Спосіб забарвлення гістологічних препаратів нервової тканини

Реферат: Винахід належить до медицини, а саме до нейроанатомії, та може бути використаний для забарвлення відділів центральної нервової системи гістологічних препаратів. Спосіб забарвлення гістологічних препаратів нервової тканини включає: матеріал фіксують в 10-15 % формаліні, готують заморожені зрізи, які розміщують на 2-3 доби в мідно-сольовому розчині, який готують ex tempore наступним чином: 0,5 г сірчанокислої міді (CuSO4 5Н2О) розчиняють в 100 мл дистильованої води, підігрівають на водяній бані до 50-55 °С, додають 4 мл фенолу, попередньо розплавленого на водяній бані, і 1-2 краплі концентрованої соляної кислоти, оброблені зрізи наклеюють на предметне скло і забарвлюють галуновим гематоксиліном 15-20 хв. в термостаті при температурі 56 °С, промивають у воді, проводять через спирти, освітлюють в карбол-ксилолі, промивають в ксилолі і укладають під покривне скло. UA 115821 C2 (12) UA 115821 C2 UA 115821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до медицини, а саме до нейроанатомії, та може бути використаний для забарвлення відділів центральної нервової системи гістологічних препаратів. Для забарвлення гістологічних препаратів нервової тканини є значний арсенал способів забарвлення, в яких використовують специфічні барвники переважно на основі срібла, золота та інших дорогих реактивів, які вибірково забарвлюють ті чи інші структурні компоненти нервової тканини. Так, наприклад, для імпрегнації нервових волокон і нервових закінчень відомий спосіб ГросБільшовського, який полягає в наступному: зразки нервової тканини товщиною 0,3-0,5 см фіксують в суміші ангідроформальдегіданіліну (АФА). Фіксуючу суміш готують заздалегідь, її складовими є нерозведений нейтральний формалін, 96° спирт і 1 % розчин миш'яковистої кислоти, які беруть порівну. Після фіксації в АФА зразки додатково фіксують у 20 % розчині нейтрального формаліну терміном 2 дні, затим готують зрізи способом заморожування і переносять в 20 % розчин азотнокислого срібла, промивають в 20 % розчині нейтрального формаліну і переносять в розчин аміачного срібла, який готують заздалегідь. Процес імпрегнації спостерігають під контролем мікроскопа, додаючи потрібну кількість 25 % розчину аміаку до появи на строкатому тлі чорних ядер нервових елементів. Зрізи промивають у кількох порціях дистильованої води і переносять у слабкий розчин хлорного золота до набуття зрізами сіро-сталевого або фіолетового тону. Диференціюють в 5 % розчині гіпосульфіту, зневоднюють, просвітлюють і укладають під покривне скло [Меркулов Г.А. Курс патологической техники / Г.А. Меркулов. - Л.: Медицина, 1969. - 423 с]. Даний спосіб має ряд істотних недоліків. Спосіб трудомісткий, потребує дорогих реактивів, не завжди дає гарні результати внаслідок невизначеності часу тих чи інших етапів імпрегнації. Відомий також спосіб Кахаля-Фаворського, запропонований для імпрегнації нервових клітин, осьових циліндрів і кінцевих структур (синапсів), який виконують на зразках біологічного матеріалу. Зразки фіксують в 80° спирті, до якого додають або мурашину кислоту, або міцну оцтову кислоту (крижану); переносять у 85° спирт, потім у 96°, промивають у воді і поміщають в розчин азотнокислого срібла на термін до 2 тижнів залежно від товщини і щільності препарату. Розчин азотнокислого срібла в цей термін змінюють 2-3 рази. Після чого препарат переносять в свіжоприготовлений проявник, в складі якого присутня пірогалова кислота, яка є отруйною речовиною, небезпечним і важкодоступним реактивом [Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс; пер. с немец. В. Александрова. - М.: Издательство иностранной литературы, 1953. 718 с]. Відомий спосіб забарвлення мієлінових оболонок нервових волокон, який включає фіксацію препарату, промивання, протравлення в хромовій суміші, повторне промивання, заливку у парафін, забарвлювання в оцтовокислому гематоксиліні, чергове промивання і диференціювання, який відрізняється тим, що протравлення виконують у суміші розчину двохромовокислого калію і хромокалієвих галунів, а хромові солі відмивають спиртом [Пат. № 54892, UA, МПК G01N 1/30. / Коробова Л.К., Жарова Н.В. - З. № u201006806; Заявл. 02.06.2010; Опубл. 25.11.2010. Спосіб забарвлювання мієлінових оболонок нервових волокон]. Спосіб не вимагає реактивів, які є отруйними або вибухонебезпечними при роботі з ними. Так само відомий спосіб дослідження нервових волокон в судинно-нервових пучках різних тканинних структур, який полягає в тому, що гістологічні препарати забарвлюють безгалуновим оцтовокислим гематоксиліном з наступною диференціацією пікрофуксином, в результатічого мієлінові оболонки нервових волокон забарвлюються в синювато-чорний колір, м'язова тканина набуває насиченого червоно-коричневого кольору, сполучна тканина - від рожевого до яскравочервоного. Епінервій, перинервій і ендонервій периферичних нервів чітко диференційовані. Безмієлінові нервові волокна вегетативної іннервації чітко контуровані як у судинно-нервових пучках, так і серед навколишньої тканини [Пат. № 65245, UA, МПК G01N 1/30. / Кихтенко О.В., Коробова Л.К., Лупир В.М., Лупир М.В. - З. № u201107297; Заявл. 09.06.2011; Опубл. 25.11.2011. Спосіб забарвлювання нервових волокон гістологічного препарату]. Для виявлення кінцевих структур (синапсів) застосовують спосіб Гольжді-Дейнека, в якому фіксацію препарату проводять в розчині АФА, а імпрегнацію в розчині азотнокислого срібла з наступним проявом розчину хлорного золота або золотохлористоводневої кислоти, в результаті чого на сірому фоні препарату різко виступають гангліозні елементи, по периферії клітинних тіл і відростків яких виявляються синаптичні утворення різної величини і форми [Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс; пер. с немец. В. Александрова. - М: Издательство иностранной литературы, 1953. - 718 с]. В способі імпрегнації астроцитарної тканини за Рамоном-і-Кахаль з модифікацією за Malik використовують золото-сулемовий розчин з подальшою фіксацією забарвлення в 5 % водному 1 UA 115821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 розчині гіпосульфіту [Меркулов Г.А. Курс патологической техники / Г.А. Меркулов. - Л.: Медицина, 1969. - 423 с]. Відомий спосіб Kaiser, який виконують наступним чином: матеріал, фіксований в 20 % формаліні, хромують протягом 2-3 днів в термостаті при температурі 37° розчином біхромату калію. Промивають у воді і переносять в кілька порцій 2 % розчину азотнокислого срібла до тих пір, поки не перестане утворюватися осад у вигляді злегка червоної каламуті. Потім зразки матеріалу поміщають у свіжий розчин азотнокислого срібла з розрахунку 50 мл на 1 зразок і залишають в темряві на 2-3 доби. Затим промивають у воді і роблять заморожені зрізи. Прояснюють і укладають під покривне скло. Результат: астроцитарна глія - чорна, фон безбарвний або злегка жовтуватий [Меркулов Г.А. Курс патологической техники / Г.А. Меркулов. - Л.: Медицина, 1969. - 423 с]. Даний спосіб забарвлення гістологічних препаратів нервової тканини є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю та результатом, який може бути досягнутий, тому його вибрано за прототип. Недоліком способу є осади, які часто з'являються в препараті по периферії. У зв'язку з вищевикладеним, в основу винаходу поставлено задачу підвищення якості способу забарвлення гістологічних препаратів нервової тканини шляхом позбавлення від осаду, який з'являється в препараті по периферії. Задачу, яку поставлено в основу винаходу, вирішують тим, що у відомому способі забарвлення гістологічних препаратів нервової тканини, який включає фіксування матеріалу, обробку в спеціальних розчинах та розміщення на склі, згідно з винаходом, матеріал фіксують в 10-15 % формаліні, готують заморожені зрізи, які розміщують на 2-3 доби в мідно-сольовому розчині, який готують ex tempore наступним чином: 0,5 г сірчанокислої міді (CuSO4 5Н2О) розчиняють в 100 мл дистильованої води, підігрівають на водяній бані до 50-55 °C, додають 4 мл фенолу, попередньо розплавленого на водяній бані, і 1-2 краплі концентрованої соляної кислоти (НСl), оброблені зрізи наклеюють на предметне скло і забарвлюють галуновим гематоксиліном 15-20 хв. в термостаті при температурі 56 °C, промивають у воді, проводять через спирти, освітлюють в карбол-ксилолі, промивають в ксилолі і укладають під покривне скло. Технічний ефект винаходу, а саме підвищення якості способу забарвлення гістологічних препаратів нервової тканини шляхом позбавлення від осаду, який з'являється в препараті по периферії, обумовлений синергізмом заходів та засобів, які заявляються. Спосіб виконують наступним чином: Матеріал фіксують в 10-15 % формаліні і готують заморожені зрізи. Розміщують на 2-3 доби в мідно-сольовому розчині, який готують ex tempore наступним чином: 0,5 г сірчанокислої міді (CuSO4 5H2O) розчиняють в 100 мл дистильованої води, підігрівають на водяній бані до 50-55 °C, додають 4 мл фенолу, попередньо розплавленого на водяній бані, і 1-2 краплі концентрованої соляної кислоти (НСl). Оброблені зрізи наклеюють на предметне скло і забарвлюють галуновим гематоксиліном 15-20 хв. в термостаті при температурі 56 °C. Промивають у воді, проводять через спирти, освітлюють в карбол-ксилолі, промивають в ксилолі і укладають під покривне скло. Спосіб ілюструють наступні приклади: Приклад 1. Результат забарвлення зразку матеріалу головного мозку за способом прототипом: астроцитарна глія - чорна, фон - злегка жовтуватий. По периферії препарату помітний осад. Приклад 2. Результат забарвлення зразку матеріалу головного мозку за способом, що заявляється: на злегка жовтому фоні клітини макроглії рожево-бузкового кольору з цитоплазмою цілком зайнятої внутрішньоклітинними фібрилярними структурами, ядра чорні. Гангліонарні клітини ледь помітні. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб забарвлення гістологічних препаратів нервової тканини, який включає фіксування матеріалу, обробку в спеціальних розчинах та розміщення на склі, який відрізняється тим, що матеріал фіксують в 10-15 % формаліні, готують заморожені зрізи, які розміщують на 2-3 доби в мідно-сольовому розчині, який готують ex tempore наступним чином: 0,5 г сірчанокислої міді (CuSO4 5Н2О) розчиняють в 100 мл дистильованої води, підігрівають на водяній бані до 50-55 °С, додають 4 мл фенолу, попередньо розплавленого на водяній бані, і 1-2 краплі концентрованої соляної кислоти, оброблені зрізи наклеюють на предметне скло і забарвлюють галуновим гематоксиліном 15-20 хв. в термостаті при температурі 56 °С, промивають у воді, 2 UA 115821 C2 проводять через спирти, освітлюють в карбол-ксилолі, промивають в ксилолі і укладають під покривне скло. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3