Спосіб отримання fc-фрагментів igm людини

Реферат: UA 67779 U UA 67779 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до імунології та біохімії і може бути використана для отримання Fc-фрагментів IgM людини. Метою корисної моделі є високоефективне та контрольоване одержання Fc-фрагментів IgM людини з використання папаїнового гідролізу молекули IgM людини та гель-хроматографії. Описано багато методик ферментативного розщеплення IgM з наступним виділенням Fcμфрагментів. Аналізуючи літературні дані [1-8] та власні результати [9], ми дійшли наступних висновків: по-перше, для одержання Fсμ-фрагментів найбільш ефективним є папаїновий, а не пепсиновий гідроліз імуноглобулінів; по-друге, багатьом методикам виділення Fcμ-фрагментів бракує достовірних методів контролю чистоти фрагментів, що одержуються, в першу чергу, це стосується імунохімічних методів контролю; по-третє, деякі підходи, описані авторами у літературі, виявилися важковідтворюваними, зокрема електрофорез у крохмальному гелі. Найбільш близькою до наших досліджень по одержанню Fc-фрагментів імуноглобулінів людини є робота американських вчених S.Hsiao та F.Putman [5], в рамках якої здійснювалося папаїнове розщеплення імуноглобулінів людини та вивчення продуктів гідролізу за допомогою хроматографії на карбоксиметил-целюлозі, ультрацентрифугування, електрофорезі в крохмальному гелі та амінокислотного аналізу. Як інгібітор ферментативної реакції використовували токсичний парахлормеркулобензоат. В основу корисної моделі поставлено задачу: високоефективний та відтворюваний спосіб одержання Fc-фрагментів IgM людини, що базується на використанні папаїнового гідролізу молекули IgM людини та гель-хроматографії. На відміну від інших способів, запропонована більш ефективна схема ферментативного розщеплення IgM людини і очистки Fcμ-фрагментів. Папаїновий гідроліз імуноглобулінів проводили у середовищі азоту, оскільки кисень повітря помітно інгібує активність ферменту [10]. Був встановлений оптимум часу ферментативної фрагментації IgM людини, який склав 30 хвилин, що дозволяло одержати максимальний вихід Fcμ-фрагментів без їх подальшої деградації. Виділення та очистку Fc-фрагментів здійснювали шляхом двохетапної гель-фільтрації на сефакрилі S-300. Для контролю чистоти одержаних Fcμ-фрагментів використовували електрофорез в ПААГ з ДСН та імунодифузію за O.Ouchterlony. Використання такої схеми дозволяє одержати Fcμ-фрагменти високого ступеня чистоти, придатні для використання в імуноаналізі, зокрема для виявлення чи виділення IgM-антитіл. Вихід Fcμ-фрагментів після всіх етапів очистки склав біля 15 % від початкової кількості імуноглобулінів у препараті. Поставлену задачу вирішують шляхом: 1) розщеплення IgM людини папаїном із проведенням контролю за процесом за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі (ПААГ) у редукуючи умовах; 2) розділення компонентів реакційної суміші (після 30 хвилин інкубування) за допомогою гель-фільтрації на колонці із сефакрилом S-300; 3) повторної гельфільтрації фракції, що при первинній хроматографії сходила другою, на колонці із сефакрилом S-300; 4) контролю чистоти отриманих Fc-фрагментів IgM людини за допомогою імунодифузії за Ouchterlony та електрофорезу у ПААГ у редукуючи умовах. Приклад 1. Розщеплення IgM людини папаїном. Для проведення ферментативного розщеплення використовували папаїн («Sigma», США) у вигляді кристалічної суспензії у 0,05 М ацетатному буфері з pH 4,5 з додаванням 0,01 % тимолу. Реакцію розщеплення проводили у 0,01 М фосфатному буфері, рН 6,5, який містив 0,002 М Na2ЕДТА. У реакційну суміш компоненти вносили в наступних співвідношеннях: на 100 мг глобулінової фракції - 1 мг папаїну [5]. Реакційну суміш інкубували при 37 °С у атмосфері азоту для запобігання інактивації папаїну киснем повітря [10]. З метою віднаходження оптимального часу інкубування з реакційної суміші відбирали проби через 10, 20, 40, 60 та 120 хвилин від початку постановки реакції. Ферментативний гідроліз у пробах зупиняли шляхом їх заморожування. Процес ферментативного гідролізу контролювали за допомогою вертикального електрофорезу у ПААГ з додецилсульфатом натрію (ДСН). У редукуючих умовах імуноглобуліни розпадалися на важкі (Н) та легкі (L) ланцюги, формуючи дві чіткі смуги на рівні 70 і 23 кДа. На електрофореграмі проб з реакційної суміші з'являється третя смуга (≈35 кДа), яка відповідає за Fcμ-фрагменти важких ланцюгів імуноглобулінів. При збільшенні часу інкубації з папаїном до 120 хвилин поступово зникає смуга, що обумовлена присутністю важких ланцюгів. Починаючи із 40 хвилин гідролізу фіксується утворення низькомолекулярних фрагментів (≈13 кДа), що свідчить про небажану деградацію IgM. Оптимум часу ферментативної фрагментації імуноглобулінів становить 30 хвилин, що дозволяє одержувати максимальний вихід Fcμфрагментів без їх небажаної деградації. 1 UA 67779 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Приклад 2. Гель-фільтрація реакційної суміші на сефакрилі S-300 Після фрагментації IgM проводили виділення та очистку (Fc)5μ-фрагментів. Цю задачу вирішували послідовним вилученням Fabμ-фрагментів, мономерних Fcμ-фрагментів. З метою розділення компонентів реакційної суміші, після 30 хвилин інкубування, її пропускали через колонку із сефакрилом S-300 (Фіг. 1). Реакційна суміш розділяється на чотири фракції. Першими з колонки сходять нефрагментовані IgM, які мають найбільшу молекулярну масу, другий пік, утворюють (Рс)5μ-фрагменти, третій - Fabμ-фрагменти та мономерні Fcμ-фрагменти, а четвертий - низькомолекулярні фрагменти, продукти небажаної фрагментації імуноглобулінів. Приклад 3. Електрофоретичний та імунохімічний аналіз фракцій реакційної суміші Для аналізу перших трьох фракцій (див. Фіг. 1) використовували вертикальний електрофорез у ПААГ з ДСН, результати якого зображено на Фіг. 2: 1 - фракція 1 піку; 2 фракція 2 піку; 3 - фракція 3 піку; 4 - маркери молекулярної маси. Фракції 1-го піку відповідає дві смуги на рівні 70, 23 кДа, які відповідають, відповідно, за важкі (Н), легкі (L) ланцюги IgM. Фракції 2-го піку відповідає три смуги: невеликі смуги на рівні 70 та 23 кДа, які обумовлені присутністю негідролізованих IgM (Н- та L-ланцюги), інтенсивна смуга на рівні 50 кДа (відповідає (Fс)5μфрагментам). Фракція 3-го піку утворює дві виражені смуги на рівні 50 кДа (мономерний Fcμфрагмент) та 23 кДа (Fabμ-фрагменти). Середній вміст білку у фракції з Fcu-фрагментами - 0,32 мг/мл. Вміст фракцій, отриманих після гель-фільтрації на сефакрилі S-300, досліджували у імунодифузії за Ouchterlony. Фракція 1-го піку утворювала лінії преципітації з імунними сироватками до цільних молекул IgM, κL- та λL-ланцюгів. Фракція 2-го піку утворювала лінії преципітації з сироватками до IgM, що підтверджує наявність Fcμ-фрагментів у фракції 2 піку. Слабка лінія приципітиції з сироваткою до κL-ланцюгів свідчить про недостатню чистоту отриманих Fcμ-фрагментів, пов'язану з присутністю домішок молекул IgM. Фракція 3-го піку давала позитивні реакції аналогічно до фракції першого піку, що підтверджує вміст у ній Fcμ- та Fabμ-фрагментів. Приклад 4. Другий етап гель-фільтраційної очистки Fcμ-фрагментів Проведення другого циклу гель-фільтрації на сефакрилі S-300 із фракцією 2-го піку (див. Фіг. 1) проводили за аналогічною методикою. Залишки нефрагментованих імуноглобулінів сходять першими з колонки, утворюючи перший пік; другий пік формують Fcμ-фрагменти. Результати гель-фільтрації фракції 2-го піку на сефакрилі S-300 зображено на Фіг. 3: 1 пік - залишки нефрагментованих IgM; 2 пік - Fcμ-фрагменти. Перелік літературних джерел: 1. Антитела. Методы: Кн. 1: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991. - 287 с. 2. Иммунологические методы /Под ред. Х. Фримеля. - М.: Мир, 1979. - 520 с. 3. Иммунология: Практикум / Е.У. Пастер, В.В. Овод, В.К. Позур, Н.Е. Вихоть. - К.: Вища шк. Изд-во при Киев. Ун-те, 1989. - 304 с. 4. Методы иммунохимического анализа в биологии развития (практическое руководство) / А.Т. Михайлов, В.Н. Симирский. - М.: Наука, 1991. - 288 с. 5. Hsiao, Shu-hsi, Putman, Frank W. The cleavage of human γ-globulin by papain // J. Biol. Chem. - 1961. - 236, N 1. - P. 122-135. 6. Johnstone A. Immunochemistry 2: A practical approach. - Oxford, NJ, Tokyo: IRL Press, 1997. 270 p. 7. Porter R.R. The hydrolysis of rabbit γ-globulin and antibodies with crystalline papain // Biochem. J. - 1959. - 73. - P. 376-379. 8. Sanderson A.M., banning M.G. Crystalline Fc prepared in high yield from normal IgG // Nature. - 1970. - 226. - P. 356-358. 9. Ніколаєнко І.В., Галкін О.Ю., Грабченко Н.І. та ін. Отримання Fc-фрагментів імуноглобулінів людини класу G // Імунологія та алергологія. - 2003. - № 1. - с. 15-19. 10. Goding J. Monoclonal antibodies. Principles and practice. - San Diego: Acedemic press, 1996. - 492 p. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 60 Спосіб отримання Fc-фрагментів IgM людини, що включає одержання Fсμ-фрагментів, придатних для використання в імуноаналізі, який відрізняється тим, що спосіб передбачає розщеплення IgM людини папаїном із проведенням контролю за процесом за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі (ПААГ) у редукуючих умовах, розділення компонентів реакційної суміші після 30 хвилин інкубування за допомогою гель-фільтрації на колонці із сефакрилом S-300, повторну гель-фільтрацію фракції, що при первинній хроматографії сходила 2 UA 67779 U другою, на колонці із сефакрилом S-300, контроль чистоти отриманих Fc-фрагментів IgM людини за допомогою імунодифузії за Ouchterlony та електрофорезу у ПААГ у редукуючих умовах. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3