Спосіб кріогенного збереження фрагментів перикарда людини

Реферат: Спосіб кріогенного збереження фрагментів перикарда людини передбачає розміщення відпрепарованих фрагментів перикарда в суміші поживного середовища (для культивування клітки) та кріопротектора - диметилсульфоксиду, з подальшим поступовим охолодженням одержаної суміші аж до температури її замороження. Як поживне середовище використовують DMEM/F 12 та аутологічну сироватку. Співвідношення диметилсульфоксиду, DMEM/F 12 та аутологічної сироватки складає, мас. %: 20:55:25. Після чого поступово знижують температуру до -80 °C. Подальше кріозбереження виконують при 196 °C. UA 102774 U (12) UA 102774 U UA 102774 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до регенеративної медицини, зокрема до кардіохірургії, та може бути використана для зберігання тканини перикарда людини з подальшим виконанням пластики серцевих клапанів. Одною із сучасних та найбільш складних проблем кардіохірургії і, особливо дитячої хірургії, є корекція вроджених та набутих вад серця. На даний час широкого застосування набуло використання заплат та судинних кондуїтів при реконструктивних оперативних втручаннях з приводу вроджених та набутих вад серця. Серед матеріалів, які широко використовують за вказаним вище призначенням, виділяють синтетичні матеріали, аутологічний, алогенний та ксеногенний перикард. Синтетичні матеріали, що знайшли застосування в серцево-судинній хірургії, представлені полімерами, металами чи комбінаціями металів з полімерами. Найбільшою перевагою синтетичних матеріалів є міцність і тривалий час експлуатації, в той же час їхня біосумісність може спричиняти певні ускладнення. Значним недоліком вказаних синтетичним матеріалів є токсичність, особливо у випадку матеріалів, однією з властивостей яких є біодеградація, що може бути причиною появи шкідливих продуктів у організмі людини [1-5]. Серед натуральних матеріалів для заміни або пластики та відновлення серцево-судинних структур найбільші функціональні переваги має вищезгаданий перикард. До кращого вибору відносяться алогенні тканини чи донорські тканини від організму людини, але кількість таких тканин дуже обмежена, тому ксеногенні тканини від тварин є найбільш доступним матеріалом особливо при заміні клапанів серця. Алогенні та ксеногенні тканини мають недоліки відносно імунної відповіді, що потребує імунодепресивної терапії [6], яка не завжди дає бажаний результат. Ксеногенні тканини повинні проходити спеціальну обробку децелюляризацію [7], але цей процес не завжди виправданий, оскільки залишаються речовини, які можуть пошкодити тканину, пластика якої виконується. Але оптимальну функціональність у віддаленому періоді демонструє аутологічний перикард в порівнянні з ксено- та алогенним. Незважаючи на великий об'єм наукових досліджень та практичних застосувань [8], ксеноперикард поступається по комплексу споживчих властивостей аутологічному перикарду. Слід зауважити, що кожна тканина в організмі має специфічні, притаманні лише даній системі чи органу властивості і тому має відповідну лише цій тканині біосумісність. Такому принципу в найбільшій мірі відповідає аутологічна тканина перикарда чи тканина перикарда від донорів. Оскільки тканини організму (перикарда) є обмеженими, а забір достатньої їх кількості може впливати на здоров'я пацієнта, то існує багато перешкод у отриманні аутологічних тканин. Із відміченого вище випливає, що фрагменти аутологічної тканини перикарда являють собою цінність і їх збереження особливо важливо при деяких реконструктивних кардіохірургічних втручаннях. Слід зауважити, що під час повторних кардіохірургічних втручань площа та якість аутологічного перикарда значно зменшується через порушення цілісності перикардіальної сумки під час першої операції. Перикард фіброзується, потовщується та залучається в спайковий процес. Для того, щоб фрагменти нативного аутологічного перикарда, одержаного під час первинної кардіохірургічної операції можливо було застосувати під час повторних реконструктивних втручань на серці, їх необхідно кріозберігати. На цей час практично відсутні способи збереження сполучної тканини перикарда і, в першу чергу, кріозбереження. При збереженні фрагментів сполучної тканини перикарда, одержаного при первинному втручанні з приводу вроджених та набутих вад серця, повинен бути дотриманий принцип максимального збереження властивостей речовин позаклітинного матриксу та життєздатності клітин. На цей час найближчим аналогом корисної моделі, що заявляється, є патент US 4890457,МПК F25D 13/04, публ. 02.02.1990 p. Відомий спосіб збереження перикарда містить в собі як хімічні, так і фізичні прийоми. До фізичних прийомів відносяться дії вітрифікації або поступового заморожування та розморожування перикарда. Кінцева температура кріозбереження складає 132 С. Спосіб кріогенного зберігання фрагментів перикарда передбачає вміщення відпрепарованих фрагментів перикарда у ізотонічне середовище, яке містить поживне середовище та кріопротектор. Як кріопротектор використовують диметилсульфоксид, а поживне середовище містить ефективну кількість поліміксину сульфату В, ванкоміцину та лінкоміцину. Хімічні компоненти, що використовуються в процесі кріозбереження перикарда, забезпечують суттєве запобігання цитотоксичності та підтримання антибіотичної ефективності. 1 UA 102774 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Недоліком найближчого аналога є технологічна складність його здійснення, пов'язана, в першу чергу, з повільним поступальним зниженням температури і з наступним поступальним підвищенням температури при розморожуванні перикарда. Крім того, хімічна складова разом з фізичною здійснення способу не забезпечує в повній мірі життєдіяльність клітин перикарда в силу їх часткового пошкодження, а отже є причиною можливих порушень при пластиці, наприклад, серцевих клапанів. Задачею запропонованої корисної моделі є вдосконалення відомого способу, шляхом використання особливих умов кріозбереження сполучної тканини перикарда як матриксу, так і її клітин, що забезпечує високу ефективність і надійність для наступних кардіохірургічних маніпуляцій. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб кріогенного збереження фрагментів перикарда людини передбачає розміщення відпрепарованих фрагментів перикарда в суміші поживного середовища (для культивування клітин) та кріопротектора - диметилсульфоксиду, з подальшим поступовим охолодженням одержаної суміші аж до температури її замороження, згідно з корисною моделлю, як поживне середовище використовують DMEM/F 12 та аутологічну сироватку, причому співвідношення диметилсульфоксиду, DMEM/F 12 та аутологічної сироватки складає, мас. %: 20:55:25, після чого поступово знижують температуру до -80 °C, а подальше кріозбереження виконують при 196 °C. Авторами запропонованої корисної моделі, показано, що сполучна тканина перикарда має такі властивості, які ідеально підходять для пластики серцевих клапанів, особливо для дітей раннього віку. Але, властивості перикарда, які обумовлені, в першу чергу, його матриксом та клітинною складовою, повинні бути збережені до часу їх реального дослідження. Запропоновані умови кріозбереження тканини перикарда, які передбачають витримку його в суміші диметилсульфоксиду, який виконує роль кріопротектора, DMEM/F 12 та аутолітичної сиворотки, які призначені для культивування клітин та для їх росту, відповідно. Співвідношення вказаних компонентів в повній мірі відповідають результату, що досягаються. Слід відмітити, що поступовий процес охолодження, а потім заморожування перикарда у вказаному вище середовищі сприяє оптимальним процесам культивування і росту клітин, що є визначальним фактором кріозбереження перикарда. Витримання перикарда при температурі -196 °C (температура рідкого азоту) також не викликає негативних або шкідливих ефектів та дозволяє зберігати перикард максимально тривалий час. Для здійснення контролю якості перикарда перед і після кріозбереження авторами були виконані наступні дослідження. Життєздатність клітин перикарда показана шляхом культивування фрагментів перикарда. Отримані клітини характеризувались фібробластоподібною морфологією, були здатні до активної проліферації. Культури, отримані перед та після заморожування фрагментів перикарда, не мали морфологічних відмінностей. Патологічний аналіз показав збереження архітектоніки тканини та характеристик позаклітинного матриксу після розморожування, що свідчить на користь обраного способу кріозбереження. Проведено денсіометричне визначення оптичної щільності препаратів, зафарбованих за ван Гізоном перед кріозбереженням та після нього в різних кріопротективних середовищах. Оптична щільність свідчить про кількість колагенових волокон на умовну одиницю площі мікропрепарату, тобто щільність їх розташування. Дослідження показало, що середнє значення (М±ò) світлооптичної щільності свіжого перикарда (І група) склало 84,26±16,77 ум. од. після розморожування препарати перикарда ІІ групи (зберігались в стандартному кріопротекторному середовищі) мали значно більшу світлооптичну щільність, яка склала 98,26±29,96 ум. од. (р=0,043), тоді як фрагменти перикарда ІІІ групи (зберігались в модифікованому кріопротекторному середовищі із додаванням аутологічної сироватки крові пацієнта) практично не зазнали змін: середнє значення (М±ò) світлооптичної щільності склало 89,74±24,23 ум. од. (р=0,74). На думку авторів дана різниця значень світлооптичної щільності фрагментів перикарда ІІ та ІІІ груп обумовлена ретракцією біологічного матеріалу, яка практично не відбувається в ІІІ групі. Цей факт може бути пояснений ізоонкотичним тиском в тканині перикарда та аутологічної сироватки крові пацієнта, що додавалась до кріопротекорного середовища в ІІІ групі замість бичачої сироватки крові в ІІ групі. Корисна модель пояснюється прикладом конкретного виконання способу, що заявляється. Після отримання фрагменту перикарда під час операції його вміщують за стерильних умов (в операційній) у кріоємність, що містить раніше підготовлене середовище для кріозбереження. Середовище для кріозбереження складається з наступних компонентів: кріопротектор 2 UA 102774 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 диметилсульфоксид (DMSO), поживне середовище для культивування клітин DMEM/F12 та компонент, що містить ростові фактори (аутологічна сироватка) у співвідношенні, мас. %: 20:55:25. Таке співвідношення дозволяє забезпечити клітинам найбільш близькі до фізіологічних умови. Середовище готують у стерильних умовах та надають до операційної заздалегідь. Готове середовище зберігають у холодильнику при температурі +4 °C. дана композиція дозволяє залишити клітини у складі тканини перикарда життєздатними. Це доведено шляхом культивування клітин. Кріопробірку з фрагментом перикарда, зануреним у кріосередовище транспортують до лабораторії кріозберігання. Далі кріопробірку вміщують у металеву стійку для зразків. Після цього зразок переносять у пристрій для програмного заморожування тканин Planer Cryo-516. Зразок підлягає заморожуванню за автоматизованою програмою, що виконує поступове зниження температури з +18 °C до -80 °C, після цього металеву стійку вміщують у судину Дюара, наповнену рідким азотом, що підтримує температуру -196 °C. Таким чином, запропонований спосіб характеризується такою сукупністю дій та прийомів кріозбереження, які визначають високу ефективність й надійність наступних кардіохірургічних маніпуляцій, зокрема пластики серцевих клапанів. Джерела інформації: 1. Pok S, Jacot JG. Biomaterials advances in patches for congenital heart defect repair. J Cardiovasc Transl Res. 2011; 4(5):646-654. 2. Aumsuwan N, Ye SH, Wagner WR, Urban MW. Covalent attachment of multilayers on poly(tetrafluoroethylene) surfaces. Langmuir. 2011; 27(17): 11106-11110. 3. Kudo FA, Nishibe T, Miyazaki K, Flores J, Yasuda K. Albumin-coated knitted Dacron aortic prosthses. Study of postoperative inflammatory reactions. Int Angiol. 2002; 21(3): 214-217. 4. Maya ID, Weatherspoon J, Young CJ, Barker J, Allon M. Increased risk of infection Associated with polyurethane dialysis grafts. Semin Dial. 2007; 20(6): 616-620. 5. Koh AS, Choi LM, Sim LL, et al. Comparing the use of cobalt chromium stents to stainless steel stents in primary percutaneous coronary intervention for acute myocardial infarction: a prospective registry. Acute Card Care. 2011; 13(4): 219-222 6. Hodges AM, Lyster H, McDermott A, et al. Late antibody-mediated rejection after hearttransplantation following the development of deovodonor-specific human leukocyte antigen antibody. Transplantation. 2012; 93(6): 650-656. 7. Byrne GW, McGregor CG. Cardiac xenotransplantation: progress and challenges. Curr Opin Organ Transplant. 2012; 17(2): 148-154. 8. Горленко A.A., Михайлова И.П., Сандомирский Б.П. Влияние низких температур и ионизирующего облучения на физико-механические свойства фиброзной оболочки перикарда и лепестков аортального клапана свиньи. Проблемы криобиологии и криомедицины. Т.23, № 2, 2013. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб кріогенного збереження фрагментів перикарда людини, який передбачає розміщення відпрепарованих фрагментів перикарда в суміші поживного середовища (для культивування клітки) та кріопротектора - диметилсульфоксиду, з подальшим поступовим охолодженням одержаної суміші аж до температури її замороження, який відрізняється тим, що як поживне середовище використовують DMEM/F 12 та аутологічну сироватку, причому співвідношення диметилсульфоксиду, DMEM/F 12 та аутологічної сироватки складає, мас. %: 20:55:25, після чого поступово знижують температуру до -80 °C, а подальше кріозбереження виконують при 196 °C. 50 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3