Спосіб стимуляції цвітіння буряків в культурі in vitro

Спосіб стимуляції цвітіння мікророслин буряків in vitro, що включає вирощування розсади, яровизацію рослин в холодильній камері не менше 5060 діб за температури повітря - 4-13 °С, освітлення люмінісцентними лампами, перенесення в бокс з температурою повітря 15-20 °С та додатковим освітленням 12 годин на добу, який відрізняється тим, що цвітіння мікроклонів стимулюють в умовах in vitro, мікророслини яровизують на модифікованому агаризованому середовищі Гамборга або Мурасіге-Скуга, до складу якого додають 1-10 мг/л тіаміну, 1 мг/л піридоксину, 1 мг/л нікотинової кис 3 Відомий і пропонований способи мають спільні суттєві ознаки, а саме - включення гіберелової кислоти в агаризоване живильне середовище для подовження пагонів, але відомий спосіб не забезпечує утворення стебла у мікроклонів, а тільки регенерацію бруньок та незначне подовження пагонів при використанні 0,1 мг/л гіберелової кислоти. При підвищенні концентрації цього гормону спостерігається негативне явище - хлороз мікророслин. Тоді як у пропонованому способі використання гіберелової кислоти у підвищених концентраціях сприяє утворенню стебла, тому що використовується після яровизації мікророслин, яка є стимулом утворення стебла. Відомо використання аскорбінової кислоти для стимуляції органогенної здатності експлантів та розвитку пазушних бруньок цукрових буряків в умовах in vitro [Ильенко И.И. Микроклональное размножение и сохранение селекционного материала сахарной свеклы в культуре in vitro // Физиология и биохимия культурных растений. - 1983. Т.15. - №4. - C.351-355], а в запропонованому способі аскорбінова кислота використовується у складі живильного середовища разом з гіберелінами для стимуляції утворення стебла. Відомий спосіб збереження мікророслин буряків в умовах in vitro [Патент №16702 від 15.08 2006 "Спосіб довготривалого збереження буряків в умовах in vitro"], в якому збереження мікророслин проводять при температурі 3-6 С, 14-16-годинному фотоперіоді та освітленні 1-2 клк. У відомому способі мікроклони зберігають на певному живильному середовищі, тоді як в запропонованому способі охолодження мікроклонів використовують для стимуляції цвітіння. Найбільш близьким за сукупністю ознак до запропонованого способу є спосіб вирощування насіння цукрових буряків за однорічним циклом [Булин В.Н., Юрчак В.П. Методика выращивания семян по однолетнему циклу //Сахарная свекла. 1986. - №1. - С.33-34], що включає посів насіння цукрових буряків в поліетиленові стаканчики, вирощування розсади в теплиці до утворення двохтрьох пар справжніх листків, витримування її в холодильній камері при 4-13°С, з додатковим освітленням, пересадку рослин у відкритий ґрунт або в відповідні ємкості при необхідності отримання насіння в теплиці. Відомий та пропонований способи мають спільні суттєві ознаки: вирощування рослин буряків до фази двох-трьох пар справжніх листків за температур 16-20°С, проведення яровизації рослин з використанням холодильної камери, перенесення в бокс з температурою повітря 15-20°С та додатковим освітленням 12 годин на добу, вирощування насінників в посудинах (за отримання насіння в теплиці), але у відомому способі усі дії проводяться з рослинами in vivo, тоді як у пропонованому - in vitro. Відомий спосіб не забезпечує цвітіння мікророслин рослин цукрових буряків in vitro, тому що для яровизації використовують розсаду, що вирощують та яровизують в умовах in vivo, вирощують насінники в посудинах об'ємом 1,0-1,5 л (за вирощування насіння в теплиці), тоді як в запропонованому способі мікророслини вирощують та яровизують in vitro, стимулюють цві 54424 4 тіння рослин також in vitro. В відомому способі після проведення яровизації рослини переносять в бокс з температурою повітря 15-20°С та додатковим освітленням 12 годин на добу, де вони знаходяться до цвітіння, не потребуючи додаткових заходів, тоді як в запропонованому мікророслини переносять в культуральну кімнату із стандартними умовами культивування: за температури 2228°С, освітленні 2-4 клк з довжиною світлового періоду 14-16 годин та для стимуляції утворення стебла використовують фітогормон гіберелін, без якого яровизовані мікророслини залишаються у стані розетки. Для стимуляції цвітіння мікророслини у запропонованому способі знов розміщують в холодильній камери за температури 10-16°С, освітленні 1-2 клк з довжиною світлового періоду 14-16 годин до появи генеративних органів - цвітіння, тоді як у відомому способі такі заходи непотрібні. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб стимуляції цвітіння буряків в культурі in vitro шляхом вирощування мікроклонів, яровизації та стимуляції їх генеративного розвитку в умовах in vitro. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі вирощування насіння цукрових буряків за однорічним циклом, що включає посів по одній насінині цукрових буряків в поліетиленові стаканчики, вирощування в теплиці розсади до утворення двох-трьох пар справжніх листків, обробку її в холодильній камері при 4-13°С, додатковим освітленням та пересаджуванням рослин у відкритий ґрунт або в ємкості за умови отримання насіння в теплиці. А згідно корисної моделі рослини вирощують в умовах in vitro, яровизацію мікроклонів проводять in vitro на модифікованому агаризованому середовищі Гамборга або Мурасіге-Скугом з вітамінами: тіаміну - 1-10 мг, піридоксину та нікотинової кислоти по 1 мг на літр середовища, з додаванням у кожне живильне середовище 0,1-0,2 мг/л БАП або 1-5 мг/л проліну, мікророслини витримують в холодильній камері 42-70 діб, освітлюють періодично 14-16 годин на добу, після яровизації для утворення стебла мікроклони пересаджують на модифіковане живильне середовище Гамборга або Мурасіге-Скуга, до складу якого додатково вводять 110 мг/л тіаміну, 1 мг/л піридоксину, 1 мг/л нікотинової кислоти, 5-15 мг/л гібереліну, 10-25 мг/л та аскорбінової кислоти, утримують у стандартних умовах культивування, а після утворення стебла для появи генеративних органів мікророслини пасивують на модифіковане агаризоване середовище Гамборга або Мурасіге-Скуга, до складу якого вводять 1-10 мг/л тіаміну, 1 мг/л піридоксину, 1 мг/л нікотинової кислоти, 1-5 мг/л проліну з наступним розміщенням в холодильній камері, за температури 10-16°С, освітленні 1-2 клк протягом 14-16 годин до появи генеративних органів - цвітіння. Новими суттєвими ознаками корисної моделі є: - яровизація мікророслин буряків в умовах in vitro на певному живильному середовищі - модифікованому агаризованому середовищі Гамборга або Мурасіге-Скуга, до складу якого додають 1 5 54424 10 мг/л тіаміну, 1 мг/л піридоксину, 1 мг/л нікотинової кислоти, 0,1-0,2 мг/л БАП, або замість БАП - 15 мг/л проліну; - яровизація мікророслин буряків протягом 4270 діб в холодильній камері з періодичним освітленням протягом 14-16 годин на добу; - стимуляція утворення стебла у яровизованих мікророслин буряків в умовах in vitro за рахунок додавання 5-15 мг/л гібереліну та 10-25 мг/л аскорбінової кислоти у модифіковані живильні середовища Гамборга або Мурасіге-Скуга з вітамінами: тіаміном - 1-10 мг, піридоксином та нікотиновою кислотою по 1 мг на літр середовища; - стимуляція цвітіння після утворення стебла у яровизованих мікророслин буряків за рахунок ви 6 рощування їх в холодильній камері до появи генеративних органів за температури 10-16°С, освітленні 1-2 клк з довжиною світлового періоду 14-16 годин на певному живильному середовищі - модифікованому середовищі Гамборга або МурасігеСкуга до складу якого вводять 1-10 мг/л тіаміну, 1 мг/л піридоксину, 1 мг/л нікотинової кислоти, 15 мг/л проліну. Впровадження запропонованого способу стимуляції цвітіння мікророслин буряків in vitro сприятиме прискоренню селекційного процесу за рахунок стимуляції генеративного розвитку рослин. Спосіб забезпечить проведення частини селекційних робіт in vitro (схрещування, визначення фертильності, виявлення апоміктичних форм та ін.). Таблиця 1 Вплив температурного режиму яровизації мікроклонів цукрових буряків in vitro на процес утворення стебла мікророслин після проведення яровизації Температура, С 3-10 11-16 17-25 28-36 Тривалість охолодження мікророслин, доба 36-42 42-56 +/+ 56-70 + "+" - стеблоутворення у 100 % мікророслин на середовищі з додаванням гібереліну після яровизації; "-" - відсутність стеблоутворення у 100 % мікророслин на середовищі з додаванням гібереліну після яровизації; "+/-" - утворення стебла у 70-80 % мікророслин. Дані, що наведені в таблиці 1, показують, що найбільш впливовими на перебіг процесу яровизації є температури у межах 3-10°С з тривалістю охолодження 42-70 діб. За охолодження тривалістю 36-42 доби утворення стебла спостерігається тільки у 70-80% рослин. Освітлення рослин під час термоіндукції у межах 1-4 клк при 14-16 годинному фотоперіоді (дов гий день) сприяє кращому збереженню рослин під час яровизації. Перебування мікророслин в умовах короткого дня (9-10 годин освітлення) негативно впливає на збереженість рослин під час яровизації в умовах низьких позитивних температур, а цілодобове освітлення, як і освітлення більшої інтенсивності сприяє клонуванню рослин та небажаним ростовим процесам. Таблиця 2 Вплив складу живильного середовища на тип морфогенезу мікроклонів цукрових буряків в культурі in vitro після їх яровизації № Живильне середовище Модифіковане середовище Гамборга або Му1. расіге-Скуга + вітаміни (тіамін -1-10 мг, піридоксин - 1 мг/л, нікотинова кислота - 1 мг/л) Теж + НУК - 0,2 мг/л або ІМК - 1-2 мг/л + аско2. рбінова кислота - 10-25 мг/л 3. Теж + БАП - 0,1-0,8 мг/л Теж + гіберелін - 5-15 мг/л + аскорбінова кис4. лота - 10-25 мг/л З даних таблиці 2 видно, що напрямок морфогенезу - вегетативний чи генеративний у цукрових буряків в умовах in vitro після їх яровизації можна змінювати при зміні умов культивування, насамперед, вмісту фітогормонів (ауксинів, цитокінінів, гіберелінів). Тип морфогенезу мікроклонів після яровизації СтеблоутвоРозетки Вкорінення Цвітіння рення + + + + + Так, додавання до середовища фітогормонів ауксинової природи (ІОК, ІМК, НОК) сприяє індукції та розвитку кореневої системи, цитокінінів (БАП, кінетину) - стимуляції брунькоутворення, клонуванню і тільки додавання до середовища гіберелінів, зокрема ГК, який вважається основним індук 7 54424 тором утворення стебла у дворічних рослин, приводить до початку реалізації яровизації - стрілкування (Рис.1 - стрілкування мікророслин цукрових буряків in vitro). На безгормональному середовищі утворення стебла у яровизованих мікророслин цукрових буряків не відбувається. Таким чином, гормональний фактор виявився вирішальним для 8 стимуляції утворення стебла у цукрових буряків в культурі in vitro після дії яровизуючих факторів. На безгормональному середовищі, а також при наявності в середовищі ауксину чи цитокініну, як основного фітогормону, яровизовані мікророслини цукрових буряків не переходять до репродуктивної фази, а залишаються у вегетативному стані. Таблиця 3 Вплив складу живильного середовища на тип розвитку мікроклонів цукрових буряків в культурі in vitro після їх яровизації та утворення стебла № Тип розвитку мікроклонів після яровизації та стеблоутворення Розетки на КоренеутвоРіст стебла Цвітіння стеблі рення Живильне середовище Модифіковане середовище Гамборга або Му1. расіге-Скуга + вітаміни (тіамін - 1-10 мг, піридоксин - 1 мг/л, нікотинова кислота - 1 мг/л) 2. Теж + БАП - 0,1-0,8 мг/л Теж + гіберелін - 5-15 мг/л + аскорбінова кис3. лота - 10-25 мг/л Теж + НУК - 0.2 мг/л або ІМК - 1-2 мг/л + аско4. рбінова кислота - 10-25 мг/л 5. Теж + пролін - 1-5 мг/л + + + + + + + Таблиця 4 Вплив температурного режиму на цвітіння мікроклонів цукрових буряків in vitro після яровизації та стеблоутворення Температура, °С 6-9 10-16 17-30 Ріст стебла Дуже повільний + + Формування та ріст стебла у цукрових буряків - це тільки перша фаза цвітіння, яка в умовах in vitro не завершується, не відбувається формування квіток. Визначення впливу факторів на подальший розвиток мікророслин та їх цвітіння показало, що для стимуляції цвітіння після утворення стебла наявність фітогормонів в живильному середовищі не потрібна. Так, додавання у живильне середовище гіберелінів приводило до подальшого росту стебла, ауксинів - корінців, а цитокінінів - вегетативних утворень - піднесених розеток листя, онтогенетичної регресії. Подальший розвиток мікророслин - утворення генеративних органів, тобто перехід до цвітіння відбувається на безгормональному середовищі з додаванням амінокислоти пролін (Рис.2 - генеративний розвиток мікророслин цукрових буряків в культурі in vitro, Рис.3 - сегмент мікророслини цукрового буряка з квітковими бруньками). Крім складу живильного середовища значну роль для переходу рослин до фази цвітіння відіграє температурний фактор. Утворення генеративних органів у мікророслин цукрових буряків відбувається лише в умовах знижених температур з діапазоном - 10-16°С (табл. 4). За більш високих температур (17-30°С) спостерігається подальший Цвітіння + ріст стебла, а за низьких (6-9°С) - ріст стебла дуже повільний, або навіть гальмується (без появи генеративних органів). Спосіб здійснюється таким чином. Мікроклони буряків розмножують та вирощують за стандартних умов культивування: освітлення 2-4 клк, 16-годинному фотоперіоді, температурі 22-28°С на модифікованих агаризованих середовищах Гамборга або Мурасіге-Скуга з включенням 0,1-1,0 мг/л БАП, пасивують на модифіковане агаризоване середовище Гамборга або МурасігеСкуга та вітамінами: тіаміном - 1-10 мг, піридоксином та нікотиновою кислотою по 1 мг на літр середовища, з додаванням 0,1-0,2 мг/л БАП або 15 мг/л проліну замість БАП, переносять в холодильну камеру з температурою повітря 3-10°С та освітленні 1-2 клк протягом 14-16 годин, де витримують (яровизують) 42-70 діб, після яровизації мікроклони пересаджують на живильне середовище з іншим складом - модифіковане агаризоване середовище Гамборга або Мурасіге-Скуга та вітамінами: тіаміном - 1-10 мг, піридоксином та нікотиновою кислотою по 1 мг на літр середовища з додаванням 5-15 мг/л гібереліну та 10-25 мг/л аскорбінової кислоти та розміщують в культуральній кімнаті із стандартними умовами культивування: за температури 22-28°С, освітленні 2-4 клк з 9 54424 довжиною світлового періоду 14-16 годин для стимуляції утворення стебла, після утворення стебла довжиною не менш 3-4 см, мікророслини пасивують на живильне середовище з іншим складом: модифіковане агаризоване середовище Гамборга або Мурасіге-Скуга та вітамінами: тіаміном - 110 мг, піридоксином та нікотиновою кислотою по Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 10 1 мг на літр середовища з додаванням у кожне середовище 1-5 мг/л проліну та знов розміщують в холодильній камері, але за температури 10-16°С, освітленні 1-2 клк з довжиною світлового періоду 14-16 годин до появи генеративних органів - цвітіння. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601