Спосіб лікування цукрового діабету i типу

Реферат: Спосіб лікування цукрового діабету включає внутрішньовенне введення мезенхімальних стромальних клітин (МСК) пупкового канатика мезенхімально-стромальної фракції у комплексі з ядровмісними клітинами пуповинної крові. Застосування МСК і донорських гематопоетичних клітин пуповинної крові дозволило отримати високий ефект лікуванням цукрового діабету. UA 114765 U (12) UA 114765 U UA 114765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель стосується лікування цукрового діабету I типу і може бути використана в медицині при лікуванні людей з відповідним захворюванням імунної системи. Діабет I типу є аутоімунним захворюванням, коли імунна система атакує і руйнує β-клітини острівців Лангерганса або, власне, інсулін, що призводить до абсолютного дефіциту інсуліну у крові. Порушення вуглеводневого обміну і клінічне проявлення цукрового діабету виникає при руйнуванні більше 80 % β-клітин. Зниження продукції інсуліну викликає збільшення глюкози у крові (гіперглікемія) і у сечовині (глюкозурія), що призводить до тяжких порушень обміну речовин (ожиріння), враження судин, нейропатій, нефропатій і ретінопатії. Традиційно, інсулінзалежний діабет лікують призначенням екзогенного інсуліну, однак, з часом і до нього виникають антитіла. Також, призначають препарати, що стимулюють виробляння ендогенного інсуліну (препарати сульфанілсечовини: гліклазид, гліквідон), препарати, що знижують адсорбцію глюкози у кишечнику (зокрема: бігуаніди - метформін, інгібітори -глюкози акарбоза). Найбільш близьким є спосіб лікування цукрового діабету I типу, що включає застосування у курсі лікування клітинної терапії з використанням мезенхімальних стовбурових клітин (RU, патент на винахід № 2265443 С1, опублікований 10.12.2005 р. [1]). За відомим способом пацієнту внутрішньовенно крапельним методом вводять біотрансплантат, що містить мезенхімальні стовбурові клітини, отримані з фетального, донорського або аутологічного матеріалу шляхом дезагрегування тканини, ресуспендування отриманої клітинної суспензії і культивування на ростовому середовищі, що містить трансферин, інсулін, фактор росту фібробластів і гепарин. Недоліком відомого способу є використання ембріональних тканин людини як з етичної точки зору, так і з небезпекою можливою їх тератогенності. Крім того, ростове середовище, що застосоване для культивування, містить білки ксеногенного походження, що є небезпечними для терапії. Задачею корисної моделі є удосконалення способу лікування цукрового діабету I типу, в якому завдяки запропонованого комплексного застосування мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика і донорських гематопоетичних клітин пуповинної крові досягається висока ефективність лікування зазначеної хвороби без застосування ембріональних тканин людини і використання небезпечного ростового середовища при культивуванні мезенхімальних стромальних клітин. Поставлена задача вирішується запропонованим способом лікування цукрового діабету I типу, що включає застосування у курсі лікування клітинної терапії з використанням мезенхімальних стовбурових клітин, в якому клітинну терапію здійснюють шляхом внутрішньовенного введення мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика мезенхімально-стромальної фракції у комплексі з ядровмісними клітинами пуповинної крові. При цьому, кожна процедура клітинної терапії включає внутрішньовенне введення по (106 15)×10 мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика на 10 кг ваги пацієнта і (1006 150)×10 ядровмісних клітин пуповинної крові на 10 кг ваги пацієнта. У способі лікування цукрового діабету I типу зазначені мезенхімальні стромальні клітини пупкового канатика складаються з фібробластоподібних клітин, близько 95 % яких є клітинами CD105, CD73 і CD90, а ядровмісні клітини пуповинної крові взяті у вигляді концентрату, що містить лімфоцити з маркерним складом CD34, CD45, CD14, CD19 і HLA-DR. Запропонований спосіб лікування цукрового діабету I типу додатково може включати терапію протидіабетичними препаратами. Нами було встановлено, що сукупне застосування мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика і донорських гематопоетичних клітин пуповинної крові є ефективним лікуванням цукрового діабету I типу. При цьому, не застосовуються ембріональні тканини людини і не використовується небезпечне ростове середовище при культивуванні мезенхімальних стромальних клітин. Біотрансплантат для лікування цукрового діабету I типу характеризується тим, що отриманий з донорських пупкових канатиків, отриманих в ході нормальних пологів після одержання інформованої згоди поліжниці. За останні 10 років проводяться дослідження різних клітинних препаратів, здатних полегшити стан хворих. Основними задачами терапії діабету I типу стовбуровими клітинами є: зберегти β-клітини, що залишилися, замістити втрачені β-клітини, запобігти атаки імунної системи на оновлені β-клітини. Нами було встановлено, що обидва типи клітин: мезенхімальні стромальні клітини пупкового канатика і ядровмісні клітини пуповинної крові, - негативно впливають на проліферацію T-клітин і уповільнюють дозрівання дендритних клітин, що підтверджує їх імуносупресуючу функцію. 1 UA 114765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, використовуючи комбінацію двох типів клітин, здійснюється вплив на імунну систему пацієнта, щоб запобігти подальшому знищенню клітин підшлункової залози. Спосіб здійснюють наступним чином. Наявність цукрового діабету I типу встановлювали за результатами огляду пацієнта, вивчення його аналізів і визначення концентрації глікованого гемоглобіну (HbA1), загального холестерину ліпопротеїдів високої і низької щільності, тригліцеридів і розрахунку індексу атерогенності встановлювали. При цьому кров на дослідження брали з ліктьової вени вранці натще. Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали із застосуванням методів варіаційної статистики. Достовірність різниці кількісних показників визначали за парним критерієм Стьюдента. Діагноз діабет I типу і курс клітинної терапії призначали пацієнтам, вихідний рівень глікемії у яких у середньому становив 9,81,2 ммоль/л, концентрація HbA1 9,960,6 %. Для клітинної терапії попередньо отримували мезенхімально-стромальну фракцію клитин та ядровмісні клітини пуповинної крові. Мезенхімально-стромальну фракцію клітин отримували з пуповинного канатика (10-12 см відрізка пуповинного канатика), отриманого в процесі нормальних пологів після відсікання пуповини. Виділення проводять методом ферментної дисоціації з застосуванням колагенази типу А. Інкубація подрібненої пуповини у середовищі DMEM без сироватки у присутності 1 мг/мл колагенази типу А проводилась протягом 2 годин при температурі 37 ºC і постійному прокачуванні. Далі клітини двічі промиваються середовищем DMEM з сироваткою. Клітинний осад ресуспендували у середовищі росту DMEM/F12, що містить 10 % сироватку телят (середовище, що не містить білків ксеногенного походження), 2 mmol/L глутаміну, 1 % незамінних амінокислот і 1 % пеніцилін/стрептоміцин. Культивували при 37 ºC у атмосфері 5 % CO2. При досягненні суцільного конфлюентного моношару клітини пересівали з використанням 2 0,0125 % розчину трипсину до нових флаконів з площею дна 175 см з культуральним середовищем CTS Xeno free (GIBCO). Такий метод культивування дозволяє отримати до кінця 4-5 тижня популяцію 8 мезенхімальних стромальних клітин у кількості (1-1,5)×10 мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика, необхідній для трансплантації. Отримані мезенхімальні стромальні клітини пупкового канатика складаються з фібробластоподібних клітин, близько 95 % яких є клітинами CD105, CD73 і CD90. Донорські гематопоетичні клітини - ядровмісні клітини пуповинної крові - виділяли з пуповинної крові добровільних донорів, отриманої під час нормальних пологів після відсікання пуповини, шляхом проведення седиментації у присутності 1,2 % гідроксіетилкрохмалю і подальшого заморожування концентрату у присутності DMSO. Концентрат ядровмісних клітин пуповинної крові містить лімфоцити з маркерним складом CD34, CD45, CD14, CD19 і HLA-DR. Концентрат також характеризується групою крові і резус-фактором, які мають відповідати групі крові і резус-фактору пацієнта. Мезенхімальні стромальні клітини пупкового канатика і ядровмісні клітини пуповинної крові досліджуються на відсутність вірусів, бактеріальних і мікроплазмених інфекцій та грибів. Кожна процедура клітинної терапії включає внутрішньовенне введення по 10-15 млн мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика мезенхімально-стромальної фракції на 10 кг ваги пацієнта і 100-150 млн ядровмісних клітин пуповинної крові на 10 кг ваги пацієнта. Введення здійснюється внутрішньовенно крапельним методом під контролем тиску і температури пацієнта. Спосіб лікування пройшов досліджувався на групі з 15 пацієнтів. Всім пацієнтам визначали концентрацію глікованого гемоглобіну (HbA1), загальний холестерин ліпопротеїдів високої і низької щільності, тригліцериди і розраховували індекс атерогенності на початку лікування і по закінченні дослідження. Після проведення запропонованогоспособу лікування з застосуванням процедури введення мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика мезенхімально-стромальної фракції у комплексі з ядровмісними клітинами пуповинної крові відповідної групи крові рівень глікемії у пацієнтів вже через тиждень знижався на 1,5 ммоль/л (p0,01). При повторних процедурах через 2 і 4 місяці концентрація глюкози натще продовжувала знижуватися і була на рівні, відповідно: 6,80,3 і 6,00,3 ммоль/л. Аналіз крові на глікований гемоглобін через 4 місяці після початку лікування знижався до 6,230,3 % (кращий результат). Найкращі результати були досягнуті після року лікування, протягом якого пацієнти отримали чотири процедури введення мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика мезенхімально-стромальної фракції у комплексі з ядровмісними клітинами пуповинної крові: глікемія знизилася до 5,70,6 ммоль/л (p0,05), HbA1 - до 5,80,3 % (p0,05). Значне покращення компенсації цукрового діабету I типу 2 UA 114765 U 5 10 15 20 25 призвело до зменшення концентрації загального холестерину, холестерину ліпопротеїдів низької щільності. Нижче наведені приклади, які демонструють, але не обмежують корисну модель. Приклад 1 Пацієнт Г., 35 років. Діабет I типу виявлений вперше. Вихідний рівень глікемії -9,80,3 ммоль/л, концентрація HbA1 - 9,40,3 %. Група крові І(0)Rh+. Після попередньої терапії всіх супутніх захворювань Пацієнту Г. було призначено чотири процедури мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика мезенхімально-стромальної фракції (МСК) у комплексі з ядровмісними клітинами пуповинної крові відповідної групи крові (І(0)Rh+) в дозі 90 млн МСК і 900 млн. концентрату ядровмісними клітинами пуповинної крові. Процедури повторювали через 2 місяці. Через 2 місяці після першої процедури МСК і ядровмісних клітин пуповинної крові стан Пацієнта Г. значно покращився. Спостерігалося зниження у два рази аутоантитіл до клітин острівців Лангенрганса. Знизилося значення глюкози у крові. Через 6 місяців спостереження відмітили нормалізацію рівня глікемії, зникнення глюкозурії, нормалізація рівня С-пептиду, зменшення проявлення нефропатії, що дозволило знизити дозування протидіабетичних препаратів. За рік глікемія знизилася до - 5,70,6 ммоль/л, концентрація HbA1 - 5,80,3 %. Приклад 2 Пацієнтка М., 25 років. Діабет I типу. Вихідний рівень глікемії - 9,81,2 ммоль/л, концентрація HbA1 - 9,50,4 %. Група крові B(III)Rh+. Приймає екзогенний інсулін. Після проведення двократної терапії мезенхімальними стромальними клітинами пупкового канатика мезенхімально-стромальної фракції (МСК) у комплексі з ядровмісними клітинами пуповинної крові відповідної групи крові (B(III)Rh+) в дозі 55 млн МСК і 500 млн. концентрату ядровмісними клітинами пуповинної крові відмічене покращення загального стану пацієнтки М. Об’єктивно: аналіз крові на глікований гемоглобін через 6 місяців від початку лікування показав більш низький рівень HbA1 - 6,230,3 %. Найкращих результатів Пацієнтка М. отримала після року лікування (4 процедури на рік з періодичністю 2 місяці). За рік глікемія знизилася до 5,70,6 ммоль/л, концентрація HbA1 - 5,80,3 %. Після завершення лікування Пацієнтці М. була значно знижено дозування екзогенного інсуліну. 30 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 45 1. Спосіб лікування цукрового діабету I типу, що включає застосування у курсі лікування клітинної терапії з використанням мезенхімальних стовбурових клітин, який відрізняється тим, що клітинну терапію здійснюють шляхом внутрішньовенного введення мезенхімальних стромальних клітин пупкового канатика мезенхімально-стромальної фракції у комплексі з ядровмісними клітинами пуповинної крові. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що кожна процедура клітинної терапії включає 6 внутрішньовенне введення по (10-15)×10 мезенхімальних стромальних клітин пупкового 6 канатика на 10 кг ваги пацієнта і (100-150)×10 ядровмісних клітин пуповинної крові на 10 кг ваги пацієнта. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що зазначені мезенхімальні стромальні клітини пупкового канатика складаються з фібробластоподібних клітин, близько 95 % яких є клітинами CD105, CD73 і CD90, а ядровмісні клітини пуповинної крові взяті у вигляді концентрату, що містить лімфоцити з маркерним складом CD34, CD45, CD14, CD19 і HLA-DR. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що додатково включає терапію протидіабетичними препаратами. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3