Спосіб імуносупресивної терапії у посттрансплантаційному періоді

Спосіб імуносупресивної терапії у посттрансплантаційному періоді, який включає введення імуносупресивних препаратів з визначенням напрямку взаємодії між ними, який відрізняється тим, що комбінацію доз імуносупресивних ЛІКІВ вводять з урахуванням коефіцієнта співвідношення їх дії,і, якщо його величина більше 1,0, визначають їх синергізм, менше 1,0 - антагонізм та дорівнює 1,0 - адитивність впливу імуносупресивної терапії реципієнтів з алогенною ниркою Винахід відноситься до медицини, а саме до експериментальної трансплантаційної імунологи і може бути використаний в оптимізацм імуносупресивної терапії Синергічне сполучення лікарських препаратів може бути самим ефективним способом досягнення імуносупресм, достатньої для керування імуноадаптацією реципієнтів у посттрансплантаційному періоді Окремі препарати, які використовують в імуносупресивній стратегії на теперішній час, часто виявляють токсичні побічні ефекти при введенні в терапевтичних концентраціях Відомий спосіб визначення синергізму, як напрямку взаємодії імуносупресивних препаратів [1], який включає аналіз взаємодії "доза-реакція" для кожного окремого препарату та фіксованих співвідношеннях сполучень цих ЛІКІВ Недоліком цього способу є труднощі у підборі синергічних сполучень препаратів, при використанні трьох та більш компонентної імуносупресивної терапії, в індивідуальних субтерапевтичних дозах, які дозволять знизити токсичність кожного з них, а також в їх обробці Відомий також спосіб медіанного ефекту взаємодії ЛІКІВ [2] що взятий нами за прототип, який полягає у введенні імуносупресивних препаратів циклоспорина А з рапамицином і бреквшаром та визначенням КІЛЬКІСНОГО співвідношення їх доз Недоліком способу с те, що при призначенні кожного набору препаратів кількісне співвідношення іх треба коректувати, що призводить до труднощів аналізу отриманих результатів та їх засто сування в КЛІНІЧНІЙ трансплантологи В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу імуносупресивної терапії у посттрансплантаційному періоді шляхом введення імуносупресивних ЛІКІВ з визначенням напрямку їх взаємодії, що дозволить спрощувати аналіз отриманих результатів та оптимізувати схему призначення ЛІКІВ Поставлена задача вирішується тим, що спосіб імуносупресивної терапії у посттрансплантаційному періоді, який включає введення імуносупресивних препаратів з визначенням напрямку взаємодії між ними, згідно з винаходом, комбінацію доз імуносупресивних ЛІКІВ вводять з урахуванням коефіцієнта співвідношення їх дії і при його величині більше ()1,0 - антагонізм та дорівнює (=)1,0 - адитивність впливу імуносупресивної терапії реципієнтів з алогенною ниркою Розпізнавання лімфоцитами антигенів і обмін сигналами з іншими клітинами імунної системи є умовами прояву активації лімфоцитів - процесу, на якому базуються практично усі імунологічні реакції, прояви імунної ВІДПОВІДІ Передумовою виконання функцій лімфоцитами завжди служить їх проліферація Спосіб імуносупресивної терапії у посттрансплантаційному періоді проводять на підставі аналізу результатів експериметальних досліджень ступеня імуносупресивної дії препаратів на лімфоцити периферичної крові здорових людей (15 студентів-волонтерів) in vitro з урахуванням їх CO го Ю 51133 проліферативної ВІДПОВІДІ мітоген - фітогемаглютинин (ФГА) При цьому досліджують вплив стандартних розчинів кожного препарату окремо, а потім визначають дозу кожного препарату, при якій досягалася 50% шпбіція Спочатку два препарати змішують in vitro в пропорції їх рівної сили впливу, а потім - у мінливих пропорціях, щоб одержати співвідношення, що дає найбільш синергічне сполучення Взаємодію двох препаратів визначають коефіцієнтом сполучення (КС) за ВІДПОВІДНОЮ формулою Спосіб імуносупресивної терапії у посттрансплантаційному періоді виконують наступним чином 1 Розведення стандартних розчинів імуносупрессивних препаратів Базовими імуносупресивними препаратами є сандимун-неорал ("Sandimmun-Neoral", Novartis Phanna AG, Switzerland циклоспорин А, у капсулах по 100мг) і дексаметазон ("Dexamethazone" KRKA, Slovenia - Dexa, препарат у розчині по 1мл, який містить 4мг дексаметазону фосфату у вигляді натрієвої солі) Сандимун-неорал є базовим препаратом у сучасних протоколах імуносупресивної клінічної транспланталогм, а дексаметазон - препарат кортикостероїдного ряду, який використовується для посилення дії першого Комбіноване використання цих двох препаратів дозволяє призначати їх у меншій дозі з одержанням того ж самого імуносупресивного ефекту Для приготування стандартних розчинів сандимуну-неоралу за розчинник використовують суміш етанолу і твіну 80 у процентному співвідношенні 80 20 Розчиняють капсулу ЮОмг сандимуну-неоралу в 1мл вказаної суміші і одержують концентрацію препарату 100мг/мл Наступні концентрації 50мг/мл, 25мг/мл, 12,5мг/мл, 6,25мг/мл, 3,125мг/мл і 1,56мг/мл, одержують шляхом розведення живильним середовищем RPMI-1640 Концентрації дексаметазону 4мг/мл, 2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл, 0,25мг/мл і 0,125мг/мл одержують також розведенням живильного середовища RPMI-1640 Робочі розчини препаратів зберігають у холодильнику у флаконах зі щільно притертою кришкою 2 Виділення лімфоцитів з гепаринізованої венозної крові у здорової людини забирають Юмл венозної крові в скляну силіконовану пробірку, розводять середовищем 199 у співвідношенні 1 2 і нашаровують на 5 - 7мл розчину фікола (р=1078) в З центрифугальних пробірки та центрифугують протягом 20 хвилин при швидкості 2000об/хв Відбирають лімфоцітарний шар у штерфазі й обробляють 0,83% розчином NH4CI протягом 10 хвилин для повного лізису еритроцитів Потім КЛІТИНИ ДВІЧІ відмивають середовищем 199 Одержаний лімфоцитарний осад розводять комплексним живильним середовищем RPMI-1640, до складу якого входить 10% шактивованої телячої ембріональної сироватки, 2мМ L-глютамша, 40мкг/мл гентаміцината 5 10 5 М 2-меркапто-этанола Концентрація суміші лімфоцитів повинна складати 3 106/мл 3 Активація лімфоцитів in vitro Для вимірювання клітинної проліферації використовують колориметричний метод, заснований на здатності мітохондріальних ферментів живих клітин відновлювати тетразолієву сіль ММТ до ММТ формазану Тільки живі клітини відновлюють жовтий ММТ - субстрат у темно-синій формазан Ані мертві клітини, ні середовище для культивування клітин такої здатності не мають КІЛЬКІСТЬ життєздатних клітин прямо пропорційна КІЛЬКОСТІ відновленого формазану, яку визначають фотометричне після розчинення в органічному розчиннику У плоскодонні планшети розкопують по 50мкл робочих розчинів препаратів (для кожного препарату своя планшета) піпетковим дозатором, потім вносять в кожну лунку по 50мкл лімфоцитарної зависі в концентрації 3106/мл і далі додають 50мкл ФГА ("Difco") у дозі 10мкг/мл Контрольна лунка містить 50мкл лімфоцитарної зависі, 50мкл ФГА у концентраціях вказаних вище, і 50мкл комплексного живильного середовища RPMI-1640 Усі лунки розкопують в 3 паралелях Крім того, розкопують контрольний ряд (також у 3 паралелях), який містить по 50мкл робочих розчинів препарату, 50мкл лімфоцитарної зависі і 50мкл комплексного живильного середовища RPMI Культивація триває 72 години при Т=37°С з 5% ССЬ в атмосфері По закінченні інкубації додають по 20мкл розчину ММТ (тетразолієва сіль), який готують на фосфатному буфері у концентрації 5мг/мл і зберігають при Т=4°С у темному посуді не більше ніж 2 тижні До використання цей розчин фільтрують через фільтри з діаметром пор 0,22мкм для видалення нерозчинного осаду Інкубація триває ще 4 години, після чого планшети центрифугують 15 хвилин при швидкості V=1000O6/XB 3 лунок видаляють супернатант й додають 150мкл диметилсульфоксиду (ДМСО) Для кращого розчинення формазану планшети 10 хвилин струшують на шейкері Після ЧОГО В КОЖНІЙ лунці вимірюють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ на вертикальному фотометрі "Stat Fax 303" (США), при довжині хвилі 550нм % інгібування оцінюють за формулою ОЩд 100%, де % інгібування ОШк - оптична ЩІЛЬНІСТЬ у лунках з препаратом (ДОСЛІД), ОЩк - оптична ЩІЛЬНІСТЬ у лунках без препарата (контроль) Для оцінки дії двох ЛІКІВ сандимуну-неоралу і дексаметазону, які відображають ступінь інпбіцм проліферативної ВІДПОВІДІ лімфоцитів здорових людей у присутності різних доз цих препаратів, аналізують ті дози, які окремо дають однаковий ефект дії, а потім у різних пропорціях по всьому діапазону доз Взаємодію двох препаратів оцінювали коефіцієнтом сполучення КСх сполучені тічьки сполучені тільки сполучені Дії Дг - це дози препаратів 1 і 2, необхідні у суміші, щоб робити дію х (це рівень інпбі 51133 5 ції), а тільки Д і і Дг - це дози тих самих препаратів ВІДПОВІДНО, необхідні для такої ж дії х, якщо їх використовувати окремо (не у суміші) Величини КС1,0 - антагонізм взаємодії Винахід пояснюється ілюстративними матеріалами На фіг 1 представлений графік "доза-ефект" дії Сандимуну-неоралу на проліферативну ВІДПОВІДЬ лімфоцитів студентів-волонтерів in vitro На фіг 2 - графік "доза-ефект" дії дексаметазону на проліферативну ВІДПОВІДЬ лімфоцитів студентів-волонтерів in vitro Наводимо приклади застосування способу імуносупресивної терапії у посттрансплантаційному періоді в умовах in vitro на лімфоцитах студентів-волонтерів 1, 2, З Приклад 1 Лімфоцити студента-волонтера 1 Дексаметазон у дозі 4мг/мл справляє інгібуючий ефект на проліферативну ВІДПОВІДЬ лімфоцитів у діапазоні 94 - 97% (фіг 2), а сандимун-неорал у дозі 100мг/мл призводить до інпбіцм проліферативної ВІДПОВІДІ в діапазоні 93 - 100% (фиг 1) Подібний ефект інпбіцм - 90 - 100% відмічений при дії колишньої дози дексаметазону, а сандимунунеоралу зменшеної ВДВІЧІ, тобто 4мг/мл і 50мг/мл Ці ДОЗИ використовують у суміші для одночасної дії на лімфоцити волонтерів У цьому випадку рівень інпбіцм проліферативної ВІДПОВІДІ становить 9 1 % При розрахунку коефіцієнт сполучення відобразив антагонізм взаємодії 4мг/мл дексаметазону і 50мг/мл сандимуну-неоралу 4 мг/мл + С-н KCx-Dexa 4 мг/мл 50 мг/мл = L0 + 0.5-- 1.5, де 100 мг/мл х - рівень інпбіцм складає 9 1 % Приклад 2 Лімфоцити студента-волонтера 2 Доза дексаметазону 4мг/мл і доза сандимунунеоралу - 100мг/мл дає найбільше виражений ефект інпбіцм, ВІДПОВІДНО 94 - 97% і 93 - 1 0 0 % При використанні зменшених удвічі доз цих препаратів рівень інпбіцм становить 90%, що розцінюють як ефект рівної сили дм при використанні препаратів по одному Коефіцієнт сполучення становив 2 мг/мл 50 мг/мл Dexa+ С-и • -0.5 + 0 . 5 - 1.0. 4 мг/мл 100 мг/мл що відображає адитивний ефект взаємодії Приклад 3 Лімфоцити студента-волонтера З При зменшенні дози сандимуну-неоралу до 12,5мг/мл, а дексаметазон залишити без змін 2мг/мл KVx 51133 100% % інпбіціі волонтер 1 волонтер 2 волонтер З 1,56 З ,Ї 25 6,25 12,5 25 50 Дози Сандимуиу-нсорал> ФІГ. і її- ,н,-№.т>,АШщ*itf-M U 100 51133 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 10