Спосіб отримання трансформованих рослин ріпаку методом агробактеріальної трансформації

1. Спосіб отримання трансформованих рослин ріпаку методом агробактеріальної трансформації, який включає одержання рослинних експлантів, нарізання їх на сегменти, кокультивування спочатку в нарощеній суспензії агробактерій, потім 3 39205 них рослин ріпаку методом агробактеріальної трансформації, в якому, шляхом заміни експлантів - гіпокотилів на листові експланти, досягається підвищення ефективності трансформації, тобто відношення числа трансгенних рослин до загальної кількості рослин, отриманих при трансформації з одночасним збільшенням генетичної однорідності клітинних популяцій. Крім того, запропонований спосіб виключає необхідність використання великої кількості насіння, яке необхідно стерилізувати перед постановкою кожного експерименту. Для вирішення завдання запропонований спосіб отримання трансформованих рослин ріпаку методом агробактеріальної трансформації, який включає одержання рослинних експлантів, нарізання їх на сегменти, кокультивування спочатку в нарощеній суспензії агробактерій, потім на агаризованому середовищі, відмивання експлантів, розміщення їх на селективному середовищі і отримання рослин-регенерантів, за яким, згідно з корисною моделлю, як рослинні експланти для трансформації використовують листові диски культивованих in vitro рослин ріпаку. Найбільш придатним для агробактеріальної трансформації є листя 3-4-тижневих рослин ріпаку. Для підготовки рослинної тканини до інфікування і для підвищення сприйнятливості рослинних тканин до агробактерії додатково проводять прекультивування експлантів на середовищі для калюсоутворення перед нарізанням їх на сегменти. До переваг даного способу можна віднести виключення необхідності стерилізації вихідного матеріалу перед постановкою кожного експерименту, можливість роботи з більш однорідною в генетичному відношенні популяцією клітин, ніж у разі використання гіпокотилів паростків та можливість використання малої кількості вихідного насіння в разі його обмеження, за рахунок розмноження і підтримання рослин ріпаку в умовах in vitro, висока ефективність трансформації (~70-85%). Конкретний приклад виконання способу Рослинний матеріал. Як вихідний матеріал для досліджень використовували насіння ярого ріпаку 4 (Brassica napus L. var. oleifera DC.) двох промислових сортів - Калинівській і ВНІС 100. Стерилізацію насіння проводили наступним чином: ситечко з насінням занурювали на 1хв. в 70% етанол, потім переносили в діацид на 20хв., а потім промивали 3 рази стерильною дистильованою водою і просушували на фільтрувальному папері. Асептичне насіння пророщували в термостаті при 24°С на безгормональному середовищі Мурашіге і Скуга [MS - Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures //Physiol. Plant. -1962. -15. -P.473-97] протягом 7 днів. Потім паростки висаджували на середовище MS и розмножували живцюванням. Agrobacterium tumefaciens-опосередкована трансформація ріпаку. Для агробактериальної трансформації В. napus використовували листя 34-тижневих рослин ріпаку, що вирощувались в асептичних умовах (температура 24°С, освітленість 4000-5000лк при 16/8 (світло/темрява) фотоперіоді). Листові диски насікали та розміщували на поверхні агаризованого середовища для калюсоутворення (середовище І, табл.1), яке було доповнене для підвищення сприйнятливості рослинних тканин до агробактерії 1г/л тіосульфату Na та витримували 4 доби в термостаті при 24°С. Надалі експланти нарізали на сегменти розміром 0,5´0,5см в суспензії агробактерії та кокультивували протягом 30 хвилин. Підсушив на фільтрувальному папері, експланти переносили на теж середовище і кокультивували ще дві доби в умовах термальної кімнати. Через 48 годин відмиті рідким середовищем ІІ і підсушені на фільтрувальному папері експланти переносили на агаризоване середовище ІІ для калюсоутворення (табл.1) з тіосульфатом срібла в концентрації 5мг/л та цефотаксимом у концентрації 500мг/л для елімінації агробактерії. Через тиждень культивування експлантів в умовах термостата (24°С) їх переносили на селективне середовище того ж складу з додаванням фосфінотрицину (РРТ) в концентрації 5мг/л, а також цефотаксиму та тіосульфату срібла в ти х же концентраціях. Таблиця 1 Склад живильних середовищ, використаних в експериментах з трансформації ріпаку Компоненти, мг/л 1 макросолі мікросолі Fe-хелат В1 В6 РР сахароза інозитол гідролізат казеїну 2,4-Д І 2 MS MS MS 10 1 1 30000 300 300 2 Середовище ІІ 3 MS MS MS 10 1 1 30000 300 300 2 ІІІ 4 MS MS MS 10 1 1 10000 100 5 39205 6 Продовження таблиці 1 1 НОК кінетин БАП АБК зеатин ГК тіосульфат Na МЕС агар рН 2 1 0,1 0,1 1000 950 8000 5,8 3 1 0,1 0,1 950 8000 5,8 4 1 2 1 1 1 950 8000 5,8 Примітка. MS - солі та Fe-хелат за Мурашіге і Скугом [Murashige Т., Skoog F. A re vised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures //Physiol. Plant. -1962. -15. -P.473-497]. Формування калюсу при цьому продовжувалося на розсіяному світлі протягом наступних 7-10 днів. Надалі відібрані зелені калюси культивували на середовищі для регенерації (середовище ІІІ, табл.1) з тими ж селективними агентами. Через 3 тижні сформовані пагони пересаджували на безгормональне середовище MS, доповнене 5мг/л РРТ, а калюси знову пересаджували на регенераційне середовище того ж складу. Отримані рослини вирощували на безгормональному агаризованому середовищі MS з 10мг/л РРТ. Формування коренів проходило в цих умовах без додаткової ініціації. Плазміди і бактеріальний штам. Для трансформації використовували плазміди рІСН 3744, рІСН 3737, рІСН 9414, що показані на кресленні. Окрім селективного гена неоміцинфосфотрансферази ІІ (nptІІ) вони містили кодуючу послідовність гена стійкості до фосфінотрицину (bar гена) і незалежний 35S промотор (35S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти), які були розміщені між двома інвертованими lох сайтами. Загальну схему конструкцій можна представити як RB-lох-bar-35S-lох-nptII -. Плазміди рІСН 3744 і рІСН 9414 містили додатковий lох А (lо хР) сайт, що знаходився в прямій орієнтації по відношенню до іншого lохА (lохР) сайту. Нічну культур у Agrobacterium tumefaciens (штам GV3101) нарощували в 20мл рідкого середовища LB [Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Мир. -1984. -521с.] доповненого 50мг/л карбеніциліну і 100мг/л рифампіцину, на шейкері (180об/хв.) протягом 24 годин при 24°С в темряві. Потім агробактеріальну суспензію розводили в 3 рази рідким середовищем II (табл.1) і інкубували за тих же умов протягом 3-4 годин. Отриману суспензію використовували для інфікування. Аналіз за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Інтеграцію чужорідних генів в рослинний геном визначали за допомогою ПЛР. Тотальну рослинну ДНК виділяли з листової тканини за методикою, запропонованою Cheung et al. [Cheung W.Y. et al. A simple and rapid DNA microextraction method for plant, animal and insect suitable for RAPD and other PCR analyses //PCR Meths Applies. -1993. -3. -P.69-70]. Для реакції використовували 40нг ДНК рослинного зразка, по 0,5мкМ відповідних праймерів, по 200мкМ кожного з трифосфатів, 1ед. Taq ДНК-полімерази, ПЛР реакційний буфер, який містив 50мМ КСl, 10мМ Tris-НСl (рН 9,0 при 25°С), 0,1% Triton X-100 і 2мМ MgCl2. Загальний об'єм суміші становив 20мкл. Для ідентифікації гена nptII використовували праймери 5'GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3' і 5'CAAGCTCTTC AGC A ATATC ACG-3', що ампліфікували фрагмент довжиною 622пн. Наявність в геномі регенерантів кодуючої послідовності гена bar підтверджували, використовуючи праймери 5'ATGAGCCCAGAACGACGCCGGCC-3' і 5'CAGATCTCGGTGACGGGC A GGAC-3', що давали фрагмент величиною 551пн. Ізольована ДНК з нетрансформованих рослин (негативний контроль) і 1нг плазмідного вектора рІСН 3744 (позитивний контроль) були ампліфіковані з тими ж праймерами і за тих же умов. Реакцію проводили в ампліфікаторі "Терцик ИМ02" (фірма "ДНК-технология", Москва). Використовували наступні профілі: для гена nptII–94°С-1хв., 35 циклів: 94°С-1 хв., 60°С1хв., 72°С-45сек., потім 4хв. при 72°С; для гена bar–94°С-1хв., 35 циклів: 94°С-1хв., 60°С-1хв., 72°С-30сек., потім 4хв. при 72°С. Фрагменти ДНК, отримані в результаті полімеразної ланцюгової реакції, аналізували за допомогою електрофорезу в 1,5%-ному агарозному гелі в трис-ацетатній буферній системі. Статистична обробка результатів. Частоту трансформації визначали як відношення числа отриманих трансформованих рослин до загальної кількості експлантів, ефективність трансформації розраховували як відношення числа трансгенних рослин до загальної кількості рослин, отриманих при трансформації. Результати. В результаті експериментів отримано 88 незалежних фосфінотрицинстійких ліній ріпаку двох промислових сортів (табл.2). 7 39205 8 Таблиця 2 Ефективність регенерації та трансформації листових експлантів ріпаку Сорт Калинівський ВНІС 100 ВНІС 100 Вектор Кількість, шт Частота трансстійких трансгенних формації, (%) експлантів регенерантів до РРТ* (ПЛР+) рІСН 3744 рІСН 3737 рІСН 9414 Ефективність трансформації, (%) 210 22 19 19 9 86,3 640 70 51 50 8 72,8 200 24 18 18 9 75,0 *РРТ - фосфінотрицин В якості експлантів використовували прекультивовані листові диски рослин ріпаку, вирощених в асептичних умовах. Початок регенерації спостерігався через 4-5 тижнів після початку експерименту в умовах селективного тиску фосфінотрицину (5мг/л). Ще через 7-14 діб стійкі пагони формувалися повністю. При перенесенні на безгормональне середовище вкорінення регенерантів відбувалося без додаткової індукції протягом подальших 2-3 тижнів. Розбіжності, що спостерігались у використаних сортів щодо ефективності регенерації і трансформації, були незначними (табл.2). Використання листових дисків культивованих in vitro рослин дозволило отримати трансформанти ріпаку з прийнятною частотою (~9%) і ефективністю (~70-85%) за досить короткий час (появу перших регенерантів спостерігали за 7-8 тижнів від початку експериментів, на отримання основної кількості вкорінених рослин потрібно було 3-3,5 місяці). Ефективність трансформації по прототипу складала 4,0-6,5%. До переваг даного підходу можна віднести виключення необхідності стерилізації вихідного матеріалу перед постановкою кожного експерименту, можливість роботи з більш однорідною в генетичному відношенні популяцією клітин, ніж у разі використання гіпокотилів паростків та можливість використання малої кількості вихідного насіння в разі його обмеження. Одним з визначальних моментів в проведенні експериментів ми вважаємо прекультивування листових експлантів на середовищі для калюсоутворення, що призводить до підготовки рослинної тканини до інфікування і, в той же час, дозволяє їй легше пережити обробку агробактерією. Як показали наші попередні дослідження, використання листових дисків без прекультивування або прекультивування їх протягом 1-2 діб було неефективним і приводило до практично повної загибелі рослинних тканин. Прекультивування експлантів давало позитивні результати і в експериментах Mukhopadhyay et al. [Mukhopadhyay N. et al. Agrobacterium mediated genetic transformation of oilseed Brassica campestris: transformation frequency is strongly influenced by the mode of shoot regeneration //Plant Cell Reports. 1991. -Vol.11. -P.506-513]. В деяких роботах [Ралдугина Г.Н. и др. Стабильность и наследование трансгенов в растениях рапса //Физиология растений. -2000. -47, №3. -С.437-445] вказують на недоцільність такого кроку, відзначаючи, що хоча і посилюється утворення калюсу на експлантах, але повністю інгібується морфогенез. Можливо, така ситуація характерна тільки для певного виду експлантів (були використані міжвузля 6-8-тижневих рослин ріпаку з асептичної культури), або на кінцевий результат вплинуло і вирощування самих вихідних рослин на гормональному середовищі. Наявність гена bar в регенерованих лініях підтверджена за допомогою ПЛР аналізів. Листові диски отриманих рослин тестувалися на стійкість до канаміцину (100мг/л в середовищі для калюсоутворення). Результати тестування корелювали з результатами ПЛР. В ході експериментів отримано 116 рослинрегенерантів, з них - 88 фосфінотрицинстійких ліній. Таким чином, нами розроблена схема агробактеріальної трансформації ріпаку з використанням листових експлантів культивованих in vitro рослин. 9 Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко 39205 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601