Спосіб диференційної діагностики доброякісних вузлових новоутворень молочної залози і прогнозування розвитку злоякісної пухлини молочної залози

Реферат: Спосіб диференційної діагностики доброякісних вузлових новоутворень молочної залози і прогнозування розвитку злоякісної пухлини молочної залози включає проведення клінічного обстеження, УЗ діагностики, мамографії, магнітно-резонансної томографії, тонкоголкової аспіраційної біопсії та трепанбіопсії. Після проведення трепанбіопсії одночасно з гістологічним виконують генетичне дослідження експресії VEGF пухлинної тканини. При відсутності експресії VEGF пухлинної тканини доброякісного вузлового новоутворення молочної залози призначають консервативну терапію, а при наявності експресії VEGF прогнозують підвищений ризик подальшого розвитку злоякісної пухлини молочної залози, що потребує призначення оперативного лікування. UA 82002 U (54) СПОСІБ ДИФЕРЕНЦІЙНОЇ ДІАГНОСТИКИ ДОБРОЯКІСНИХ ВУЗЛОВИХ НОВОУТВОРЕНЬ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ І ПРОГНОЗУВАННЯ РОЗВИТКУ ЗЛОЯКІСНОЇ ПУХЛИНИ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ UA 82002 U UA 82002 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до області медицини, а саме хірургії та онкології, і може бути використаним для проведення диференційної діагностики доброякісних пухлинних захворювань молочної залози (МЗ), прогнозування розвитку злоякісних пухлин МЗ та визначення тактики лікування хворих. Мамографія - відомий рентгенологічний спосіб діагностики молочної залози, який полягає в просвічуванні рентгенівськими променями масиву молочної залози та реєстрації на рентгенівській плівці зображення пухлинної тіні (1, 2, 3). Але внаслідок вказаного обстеження отримують інтегральну оцінку пухлини за допомогою мамограми, а не диференційну картину структури захворювання МЗ. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є ультразвуковий спосіб діагностики захворювань МЗ, при виконанні якого в масив молочної залози спрямовують потік енергії ультразвукових коливань, які проникають крізь молочну залозу, і за рівнем відбиття ультразвукових коливань судять про стан МЗ (4). Однак точність діагностики оцінки структури цим способом недостатня, так як ультразвукові дослідження не виявляють малі пухлини та ефективні лише у молодих жінок, у котрих добре розвинута залозиста тканина та щільні молочні залози. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу діагностики доброякісних вузлових новоутворень МЗ і прогнозування розвитку злоякісної пухлини МЗ шляхом проведення поряд з гістологічним генетичного дослідження експресії VEGF у пухлинній тканині, що дозволить з високим ступенем точності прогнозувати підвищений ризик подальшого розвитку злоякісної пухлини МЗ, що вказує на доцільність відмови від консервативного лікування, і потребує призначення оперативного, та діагностувати доброякісні вузлові новоутворення, для лікування яких рекомендують консервативну терапію під контролем її ефективності через 1-3 місяці. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з корисною моделлю, після проведення трепанбіопсії одночасно з гістологічним виконують генетичне дослідження експресії VEGF пухлинної тканини і при відсутності експресії VEGF пухлинної тканини доброякісного вузлового новоутворення молочної залози призначають консервативну терапію під контролем її ефективності через 1-3 місяці, а при наявності експресії VEGF прогнозують підвищений ризик подальшого розвитку злоякісної пухлини молочної залози, що потребує призначення оперативного лікування. Спосіб виконується наступним чином. Для проведення диференційної діагностики вузлових новоутворень МЗ окрім проведення клінічного огляду, УЗД молочних залоз, мамографії, МРТ молочних залоз, проводять морфологічне підтвердження діагнозу. Тонкоголчаста аспіраційна біопсія дозволяє отримати клітинний матеріал, трепанбіопсія - стовпчик тканини новоутворення для проведення гістологічного та імуногістохімічного аналізів. Однак і дані методи дослідження в цілому ряді випадків при отриманні доброякісного варіанта вузлового утворення МЗ не дозволяють однозначно відповісти на питання: слід пропонувати пацієнтці оперативне лікування або проводити на першому етапі консервативну терапію. З метою додаткового підвищення об'єктивності призначення оперативного лікування хворим з доброякісними вузловими новоутвореннями МЗ після проведення трепанбіопсії пухлини одночасно з гістологічним дослідженням проводилося генетичне дослідження експресії VEGF у пухлинній тканині. Першим етапом заявленого способу є забір матеріалу. При проведенні забору гістологічного матеріалу використовується одноразова стерильна голка для трепанбіопсії діаметром G14 і G16, яку поміщають у спеціальний напівавтоматичний пристрій. Після проведення внутрішньо шкірної проби на чутливість до препарату для місцевої анестезії (частіше використовується розчин лідокаїну 1 %) виконується місцева анестезія шкіри та ділянки МЗ з пухлиною. Голка проходить крізь шкіру і підшкірно - жирову клітковину в паренхіму молочної залози аж до пухлини, яку пунктують. У цій точці при натисканні кнопки напівавтоматичного біопсійного пристрою він вистрілює і голка висувається вперед. Після кожного вистрілювання голка витягується, відкривається камера і оцінюється якість отриманого зразка тканини. У більшості випадків проводиться дві або три біопсії для забезпечення отримання адекватних зразків тканини. Частина отриманої тканини негайно замочується в буферному розчині формальдегіду і направляється до патоморфологічної лабораторії для гістологічного і імунологічного аналізу; інша частина тканини поміщується в стерильну пробірку і негайно відправляється для дослідження до молекулярно-генетичної лабораторії. 1 UA 82002 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Попередню обробку проб виконують за стандартною методикою. Другим етапом є проведення дослідження ПЛР з використанням комплексу реагентів для ампліфікації "SNPекспрес". При приготуванні робочої ампліфікаційної суміші всі компоненти додають окремими наконечниками з аерозольними бар'єрами (фільтрами). Такі ж наконечники використовують і для внесення до пробірки препарату ДНК. Розріджувач, Taq-полімераза і мінеральне масло є однаковими для всіх комплектів формату "SNP-експрес". Робочі суміші готують безпосередньо перед ампліфікацією. Після внесення зразка пробірки з ампліфікацій ними сумішами якомога швидше поміщають до ампліфікатора. 1. Готують і нумерують пробірки для проведення ампліфікації місткістю 0,5 мл відповідно з кількістю аналізованих проб плюс негативний контроль. Для кожної проби готуємо 2 пробірки (Н (норма) і М (мутація)). 2. За 20-30 хвилин до приготування робочої ампліфікаційної суміші витягають комплект реагентів для ПЛР з морозильника, розморожують вміст. Пробірки з реакційною сумішшю і повністю розмороженим розчином розріджувача ретельно перемішують. Перемішування розріджувача відбувається при перевертанні пробірки (бульбашкою повітря). Перемішування реакційної суміші проводимо вортексируванням. 3. З компонентів комплекту готуємо робочі суміші реагентів для ампліфікації з розрахунку на 1 пробу: 17,5 мкл розріджувача, 2,5 мкл реакційної суміші, 0,2 мкл Taq-полімерази (вноситься в останню чергу і перед її внесенням суміш трохи перемішують). Готують 2 робочі суміші: з реакційною сумішшю НОРМА і реакційною сумішшю мутації. 4. Після додавання Taq-полімерази, яке проводиться в останню чергу, ретельно перемішують суміш піпетуванням. 5. Додають по 20 мкл відповідної робочої ампліфікаційної суміші в усі відповідні пробірки, підготовані для ампліфікації. 6. Додають в усі пробірки по 1 краплі (близько 25 мкл) мінерального масла. 7. Вносять по 5 мкл зразка з обробленої аналізованої проби в пробірку з робочою ампліфікаційною сумішшю НОРМА і в пробірку з робочою ампліфікаційною сумішшю мутацій під шар масла. Як негативний контрольний зразок вносять розріджувач в об'ємі 5 мкл в обидва типи реакційної суміші. 8. Пробірки закривають і центрифугують протягом 3-5 секунд при 1500-3000 об/хв. при кімнатній температурі на мікроцентрифузі - вортексі. 9. Переносять пробірки в прогрітий до температури + 94 °C (стабільна температура в режимі Пауза) програмований термостат (ампліфікатор) і проводять ампліфікації по програмі, що зазначена в наборі. Наступний етап дослідження - детекція продуктів ампліфікації. Розподіл продуктів ампліфікації методом горизонтального електрофорезу. 1. Заливають в апарат для електрофорезу ТАЕ буфер, приготований на дистильованій воді розбавленням 50хТАЕ в 50 разів (рН = 8,3). 2. Готують 3 % агарозу з розрахунку на 1 гель: до 1,5 г ага рози додають 1 мл 50хТАЕ буфера і 55 мл дистильованої води (включений запас на випаровування). 3. Приготовлену суміш розплавляють в СВЧ-печі на невеликій потужності. Додають до 50 мл розплавленої агарози 5 мкл 1 % розчину бромистого етидію. Перемішують. 4. Розплавлену агарозу відразу ж заливають в планшет для заливки гелю. Для отримання в агарозному гелі кишень для нанесення зразків встановлюють на планшет гребінку, використовуючи затискач типу "бульдог". Після застигання агарози обережно виймають гребінку з гелю і переносять планшет з гелем в камеру для проведення електрофорезу. 5. Наносять в кишені гелю по 10-15 мкл ампліфікату в послідовності, відповідної нумерації проб. 6. Підключають електрофоретичну камеру до джерела живлення і задають напругу, відповідну напруженості електричного поля 10-15 В/см гелю (для камери з відстанню між електродами 27 см максимальна напруга 150 В). Проводять електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації в напрямку від катода (-) до анода (+). Контроль за електрофоретичним розподілом здійснюють візуально за рухом смуги барвника. Смуга барвника повинна пройти від старту 1,5-2 см (смуги ампліконів будуть випереджати смугу барвника, оптимальний час розгонки - 17 хв.). Проводять візуалізацію результатів електрофорезу. 7. Виймають гель з форми і переносять його на скло УФ-трансілюмінатор. 8. Включають трансілюмінатор і аналізують результати аналізу. Фрагменти аналізованої ДНК виявляються у вигляді світних оранжево-червоних смуг під УФ-випромінюванням з довжиною хвилі 310 нм. 2 UA 82002 U 5 Далі виконують аналіз результатів. При інтерпретації результатів всі смуги на електрофорезі повинні бути чіткими і приблизно однакової інтенсивності (допускаються невеликі відмінності в яскравості як між тестами на норму і мутацію, так і від проби до проби). У всіх цих випадках повторюємо ампліфікацію і детекцію, а при повторному прояві малоінтенсивних смуг - повторюємо аналіз, починаючи зі стадії виділення ДНК з відповідної проби. Використовують три варіанти інтерпретації результату дослідження: нормальна гомозигота, гетерозигота, мутантна гомозигота. Результати дослідження поліморфізму C634G гена VEGF вносять у бланк-таблицю. Бланк-таблиця Досліджуваний ген VEGF Поліморфізм C634G Результат дослідження C/G С/С Гомозиготний G/G Гомозиготна Гетерозиготна носій форма форма нормального гена поліморфізму поліморфізму 10 15 20 25 30 35 40 45 При оцінці відповідності розподілу частот різних генотипів, визначених у даних дослідженнях, встановлено, що в групі жінок з раком МЗ поширення гомозиготних і гетерозиготних генотипів не відповідає рівнянню Харді-Вайнберга (χ2=26,89 р