Спосіб подолання генетичної системи протидії самозапиленню у видів культурної люцерни

Спосіб подолання генетичної системи протидії самозапиленню у видів культурної люцерни, що включає міжвидові насичуючі схрещування і самозапилення, які періодично повторюють, який відрізняється тим, що компонентами схрещувань вибирають культурні види люцерни, які поряд з господарсько-цінними ознаками об'єктом міжвидової інтрогресії - несуть зчеплені з ними багатогенні альтернативні маркери - колір пелюсток квітки (синій - жовтий), форму і розмір боба (серпоподібну - округлу з певним числом 3 раз. Сорт В є таким, що повторюється в схрещуваннях, чому і отримав назву рекурентний батько. Його частка в зародковій плазмі гібрида, як видно з рис.1, поступово збільшується і досягає 15/16 в поколінні третього насичення, а в поколінні насичення n частка компонента В складає n - 1 n Цей спосіб селекції - (прототип) набув широкого застосування у видів самозапильників злакових культур і кукурудзи, самозапилення у яких є облігатним або факультативним і високорезультативним. Є поодинокі випадки використання цього способу у перехреснозапильних культур. Так, наприклад, відомий один приклад використання цього способу у люцерни [Бриггс, Ноулз «Научные основы селекции растений». - Москва: «Колос», 1972. - С. 153-165]. В даному випадку здійснена одноразова передача ознаки стійкості до хвороб, яка має простий генетичний контроль, а важлива операція по самозапиленню гібридів була замінена близькоспорідненим схрещуванням, що, враховуючи складну генетичну організацію розщеплення інбредних нащадків у люцерни, потребувало проведення аналізу великого числа рослин і була дуже трудомісткою. Відомий спосіб насичуючих схрещувань (прототип) має численні і суттєві недоліки, які визначають серйозні вимоги до об'єкту селекції, які обмежують або унеможливлюють його застосування: 1. Донорна ознака повинна мати простий генетичний механізм контролю (контроль здіснюється одним геном), щоб в разі потреби шляхом самозапилення гібрида можна було би отримати гомозиготу донорної ознаки і визначити ступінь її прояву і функціонування. Якщо донорна ознака має складну генетичну природу, контроль здійснюється багатьма генами, то застосування способу дуже ускладнюється або унеможливлює отримання позитивного результату. 2. Рослинний організм виду, для якого ведеться застосування способу, повинен мати просту генетичну структуру - диплоїд з дисомічним типом кон'югації і розходження хромосом. 3. Рослина виду повинна бути самозапильником, щоб штучне схрещування могло легко чергуватися з результативним самозапиленням. Всі ці вимоги обмежують використання прототипу у люцерни, оскільки: її корисні ознаки, які бажано об'єднати, мають різновидові походження і складну полігенну природу (урожай кормової маси, урожай насіння, зимо- і морозостійкість, стійкість до інших незадовільних чинників середовища), рослини всіх культурних видів люцерни є тетраплоїдами (4n = 32, n = 8) з тетрасомічним типом розщеплення, що забезпечує складне розщеплення ознак, а гомозиготи появляються з надзвичайно низькою частотою і для їх виявлення потрібно вивчити велику чисельність рослин. До того ж види культурної люцерни є перехреснозапильними із строгою генетичною системою контролю 30229 4 (опозиційні гени SSSS), яка перешкоджає самозаплідненню. В основу корисної моделі поставлено задачу зняти названі недоліки у існуючого способу (прототипу) і розширити можливості застосування повторних схрещувань при міжвидовій гібридизації серед культурних видів роду люцерна. Поставлена задача у запропонованому способі вирішується таким чином: 1. У компонентів схрещування (донора і рекурентного батька), використовують альтернативні маркери багатогенної природи, які є у кожного виду і які зчеплені з багатьма селекційними ознаками, і легко розпізнаються візуально. Це дозволяє вести контроль передачі і розщеплення донорної ознаки не залежно від складності її генетичної організації, типу розмноження рослини. 2. Одному з компонентів схрещування надають додатково ознаку генетичне контрольованої самофертильності, яка функціонує в зародковій плазмі всіх трьох культурних видів люцерни як в гомозиготному (SfSfSS), так і гетерозиготному (SfSfSfSf) стані [Бобер А. Ф. дані не опубліковані]. Це дозволяє після кожного насичуючого схрещування отримувати чисельні інбредні нащадки і серед них виділити рекомбінантні генотипи потрібної генетичної структури. Запропонований спосіб селекції люцерни з використанням міжвидових насичуючих схрещувань (корисна модель) характеризується такими суттєвими ознаками (Фіг.2): 1. Компоненти схрещування, що належать до різних культурних видів люцерни, в даному випадку до люцерни серповидної (А) і люцерни посівної (В), є носіями різних селекційних ознак для міжвидової передачі, генетична структура яких має складну організацію. Використання різних видів люцерни як компонентів насичуючих схрещувань пропонується вперше. 2. Схрещування видів проводять штучно, а гібридні рослини самозапилюють і серед інбредних нащадків добирають такі, котрі мають ознаки двох видів в певному співвідношенні. 3. Рівень передачі ознак кожного компонента схрещування, характер їх розщеплення і обсяг накопичення в кожному поколінні гібрида визначають за генетичними маркерами, які притаманні кожному компоненту і мають багатогенну природу і, відповідно, належне зчеплення з генами цінних селекційних ознак. Маркери багатогенної природи для насичуючих схрещувань пропонуються вперше. 4. В якості генетичних маркерів використовують альтернативні ознаки кольору квітки: сині (СССС РРРР уууу) і жовті (СССС рррр УУУУ), що контролюються трьома генами [D. K.Bames. A system for visually classifying alfalfa flower color. Agricultural handbook, №424. Agricultural research service . U.S.Department of agriculture, 1972] та форми і довжини боба (серповидний або округлий з 3 оборотами спіралі, які контролюються, вірогідно, чотирма генами сумісної (адитивної) дії (неопубліковані дані Бобер 5 А. Ф. і інші). Наведені ознаки в якості маркерів насичуючих схрещувань пропонуються вперше. 5. Одному з компонентів схрещування надають ознаку генетично-контрольованої автогамії, що позволяє проводити результативне самозапилення рослин гібридних нащадків і аналізувати високу чисельність рослин інбредного покоління для виділення рідких рекомбінацій генів. Використання генетично-контрольваної автогамії (самосумісності) в насичуючих схрещуваннях пропонується вперше. 6. Ознаку автогамії беруть від донора Гермафродита 2, що є гомозиготою за геном автогамії (SfSfSfSf) і проявляється в зародковій плазмі всіх існуючих культурних видів люцерни як в гомозиготному, так і гетерозиготному стані. Донор автогамії люцерни створений вперше авторами запропонованого винаходу. Він належить до числа високоефективних, так як забезпечує зав'язування 80 відсотків при самозапиленні квіток. 7. Відібрані гібридні рослини, що є рекомбінантами очікуваної генетичної структури з врахуванням частки ознак компонента-донора, схрещують повторно з компонентом рекурентним батьком. 8. Число повторень насичуючих схрещувань визначають за генотипами маркерних ознак на першому етапі роботи винаходу і за показниками розвитку прямих селекційних ознак - на другому етапі роботи корисної моделі. За винятком ознаки, зазначеної в пунктах 2 і 7, всі інші (1, 3, 4, 5, 6, 8) є новими в запропонованому способі, або несуть окремі суттєві елементи новизни. Корисна модель здійснюється таким чином (Фіг.2): Спочатку ведеться робота по підготовці компонентів до схрещування. Три види культурної люцерни мають відомий перелік специфічних ознак і властивостей (селекційних ознак), які заслуговують на увагу бути використані в селекційній роботі. Зокрема, вид люцерна посівна має високий врожай кормової маси і задовільну насіннєву продуктивність, а два других види - люцерна серповидна і люцерна північна проявляють високу стійкість до незадовільних чинників довкілля (морозо- і зимостійкість, помірну стійкість до надлишкової вологості грунту, соле- і кислотостійкість). Селекційне використання цих видів як носіїв цінних ознак є беззаперечним. Люцерна посівна, яка може використовуватися як потенційний компонент схрещування має маркерні ознаки: синій колір квітки, округлий з трьома оборотами спіралі біб, а два інших види - альтернативні маркерні ознаки - жовтий колір квітки і серповидний біб, генетика яких наведена вище. Незалежна дія генів і тип розщеплення свідчать, що вони зосереджені не менше як у трьох із чотирьох хромосом в кожній з чотирьох груп зчеплення, які включають вісім хромосом. Тобто вони зчепленні з 37,5-50,0 відсотками генів зародкової плазми кожного виду, що забезпечує 30229 6 задовільні умови для функціонування вказаних ознак як маркерів. Синьоквітковому компоненту з округлим багатоспіральним бобом додатково надається ознака автогамії шляхом насичуючих схрещувань з донором Гермафродита-2, який є гомозиготою за Sf генами самофертильності, тобто має простий генетичний контроль, а наявність гена легко розпізнається тестуванням на плодоутворення при самозапиленні. Передача генів самофертильності потребує декілька циклів схрещувань і самозапилення гібридів та добору за ознаками самоплодовитості. Наслідком такої роботи, яка включала п'ять циклів насичення, є створений універсальний компонент . люцерни посівної, який несе три групи генів, що контролюють синій колір квітки, округлий з трьома оборотами спіралі біб, самоплодовитість. Цей компонент поєднує кращі ознаки продуктивності люцерни посівної, що є надбанням багаторазового насичення і відновлення більшості ознак реципієнта. Такий компонент отримав назву Гермафродита-3. Він може використовуватися для передачі багатьох генетичних ознак люцерни посівної. Варто зауважити, що коли не ставиться задача вилучення з компонента-донора певних незадовільних ознак, то лише ознаки автогамії можливо передати за один цикл насичення. Власне робота по здійсненню способу, що пропонується як винахід (Фіг.2), включає 5-7 циклів насичення. Кожен цикл включає три операції. Перша операція є схрещування двох видів компонентів: жовтоквіткового з серповидним бобом (донор) з синьоквітковим штучноствореним компонентом (Гермафродита-2, рекурентний батько). Наступні операції - це самозапилення гібридних рослин (F1) і добір жовтоквіткових з округлим бобом з 1-3 оборотами спіралі. Такі рослини повинні зустрічатися, виходячи з теоретичних розрахунків і приймаючи до уваги рівень успадкування цих ознак, з частотою 1/641/120, що підтвердилося в наших дослідах. Ознаки самофертильності у виділених рослин накопичуються автоматично при самозапиленні рослин нащадків. Генетична структура виділених гібридів за маркерними ознаками свідчить про те, що близько 50% генів одного і стільки ж другого видів буде знаходитись в зародковій плазмі гібридів. Виділені жовтоквіткові рослини повторно схрещують з синьоквітковим компонентом для посилення ознак люцерни посівної. Такі цикли операцій повторюють 5-7 разів. При цьому переслідується ціль передачі і гомозиготації генів контролю певних ознак від люцерни посівної (таких, наприклад, як високе плодоутворення) в зародкову плазму жовтоквіткового виду (наприклад, люцерни серповидній), що характеризується високою стійкістю до незадовільних умов дозвілля. В результаті отримують жовтоквіткові гібриди, які мають округлий біб з двома-трьома оборотами спіралі. Одночасно у гібридів зростає насіннєва продуктивність, яка досягає такого рівня, як у виду люцерна посівна. Загальний розвиток ознак, що передавали схрещуваннями від двох видів, і 7 рівень вирівнянності рослин гібридів слугують сигналом переходу до другого етапу у здійсненні винаходу. На другому етапі оцінки гібридів проводять за прямими селекційними ознаками. Як, наприклад, в даному випадку оцінка ведеться за ознаками продуктивності, зимо- і морозостійкості. На основі цих оцінок і доборів створюють новий сорт шляхом об'єднання кращих родин. Порівняльний аналіз винаходу з прототипом показав, що заявлений спосіб відрізняється новими суттєвими ознаками, які полягають у використанні вперше запропонованих багатогенних маркерів - кольору квітки, форми та довжини спіралі боба, які є у культурних видів люцерни і візуально легко ідентифікуються, та генів самофертильності. Це дозволяє при міжвидовій гібридизації передавати без будь-яких обмежень ознаки любої складності і досягати якісного відновлення їх функції в зародковій плазмі іншого виду. При цьому виконання робіт проходить з мінімальними затратами часу і матеріальних засобів. В загальнодоступних джерелах інформації відсутні відомості про використання багатогенних маркерів як таких і, зокрема, кольору квітки і форми та довжини боба, а також генів генетично контрольованої самофертильності, для міжвидової гібридизації у люцерни з метою ідентифікації гібридів і відновлення функцій генетичних структур в зародковій плазмі інших видів. Зроблена перша спроба застосування цього способу в селекції люцерни. Проведено насичуючі схрещування між відомим сортом люцерни серповидної -Павловська 7 (донор багаторічності і зимо-, морозостійкості) і зразком люцерни посівної Гермофродіта-2 (рекурентний батько). Трьохразове насичуюче схрещування і самозапилення гібридних нащадків з використанням контролю за передачею (інтрогресією) ознак і відновленням їх функції в зародковій плазмі гібридів за допомогою генетичних маркерів дало можливість виділити принципово нову форму люцерни, яка успішно поєднує ознаки двох видів: добрий розвиток кормової маси, задовільну насіннєву продуктивність, стійкість до незадовільних чинників довкілля люцерни серповидної. Опосередкованим доказом такого поєднання ознак є генетичні маркери -жовтий колір пелюсток квітки і округлий біб з трьома оборотами спіралі, які притаманні двом видам люцерни. Люцерна з таким поєднанням ознак в природі не зустрічається. Ця форма люцерни отримала назву Наречена Півночі і передана в державне сортовипробування, де буде випробовуватися, починаючи з 2006 року. 30229 8 9 30229 10