Спосіб виділення дезоксирибонуклеїнової кислоти (днк) з тканини злоякісної пухлини щитоподібної залози, що фіксована в формальдегіді та поміщена у парафіновий блок

Реферат: Спосіб виділення дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) з тканини злоякісної пухлини щитоподібної залози, що фіксована в формальдегіді та поміщена у парафін, включає депарафінізацію тканини ксилолом інкубацією при кімнатній температурі (21-22 °C). Попередньо перед етапом депарафінізації тканину обробляють мінеральною олією і проводять інкубацію протягом 20 хвилин при температурі 90 °C далі проводять інкубацію при кімнатній температурі (21-22 °C), додають ксилол і подальше виділення ДНК здійснюють із застосуванням протеїнази К та відмивкою зразків з фільтруванням. UA 114665 U (12) UA 114665 U UA 114665 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до молекулярно-генетичної діагностики, патологічної анатомії, ендокринної хірургії і призначена для пoвного усунення парафіну при виділенні ДНК з тканин злоякісних пухлини щитоподібної залози (високо-диференційована, низько-диференційована карцинома, недиференційований рак, медулярна карцинома). ДНК - нуклеїнова кислота (дезоксирибону олеїнова кислота), з якої складаються структурні одиниці носіїв генетичної інформації (гени) живих організмів, в т.ч. людини. Виділення та використання ДНК широко впроваджується в клінічну практику закладів охорони здоров'я України; ДНК є субстратом для визначення генних аномалій (мутації, делеції, перестановки тощо) за допомогою методів молекулярно-генетичного аналізу, зокрема полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Мінеральна олія - суміш вуглеводів різної будови: лінійної (парафіни або алкани), розгалуженої (ізопарафіни або ізоалкіни), циклічної (нафтени), ароматичної та циклоароматичної, до складу якої також входять, з різною пропорцією вмісту, похідні цих вуглеводів (кисневі, сірчані або азотовмісні). Актуальність способу полягає в тому, що фіксовані в формаліні та заключні в парафін тканини злоякісних пухлин щитоподібної залози можуть бути використані для післяопераційної діагностики, диференційної діагностики, визначення прогнозу пацієнтів, а також з науководослідною метою з застосуванням ПЛР. Проте при застосуванні типових протоколів (методів) виділення ДНК з вищезазначених тканин існує ризик недостатнього очищенням цих тканин від парафіну під час етапу депарафінізації ксилолом. Типові протоколи виділення ДНК з тканин злоякісних пухлин щитоподібної залози, що були фіксовані в формальдегіді та заключні в парафін, мають декілька етапів, що детально описані в вітчизняних та зарубіжних наукових джерелах [2-5]. Одними з ключових моментів серед цих етапів є повне очищення тканини злоякісних пухлин щитоподібної залози від парафіну та формальдегіду, що досягається шляхом інкубації тканини в ксилолі. Але застосування ксилолу не забезпечує повного видалення парафіну в процесі виділення ДНК з тканин злоякісних пухлин щитоподібної залози, що були фіксовані в формальдегіді та заключні в парафін. Відомий спосіб отримання ДНК для полімеразно-ланцюгової реакції із тканин за патентом UA 99734 [6], згідно з яким тканину підігрівають в лізуючому розчині до 60-62 °C і відбирають ДНК з підпарафінової плівки лізуючого розчину. Але цей спосіб не забезпечує повного очищення тканини і тому не забезпечує достатньої якості виділення ДНК. Відомий спосіб виділення ДНК з парафінових гістологічних блоків за патентом UA 1087.36 [7], згідно з яким депарафінізацію тканини злоякісної пухлини виконують шляхом поетапної промивки тканини, що фіксована в формальдегіді та заключна в парафін, ксилолом при кімнатній температурі, використовуючи різні часові параметри інкубації в ксилолі (5 хвилин, 10 хвилин). Цей спосіб вибраний як прототип. Недоліками цього способу є те, що застосування ксилолу при інкубації також не забезпечує повного очищення тканини і тому не забезпечує достатньої якості виділення ДНК. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб виділення ДНК з тканини злоякісної пухлини щитоподібної залози, що фіксована в формальдегіді та заключна у парафін, шляхом попередньої обробки тканини мінеральною олією та вибором оптимальних параметрів наступної інкубації який забезпечує повне очищення тканини від фіксуючих компонентів (формальдегіду, парафіну), при цьому виділена ДНК має високу якість, що дозволяє отримувати репрезентативний результат при дослідженні за допомогою ПЛР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб виділення дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) з тканини злоякісної пухлини щитоподібної залози, що фіксована в формальдегіді та заключна у парафін включає депарафінізацію тканини ксилолом інкубацією при кімнатній температурі (21-22 °C) і, згідно з корисною моделлю, попередньо перед етапом депарафінізації тканину обробляють мінеральною олією і проводять інкубацію протягом 20 хвилин при температурі 90 °C, далі проводять інкубацію при кімнатній температурі (21-22 °C), додають ксилол і подальше виділення ДНК здійснюють із застосуванням протеїнази К та відмивкою зразків з фільтруванням. Спосіб здійснюють наступним чином. В пробірку типу "eppendorf" 1,5 мл поміщають 10 зрізів товщиною 4 мкм кожний тканини злоякісної пухлини щитоподібної залози, що фіксована в формальдегіді та заключна у парафін. Далі в пробірку додають 350 мкл мінеральної олії і встановлюють в нагрітий до 90 °C електричний лабораторний нагрівач і витримують в ньому при такій температурі 20 хвилин. Потім пробирку виймають та інкубують при кімнатній температурі (21-22 °C) протягом 10 хвилин. В подальшому в пробірку додають ксилол і подальше виділення ДНК здійснюють із застосуванням протеїнази К та відмивкою зразків з фільтруванням. 1 UA 114665 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклад застосування способу. Запропонований спосіб виділення ДНК був застосований в науково-дослідній роботі по вивченню пост-Чорнобильської карциноми, матеріалом для якої були 70 зразків тканини злоякісної пухлини щитоподібної залози, що фіксовані в формальдегіді та заключні у парафін [4]. З кожного з цих зразків за допомогою мікротому були отримані по 10 зрізів товщиною 4 мкм, що були переміщені в пробірку типу "eppendorf" ємкістю 1,5 мл. В пробірку додавали 350 мкл мінеральної олії, пробірку нагрівали до 90 °C в електричному лабораторному нагрівачі і витримували в ньому при такій температурі 20 хвилин. Потім пробірку виймали та інкубували при кімнатній температурі (21-22 °C) протягом 10 хвилин. Далі, згідно з загальноприйнятим протоколом, проводили депарафінізацію поетапно (2 рази) інкубацією в 1 мл ксилолу, регідрацію, згідно з рекомендаціями, в 99 % етиловому спирті, в подальших етапах застосовували комерційний набір реагентів QIAamp DNA FFPE (Qiagen) та дотримувались інструкцій виробника. Концентрація ДНК перевірялась на спектрофотометрі та становила в середньому 235 нг/мкл (при виділенні ДНК з додаванням етапу інкубації в мінеральній олії). Зразки виділеної ДНК були використані для ПЛР в реальному часі з використанням праймерів для визначення аномалій гена RET (реакція з триплікатами зразків, позитивного, негативного, ендогенного контролів). В 100 % використаних зразків були визначені репрезентативні криві ампліфікації. Аналіз продуктів ПЛР за допомогою електрофорезу в агарозному гелі з додаванням фарбника RedGel показав наявність ПЛР продуктів в очікуваному діапазоні молекулярної маси, що підтверджує якість ДНК що була використана у представленому способі. Тобто після застосування вказаного способу на зразках тканини карциноми, що фіксована в формальдегіді та заключна у парафін було проведено ПЛР в реальному часі, 100 % досліджуваних зразків показали позитивний результат ПЛР - було отримано сильний сигнал продуктів ПЛР в очікуваному діапазоні молекулярної маси ампліфікованої ділянки ДНК при візуалізації бендів в агарозному гелі з використанням фарбника RedGel. При аналізі продуктів ПЛР в агарозному гелі було також виявлено, що у зразків злоякісних пухлин щитоподібної залози, ДНК яких виділялась, згідно з загальноприйнятим протоколом, сигнал був відсутній (негативний результат ПЛР) в 60 %, а в зразках, де сигнал був ідентифікований, яскравість продуктів ПЛР була суб'єктивно слабкіша в 25 % випадків. Зразки, де результат ПЛР був негативний, піддавались повторному проведенню ПЛР, що збільшило витрати реагентів та власне ДНК. Наведений приклад доводить, що при застосуванні способу, який заявляється, відбувається повне очищення тканини від фіксуючих компонентів (формальдегід, парафін), а виділена ДНК має високу якість, що дозволяє отримувати репрезентативний результат при дослідженні за допомогою ПЛР. Спосіб, що заявляється, може бути застосований у будь-якій патологоморфологічній лабораторії, де виконуються молекулярно-генетичні тести з використанням ДНК, що виділяється з тканини злоякісної пухлини щитоподібної залози, що фіксована в формальдегіді та заключна у парафін. Рекомендується застосовувати запропонований спосіб для виділення ДНК з тканин злоякісної пухлини щитоподібної залози, що фіксовані в формальдегіді та заключні у парафін для визначення аномалій ДНК з діагностичною, прогностичною, науково-дослідною метою. Джерела інформації: 1. Verallo-Rowell, V.M., S.S. Katalbas, and J.P. Pangasinan, Natural(Mineral, Vegetable, Coconut, Essential) Oils and Contact Dermatitis. Curr Allergy Asthma Rep, 2016. - 16(7). - Р. 51. 2. Bailey, В., et al., Discrepancy between CYP2D6 phenotype and genotype derived from postmortem dextromethorphan blood level. Forensic Sci Int, 2000. - 110(1). - Р. 61-70. 3. Press, O.A., et al., Gender-related survival differences associated with EGFR polymorphisms in metastatic colon cancer. Cancer Res, 2008. - 68(8). - Р. 3037-42. 4. Dinets, A., et al., Clinical, genetic, and immunohistochemical characterization of 70 Ukrainian adult cases with post-Chornobyl papillary thyroid carcinoma. Eur J Endocrinol, 2012. - 166(6). - Р. 1049-60. 5. Лісяний, M.I. та інш. Частота виявлення ДНК вируса герпеса 4 типа в пухлинах головного мозку. Український нейрохірургічний журнал - 2015. - № 3. - С. 35-37. 6. Спосіб отримання ДНК для полімеразно-ланцюгової реакції із тканин. М.І. Лісяний та інш. Патент UA 99734, опубл. 25.06.2015, бюл. № 12. 7. Спосіб виділення ДНК з парафінових гістологічних блоків. Є.В. Кузенко та інш. Патент UA 108736, опубл. 25.07.2015, бюл. № 14. 60 2 UA 114665 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб виділення дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) з тканини злоякісної пухлини щитоподібної залози, що фіксована в формальдегіді та поміщена у парафін, що включає депарафінізацію тканини ксилолом інкубацією при кімнатній температурі (21-22 °C), який відрізняється тим, що попередньо перед етапом депарафінізації тканину обробляють мінеральною олією і проводять інкубацію протягом 20 хвилин при температурі 90 °C далі проводять інкубацію при кімнатній температурі (21-22 °C), додають ксилол і подальше виділення ДНК здійснюють із застосуванням протеїнази К та відмивкою зразків з фільтруванням. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3