Спосіб лікування експериментального алергічного енцефаломієліту мезенхімальними стовбуровими клітинами (мск)

Реферат: Спосіб лікування експериментального алергічного енцефаломієліту мезенхімальними стовбуровими клітинами (МСК) є експериментальним методом лікування і включає ін'єкційне введення тваринам-реципієнтам МСК донорського походження. При цьому як МСК застосовують збагачені в процесі культивування ембріональні МСК (ранніх етапів дозрівання) пуповини людини, додатково здійснюють введення цих клітин у велику потиличну цистерну субокципітально. UA 101499 U (12) UA 101499 U UA 101499 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме нейрохірургії, і може бути використана для лікування експериментального алергічного енцефаломієліту мезенхімальними стовбуровими клітинами. Лікування нейродегенеративних хвороб - актуальна наукова проблема [1]. Важливою складовою вирішення цієї проблеми є експериментальні дослідження з використанням лабораторних тварин. Експериментальний алергійний енцефаломієліт (ЕАЕ) тварин розглядають як найбільш вдалу експериментальну модель розсіяного склерозу людини, особливо, аутоімунного його компонента. У патогенезі ЕАЕ на різних етапах істотне значення має поєднання процесів запалення, демієлінізації та аксональної дегенерації. Як енцефалітогенні субстанції можуть бути пептиди і глікопротеїни мієліну, білки теплового шоку, білок S-100 і інші білки ЦНС. На сьогодні одним з основних підходів до лікування ЕАЕ є імуносупресивна терапія, що створює передумови для відновлення зруйнованих мієлінових оболонок нервів. Як правило, таке лікування спрямоване на пригнічення основної патогенетичної ланки ЕАЕ - активності антиОБМ-антиген-специфічних СД4-Т-лімфоцитів, які утворюються у відповідь на імунізацію тварин енцефалітогенною емульсією з ад'ювантом Фрейнда. Серед таких методів можна згадати застосування препарату "Копаксон" (глатимеру ацетат) - синтетичного співполимеру L1 амінокислот Glu, Lys, Ala та Туг. Копаксон в тримолекулярному комплексі утворює більш щільний зв'язок з рецептором, ніж загальний білок мієліну (ЗБМ), відштовхуючи його і перетворюючись у "хибну мішень" для активованих Т-лімфоцитів. Крім цього, взаємодія Т-клітин з копаксоном замість ОБМ у тримолекулярному комплексі веде до проліферації копаксонспецифічних Т-клітин, здатних долати ГЕБ. Постійне введення препарату веде до зсуву фенотипу копаксон-специфічних клітин до Т2-типу. Це сприяє супресорному ефекту. Копаксонспецифічні Т2-лімфоцити долають ГЕБ і утворюють у ЦНС так звану фонову супресію. При взаємодії з аутоантигенами (ЗБМ та іншими) вони реактивуються і продукують протизапальні цитокіни - інтерлейкіни 4 і 10 та фактор некрозу пухлин (бета). Крім цього, копаксон бере участь у апоптозі активованих Т1-лімфоцитів, що веде до їх анергії [1]. До недоліків цього способу можна віднести фінансову складову такого лікування, бо препарат "Копаксон" лишається унікальним і недоступним для перманентного використання хворими на демієлізуючі хвороби з країн, що розвиваються. Крім цього, відомо, що у частини хворих розвивається гуморальна відповідь на діючу речовину препарату "Копаксон". Ці антитіла зв'язують молекули пептиду, інактивують його рецепторзв'язуючий домен і дія препарату призупиняється. Комплексний вплив на агресивний аутоімунітет при ЕАЕ може бути досягнутий при застосуванні окремих фракцій клітин алогенного головного мозку новонароджених тварин та плодів [2]. Механізм лікувального ефекту дослідники пов'язують з кількома факторами. З одного боку, може мати значення делеція енцефалітогенних клонів Т-лімфоцитів за рахунок того, що частина клітин, що трансплантуються, вже формує мієлінову оболонку. Після потрапляння у ЦНС шляхом субокципітального введення, фрагменти цієї оболонки, що містять мієлін, можуть бути джерелом відповідних антигенів, які, в умовах антиген специфічного запалення у мішеневому органі при повторному контакті з Т-лімфоцитами можуть сприяти селекції регуляторних Т-клітин, що продукують інтерлейкін-10. Цей процес, теоретично, має вести до супресії ЕАЕ шляхом цитокінзалежних механізмів [3]. З іншого боку, не можна виключати низки різноманітних імуномодулюючих впливів стовбурових клітин та клітин-прогеніторів, які містяться в суспензіях, отриманих з головного мозку незрілих тварин. Експериментально показано, що після субокципітального введення стовбурових нейроклітин та клітин-прогеніторів спостерігаються характерні ознаки ослаблення проявів антигенспецифічних реакцій в імунній системі тварин з ЕАЕ (зменшення міжламелярного та періаксонального набряку ламел мієлінової оболонки аксонів на тлі нормалізації питомої ваги кортизолрезистентних лімфоцитів периферичних органів імунної системи) [4]. До недоліків цього методу можна віднести необхідність застосування фетальних клітин, що може не відповідати етичним нормам і правилам. Оскільки в основі патогенезу ЕАЕ лежить розвиток аутоімунного стану, на сьогоднішній день одним з основних підходів до лікування ЕАЕ може бути застосування з метою імуносупресії терапії мезенхімальними стовбуровими клітинами (МСК), джерелом яких є жирова тканина і кістковий мозок дорослих особин [5]. Цим клітинам притаманний імуносупресуючий вплив за рахунок пригнічення ІЛ-2-залежної активації Т- і В-лімфоцитів, супресії проліферації Тлімфоцитів, що веде до пригнічення антигенспецифічного запалення і створює умови для відновлення мієлінової оболонки аксонів у тварин з ЕАЕ [5]. До недоліків цього способу можна віднести необхідність застосування великої кількості МСК для системного введення тваринам і 1 UA 101499 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ці клітини є дорослими стовбуровими клітинами з можливістю трансформуватися в клітини небажаних ліній. Найближчим аналогом (прототипом) способу лікування ЕАЕ є спосіб, який передбачає внутрішньовенне введення тваринам живих МСК, що отримані з тканин дорослих і збагачені шляхом культивування in vitro. Таку маніпуляцію проводять одноразово, на 18 добу після індукції ЕАЕ [6]. На першому етапі лікування проводять заготівлю клітин дорослих тварин, що містять у своєму складі МСК. Потім проводять культивування отриманих суспензій у поживному середовищі до досягнення субконфлюентного шару, перенесення (пасаж) отриманих клітин у новий культуральний посуд і наступне культивування. У подальшому, після досягнення культурою необхідного ступеня щільності, видаляють МСК з культуральної підкладки, виготовляють суспензію МСК і вводять внутрішньовенно тваринам-реціпієнтам на 18 добу після індукції ЕАЕ [6, 7]. Описаний спосіб дозволяє досягти лікувального ефекту у тварин, зменшити ступінь рухового дефіциту, прискорити досягнення стану ремісії. Проте одним з факторів, які стримують використання цього способу і змушують більш прискіпливо розглядати результати такого лікування, є необхідність внутрішньовенного введення тваринам-реціпієнтам досить великої дози МСК (приблизно 1 млн. клітин на 10,0 г ваги). Автори розробки помітили, що лікування ЕАЕ внутрішньовенним введенням МСК є ефективним тільки за умови проведення його на піку клінічних проявів ЕАЕ. Враховуючи, що лікування передбачає етап культивування з метою збагачення суспензії МСК з подальшим нарощуванням їх клітинної маси (вони мають відповідати фенотиповим і кількісним критеріям у день трансплантації, а саме на 18-ту добу після індукції ЕАЕ) важко розраховувати на гарантовану трансплантацію необхідної кількості клітин усім тваринам дослідної групи. Такі ризики негативно впливають на результати досліджень. Поставлена задача полягає в удосконаленні способу лікування ЕАЕ з використанням стовбурових клітин за рахунок оптимізації способу введення МСК, внаслідок чого реципієнт отримує імуносупресивну терапію у необхідний термін після індукції ЕАЕ у необхідному обсязі. Технічний результат, що досягається корисною моделлю, буде полягати у зниженні необхідної для лікування дози МСК і створенні умов для проведення лікування необхідній кількості експериментальних тварин дослідної групи. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі лікування ЕАЕ з використанням МСК, який включає ін'єкційне введення тваринам-реципієнтам МСК донорського походження, згідно з корисною моделлю, як МСК застосовують збагачені в процесі культивування ембріональні МСК (ранніх етапів дозрівання) дорослих донорів, додатково здійснюють введення цих клітин у велику потиличну цистерну субокципітально. Відмінною особливістю способу, що заявляється, є те, що тварині з ЕАЕ субокципітально трансплантують клітинну суспензію, яка містить значно меншу кількість культивованих ембріональних МСК. Нейрохірургічний підхід - субокципітальне введення - забезпечує доставку необхідних клітинних субстанцій у місця руйнування мієліну, де МСК можуть мати притаманний їм імуносупресуючий вплив за рахунок пригнічення ІЛ-2-залежної активації Т- і В-лімфоцитів, супресії проліферації Т-лімфоцитів значно меншою кількістю клітин, а пригнічення антигенспецифічного запалення за рахунок цього лікування створює умови для відновлення мієлінової оболонки аксонів у тварин з ЕАЕ. Покращення мієлінізації аксонів сприяє покращенню рухових функцій тварин. За відомими літературними даними такий спосіб лікування ЕАЕ з використанням ембріональних МСК дорослих донорів невідомий. Запропонований спосіб лікування здійснюється наступним чином. Забір донорських тканин (пуповини) здійснюється у пологовому залі після відходження плаценти. Пуповинний канатик стерильно забирають у культуральний посуд у поживне середовище з антибіотиком (10-кратна концентрація антибіотиків (пеніцилін та стрептоміцин, 1 3 мг та 1000 одиниць на см , відповідно) та 1-кратної концентрації амфотерицину Б) і транспортують у лабораторію культивування тканин. Там з тканини канатика стерильно вилучають Вартонів "студень", видаляють судини, подрібнюють матрикс пуповини на шматочки та переносять на культуральний пластик в поживне середовище ДМЕМ з 10 % фетальної сироватки КРС. Середовище замінюють кожні 3-5 днів при його пожовтінні. Після виходу клітин з експлантів приблизно на 7-10 добу шматочки видаляють і продовжують культивування клонів (0-й пасаж МСК), що утворюються, до конфлюентності приблизно 70 %, після чого клітини відділяють з підкладки, переносять у культуральний посуд з новим поживним середовищем і продовжують культивування. Дану процедуру (пересів клітин) проводять ще один раз до отримання 2-го пасажу. Потім МСК пуповини вилучають з культурального посуду, відмивають 2 UA 101499 U 5 10 15 20 25 30 35 від залишків культурального середовища та сироватки, підраховують кількість клітин, визначають фенотип клітин. Наркотизованим щурам вистригають шерсть на шиї, обробляють шкіру 3 % спиртовим розчином йоду, проводять пункцію великої потиличної цистерни і вводять суспензію в об'ємі 100 мкл фізіологічного розчину (1,0 млн.) інсуліновим шприцом. Таку трансплантацію на курс лікування проводять одноразово. Таким чином, субокципітальна трансплантація культивованих МСК пуповини дорослих донорів забезпечує доставку необхідних клітинних субстанційу місця руйнування мієліну, справляє імуносупресуючий вплив значно меншою кількістю клітин мезенхімального походження, сприяє покращенню рухових функцій тварин. Запропонований нами спосіб має такі переваги: тварині з ЕАЕ субокципітально трансплантують клітинну суспензію, яка містить значно меншу кількість культивованих ембріональних МСК; субокципітальне введення МСК зумовлює використання значно меншої кількості клітин; розроблений метод значно спрощує збір та зберігання вихідного матеріалу для проведення досліджень; розроблений метод не є дороговартісним і не потребує спеціального обладнання; субокципітальне введення - забезпечує доставку необхідних клітинних субстанцій безпосередньо у місце ураження місця руйнування мієліну, де МСК можуть мати притаманний їм імуносупресуючий вплив; більш виражений терапевтичний ефект. Джерела інформації: 1. Патофізіологія: підручник / М.Н. Зайко, Ю.В. Биць, Г.М. Бутенко та ін.; за ред. М.Н. Зайка та Ю.В. Биця. - 2-ге вид., перероб. і доп. - К;: Медицина. - 2008. - 704 с. 2. Цимбалюк В.І., Лісяний М.І., Маркова О.В., Пічкур Л.Д., Любич Л.Д., Вербовська С.А., Касяненко Ю.А., Вотякова І.А., Василовська С.В. Результати хірургічного лікування експериментального алергічного енцефаломієліту // Трансплантологія. - 2003. - Том 4. - № 1. С. 115-117. 3. Цимбалюк В.І., Васильєва І.Г. Спосіб отримання лікарського препарату "Трофін" / Патент на винахід 34141, Україна, А61К35/28. Заявл. 08.06.1999, опубл. 15.02.2001, бюл. № 1. 4. Лисяный Н.И., Маркова О.В., Вельская Л.Н. Применение нейральных стволовых клеток для лечения демиелинизирующих заболеваний. В кн.: Нейрогенная дифференцировка стволовых клеток. - К. - 2005. - 368 с. [с. 238] 5. Маркова О.В. Применение гемопоэтических стволовых клеток в лечении очаговых поражений ЦНС // Матеріали IV з'їзду нейрохірургів України (м. Дніпропетровськ, 27-30 травня 2008 року). Дніпрпетровськ. - 2008. - С. 210. 6. Вершигора А.Е. Основы иммунологии. - К.: Вища школа. - 1990. - 503 с. 7. Цимбалюк В.І., Маркова О.В., Пічкур Л.Д., Заяць Т.А. Вплив хірургічного лікування щурів з експериментальним демієлінізуючим захворюванням на вміст сироваткових циркулюючих імунних комплексів // Імунологія та алергологія. - 2004. - №1. - С. 64. 40 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 Спосіб лікування експериментального алергічного енцефаломієліту мезенхімальними стовбуровими клітинами (МСК), що є експериментальним методом лікування і включає ін'єкційне введення тваринам-реципієнтам МСК донорського походження, який відрізняється тим, що як МСК застосовують збагачені в процесі культивування ембріональні МСК (ранніх етапів дозрівання) пуповини людини, додатково здійснюють введення цих клітин у велику потиличну цистерну субокципітально. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3