Спосіб оцінки в експерименті ефективності відновлення рухової функції нижньої кінцівки після ушкодження периферичного нерва

Реферат: Спосіб оцінки в експерименті ефективності відновлення рухової функції нижньої кінцівки після ушкодження периферичного нерва включає використання функціональних тестів та мікроскопії на світлооптичному рівні. При цьому у мишей із травмою сідничного нерва додатково до "тесту ходьби на доріжці" з дослідженням "відбитків підошовних поверхонь стопи" виконують поведінковий тест "відкритого поля" з часовим проміжком в 1 тиждень (впродовж 4 тижнів) та одночасним морфометричним дослідженням нерва. При отриманні значень показників, близьких до вихідних, свідчать про покращення порушеної рухової функції. UA 113678 U (12) UA 113678 U UA 113678 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної медицини, зокрема неврології, травматології, і може застосовуватись на експериментальній моделі травми периферичного (сідничного) нерва для оцінки відновлення порушеної рухової функції нижньої кінцівки. Актуальність проблеми ушкодження периферичних нервів зумовлена поширеністю цієї патології з високою інвалідизацією пацієнтів. Порушення рухової активності травмованої нижньої кінцівки може бути пов'язане зі зміною структури травмованого нерва, мотонейронів спинного мозку та кори головного мозку, а також із розвитком ішемії скелетних м'язів травмованої кінцівки. При дослідженні динаміки репаративної регенерації сідничного нерва є важливим застосуванням методичних підходів, які дозволять об'єктивно оцінити процес відновлення ушкодженої рухової активності. Відомий спосіб оцінки у мишей посилення зниженої рухової функції нижньої кінцівки після травми периферичного нерва шляхом вивчення динаміки відновлення функції м'язів-розгиначів стопи нижньої кінцівки, які інервуються ушкодженим нервом, та одночасного використання електрофізіологічного методу [Карагяур М.Н. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на восстановление периферического нерва после травмы: дис. … к. б. н.: 03.01.04 / М.Н. Карагяур. - Москва, 2013]. Недоліками цього способу є проведення оцінки рухової активності лише у ранні строки після травми (через 1, 2, 4 і 7 діб), без морфологічного аналізу динаміки регенерації ушкодженого нерва; необхідність використання пристроїв для електрофізіологічного дослідження у мілких тварин. Відомий спосіб оцінки у щурів регенерації ушкодженого сідничного нерва шляхом визначення функціонального індексу сідничного нерва в "тесті ходьби на доріжці" / Цимбалюк В.І. Оцінка регенерації сідничного нерва під впливом адгезивної фракції жирової тканини функціональним методом у експерименті / В.І. Цимбалюк, М.І. Лісяний, Т.І. Петрів // Науковопрактична конференція "Інновації в нейрохірургії", в рамках IV Міжнародного медичного конгресу "Впровадження сучасних досягнень медичної науки в практику охорони здоров'я України", 2015. - С. 7]. Проте цей спосіб дає можливість оцінити рухову функцію травмованої кінцівки лише у віддалені строки після травми нерва (через 30 і 60 діб), і, крім того, проводиться з великим часовим інтервалом між строками дослідження. Відомий спосіб оцінки ефективності регенерації ушкодженого периферичного нерва шляхом морфологічного дослідження такого нерва [Патент № 57217 UA. Храпай О.В. Спосіб оцінки ефективності регенерації травмованого периферичного нерва під впливом біофлавоноїдів на ранніх етапах (в експерименті) / Храпай О.В., Чайковський Ю.Б. // Опубл. 10.02.2011. Бюл. №3, 2011]. Спосіб полягає у визначенні щільності нервових волокон та кута їх відхилення від осі травмованого нерва через 3 та 6 тижнів після його ушкодження; отримані результати порівнюють із контролем. Недоліками цього способу є відсутність даних щодо динаміки відновлення рухової функції у таких тварин, а також відсутність даних щодо динаміки змін структури травмованого нерва впродовж перших двох тижнів. Відомий спосіб оцінки ефективності регенерації ушкодженого периферичного нерва шляхом дослідження його ультраструктури [Патент № 87206 UA. Храпай О.В. Спосіб оцінки ефективності регенерації травмованого периферичного нерва під впливом ліпофлавону на пізніх етапах (в експерименті) / Храпай О.В., Чайковський Ю.Б. // Опубл. 27.01.2014. Бюл. №2, 2014]. Спосіб полягає у визначенні щільності нервових волокон та кута їх відхилення від осі травмованого нерва через 12 тижнів після моделювання ушкодження порівняно із контрольними тваринами. Недоліками цього способу є відсутність у таких тварин даних щодо динаміки відновлення рухової функції, а також динаміки змін структури травмованого нерва впродовж більш ранніх строків дослідження. Найближчим аналогом способу, що заявляється, є спосіб оцінки у мишей динаміки покращення рухової функції травмованої кінцівки за допомогою використання функціонального "тесту ходьби на доріжці" з дослідженням "відбитків підошовних поверхонь стопи" через 3, 6, 9 і 12 тижнів після травми нерва, а також імунофлуоресцентного аналізу структури ушкодженого нерва через 9 тижнів після травми [Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves/ Y. Amoh [et al.] // PNAS. - 2005. - V. 102, № 49. - P. 17734-17738]. Проте цей спосіб є недостатньо інформативним, оскільки пропонує оцінку рухової активності експериментальних мишей з інтервалом у 3 тижні, без дослідження потижневої динаміки регенерації сідничного нерва; відсутні дані інших функціональних тестів, які дають можливість врахувати при ушкодженнях периферичного нерва зміни стану регулятора рухових функцій - центральної нервової системи (ЦНС); імунофлуоресцентний аналіз потребує використання реактивів із високою вартістю (моноклональні антитіла). В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб оцінки в експерименті ефективності відновлення рухової функції нижньої кінцівки після ушкодження периферичного 1 UA 113678 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нерва шляхом одночасного застосування функціональних тестів, які віддзеркалюють стан периферичної і центральної нервової систем при травмах нерва, у поєднанні з морфологічним методом (методом мікроскопії на світлооптичному рівні), що дозволить підвищити інформативність щодо динаміки відновлення порушеної рухової функції травмованої кінцівки. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає використання функціональних тестів та мікроскопії на світлооптичному рівні, згідно з корисною моделлю, у мишей із травмою сідничного нерва додатково до "тесту ходьби на доріжці" з дослідженням "відбитків підошовних поверхонь стопи" виконують поведінковий тест "відкритого поля" із часовим проміжком в 1 тиждень (впродовж 4 тижнів) та одночасним морфометричним дослідженням нерва і при отриманні значень показників, близьких до вихідних, свідчать про покращення порушеної рухової функції. Дане рішення стало можливим завдяки експериментальним морфологічним дослідженням авторів динаміки де- і регенерації травмованого сідничного нерва на тлі використання адекватних функціональних тестів та їх порівняльної оцінки. Спосіб здійснюється наступним чином. У інтактних мишей лінії FVB віком 4-6 міс., які знаходяться у стандартних умовах віварію при фіксованому режимі освітлення 12:12, моделюють стандартне ушкодження периферичного нерва (перерізання сідничного нерва у середній його третині). Всі маніпуляції проводять під авертиновим наркозом (2,5 %-ний розчин, внутрішньоочеревинно). У тварин до і через 1, 2, 3 і 4 тижні після травми оцінюють рухову активність, використовуючи поведінковий тест "відкритого поля" і дослідження "відбитків підошовних поверхонь стопи", а також виконують морфологічні дослідження - звичайну світлову мікроскопію з морфометричним аналізом. У тесті "відкритого поля" визначають горизонтальну і вертикальну рухову активність, які дають змогу оцінити зміни стану ЦНС за умов дії ушкоджуючих чинників. Процедура виконання поведінкового тесту полягає в наступному: тварину поміщають у "Квадратне відкрите поле", яке являє собою камеру з високими бортами (606060 см). Підлога установки розкреслена на рівні сектори (16 штук), які призначені для візуальної реєстрації горизонтальної рухової активності (кількість перетнутих квадратів) експериментальних тварин. Підйом тварин на задні лапи з опорою на стінку характеризує вертикальну рухову активність. Горизонтальну і вертикальну рухову активність у тварин реєструють впродовж 3 хвилин. У тесті "відбитків підошовних поверхонь стопи" оцінюють відстань (мм) між крайніми пальцями стопи нижньої кінцівки, як одного із показників функціонального "тесту ходьби на доріжці"). Перед дослідженням стопу фарбують стандартним розчином смарагдового зеленого. При виконанні морфологічних досліджень дистальний фрагмент сідничного нерва фіксують впродовж доби в 10 %-ному розчині нейтрального формаліну; після промивання виготовлюють кріостатні зрізи, які надалі імпрегнують азотнокислим сріблом. Для морфометричного аналізу результатів світлооптичної мікроскопії гістологічних препаратів використовують комп'ютерну програму "UTHSCSA Image Tool for Windows" (Version 2.00). Препарати гістологічних зрізів фотографують за допомогою цифрової фотокамери і визначають щільність розподілу нервових волокон у дистальному відрізку травмованого нерва. Оцінку рухової функції і морфометричні дослідження проводили у тварин із травмою сідничного нерва в динаміці (n=25) (таблиця). При дослідженні "відбитків підошовних поверхонь стопи" встановлено, що відстань між крайніми пальцями стопи травмованої кінцівки суттєво зменшена відносно значень показника до травми в динаміці всього періоду спостереження; через 4 тижні значення показника вище, ніж через 3 тижні. В тесті "відкритого поля" горизонтальна рухова активність у мишей із травмою нерва суттєво менша, ніж до травми у всі строки дослідження; при цьому через 4 тижні після ушкодження нерва значення показника стають вище, ніж у попередні строки дослідження. При оцінці вертикальної рухової активності встановлено її значне зниження вже через 1 тиждень після травми нерва і практичне відновлення до вихідних значень через 3 та 4 тижні після травми. При проведенні морфометричних досліджень встановлено суттєве зменшення щільності нервових волокон впродовж всього періоду спостереження, однак через 3 і 4 тижні після травми нерва значення показника перевищують ті, що були у попередні строки дослідження. В таблиці наведені показники динаміки відновлення рухової функції нижньої кінцівки у мишей після травми сідничного нерва (М±m). 2 UA 113678 U Показник Строки дослідження після травми (тижні) 1 2 3 4 Функціональні тести & 10,1±0,5 5,2±0,2* 5,7±0,3* 5,0±0,1* 5,6±0,2* &# 31,8±2,9 20,3±1,9* 21,0±2,1* 19,0±1,1* 25,0±1,3* # 1,2±0,4 0,5±0,2* 0,7±0,1* 1.0±0,2 1,4±0,2** До травми Відстань між пальцями стопи, мм Кількість перетнутих квадратів Кількість вертикальних стійок Морфометрія 2 # # # Щільність нервових волокон, мм 11024±628 3208±520* 5725±337* 7020±427* ** 8409±739* ** # 5 10 Примітки: * - р