Спосіб визначення критичної дози впливу на рослину

Реферат: Винахід належить до способу, що ґрунтується на вимірюванні сигналів індукції флуоресценції нативного хлорофілу між кроками покроково наростаючої дії чинника, виділенні з поточних значень флуоресценції максимальної Fm і стаціонарної Fst та визначення критичної дози дії чинника при Fst > 0,5Fm. UA 115272 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб належить до області дослідження матеріалів шляхом визначення фізичних властивостей, зокрема запису і аналізу кривої індукції флуоресценції нативного хлорофілу інтактного листка рослини (індукційна крива Каутського). Спосіб орієнтовано на застосування у сільському господарстві, зокрема рослинництві садівництві та селекційній роботі. Відомо спосіб діагностики стійкості винограду до абіотичного стресу методом індукції флуоресценції хлорофілу патент України № 87319 від 10.02.2014 р. Спосіб полягає у визначенні критичних концентрацій стресових агентів для різних сортів і шляхом порівняння критичних концентрацій визначають стійкість сортів. Спільними рисами запропонованого способу та аналогу є нормований вплив різних концентрацій стресових агентів на рослини винограду та порівняння їх разом з флуоресценцією для різних сортів для визначення стійкості винограду. Причиною, що заважає отриманню бажаного технічного результату є те, що критичні концентрації стресових агентів для порівняння ще треба визначити, а як це зробити аналог не дає. Найближчим по суті до запропонованого способі є "Спосіб діагностики стану рослин" патент України № 84630, бюл. № 20 від 25.10.2013 р. Спосіб прототип включає опромінення листка рослини після темнової фази світлом з довжиною хвилі у діапазоні довжин хвиль 400-700 нм, прийомі, вимірюванні та реєстрації сигналів флуоресценції в діапазоні хвиль 650-750 нм, із значень яких будують криву індукції флуоресценції та визначають значення фонової F 0, максимальної Fm, стаціонарної флуоресценції, Fst значення флуоресценції плато Fpl для дослідної і контрольної рослин, та на дослідну рослину діють зовнішнім чинником різної величини, порівнюють відповідні значення виміряних флуоресценцій контрольної та дослідних рослин, знаходять максимальні значення їх різниць і по залежності різниці від зовнішнього чинника судять про стан рослини. Спільними рисами прототипу та запропонованого способу є операції отримання флуоресцентних сигналів листя рослин і дія на дослідну рослину зовнішнім чинником різної величини. Причиною, що заважає отриманню бажаного технічного результату є те, що критерієм стану рослини у прототипі є залежність максимальної різниці виміряних флуоресценцій контрольної і дослідної рослин від зовнішнього чинника, що не визначає критичну дозу чинника і дозу взагалі. В основу винаходу поставлена задача створення такого експресного способу визначення критичної дози впливу на рослину в польових умовах, в якому завдяки введенню у відомий спосіб нових операцій, їх послідовності та інтерпретації результатів стало б можливим експресно визначити та кількісно оцінити критичну дозу впливу на рослину. Вирішення поставленої задачі досягається тим, що запропонований спосіб визначення критичної дози впливу (дії) на рослину, ґрунтується на опроміненні листка рослини після темнової фази світлом у діапазоні довжин хвиль 400-650 нм, прийом, виділення та вимірювання сигналів наведеної флуоресценції у діапазоні хвиль 670-770 нм із значень яких будують криву індукції флуоресценції та визначають значення, максимальної Fm та стаціонарної флуоресценції Fst, а також на дослідну рослину впливають покроково наростаючою дозою впливу та між кроками вимірюють індукцію флуоресценції хлорофілу, а дозу впливу при якій сигнал флуоресценції ІФХ на рівні стаціонарної флуоресценції Ft стає більшим половини максимальної флуоресценції Fm, вважають критичною дозою впливу чинника на рослину. Відмінними ознаками запропонованого способу є те, що на дослідну рослину впливають покроково наростаючою дозою впливу та між кроками вимірюють індукцію флуоресценції хлорофілу, а дозу впливу при якій сигнал флуоресценції ІФХ на рівні стаціонарної Ft стає більшим половини максимальної флуоресценції Fm, вважають критичною дозою впливу чинника на рослину. Введення у відомий спосіб операції впливу на дослідну рослину покроково наростаючою дозою впливу та вимірювання флуоресценції в між кроковий період, дозволить виявити дозу впливу. А застосування критерію критичної дози впливу Fst > 0,5 Fm, дозволить виявити критичну дозу впливу. Для однозначності сприйняття наведемо деякі визначення: ДОЗА ДІЇ (впливу)- кількість дії, добуток інтенсивності дії на час дії. КРИТИЧНА ДОЗА дії (впливу) на рослину - кількість дії, що викликає незворотні зміни рослини. Знання критичної дози дії чинника на рослину необхідно для визначення стійкості рослин до дії різних природних та антропогенних екзо та ендогенних чинників. При дії на рослину стресового чинника вона змінює свій стан, а тим самим показники індукції флуоресценції, зокрема індикатор стресу - індекс Rfd = (Fp-Fs)/FS. 1 UA 115272 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Введення у відомий спосіб операцій дії покроково наростаючою дозою впливу та між кроками вимірювання індукції флуоресценції хлорофілу, а дозу впливу при якій сигнал флуоресценції ІФХ на рівні стаціонарної флуоресценції Ft стає більшим половини максимальної флуоресценції Fm, дозволяє визначити критичну дозу впливу чинника на рослину. Відомо, що певні ділянки кривої індукції флуоресценції хлорофілу є індикаторами відповідних фізіологічних процесів у ланцюгу фотосинтезу. Тому порушення окремих ланок фотосинтезу, викликані екзо та ендогенними чинниками проявляються у змінах характерних значень кривої ІФХ. Такі зміни індукційної кривої рослини, на яку діє стресор доцільно використати як діагностичну ознаку. Параметр. Fst, вибрано у зв'язку з більш високою чутливістю темнових фотосинтетичних процесів дії стресових чинників. Один з найбільш чутливих показників є активність рібульозобісфосфат-карбоксилази (Рубіско). Зменшення активності рубіско приводить до відновлення переносників ЕТЛ ФС2, в результаті пониження атрагуючої здатності цього ферменту. Але відновлення переносників призводить до відновлення і закриття РЦ ФС2. Останнє супроводжується зниженням спаду ІФХ і реєструється як підвищення Fst. Запропонований спосіб реалізує наступний порядок визначень: з допомогою хроно флуорометра, наприклад ФЛОРАТЕСТА, отримують поточні значення флуоресценції і з них будують індукційну криву листка. Фрагмент листка опромінюють світлом, яке збуджує флуоресценцію хлорофілу. Частіше довжину хвилі опромінення вибирають у діапазоні хвиль поглинання хлорофілу 400650 нм, який охоплює головні λ=450 нм і λ=650 нм та проміжні λ=500 нм, λ=550 максимуми довжин хвиль. Опромінення актинічним світлом здійснюють у діапазоні інтенсивності 1002000 мкмоль -2 -1 фотонів м с , яка підтримує фотосинтез. Одночасно з опроміненням здійснюють прийом, виділення, вимірювання і реєстрацію сигналів флуоресценції з освітленої плями листка в діапазоні хвиль 670-750нм. Діапазон флуоресценції охоплює обидва максимуми флуоресценції нативного хлорофілу на λ=680 нм та λ=735 нм. Із поточних значень флуоресценції будують індукційну криву флуоресценції і виділяють характерні значення максимальної та стаціонарної флуоресценції. Запропонований спосіб визначення критичної дози впливу на рослину як видно з його опису, може бути реалізований у виробних умовах, так як для його реалізації використовують серійні хлорофіл флуорометри, які дозволяють записувати індукційну криву. При реалізації способу був застосований переносний флуорометр "Флоратест" з сенсором хлорофілу по патенту на винахід № 94814 виробництва Інституту кібернетики HAH України, але можна використати інші прилади, наприклад, портативний хлорофіл-флуорометр РАМ - 2100 німецької фірми Heinz Walz GmbH, або хлорофіл-флуорометр OS-30р фірми OPTI-Sciences, USA. Приклад реалізації способу: Спосіб реалізовано при визначенні критичної дози охолодження саджанців в умовах лабораторного досліду. Листок суниці садової Fragaria vesca вирощеної в горщику охолоджували з кроком 2 °C в інтервалі температур +20…-16 °C (фіг. 1). Перед кожним кроком підвищення (пониження) температури міряють індукцію флуоресценції хлорофілу (ІФХ), фіксують величину Fst і порівнюють її з Fm (значення в максимумі флуоресценції Fm нормують). При Fst> 0,5Fm дозу впливу (дії) вважають критичною і вимірювання припиняють. Дозу дії визначають як добуток температури на час дії. Вимірювання ІФХ виконують наступним чином: Листок рослини розміщували між пластинами сенсора і витримували без світла 10 хв. Для опромінення листка рослини було використано 4 синіх світло діода NSPB500S (Nicbia) з довжиною хвилі випромінення 460 нм ± 10 нм. Діоди розміщені попарно на протилежних сторонах каркаса, симетрично відносно фотоприймача і в межах плями освітлення діаметром 5 мм створюють рівномірне освітлення. При інтенсивності -2 -1 освітлення 450 мкмоль м с і більше сигнал індукованої флуоресценції надійно фіксується. Для виділення сигналу флуоресценції нами застосовано червоний скляний світлофільтр КС-17, який забезпечує надійне відсікання випромінення світло діодів і пропускання сигналів флуоресценції. В якості фотоприймача використано інтегрований з підсилювачем світло діод ОРТ301М (BurrBrown), у якого максимум чутливості в діапазоні хвиль 650800 нм. Для вимірювання і реєстрації сигналів використано мікроконтролер ADuC 842 (Analog Devieces). Спеціалізовані програми роботи контролера дозволяють виділити Fst та Fm і визначити критичну дозу холоду для суниці. Запропонований спосіб дозволяє визначити критичну дозу впливу (дії) чинника при масових експресних визначеннях стійкості рослин до стресових чинників. Запропонований спосіб визначення критичної дози впливу на рослину буде застосовано в Інституті садівництва НААН при тестуванні суниці садової, ожини та ефіроолійних культур, що зимують з листям, саджанців плодових дерев та ягідників. 60 2 UA 115272 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 Спосіб визначення критичної дози впливу на рослину, який включає темнову адаптацію фрагмента рослини, опромінення його світлом у діапазоні хвиль поглинання хлорофілу, прийом, виділення та вимірювання сигналів наведеної флуоресценції у діапазоні хвиль флуоресценції хлорофілу і виділення з поточних значень максимальної флуоресценції Fm та стаціонарної Fst, який відрізняється тим, що на дослідну рослину впливають покроково наростаючою дозою впливу та між кроками вимірюють індукцію флуоресценції хлорофілу, а дозу впливу, при якій сигнал флуоресценції ІФХ на рівні стаціонарної Fst стає більшим половини максимальної Fm, вважають критичною дозою впливу чинника на рослину. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3