Спосіб оцінки запліднювальної здатності сперми

1 Спосіб оцінки запліднювальної здатності сперми шляхом визначення рухливості і середньої швидкості сперміїв в вимірювальній камері при опроміненні їх когерентним світлом та реєстрації фотодетектором флуктуацій інтенсивності розсіяного на сперміях випромінювання з наступною побудовою кореляційної функції фотоструму, який відрізняється тим, що в зоні досліджень додатково визначають із кореляційної функції питомі енерговитрати сперміїв на рух (енергію сперміїв) за формулою E=V2*ii*G(o) де Е - енергія сперміїв, ум од , V - середня швидкість руху сперміїв, мкм/с, ті - рухливість сперміїв, бал , G(o) - значення кореляційної функції при часі затримки, що дорівнює нулю, пропорційне КІЛЬКОСТІ сперміїв в зоні спостереження, ум од , після чого, через дві години термостатування сперми при 38°С, енергію сперміїв визначають повторно, а потім обчислюють «терморезистентний тест енергії сперміїв» за формулою ТРТ2е=Ео+2Е2, де ТРТ2е -терморезистентний тест енергії сперміїв, ум од , Ео - початкова енергія сперміїв, ум од , Е.2 - енергія сперміїв через дві години, ум од , 2 - проміжок часу між дослідженнями, год , при значенні якого менше 37 якість сперми визначають як низьку при запліднювальній здатності менше 55%, при значенні 37-45 - як знижену при запліднювальній здатності 55-65%, при значенні 46-55 - як середню при запліднювальній здатності 66-75%, а при значенні більше 55 - як високу при запліднювальній здатності більше 75% О О> 1 СО Ю Винахід відноситься до штучного осіменшня сільськогосподарських тварин, а саме до об'єктивних способів оцінки якості сперми і може бути широко використаний на племпідприємствах Основним критерієм визначення якості сперми є запліднювальна здатність сперміїв, що обумовлено їх основною біологічною властивістю Запліднювальну здатність сперми визначають як прямим способом - за результатами осіменшня самиць, так і непрямим - лабораторними дослідженнями сперми за показниками, що пов'язані з цією біологічною властивістю Суттєвим недоліком оцінки запліднювальної здатності прямим способом є те, що вона трудомістка, довготривала і не завжди об'єктивна, оскільки запліднюваність самиць залежить не тільки від якості сперми, але в значній мірі, від фізіологічного стану самки, обумовленого впливом ЗОВНІШНІХ І внутрішніх факторів, а також від дотримання вимог штучного осіменшня ВІДОМІ інструментальні способи оцінки якості сперми полярографічний [1], фотограмметричний [2], ультразвукової цитолізометрм [3], прямої лазерної спектроскопії [4], з використанням сучасної комп'ютерної обробки даних [5] Це об'єктивні методи досліджень сперми, але жоден з них не має достатньо високого кореляційного зв'язку із запліднювальною здатністю сперми ВІДОМІ лабораторні способи оцінки запліднювальної здатності сперми, наприклад, за активністю ферментів - амінотрансфераз [6], палуронідази [7], сукцинатдепдрогенази [8], за станом акросо 53719 мальних мембран [9] або за результатами запліднення in vitro [10] Вони мають досить високі кореляції з запліднювальною здатністю сперми (+0,5 +0,9), але у зв'язку з тривалістю та складністю вимірювань можуть використовуватись лише як ДОПОМІЖНІ Найбільш близьким по технічній суті до способу, що заявляється, є спосіб оцінки якості сперми за рухливістю і швидкістю руху сперміїв, які визначаються з використанням кореляційної допплерівської спектроскопії [11] Відомий спосіб полягає в тому, що розбавлений зразок сперми поміщають в термостатовану вимірювальну камеру і опромінюють когерентним світлом (променем лазера при довжині хвилі бЗЗнц), який розсіюється на рухливих сперміях і має допплерівський зсув за частотою Флуктуації інтенсивності розсіяного на сперміях випромінювання реєструються фотодетектором і за його кореляційною функцією визначається рухливість сперміїв (доля сперміїв з прямолінійно поступальним рухом) і їх середня швидкість руху, по яким і оцінюють якість сперми Суттєвим недоліком відомого способу є те, що він не може бути універсальним критерієм оцінки запліднювальної здатності сперми Запліднювальна здатність сперми є інтегральним показником Вона обумовлена комплексом рухових факторів клітин, станом їх мембранного апарату, рівнем обмінних процесів Рухливість і швидкість сперміїв - це лише рухові показники сперми Дуже часто, особливо у сперміїв після крюконсервацм, рухові показники залишаються високими, але клітини мають порушену акросомальну мембрану Це можуть бути незначні пошкодження мембранних структур сперміїв, які проявляються лише через деякий час після розморожування сперми в результаті обмінних процесів, прискореного перекисного окислення ЛІПІДІВ цих мембран Запліднювальна здатність такої сперми буде незначна, хоч показники рухливості і швидкості сперміїв, оцінені відомим способом відразу після її розморожування, будуть високими Отже, для оцінки такого інтегрального показника, як запліднювальна здатність повинні використовуватись комплексні тести, що відображали б як рухові показники, так і стан мембранних структур Вони повинні мати високий рівень кореляції із запліднювальною здатністю сперми В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб оцінки запліднювальної здатності сперми на основі визначення комплексного тесту, що відображає як рухові фактори сперміїв, так і рівень їх обмінних процесів і відповідає фактичній заплідненості самок від осіменіння цією спермою з високим рівнем достовірності Поставлена задача вирішується тим, що оцінка запліднювальної здатності сперми проводиться за "терморезистентним тестом енергії сперміїв" (ТРТге), що є сумарним показником зміни енергії сперміїв за 2 години іхтермостатування при 38°С Енергія сперміїв - новий комплексний показник сперми, що характеризує здатність сперміїв забезпечити їх доставку до яйцеклітини і чисельно залежить від маси рухливих клітин та швидкості їх руху Він більш інформативний порівняно як з характеристикою рухливості, так і швидкості клітин, тому що по суті є результуючою величиною цих 2 показників і відображує властивість популяції клітин до енергообміну з навколишнім середовищем Ця властивість є проявленням життєво важливих процесів клітин, які залежать від рівня їх метаболізму Показник зміни енергії сперміїв за 2 години їх функціонування свідчить про зміну чи стабільність їх обмінних процесів, які в свою чергу обумовлені станом мембранних структур Отже "терморезистентний тест енергії сперміїв" - це комплексний показник рухових факторів клітин, рівня обмінних процесів та стану мембранних структур популяції КЛІТИН, ЯКІ ОЦІНЮЮТЬСЯ Спосіб здійснюється наступним чином Зразок попередньо розбавленої сперми в термостатованій камері опромінюють когерентним світлом при довжині хвилі бЗЗнц Розсіяне на рухливих сперміях випромшення має допплерівський зсув за частотою, що реєструється фотоприймачем і передається на корелятор, а потім на комп'ютер За кореляційною функцією розсіяного світла, яка має інформацію про КІЛЬКІСТЬ рухливих сперміїв, їх швидкість та загальну КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН В ЗОНІ спо стереження, проводиться комп'ютерна обробка і обчислення енергії сперміїв за формулою Е = V2 х л х G(o), [1] де Е - енергія сперміїв, ум од , V - середня швидкість руху сперміїв, бали, ті - рухливість сперміїв, бали, G(o) - значення кореляційної функції при часі затримки, що дорівнює нулю, пропорційної КІЛЬКОСТІ сперміїв в зоні спостереження, ум од Одночасно з вимірюванням другий зразок сперми поміщають у водяний термостат при t° = 38°С на 2 години Рівно через 2 години проводять повторне вимірювання енергії сперміїв, аналогічне попередньому (Ег) На основі одержаних даних обчислюють "терморезистентний тест енергії" за формулою ТРТ2е = Ео + 2Е2, [2] де ТРТге - терморезистентний тест енергії сперміїв, ум од , Ео - початкова енергія сперміїв, ум од , Ег - енергія сперміїв через 2 години, ум од , 2 - проміжок часу між дослідженнями, год Запліднювальну здатність сперми знаходять за спеціально розрахованими критеріями Наприклад, для заморожено-відтаяної сперми бугаїв запліднювальну здатність знаходять за критеріями, представленими в таблиці 1 Таблиця 1 Запліднювальна Терморезистентний здатність замоЯкість тест енергії сперміїв, рожено-відтаяної сперми ум одиниць сперми бугаїв, % Низька 75 Приклади конкретного виконання Дослідження проводили на замороженовідтаяній спермі бугаїв, що належать Київському і 53719 Полтавському племпідприємствам Для досліджень відібрали по 100 спермодоз 30-ти серій крюконсервованої сперми 15 бугаїв Для оцінки запліднювальної здатності сперми запропонованим способом від кожної серії розморозили по 2 спермодози в 2,9% розчині натрію лимоннокислого п'ятиводного Відразу після розморожування відібрали зразок для початкової оцінки, а розморожену сперму поставили у водяний термостат при 38°С на 2 години Відібраний зразок сперми в кюветі розбавляли 2,9% розчином натрію лимоннокислого п'ятиводного у відношенні 1 1, поміщали в термостатовану камеру і опромінювали лазерним випромінюванням (бЗЗнц) протягом З хвилин для прогрівання проб і адаптації до опромінення Через 3 хвилини проводилиоцінку розсіяне на рухливих сперміях світло попадає на фотоприймач, де посилюється і передається на корелятор Обробку кореляційної функції розсіяного світла і ВІДПОВІДНІ обчислення (див формула 1) проводяться комп'ютером Результати оцінки енергії сперміїв одержували на дисплеї та у віддрукованому на принтері вигляді Через 2 години аналогічним способом проводили повторне вимірювання енергії сперми, яка знаходилась в термостаті при 38°С Всього на оцінку запліднювальної здатності сперми ЗО серій було витрачено 4 години За одержаними даними по кожній із ЗО серій сперми обчислювали "терморезистентний тест енергії сперміїв" (див формула 2), а потім згідно таблиці 1 знаходили їх теоретичну запліднювальну здатність Паралельно проводили оцінку якості сперми за відомим методом Оцінку проводили на цій же установці, але реєстрували дані рухливість роз морожених сперміїв за 10-бальною шкалою та швидкість їх руху в мкм/с ЗО серій попередньо оціненої сперми розвезли у 15 господарств з таким розрахунком, щоб в кожному господарстві була сперма двох серій, які б відрізнялися за запліднювальною здатністю Фактичну запліднювальну здатність цих серій сперми визначали в господарствах прямим способом - за заплідненістю телиць після їх штучного осіменшня в першу охоту Для досліджень відбирали виключно телиць без гінекологічних захворювань (щоб виключити вплив самиць на результати досліджень) Облік запліднюваності телиць проводили через 3 МІСЯЦІ після їх осіменшня за результатами ректальних досліджень і відсутності перегулів Всього на розвезення ЗО серій сперми по господарствах, проведення осіменшня 1000 телиць і облік їх заплідненості було витрачено 6 МІСЯЦІВ Результати порівняльної оцінки приведені по кожній серії сперми окремо в таблиці № 2 Дані табл 2 свідчать про те, що теоретична запліднювальна здатність, розрахована за "терморезистентним тестом енергії сперміїв", в основному відповідає фактичній В 23 серіях сперми вона була встановлена точно, а в 6 випадках теоретичні дані були близькими до фактичних (наприклад, при прогнозуванні заплідненості 65 - 75% було одержано фактично 77,1%, 76%, 75,9%) І лише в одному випадку із тридцяти, у серії № 12 (бугая Мусон) розбіжність становила більше 10% Для порівняння ступеню ВІДПОВІДНОСТІ фактичної заплідненості телиць теоретичній запліднювальній здатності сперми, за одержаними даними розраховували критерій ВІДПОВІДНОСТІ хі-квадрат [12] Результати обчислення (%2 = 2,76) підтвердили високу достовірність (р > 0,99) Таблиця 2 № Кличка бугая серії 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Майкоп Майкоп Жульен Жульен Жульен Мілорд Мілорд Марсель Марсель Мусон Мусон Мусон Марал Форд Сонет Сонет Марсель Марсель Відомий Рухливість, бали Швидкість, мкм/с 5,8 7,2 4,3 6,3 5,22 4,8 5,54 6,19 6,38 6,58 6,39 7,48 7,1 4,72 5,83 5,63 5,69 5,1 55,5 63 56,4 58,9 56,4 53,1 53,3 56,4 59,7 59,5 62 65,3 58,8 47,6 55 52,5 47,7 43,4 Способи оцінки сперми Запропонований Енергія Теоретична запліднювальна ТРТ2е здатність сперЕо Е2 ми, % 24,6 9,51 43,6 55-65 39,5 14,1 67,7 >75 19,0 5,87 30,7 75 22,9 12,1 47,1 65-75 20,5 7,5 35,5 75 24,4 8,53 41,5 55-65 21,4 8,25 37,9 75 21,7 10,2 42,1 55-65 34,1 8,34 50,8 65-75 44,9 18,9 82,7 >75 38,3 15,2 68,7 >75 Базовий Фактична заплідненість телиць, % 62,3* 70,2* 75,9 56,8* 70,3 72,7* 82,7* 75,7* 63,3* 75,0* 80,8* 89,5* *) фактична заплідненість телиць повністю відповідає теоретичній запліднювальній здатності сперми ВІДПОВІДНОСТІ цих даних і підтвердили, що одержані розбіжності носять випадковий характер Коефіцієнт кореляції "терморезистентного тесту енергії сперміїв" з фактичною заплідненістю телиць становив г = +0,768 ± 0,121 За результатами оцінки сперми відомим способом розрахувати теоретичну запліднювальну здатність неможливо, тому що ВІДПОВІДНІСТЬ ЦИХ даних низька У багатьох випадках сперма з високою запліднювальною здатністю має низькі значення рухливості або швидкості і навпаки Тобто оцінка сперми відомим способом може свідчити про приблизну її якість, але не запліднювальну здатність Таким чином, одержані дані підтверджують, що "терморезистентний тест енергії сперміїв" - це комплексний і об'єктивний показник якості сперми, має високий кореляційний зв'язок з фактичною заплідненістю самиць і може бути використаний для лабораторної оцінки запліднювальної здатності сперми з високим рівнем достовірності Запропонований метод оцінки запліднювальної здатності сперми значно швидший і дешевший, ніж оцінка базовим методом Тому він може мати велике значення для підвищення ефективності штучного осіменіння, оцінки бугаїв за їх відтворювальною здатністю, для розробки успішних методів збереження сперми Список використаних джерел 1 Шапиев И Ш , Мороз Л Г Полярографический метод оценки спермы хряков // Бюл ВНИИ разведения и генетики с-х животных — 1980 — 50 — С 4 - 5 2 Laszczka A , Wierzchos E Wideomikrografia komputerowa - system CVM і Cellsoft - nowoczesna metoda oceny ruchhwosci plemmkow // Przegl Hodown —1989 — 57, 8 — P 15-17 3 Акопян Б В , Мирзоев Э В , Рыбакова А А Определение качества спермы методом ультразвуковой цитолизометрии // Докл ВАСХНИЛ — 1991 — 4 , — С 53-55 4 Авторское свидетельство СССР № 974270, кл А 61 Д 19/02, G 01 N 33/48, публ 15 11 82, Бюлл № 42 5 Anzar V , Hassan V V , Graham E F, Deyo R С M, Singh G Efficacy of the Hammilton thorn motihty analyzer (HTM-2030) for the evaluation of bovine semen//Thenogenology —1991 — 36, 2 — P 307 -317 6 Авторское свидетельство СССР № 1782566 A1, кл А 61 Д 19/02, публ 23 12 92, Бюлл № 47 7 Еврев Т, Станиславов Р Радиалнодиффузионен тест за определяне на спермалната хиалуронидаза // Biol Immunol reproduct, — 1979, София — С 3 2 - 3 5 8 Зверева Г В , Чухрий Б Н , Клевец Л А Сукцинатдегидрогеназная активность спермы быков и качество спермиев // С -х Биология — 1989 — 6 — С 30-34 9 Овайдис Р Н Абилов А И , Соколовская И И Морфология гамет самцов с -х животных как критерий биологической полноценности // Морфологические исследования практического здравоохранения и животноводства — 1984 — М — С 144-147 10 Graham J К , Foote R Н Dilauroylphosphatidylcholme Liposome Effect on the to Acrosome Reaction and in Vitro Penetration of Zona-Free Hamster Eggs by Bull Sperm // Gamete Research — 1987 — 2 — P 147-158 11 Патент України № 13369 C1 A61 Д 19/02, опубл 28 02 97 Бюл № 1 12 Рокицкий ПФ Основы вариационной статистики для биологов — Минск — 1961 —220 с 53719 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24 10