище промотору, так і нижче 3' кінця конструкта для експресії, незважаючи на те, що така послідовність, що знаходиться тільки вище, також передбачена. Застосовуваний тут термін "агент контролю комах" або "агент супресії гена" належить до специфічної молекули РНК, що включає перший сегмент РНК і другий сегмент РНК, в якій комплементарність між першим і другим сегментами РНК приводить до здатності двох сегментів гібридизувати in vivo і in vitro з формуванням дволанцюгової молекули. В основному може бути переважним включення третього сегмента РНК, який зв'язує і стабілізує першу і другу послідовності так, що всі структури формують структури стебла і петлі, або ще більш сильно гібридизуючі структури можуть формувати вузлову структуру стебло-петля. У альтернативному 18 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанті, симетрична шпилька може бути сформована без третього сегмента, в якому немає ніякої сконструйованої петлі, але через стеричні причини шпилька буде формувати власну петлю, якщо стебло має достатню довжину, щоб стабілізувати. Перший і другий сегменти РНК будуть в основному знаходитися в межах довжини молекули РНК і будуть в основному інвертованими повторами один одного, і будуть сполучені третім сегментом РНК. Перший і другий сегменти відповідають незмінно і незрівнянно смисловій і антисмисловій послідовностям відносно РНК-мішені, транскрибованої від гена-мішені в заданій комасі-паразиті, яка піддається супресії за допомогою прийому всередину молекули длРНК. Агент контролю комах може також бути представлений в основному очищеною (або ізольованою) молекулою нуклеїнової кислоти і більш конкретно молекулами нуклеїнової кислоти або молекулами фрагментів нуклеїнової кислоти від геномної ДНК (gДНК) або кДНК бібліотеки. У альтернативному варіанті, фрагменти можуть включати менші олігонуклеотиди, що мають від приблизно 15 до приблизно 250 нуклеотидних залишків і більш переважно від приблизно 15 до приблизно 30 нуклеотидних залишків. Застосовуваний тут термін "геном" відносно клітин комахи або хазяїна, охоплює не тільки хромосомну ДНК, що знаходиться в ядрі, але і ДНК органел, що знаходяться в межах субклітинних компонентів клітини. ДНК даного винаходу, введена в клітини рослини, тому може бути або інтегрована з хромосомою, або локалізована в органеллі. Термін "геном", відносно бактерій, охоплює і хромосому і плазміди в межах бактеріальної клітини-хазяїна. ДНК даного винаходу, введена в бактеріальні клітини-хазяїни, тому може бути або інтегрована з хромосомою або локалізована в плазміді. Застосовуваний тут термін "паразит" належить до комах, павукоподібних комах, ракоподібних, грибів, бактерій, вірусів, нематод, плоских черв'яків, аскарид, гостриків, анкілостом, стрічкових черв'яків, трипаносом, шистосом, оводів, бліх, коростяних кліщів, кліщів і вошей, і т. п., які поширені в середовищі, що оточує людину, і які можуть поїдати або контактувати з однією або більше клітками, тканинами або рідинами, продукованими хазяїном паразита або симбіонтом, трансформованим для експресії, або покритим дволанцюговим агентом супресії гена, або які можуть поїдати рослинний матеріал, що містить агент супресії гена. Застосовувана тут ознака "стійкість до паразита" є характеристикою трансгенної рослини, трансгенної тварини, трансгенного хазяїна або трансгенного симбіонта, яка викликає стійкість рослини, тварини, хазяїна або симбіонта до нападу паразита, який в звичайних умовах здатний викликати пошкодження або втрату рослини, тваринни, хазяїна або симбіонта. Така стійкість до паразита може бути результатом спонтанної мутації або більш часто інкорпорації рекомбінантної ДНК, яка викликає стійкість до паразита. Для надання стійкості комахи до трансгенної рослини, рекомбінантна ДНК може, наприклад, бути транскрибована в молекулу РНК, яка формує молекулу длРНК в тканинах або рідинах рекомбінантної рослини. Молекула длРНК включає частину сегмента РНК, який є ідентичним відповідному сегменту РНК, закодованому послідовністю ДНК в комасі паразиті, який переважно харчується рекомбінантною рослиною. Експресія гена в комасі-аразиті мішені піддається супресії за допомогою длРНК, і супресія експресії гена в комасі-аразиті мішені приводить до формування рослини, стійкої до комахи. Fire і ін. (Патент США № 6506599) загалом описав інгібування ураження паразитами, надаючи специфічні особливості тільки приблизно декількох нуклеотидних послідовностей, які були ефективні для інгібування функції генів у нематод виду Caenorhabditis elegans. Подібним чином, Plaetinck і ін. (US 2003/0061626) описав застосування длРНК для інгібування функції генів у множини паразитів нематод. Mesa і ін. (US 2003/0150017) описав застосування послідовності дцДНК для трансформації клітин хазяїна для експресії відповідних послідовностей длРНК, які в основному ідентичні послідовностям-мішеням в специфічних патогенах, і зокрема описав створення рекомбінантних рослин, експресуючих такі послідовності длРНК, для поїдання різними шкідниками рослин, сприяючи знижувальній регуляції гена в геномі паразита і підвищенню стійкості рослини до ураження паразитами. Даний винахід забезпечує інгібовану експресію одного або множини генів-мішеней в паразиті-мішені за допомогою способів стабілізованої длРНК. Винахід особливо ефективний в модуляції експресії еукаріотичних генів, зокрема модуляції експресії генів, що знаходяться в паразитах, які мають рівень рН в травній системі від приблизно 4,5 до приблизно 9,5, більш переважно від приблизно 5,0 до приблизно 8,0 і ще більш переважно від приблизно 6,5 до приблизно 7,5. Для шкідників рослин з травною системою, яка має рівень рН поза цими діапазонами, може бути бажаним застосування способів доставки, які не вимагають прийому всередину молекул длРНК. Модулюючий ефект длРНК застосовний до множини генів, що експресуються в паразитах, включаючи, наприклад, ендогенні гени, відповідальні за клітинний метаболізм або клітинну 19 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансформацію, включаючи гени підтримання житла, фактори транскрипції і інші гени, які кодують поліпептиди, задіяні в клітинному метаболізмі. Застосовувана тут фраза "інгібування експресії гена" або "інгібована експресія гена-мішені в клітині комахи" належить до відсутності (або об'єктивному зменшенню) рівня білка і/або продукту мРНК від гена-мішені. Специфічність належить до здатності інгібувати ген-мішень без ефектів, що виявляються, на інші гени клітини і без будь-яких ефектів на будь-який ген в клітині, яка продукує молекулу длРНК. Інгібування експресії гена-мішені у комахи-паразита може привести до нових фенотипічних ознак у комахи-паразита. Даний винахід частково надає систему доставки для доставки агентів контролю комах до комах за допомогою впливу на їх харчовий раціон, яка містить агенти контролю комах даного винаходу. Відповідно до одного з варіантів здійснення, стабілізовані молекули длРНК або siPHК можуть бути включені в харчовий раціон комахи або можуть бути нанесені на поверхню субстрату, що поїдається, для поїдання комахою. Даний винахід також частково надає систему доставки для доставки агентів контролю комах до комах за допомогою впливу на них мікроорганізму або хазяїна, такого як рослина, що містить агенти контролю комах даного винаходу, за допомогою згодовування клітин мікроорганізму або хазяїна, або вмісту клітин. Відповідно до іншого варіанта здійснення, даний винахід включає створення трансгенної рослинної клітини або рослини, яка містить рекомбінантний конструкт ДНК, транскрибуючий стабілізовані молекули длРНК даного винаходу. Застосовувана тут фраза "створення трансгенної рослинної клітини або рослини" належить до способів використання рекомбінантних технологій ДНК, легко доступних в галузі техніки (наприклад, Sambrook, і ін., 1989), для створення вектора трансформації рослини, транскрибуючого стабілізовані молекули длРНК даного винаходу, для трансформації рослинної клітини або рослини і створення трансгенної рослинної клітини або трансгенної рослини, яка містить транскрибовані, стабілізовані молекули длРНК. У ще одному варіанті здійснення, непатогенні, атенуйовані штами мікроорганізмів можуть застосовуватися як носій для агентів контролю комах і, з цієї точки зору, мікроорганізми, які несуть такі агенти, також називаються агентами контролю комах. Мікроорганізми можуть бути сконструйовані для експресії нуклеотидної послідовності гена-мішені, для продукції молекул РНК, що включають послідовності РНК, гомологічні або комплементарні послідовностям РНК, які звичайно виявляються в клітинах комахи. Вплив мікроорганізмів на комахах приводить до прийому всередину мікроорганізмів і понижувальної регуляції експресії генів-мішеней, опосередкованих прямо або непрямо молекулами РНК або їх фрагментами або похідними. У альтернативному варіанті даний винахід надає вплив на комаху агентів контролю комах даного винаходу, включених в мішалку з розпиленням і нанесених на поверхню хазяїна, такого як рослина-хазяїн. У прикладі варіанта здійснення, поїдання комахою агентів контролю комах приводить до доставки агентів контролю комах в кишечник комахи і потім в клітини організму комахи. У іншому варіанті здійснення, інфікування комахи агентами контролю комах за допомогою інших засобів, таких як ін'єкції або інші фізичні способи, також дозволяє доставити агенти контролю комах. У ще одному варіанті здійснення, молекули безпосередньо РНК інкапсулюють в синтетичну матрицю, таку як полімер, і наносять на поверхню хазяїна, такого як рослина. Поїдання комахою клітин хазяїна дозволяє доставити агенти контролю комах в комаху і приводить до знижувальної регуляції гена-мішені у хазяїна. Передбачається, що композиції даного винаходу можуть бути включені в насіння визначених видів рослин або у вигляді продукту експресії рекомбінантного гена, включеного в геном рослинних клітин, або за допомогою включення в покриття або в засіб для обробки насіння, який наносять на насіння перед посадкою. Вважається, що рослинна клітина, що містить рекомбінантний ген, є тут трансгенним об'єктом. Вважається, що пестицидний засіб для обробки насіння може надати значні переваги при об'єднанні з трансгенним об'єктом, який забезпечує захист від ураження твердокрилими паразитами, який знаходиться в межах переважного діапазону ефективності відносно захисту від паразита-мішені. Крім того, вважається, що бувають ситуації, відомі фахівцям в галузі техніки, коли сприятливо мати такі трансгенні об'єкти, які знаходяться в межах переважного діапазону ефективності. Даний винахід частково надає систему доставки для доставки агентів контролю комах в комах. Стабілізовані молекули длРНК або siPHК даного винаходу можуть бути безпосередньо введені в клітини комахи або введені у позаклітинний простір, інтерстиціальний простір, лімфатичну систему, травну систему в кровотік комахи за допомогою орального прийому всередину або інших способів, які може використати фахівець в галузі техніки. Способи для орального введення можуть включати пряме змішування РНК з їжею комахи, а також розробку 20 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 методів, в яких види, які використовуються як їжа, конструюють для експресії длРНК або siPHК, потім згодовують комасі для надання на неї впливу. Наприклад, в одному варіанті здійснення молекули длРНК або siPHК можуть бути включені всередину або нанесені на поверхню харчового субстрату комахи. У іншому варіанті здійснення, РНК може бути розпилена на поверхню рослини. У ще одному варіанті здійснення, длРНК або siPHК можуть експресуватися мікроорганізмами, а мікроорганізми можуть наноситися на поверхню рослини або вводитися в корінь, стебло за допомогою фізичного способу, такого як ін'єкція. У ще одному варіанті здійснення, рослина може бути генетично сконструйована для експресії длРНК або siPHК в кількості, достатній, щоб викликати загибель комах, які, як відомо, інфікують рослину. Зокрема, при здійсненні даного винаходу в WCR, стабілізована длРНК або siPHК може бути введена в середню кишку комахи і досягати бажаного інгібування заданих генів. Молекули длРНК або siPHК можуть бути включені в харчовий раціон або нанесені на харчовий субстрат, як обговорено вище, і можуть поїдатися комахами. У будь-якому випадку, длРНК'з даного винаходу надаються в дієті паразита-мішені. Паразит-мішень даного винаходу буде мати рН травного тракту від приблизно 4,5 до приблизно 9,5 або від приблизно 5 до приблизно 8,5, або від приблизно 6 до приблизно 8, або від приблизно 6,5 до приблизно 7,7, або приблизно 7,0. Травний тракт паразита-мішені визначений тут як орган, що локалізується в організмі паразита, в якому харчовий субстрат, який поїдається паразитом-мішенню, піддається впливу середовища, яке є сприятливим для поглинання молекул длРНК даного винаходу, не змінюючи рН настільки значно, що приводило б до дисоціації водневих зв'язків між подвійними ланцюгами длРНК і формування одноланцюгових молекул. Також очікується, що длРНК'в, продуковані за допомогою хімічного або ферментативного синтезу, можуть бути сформульовані таким чином, що будуть відповідати загальноприйнятій сільськогосподарській практиці і їх можна буде застосовувати у вигляді розпилюваних продуктів для контролю ураження комахами. Композиції можуть включати відповідні зв'язуючі речовини і змочувальні речовини, необхідні для ефективного покриття листя, а також УФ протектанти, для захисту длРНК від пошкодження під впливом УФ випромінювання. Такі добавки звичайно застосовуються в біоінсектицидній промисловості і відомі фахівцям в галузі техніки. Таке застосування можна комбінувати з іншими методами розпилення інсектицидів, біологічно обґрунтованими чи ні для посилення захисту рослин від пошкодження внаслідок поїдання комахами. Дані винахідники передбачають, що бактеріальні штами, продукуючі інсектицидні білки, можна застосовувати для продукції длРНК з метою контролю комах. Ці штами можуть мати поліпшені властивості контролю комах. Для створення длРНК для контролю комах можна використовувати множину різних бактеріальних хазяїнів. Приклади бактерій можуть включати Е. соїі, В. thuringiensis, Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Serratia entomophila і родинні Serratia sp., B. sphaericus, B. cereus, B. laterospams, B. popilliae, Clostridium bifermentans, і інші види Clostridium або інші спороутворювальні грампозитивні бактерії. У деяких варіантах здійснення бактерії можуть бути сконструйовані для контролю паразитів, таких як москіти. Даний винахід також належить до рекомбінантних конструктів ДНК для експресії в мікроорганізмі. Екзогенні нуклеїнові кислоти, від яких транскрибується цікавляча РНК, можуть , бути введені в мікробну клітину-хазяїна, таку як бактеріальна клітина або грибкова клітина, застосовуючи способи, відомі в галузі техніки. Нуклеотидні послідовності даного винаходу можуть бути введені в широкий спектр прокаріотичних і еукаріотичних мікроорганізмів-хазяїнів, для продукції стабілізованих молекул длРНК або siPHК. Термін "мікроорганізм" включає прокаріотичні і еукаріотичні мікробні види, такі як бактерії, гриби і водорості. Гриби включають дріжджі і нитчасті гриби, і ін. До ілюстративних прокаріотів, як до грамнегативних, так і грампозитивних, належать, Enterobacteriaceae, такі як Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella i Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, такі як Rhizobium; Spirillaceae, такі як photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, такі як Pseudomonas і Acetobacter;, Azotobacteraceae, Actinomycetales і Nitrobacteraceae. До еукаріотів належать гриби, такі як Phycomycetes і Ascomycetes, які включають дріжджі, такі як Saccharomyces і Schizosaccharomyces; і Basidiomycetes, такі як Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces і т. п. Для захисту рослин від комах, велика кількість мікроорганізмів, що є відомими мешканцями філоплани (поверхня листів рослини) і/або ризосфери (ґрунт, що оточує коріння рослини) широкого ряду важливих зернових культур, можуть також бути бажаними клітинами-хазяїнами для маніпуляції, поширення, зберігання, доставки і/або мутагенезу розкритих рекомбінантних конструктів. До цих мікроорганізмів належать бактерії, водорості і гриби. Особливо цікаві такі 21 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мікроорганізми, як бактерії, наприклад, роду Bacillus (включаючи види і підвиди В. thuringiensis kurstaki HD-1, В. thuringiensis kurstaki HD-73, В. thuringiensis sotto, B. thuringiensis berliner, B. thuringiensis thuringiensis, B. thuringiensis tolworthi, B. thuringiensis dendrolimus, B. thuringiensis alesti, B. thuringiensis galleriae, B. thuringiensis aizawai, B. thuringiensis subtoxicus, B. thuringiensis entomocidus, B. thuringiensis tenebrionis і В. thuringiensis san diego); Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Zanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, i Alcaligenes; гриби, зокрема дріжджі, наприклад, роду Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorala і Aureobasidium. Особливо цікаві такі бактеріальні види фітосфери, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes eutrophus і Azotobacter vinlandii; і види дріжджів фітосфери, такі як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, С laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. D. Трансгенні рослини Даний винахід надає насіння і рослини, що мають один або більшетрансгенних об'єктів. Комбінації об'єктів згадуються як "багаторівневі" трансгенні об'єкти. Ці багаторівневі трансгенні об'єкти можуть бути об'єктами, які направлені на одного і того ж паразита-мішень, або вони можуть бути направлені на різних паразитів-мішеней. У одному варіанті здійснення, насіння, що має здатність експресувати тут нуклеїнову кислоту, що надається, також має здатність експресувати принаймні один інший інсектицидний агент, включаючи, але не обмежуючись ними, молекулу РНК, послідовність якої одержана з послідовності РНК, експресованої в паразиті-мішені і яка утворює дволанцюгову структуру РНК після експресії в насінні або клітинах рослини, вирощеної з насіння, при цьому прийом всередину однієї або більше клітин рослини паразитом-мішенню приводить до супресії експресії РНК в клітинах паразита-мішені. У деяких варіантах здійснення насіння, що має здатність експресувати длРНК, послідовність якої одержана від паразита-мішені, також має трансгенний об'єкт, який забезпечує толерантність до гербіцидів. Один корисний приклад гена толерантності до гербіцидів забезпечує стійкість до гліфосфату, N-(фосфонометил)гліцину, включаючи форму солі ізопропіламіну такого гербіциду. У даному способі комбінація експресії інсектицидної кількості длРНК в клітинах трансгенного насіння або рослини, вирощеної з насіння, з обробкою насіння або рослини визначеними хімічними або білковими пестицидами може застосовуватися для забезпечення несподіваних синергічних переваг, включаючи несподівано перевершуючу ефективність захисту утворюваної в результаті трансгенної рослини від пошкодження паразитом-мішенню. У специфічних варіантах здійснення обробка трансгенного насіння, здатного експресувати деякі конструкти, які формують молекули длРНК, послідовність яких одержують з однієї або більше послідовностей, експресованих в кукурудзяному жуку, в кількості від приблизно 100 грамів до приблизно 400 грамів пестициду на 100 кг насіння, забезпечує несподівано перевершуючий захист від кукурудзяного жука. Крім того, вважають, що такі комбінації також ефективні в захисті напівзаглиблених рослин від винищування іншими паразитами. Насіння даного винаходу може також застосовуватися для зменшення вартості використання пестициду, оскільки для досягнення необхідного захисту можна застосовувати меншу кількість пестициду, ніж коли такі способи не застосовуються. Крім того, внаслідок застосування меншої кількості пестициду і внаслідок його застосування до засівання і без нанесення на окреме поле, вважають, що спосіб, що розглядається, таким чином, є більш безпечним для людини, яка його використовує, і для навколишнього середовища, і потенційно менш дорогим, ніж звичайні способи. "Синергічний" означає наявність синергічного впливу комбінації на пестицидну активність (або ефективність) комбінації трансгенного об'єкта і пестициду. Незважаючи на те, що не передбачається, що такі синергічні ефекти обмежують пестицидну активність, вони повинні також включати такі несподівані переваги, як збільшений діапазон активності, сприятливий профіль активності в частині типу і розмірів зменшення пошкодження, зменшена вартість пестициду і застосування, зменшений розподіл пестициду в навколишньому середовищі, зменшений вплив пестициду на персонал, який виробляє, транспортує і засіває насіння кукурудзи, і інші переваги, відомі фахівцям в галузі техніки. Пестициди і інсектициди, які є ефективними в композиціях в комбінації зі способами і композиціями даного винаходу, включаючи обробку і нанесення покриття на насіння, а також способи застосування таких композицій можуть бути знайдені, наприклад, в Патенті США 6551962, який наведений тут як посилання в повному об'ємі. 22 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Незважаючи на те, що вважають, що засоби обробки насіння можуть наноситися на трансгенне насіння в будь-якому фізіологічному стані, може бути переважним, щоб насіння знаходилося в достатньо стійкому стані, щоб воно не зазнавало ніякого пошкодження під час процесу обробки. Як правило, насіння є насінням, зібраним з ниви; забраним від трансгенної рослини; і відділеним від будь-якого іншого матеріалу ненасіннєвої рослини. Насіння переважно повинно бути біологічно стійким, за умови, що обробка не викличе ніякого біологічного пошкодження насіння. У одному варіанті здійснення, наприклад, може бути зроблена обробка посівного зерна, яке було зібране, очищене і висушене до вологості менше приблизно 15% по вазі. У альтернативному варіанті здійснення, насіння може бути висушене, а потім залите водою і/або іншим матеріалом і потім повторно висушене до або під час обробки пестицидом. З урахуванням описаних обмежень, вважають, що насіння може бути оброблене в будь-який час між збором насіння і засіванням насіння. Застосовуваний тут термін "незасіяне насіння" включає насіння в будь-який період між збором насіння і засіванням насіння в ґрунт з метою проростання і росту рослини. Коли сказано, що незасіяне насіння "оброблене" пестицидом, то це не означає, що така обробка включає технологію, в якій пестицид наносять на ґрунт, а не на насіння. Наприклад, вважається, що така обробка, як нанесення пестициду у вигляді смуг, "Т"смуг, або борозенок, одночасно із засіванням насіння, не включена в даний винахід. Пестицид або комбінація пестицидів, до яких можна застосувати поняття "бездомішковий", не містить яких-небудь розбавлюючих або додаткових компонентів. Однак, пестицид звичайно наносять на насіння у формі пестицидної композиції. Ця композиція може містити один або більше інших бажаних компонентів, включаючи, але не обмежуючись ними, рідкі розріджувачі, зв'язуючі речовини, що служать матрицею для пестициду, наповнювачі для захисту насіння в умовах стресу, і пластифікатори для поліпшення гнучкості, адгезії і/або розтікання покриття. Пестициди, що розглядаються, можна наносити на насіння у вигляді компонента оболонки насіння. Способи і композиції нанесення оболонки на насіння, відомі в області техніка, є ефективними, коли вони модифіковані за допомогою додавання одного з варіантів здійснення комбінації пестицидів даного винаходу. Такі способи нанесення оболонки і прилад для їх нанесення розкриті, наприклад, в Патенті США № 5918413, 5891246, 5554445, 5389399, 5107787, 5080925, 4759945 і 4465017. Композиції оболонок насіння розкриті, наприклад, в Патенті США № 5939356, 5882713, 5876739, 5849320, 5834447, 5791084, 5661103, 5622003, 5580544, 5328942, 5300127,4735015, 4634587, 4383391, 4372080, 4339456, 4272417 і 4245432, і інших. Пестициди, які є ефективними в нанесенні оболонки, є пестицидами, які описані тут. Кількість пестициду, яка застосовується для обробки насіння, варіює залежно від типу насіння і типу активних інгредієнтів, але обробка буде включати контактування насіння з визначеною кількістю комбінації пестицидів, яка є пестицидно ефективною. Коли паразитом-мішенню є комаха, цією кількістю буде кількість інсектициду, яка є інсектицидно ефективною. Застосовуваний тут термін інсектицидно ефективна кількість означає, кількість інсектициду, яка буде викликати загибель комах-паразитів в стані росту личинки або лялечки, або буде послідовно зменшувати або сповільнювати міру пошкодження, що викликається комахоюпаразитом. В основному, кількість пестициду, яка наноситься на насіння при обробці, складає від приблизно 10 г до приблизно 2000 г активного компонента пестициду на 100 кг ваги насіння. Переважно, кількість пестициду буде в межах діапазону від приблизно 50 г до приблизно 1000 г активного компонента на 100 кг насіння, більш переважно в межах діапазону від приблизно 100 г до приблизно 600 г активного компонента на 100 кг насіння і ще більш переважно в межах діапазону від приблизно 200 г до приблизно 500 г активного компонента на 100 кг ваги насіння. У альтернативному варіанті встановлено, що переважно, щоб кількість пестициду складала від приблизно 60 г активного компонента пестициду на 100 кг насіння і більш переважно від приблизно 80 г на 100 кг насіння. Пестициди, що застосовуються для обробки, не повинні інгібувати проростання насіння і повинні бути ефективними в захисті насіння і/або рослини під час життєвого циклу комахимішені, під час якого вона викликає пошкодження насіння або рослини. В основному, покриття буде ефективне протягом від приблизно 0 до 120 днів після засівання. Пестициди винаходу, що розглядається, можуть наноситися на насіння у формі оболонки. Вигоди, що надаються даним винаходом, можуть включати, але не обмежуючись ними: простоту введення длРНК в клітини комахи, низьку концентрацію длРНК, яка може застосовуватися, стійкість dsRJSFA і ефективність інгібування. Можливість використання низької концентрації стабілізованої длРНК дозволяє уникнути деяких недоліків антисмислової інтерференції. Даний винахід не обмежений застосуванням in vitro або композиціями 23 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічних послідовностей, конкретним набором генів-мішеней, специфічною частиною нуклеотидної послідовності гена-мішені або конкретним трансгеном, або конкретним способом доставки, на протилежність деяким з доступних технологій, відомих в галузі техніки, таким як антисмислова і косупресія. Крім того, генетична маніпуляція стає можливою в організмах, які не є класичними генетичними моделями. При здійсненні даного винаходу, можна здійснити селекцію для гарантії того, що наявність нуклеотидних послідовностей, транскрибованих від рекомбінантного конструкта, не є згубною для клітин, які не належать паразиту. Це може бути досягнуте за допомогою направляння генів, які мають низьку міру ідентичності послідовності з відповідними генами рослини або хребетної тварини. Переважна міра ідентичності послідовності становить менше приблизно 80%. Більш переважно міра ідентичності послідовності становить менше приблизно 70%. Найбільш переважно міра ідентичності послідовності становить менше приблизно 60%. На доповнення до прямої трансформації рослини за допомогою рекомбінантного конструкта ДНК, трансгенні рослини можуть бути одержані за допомогою схрещування першої рослини, що має рекомбінантний конструкт ДНК, з другою рослиною, яка не має конструкта. Наприклад, рекомбінантна ДНК для генної супресії може бути введена в першу лінію рослини, яка є доступною для трансформації, для продукції трансгенної рослини, яка може бути схрещена з другою лінією рослини для інтрогресїї рекомбінантної ДНК для генної супресії у другу лінію рослини. При практичному здійсненні, даний винахід може бути об'єднаний з іншими ознаками контролю комах в рослині для досягнення бажаних ознак для підвищеного контролю ураження комахами. Об'єднання ознак контролю комах, які введуть в дію різні способи активності, може надати захищені від комах трансгенні рослини зі стійкістю, яка перевершує таку у рослин, що мають одну ознаку контролю комах, внаслідок меншої імовірності розвитку цієї стійкості на ниві. Механізм інсектицидної активності кристалічних білків В. thuringiensis був широко вивчений в минулому десятиріччі. Показано, що кристалічні білки є токсичними для личинкової форми комахи тільки після прийому білка всередину. У личинках лускокрилих лужний рН і протеолітичні ферменти в середній кишці комахи розчиняють білки, таким чином, забезпечуючи вивільнення компонентів, які є токсичними для комахи. Ці токсичні компоненти руйнують клітини середньої кишки, приводять до припинення харчової активності комахи, і, зрештою, викликають загибель комахи. З цієї причини доведено, що токсини В. thuringiensis є ефективними і екологічно безпечними інсектицидами при контакті з різними комахами-паразитами. Твердокрилі і Напівтвердокрилі комахи, і ймовірно двокрилі, lygus і інші колючі і ссучі комахи мають слабокислий рН кишечнику, і таким чином токсини Bt, ефективні відносно личинок лускокрилих, неефективні проти цих паразитів. Також вважають, що слабокислий рН кишечнику цих комах є більш сприятливим для композицій даного винаходу, і, без обмежень до конкретної теорії, вважають, що лужний рН кишечнику личинок лускокрилих є суттєвою причиною, через яку попередні спроби демонстрації ефективності длРНК зазнавали невдачу (Fire et al., Патент США №6506559; Mesa et al. Публікація патенту №US2003/0150017; Rajagopal et al., 2002; Tabara et al, 1998). Тому вважають, що розкриті тут способи длРНК необхідно виборче застосовувати в композиціях і на рослинах для контролю твердокрилих, двокрилих, напівтвердокрилих, lygus і колючих і ссучих комах. Наведені тут способи і композиції особливо ефективні для направлення генів для супресії в комахах, що мають рН кишки від приблизно 4,5 до приблизно 9,5 або від приблизно 5,0 до приблизно 9,0, або від приблизно 5,5 до приблизно 8,5, або від приблизно 6,0 до приблизно 8,0, або від приблизно 6,5 до приблизно 7,7, або від приблизно 6,8 до приблизно 7,6, або приблизно 7,0. Однак передбачається, що комахи і інші види паразитів, які мають рН кишки від приблизно 7,5 до приблизно 11,5 або від приблизно 8,0 до приблизно 11,0, або від приблизно 9,0 до приблизно 10,0, такі як личинки лускокрилих комах, також входять в об'єм даного винаходу. Це особливо вірне, коли длРНК, специфічну для інгібування гена в личинках лускокрилих, вносять в дієту личинок нарівні з одним або більше білками Bt, що, в порівнянні з білком Bt, звичайно буде токсичним для цих лускокрилих личинок при застосуванні на пороговому або надпороговому рівнях. Наявність одного або більше токсинів Bt, токсичних для однакових видів комах, буде ефективно знижувати рН кишечнику, забезпечуючи стійке навколишнє середовище для дволанцюгових молекул РНК, для вияву їх ефектів пригнічення гена-мішені у комахи-паразита. Очікується, що комбінація деяких стабілізованих конструктів длРНК з одним або більше генами білка контролю комах приведе до синергій, які будуть посилювати фенотип контролю комах трансгенної рослини. Біологічні аналізи комахи, із застосуванням штучної дієти або тканини цілих рослин, можуть застосовуватися для визначення впливу дози на загибель або інгібування росту личинок, застосовуючи як білки контролю комах, так і длРНК. Фахівець в галузі 24 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 техніки може тестувати суміші молекул длРНК і білків контролю комах в біологічному аналізі для ідентифікації комбінації активних компонентів, які є синергічними і бажаними для поміщення в захищені від комах рослини (Tabashnik, 1992). Повідомлялося про синергізм між різними білками контролю комах в знищенні комах-паразитів (для огляду див. Schnepf і ін., 1998). Очікується, що синергізм буде спостерігатися між деякими длРНК і між деякими длРНК і деякими білками контролю комах. Винахід також належить до сировинних продуктів, які містять одну або більше послідовностей даного винаходу і одержуються від рекомбінантної рослини або насіння, що містить одну або більше нуклеотидних послідовностей даного винаходу, які специфічно розглянуті як варіанти здійснення даного винаходу. Передбачається, що до сировинних продуктів, що містять одну або більше послідовностей даного винаходу, належать, але не обмежуючись ними, крупи, олія або зруйновані, або цілі зерна, або насіння рослини, або будьякий харчовий продукт, включаючи будь-які крупи, олію або зруйновані, або цілі зерна рекомбінантної рослини або насіння, що містить одну або більше послідовностей даного винаходу. Детекція однієї або більше послідовностей даного винаходу в одній або більше сировині або сировинних продуктах, розглянутій тут, є явним доказом того, що сировина або сировинний продукт складені з трансгенної рослини, розробленої для експресії однієї або більше нуклеотидних послідовностей даного винаходу з метою контролю ураження комахою, за допомогою способів длРНК-опосередкованої супресії генів. D. Одержання нуклеїнових кислот Даний винахід надає спосіб одержання нуклеїнової кислоти, яка включає нуклеотидну послідовність для продукції длРНК або siPHК. У одному варіанті здійснення, такий спосіб включає: (а) дослідження бібліотеки кДНК або gДHК із зондом гібридизації, що включає всю або частину нуклеотидної послідовності або її гомолога від заданої комахи; (b) ідентифікацію клону ДНК, який гібридизує із зондом гібридизації; (с) ізоляцію клону ДНК, ідентифікованого в кроці (b); і (d) секвенування кДНК або фрагмента gДНК, який включає клон, виділений в кроці (с), в якому секвенована молекула нуклеїнової кислоти транскрибує всю або основну частину послідовності нуклеїнової кислоти РНК або її гомолога. У іншому варіанті здійснення спосіб даного винаходу для одержання фрагмента нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність для продукції основної частини длРНК або siPHК, включає: (а) синтез першого і другого олігонуклеотидних праймерів, відповідних частині одній з нуклеотидних послідовностей у заданої комахи; і (b) ампліфікацію матриці кДНК або gДHК у вектор клонування, застосовуючи перший і другий олігонуклеотидні праймери кроку (а), при цьому ампліфікована молекула нуклеїнової кислоти транскрибує основну частину длРНК або siPHК даного винаходу. При здійсненні даного винаходу, ген-мішень може бути одержаний з кукурудзяного жука (CRW), такого як WCR або SCR, або будь-яких видів комах, які викликають пошкодження хлібних злаків і подальші втрати урожаю. Передбачається, що при виборі переважних генівмішеней можна використовувати декілька критеріїв. Цікавлячим є ген, білковий продукт якого піддається швидкому метаболізму так, що інгібування длРНК може привести до швидкого зменшення вмісту білка. У деяких варіантах здійснення ефективно вибрати ген, для якого мале зниження рівня експресії приводить до негативних впливів на комаху. Якщо бажано впливати на широкий діапазон видів комах, вибирають ген, який є еволюційно високостабільним серед цих видів. Навпаки, з метою надання специфічності в деяких варіантах здійснення винаходу, вибирають ген, який містить області, які мають погану еволюційну стабільність серед окремих видів комах або серед комах і інших організмів. У деяких варіантах здійснення може бути бажаним вибір гена, який не має відомих гомологів в інших організмах. Застосовуваний тут термін "одержаний з" належить до точно встановленої нуклеотидної послідовності, яка може бути одержана з конкретного встановленого джерела або видів, хоч не обов'язково безпосередньо з цього встановленого джерела або видів. У одному варіанті здійснення, вибирають ген, який експресується в кишечнику комахи. Направлений вплив на гени, що експресуються в кишечнику, дозволяє уникнути потреби в поширенні длРНК в комасі. Гени-мішені для застосування в даному винаході можуть включати, наприклад, гени, в яких поєднуються основні гомології до нуклеотидних послідовностей відомих генів, що експресуються кишечником, які кодують білкові компоненти протонної V-АТФази вакуолі і плазматичної мембрани (Dow і ін., 1997; Dow, 1999). Цей білковий комплекс є єдиним активатором епітеліального іонного транспорту і відповідальний за облуговування порожнини середньої кишки. V-АТФаза також експресується в Мальпігієвих судинах, відростках задньої кишки комахи, функція яких складається в регуляції рідинного балансу і детоксикації чужорідних 25 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сполук за аналогією з нирками ссавців. У іншому варіанті здійснення, V-АТФаза може бути Vha68-2 або її гомологом або ортологом (наприклад, як указано в SEQ ID NО:821). У іншому варіанті здійснення вибирають ген, який в основному задіяний в рості, розвитку і репродукції комахи. До прикладів генів належать, але не обмежуючись ними, ген CHD3, ген тубуліну і ген, що кодує білок, який, як передбачається, задіяний в транспорті. Ген CHD3 у Drosophila melanogaster кодує білок з активністю АТФ-зйлежної ДНК гелікази, яка задіяна в збиранні/розбиранні хроматину в ядрі. Подібні послідовності були знайдені в різних організмах, таких як Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans i Saccharomyces cerevisiae. Сімейство генів -тубуліну кодує білки, зв'язані з мікроканальцями, які є компонентом клітинного цитоскелета. Родинні послідовності виявлені в таких різних організмах, як С. elegans і Manduca sexta. Білки, які по розрахунках є субодиницями комплексу ендосомального розпізнавання, необхідного для транспорту (ESCRT) - III (Babst і ін., 2002), наприклад, Dv49, знайдені в різних організмах, включаючи ссавців, дріжджів і комах, таких як D. virgifera. Іншим пов'язаним з транспортом білком є '-коатомерний білок, скорочено ’Cορ, який кодує продукт, задіяний в ретроградному (від Golgi до ER) транспорті. Подібні або передбачувані послідовності були ідентифіковані у С. elegans і/або virgifera, наприклад, Dv248 (SEQIDNO: ). До інших генів-мішеней для застосування в даному винаході можуть належати, наприклад, гени, які грають важливі ролі в життєздатності, рості, розвитку, репродукції і інфекційності. Ці гени-мішені можуть належати до генів підтримання житла, факторів транскрипції і генів, специфічних для комахи, або смертельних нокаут мутацій у Drosophila. Гени-мішені для застосування в даному винаході можуть також бути генами від інших організмів, наприклад, від нематод (наприклад, С. elegans). Додатково, нуклеотидні послідовності для застосування в даному винаході також можуть бути одержані з рослинних, вірусних, бактеріальних або грибкових генів, функції яких були встановлені з літератури і нуклеотидні послідовності яких в основному подібні генам-мішеням в геномі комахи. Згідно з одним аспектом даного винаходу, для контролю WCR, задані послідовності можуть в основному бути одержані від заданої комахи WCR. Деякі з прикладів заданих послідовностей з бібліотеки кДНК від WCR, які кодують білки або їх фрагменти у D. virgifera, які є гомологами відомих білків, можуть бути знайдені в Переліку послідовностей. Відомі молекули нуклеїнових кислот від D. virgifera, що кодують гомологи відомих білків (Andersen і ін., заявка на патент США Сер. №10/205189). З метою даного винаходу, молекули длРНК або siPHК можуть бути одержані від CRW за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР™) ампліфікації заданих генних послідовностей CRW, одержаних з gДHК кукурудзяного жука або бібліотеки кДНК або їх частин. Личинки WCR можуть бути одержані за допомогою способів, відомих фахівцеві в галузі техніки, а ДНК/РНК можуть бути екстраговані. З метою даного винаходу для екстракції ДНК/РНК можуть застосовуватися личинки різних розмірів в межах від 1 вікових стадій до повністю вирощених CRWs. Для ПЛР™ ампліфікації для одержання длРНК або siPHК можуть застосовуватися геномні бібліотеки ДНК або кДНК, створені від WCR. Гени-мішені можна потім ампліфікувати за допомогою ПЛР™ і упорядкувати за допомогою способів, легко доступних в галузі техніки. Фахівець в галузі техніки здатний модифікувати умови ПЛР™ для гарантії оптимального формування продукту ПЛР™. Підтверджений продукт ПЛР™ може застосовуватися як матриця для транскрипції in vitro, для створення смислової і антисмислової РНК з включеними мінімальними промоторами. Дані винахідники передбачають, що для контролю WCR і інших заданих комах в даному винаході можуть застосовуватися послідовності нуклеїнових кислот, ідентифіковані і виділені від будь-яких видів комах в царстві комах. У одному аспекті даного винаходу, нуклеїнова кислота може бути одержана від виду твердокрилих. Зокрема, нуклеїнова кислота може бути одержана від жуків листоїдів, що належать до роду Diabrotica (твердокрилі, Chrysomelidae), а саме, молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу можуть бути одержані з видів групи virgifera. Точніше, молекули нуклеїнових кислот даного винаходу можуть бути одержані з Diabrotica virgifera virgifera LeConte, який звичайно згадується як WCR. Виділені нуклеїнові кислоти можуть бути ефективними, наприклад, в ідентифікації гена-мішені і в створенні рекомбінантного вектора, який продукує стабілізовані длРНК або siPHКs даного винаходу, для захисту рослин від уражень комахами WCR. Таким чином, в одному варіанті здійснення, даний винахід включає виділені і очищені нуклеотидні послідовності від WCR або Lygus, які можна застосовувати як агенти контролю комах. Виділені і очищені нуклеотидні послідовності можуть включати послідовності, наведені в переліку послідовностей. Нуклеїнові кислоти від WCR або інших комах, які можна застосовувати в даному винаході, можуть також включати виділені і в основному очищені Unigenes і молекули нуклеїнових кислот 26 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 EST або молекули фрагментів цих нуклеїнових кислот. Молекули нуклеїнових кислот EST можуть кодувати значні частини, або фактично великі частини, поліпептидів. У альтернативному варіанті, фрагменти можуть включати менші олігонуклеотиди від приблизно 15 приблизно до 250 нуклеотидних залишків і більш переважно від приблизно 15 до приблизно 30 нуклеотидних залишків. У альтернативному варіанті, молекули нуклеїнових кислот для застосування в даному винаході можуть бути одержані з бібліотек кДНК від WCR або від будь-яких інших видів твердокрилих паразитів. Молекули нуклеїнових кислот і їх фрагменти від WCR або інших видів твердокрилих паразитів можна застосовувати для одержання інших молекул нуклеїнових кислот від інших видів для застосування в даному винаході, для продукції бажаних молекул длРНК і siPHК. Такі молекули нуклеїнових кислот включають молекули нуклеїнових кислот, які кодують всю послідовність, що кодує білок, і промотори і фланкуючі послідовності таких молекул. Крім того, такі молекули нуклеїнових кислот містять молекули нуклеїнових кислот, які кодують члени сімейства генів. Такі молекули можуть бути швидко одержані при використанні вищеописаних молекул нуклеїнової кислоти або їх фрагментів для скринінгу, наприклад, бібліотеки кДНК або gДНК одержані від D. v. virgifera або інших твердокрилих, або від Lygus hesperus. Способи формування таких бібліотек відомі в галузі техніки. Застосовувані тут фрази "кодуюча послідовність", "структурна нуклеотидна послідовність" або "структурна молекула нуклеїнової кислоти" належать до нуклеотидної послідовності, яка транслюється в поліпептид, звичайно за допомогою мРНК, при поміщенні під контролем придатних регуляторних послідовностей. Границі кодуючої послідовності визначають за допомогою трансляції стартового ко дону на 5'-кінці і термінуючого трансляцію ко дону на 3'кінці. Кодуюча послідовність може включати, але не обмежуючись вказаним, геномну ДНК, кДНК, EST і рекомбінантні нуклеотидні послідовності. Терміни "рекомбінантна ДНК" або "рекомбінантна нуклеотидна послідовність" належать до ДНК, яка містить модифікацію, створену методами генної інженерії маніпуляцією за допомогою мутагенезу, рестрикційних ензимів і т. п. Для багатьох комах, які є потенційними мішенями для контролю даним винаходом, може бути обмежена інформація відносно послідовностей більшості генів або фенотипу, внаслідок мутації специфічних генів. Тому, дані винахідники вважають, що вибір придатних генів від комах паразитів для застосування в даному винаході може бути здійснений за допомогою інформації, доступної від дослідження відповідних генів в організмі-моделі, такому як Drosophila, в деяких інших видах комах, або щвіть у видах нематод, у видах грибів, у видах рослин, в яких були характеризовані гени. У деяких випадках буде можливо одержати послідовність відповідного гена від комахи-мішені за допомогою пошуку баз даних, таких як GenBank, застосовуючи або назву гена, або послідовність від, наприклад, Drosophila, іншої комахи, нематоди, гриба або рослини, від якої був клонований ген. Після одержання послідовності, можна застосувати ПЛР™ для ампліфікації відповідно вибраного сегмента гена в комасі для застосування в даному винаході. Для одержання сегмента ДНК від відповідного гена виду комахи, на основі послідовності, виявленої в WCR або інших комахах, від яких був клонований ген, можуть бути розроблені праймери ПЛР™. Праймери розробляють для ампліфікації сегмента ДНК достатньої довжини для застосування в даному винаході. ДНК (або геномну ДНК або кДНК) одержують від видів комах, а праймери ПЛР™ застосовують для ампліфікації сегмента ДНК. Умови ампліфікації вибирають так, щоб ампліфікація відбувалася навіть, якщо праймери не будуть точно відповідати заданій послідовності. У альтернативному варіанті, ген (або його частина) може бути клонований від бібліотеки gДНК або кДНК, одержаної від видів комах-паразитів, застосовуючи ген WCR або інший відомий ген комахи як зонд. Технології здійснення ПЛР™ і клонування від бібліотек відомі. Подальші деталі процесу, за допомогою якого можуть бути ізольовані сегменти ДНК від заданих видів комах-паразитів, засновані на послідовності генів, попередньо клонованих від WCR або інших видів комах, надані в Прикладах. Фахівцеві в галузі техніки ясно, що для виділення сегментів гена від видів комах-паразитів, які відповідають генам, попередньо виділеним від інших видів, можна застосовувати множину технологій. Якщо паразитом-мішенню для даного винаходу є комаха, до таких паразитів належать, але не обмежуючись ними: комахи із ряду Лускокрилих, наприклад: Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp., Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., 27 UA 98445 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia Nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thanmetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia nі і Yponomeuta spp.; комахи із ряду Твердокрилих, наприклад: Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. і Trogoderma spp.; із ряду Прямокрилих, наприклад, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta ssp. і Schistocerca spp.; із ряду Термітів, наприклад, Reticulitemes ssp; із ряду Сіноїдів, наприклад, Liposcelis spp.; із ряду Вошей, наприклад, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. і Phylloxera spp.; із ряду Пухоїдів, наприклад, Damalinea spp. і Trichodectes spp.; із ряду Трипсів, наприклад, Franklinella spp., Hercinothrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci і Scirtothrips aurantii; із ряду Напівтвердокрилих, наприклад, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp., Triatoma spp., Miridae family spp., такі як Lygus hesperus і Lygus lineoloris, Lygaeidae family spp., такі як Blissus leucopterus і Pentatomidae family spp.; із ряду Рівнокрилих, наприклад, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigeram, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla ssp., Pulvinaria, aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae і Unaspis citri; із ряду Перетинчастокрилих, наприклад, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius sppp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp, Solenopsis spp. і Vespa ssp., із ряду Двокрилих, наприклад, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fanrlia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca ssp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. і Tipula spp., із ряду бліх, наприклад, Ceratophyllus spp. i Xenopsylla cheopis, і із ряду Щетинохвосток, наприклад, Lepisma saccharina. Встановлено, що даний винахід особливо ефективний, коли комахою-паразитом є Diabrotica spp., і особливо коли паразитом є Diabrotica virgifera virgifera (Західний кукурудзяний жук, WCR), Diabrotica barberi (Північний кукурудзяний жук, NCR), Diabrotica virgifera zea (Мексиканський кукурудзяний жук, MCR), Diabrotica balteata (Бразильський кукурудзяний жук (BZR) або комплекс 28