Спосіб якісного та кількісного визначення біологічно активних речовин у фітозасобах з артишоку

Реферат: Спосіб якісного та кількісного визначення біологічно активних речовин у фітозасобах з артишоку включає обробку аналізованої проби екстракту артишоку, хроматографування і подальше УФ-детектування. Екстракт розчиняють у 10 мл 60 %-спирту, витримують на ультразвуковій бані при кімнатній температурі протягом 5 хв. Фільтрують крізь фільтр щільності К4. Хроматографування ведуть методом тонкошарової хроматографії у системі розчинників кислота мурашина безводна Ρ - кислота оцтова льодяна Ρ - вода Ρ - етилацетат Ρ (11:11:27:100), як реактив проявлення беруть розчин 50 г/л макроголу 400 Ρ у метанолі Р. Оптичну густину випробовуваного розчину вимірюють на спектрофотометрі за довжини хвилі 325 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи як компенсаційний розчин 20 % метанол Р. UA 111355 U (12) UA 111355 U UA 111355 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до хіміко-фармацевтичній промисловості, а саме до дослідження та аналізу медичних препаратів, і може бути використана при стандартизації лікарської рослинної сировини та отриманих з неї субстанцій. Відомий спосіб кількісного визначення стероїдів та флавоноїдів біологічно активних речовин рослинного походження (пат. UA№ 41309, G01N 33/15, 12.05.2009, бюл. № 9) включає екстракцію аналізованого зразка, взаємодію його з хімічними реагентами у розчині та вимірювання оптичної густини забарвленого розчину. Аналізований зразок екстрагують в етанолі, проводять фільтрування екстракту, проводять розрахунок вмісту стероїдів та флавоноїдів. Відомий спосіб спільного визначення гідроксикоричних кислот і флавоноїдів у листках кропиви вузьколистої (Матющенко Н.В. Вплив умов сушіння на вміст флавоноїдів та гідроксикоричних кислот у листках кропиви вузьколистої. Збірник наукових праць: "Розробка, дослідження і маркетинг нової фармацевтичної продукції". - П'ятигорськ. - Вип.67. - 2012. - С. 78-79), що включає подрібнення сировини і обробку його 70 % етиловим спиртом з наступним прямим спектрометричним визначенням гідроксикоричних кислот у перерахунку на кофейну кислоту при довжині хвилі 328 нм. Визначення флавоноїдів проводиться окремо методом диференційної спектрофотометрії по реакції з алюмінію хлоридом. Відомі способи кількісного визначення сирінгіну у рослинних об'єктах (Куркин В.А. ТСХ и ВЭЖХ-анализ сирингина в Syringa vulgaris / В.А. Куркин, Η.А. Гриненко, Г.Г. Запесочная // Химия природных соединений. - 1992. - №1. - С. 45-49.). В запропонованій методиці аналіз екстрактів кори бузку звичайного проведено методом високоефективної рідинної хроматографії зі спектрофотометричним детектуванням за допомогою зворотно-фазової хроматографії на колонці (0,39 x 30 см), яка була заповнена зворотно-фазовим сорбентом Силасорб С18. Для кількісного визначення сирінгіну (елеутерозиду В) в екстрактах з кори бузку звичайного як елюєнт використовували 12 % етанол, та суміш - етанол - 0,2 % оцтова кислота (12:88). Детектування проводилося УФ-детектором при довжині хвилі 266 і 278 нм. Ці методи не є уніфікованими. Недоліком приведеної методики є тривалість аналізу, а також висока вартість приладів, що істотно обмежують його використання в хіміко-фармацевтичній промисловості. Відомий спосіб кількісного і якісного визначення розділених речовин шляхом обробки хроматографічної пластини хімічним реагентом і порівняння інтенсивностей забарвлення зон аналізованих і еталонних речовин або визначення площі зон аналізованих речовин. Найбільш близьким по технічній суті і досягнутому результату є "Способ определения биологически активных фенолов и полифенолов в различных объектах методами хроматографии (М.В. Кочетова, Е.Н. Семенистая, О.Г. Ларионов, А.А. Ревина Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук, 2005 г.). Аналіз проведено методом високоефективної рідинної хроматографії зі спектрофотометричним детектуванням при визначенні антиоксидантів Недоліки вказаного способу є використання великої кількості розчинників і матеріалів, спосіб вимагає великих затрат часу, також спосіб лише для визначення біологічно активних фенолів і поліфенолів. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити універсальну методику якісного та кількісного визначення біологічно активних речовин у засобах рослинного походження, а саме у фітозасобах з артишоку. Поставлена задача вирішується тим, що визначення проводять методом тонкошарової хроматографії. У пропонованому способі для фракціонування використовується високоефективний хроматограф і з УФ-детектором для контролю виходу фракцій. Якіснийі кількісний аналіз виділених фракцій здійснюється на спектрофотометрі. Визначення якісного складу біологічно активних речовин проводять наступним чином, 3 3 близько 0,2 г екстракту артишоку поміщають у стакан місткістю 50 мл (см ), додають 10 мл (см ) спирту (60 об/об) Р, витримують на ультразвуковій бані при кімнатній температурі протягом 5 хв, після чого фільтрують крізь фільтр щільності К4. Розчин порівняння (а). 1,0 мг кислоти хлорогенової Ρ та 1,0 мг цинарину Ρ поміщають у 3 3 флакон місткістю 10 мл (см ), розчиняють у 2 мл (см ) метанолу Ρ при перемішуванні. Розчин порівняння (b). 0,5 мг лютеолін-7-О-глюкозиду Ρ поміщають у флакон місткістю 10 3 3 мл (см ), розчиняють у 2 мл (см ) метанолу Ρ при перемішуванні. На лінію старту хроматографічної пластинки наносять, у вигляді смужок шириною 10-12 мм 10 мкл випробовуваного розчину, в одну точку по 10 мкл розчину порівняння (а) та розчину порівняння (b). Пластинку сушать у струмені теплого повітря протягом 10 хв, потім поміщають у 1 UA 111355 U 5 10 камеру із сумішшю розчинників кислота мурашина безводна Ρ - кислота оцтова льодяна Ρ вода Ρ - етилацетат Ρ (11:11:27:100) і хроматографують висхідним способом. Коли фронт розчинників пройде близько 13 см від лінії старту, пластинку виймають із камери, сушать у струмені теплого повітря до повного видалення запаху розчинників. Потім пластинку витримують у сушильній шафі за температури 100 °C протягом 5 хв і теплу пластинку обприскують розчином 10 г/л дифенілборної кислоти аміноетиловим ефіром Ρ у метанолі Р. Потім мокру пластинку обприскують розчином 50 г/л макроголу 400 Ρ у метанолі Ρ і переглядають в УФ-світлі за довжини хвилі 365 нм. Приклад 1. Нижче наведено послідовність зон, що флуоресціюють, на хроматографії випробовуваного розчину порівняння. На хроматографі випробовуваного розчину можуть виявлятися також інші зони, що флуоресціюють. Таблиця верхня частина пластинки слабка блакитна флуоресціююча зона лютеолін-7-О-глюкозид: жовта або оранжева жовта або оранжева флуоресціююча зона флуоресціююча зона (лютеолін-7-О-глюкозид) цинарин (1,4-ди-О-кофеїл-О-хінна кислота): блакитна флуоресціююча зона (цинарин (1,4-диблакитна флуоресціююча зона О-кофеїл-D-хінна кислота) кислота хлорогенова: слабка блакитна слабка блакитна флуоресціююча зона (кислота флуоресціююча зона хлорогенова) розчин порівняння (а) розчин порівняння (b) випробовуваний розчин 15 20 25 30 Запропонований спосіб дозволяє проводити стандартизацію екстракційних препаратів рослинного походження і лікарської сировини одночасно за вмістом біологічно активних речовин і може використовуватися при розробці нормативно-технічної документації. В результаті експериментальних досліджень за кількісним визначенням біологічно активних речовин в рослинній сировині і лікарських препаратах рослинного походження встановлені оптимальні умови проведення дослідів. Приклад 2. Кількісне визначення гідроксикоричних кислот у перерахунку на цинарин у екстракті артишоку. Кількісне визначення гідроксикоричних кислот у перерахунку на цинарин у екстракті артишоку проводять методом абсорбційної спектрофотометрії. Вихідний розчин. Близько 1,0 г (точна наважка) екстракту артишоку поміщають в колбу, 3 додають 25,0 мл (см ) води Р, струшують до повного розчинення екстракту та фільтрують. Випробовуваний розчин. В мірну колбу місткістю 50 мл вносять 5 мл вихідного розчину, доводять об'єм розчину до позначки 20 % метанолом Ρ і перемішують. Вимірюють оптичну густину випробовуваного розчину на спектрофотометрі за довжини хвилі 325 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи як компенсаційний розчин 20 % метанол Р. Вміст суми гідроксикоричних кислот ( X ) у перерахунку на цинарин, у міліграмах, обчислюють за формулою: A  25  50 , 616  1 5 де A - оптична густина випробовуваного розчину; 616 - питомий показник поглинання цинарину у метанолі Ρ за довжини хвилі 325 нм. X 35 40 45 Приклад 3. Кількісне визначення гідроксикоричних кислот у перерахунку на цинарин у фітозасобах з артишоку. Кількісне визначення гідроксикоричних кислот у перерахунку на цинарин у фітозасобах з артишоку проводять методом абсорбційної спектрофотометрії. 3 Вихідний розчин. 5 таблеток (або вмісту капсул) поміщають у колбу, додають 25,0 мл (см ) води Р, струшують протягом 15 хв та фільтрують. Випробовуваний розчин. В мірну колбу місткістю 50 мл вносять 5 мл вихідного розчину, доводять об'єм розчину до позначки 20 % метанолом Ρ і перемішують. Вимірюють оптичну густину випробовуваного розчину на спектрофотометрі за довжини хвилі 325 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи як компенсаційний розчин 20 % метанол Р. 2 UA 111355 U Вміст суми гідроксикоричних кислот ( X ) в 1 таблетці (1 капсулі) у перерахунку на цинарин, у міліграмах, обчислюють за формулою: A  25  50  1 616  5  5 A - оптична густина випробовуваного розчину; де 616 - питомий показник поглинання цинарину у метанолі Ρ за довжини хвилі 325 нм. X 5 10 Розроблений спосіб якісного та кількісного визначення біологічно активних речовин у засобах рослинного походження, а саме у фітозасобах з артишоку, може бути використаний у фармацевтичній і медичній промисловості для стандартизації рослинної сировини і лікарських препаратів рослинного походження за змістом біологічно активних речовин при проведенні технологічного контролю за виробництвом. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб якісного та кількісного визначення біологічно активних речовин у фітозасобах з артишоку, який включає обробку аналізованої проби екстракту артишоку, хроматографування і подальше УФ-детектування, який відрізняється тим, що екстракт розчиняють у 10 мл 60 %спирту, витримують на ультразвуковій бані при кімнатній температурі протягом 5 хв, після чого фільтрують крізь фільтр щільності К4, хроматографування ведуть методом тонкошарової хроматографії у системі розчинників кислота мурашина безводна Ρ - кислота оцтова льодяна Ρ - вода Ρ - етилацетат Ρ (11:11:27:100), як реактив проявлення беруть розчин 50 г/л макроголу 400 Ρ у метанолі Р, оптичну густину випробовуваного розчину вимірюють на спектрофотометрі за довжини хвилі 325 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи як компенсаційний розчин 20 % метанол Р. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3