Спосіб довготривалого збереження мікророслин буряків в умовах in vitro

Спосіб довготривалого збереження мікророслин буряків в умовах in vitro, що включає культивування та збереження мікророслин на модифікованому агаризованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга в умовах фотоперіодичного освіт 3 Відомий і пропонований способи мають спільні суттєві ознаки, а саме культивування мікророслин на агаризованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга, збереження мікророслин при понижених температурах, але у відомому способі не наведені умови збереження (температура). Найбільш близьким за сукупністю ознак до запропонованого способу є спосіб довготривалого збереження мікророслин буряків в умовах in vitro [Редько B.I., Недяк Т.М., Дубін О.В., Ніколаєнко Г.П. Розмноження та збереження селекційних матеріалів цукрових буряків in vitro // Зб. Наукових праць Інституту цукрових буряків УААН. - К.,2000 Вип.2, Кн.1. C. 123-130], що включає розмноження та збереження рослин буряків на модифікованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга, в якому міститься: гіберелова кислота - 0,05мг/л, кінетин від 0,1 до 0,7мг/л в умовах освітлення 3-5клк при 18-годинному фотоперіоді, температурі 26°С. Відомий і пропонований способи мають спільні суттєві ознаки: культивування мікророслин на агаризованому живильному середовищі МурасігеСкуга та умови збереження їх при освітленні, фотоперіоді, температурному режимі, але відомий спосіб не забезпечує довготривалого збереження мікророслин без систематичного пересаджування на нове живильне середовище, тому що для збереження мікророслин необхідно використання певного середовища з відмінним якісним та кількісним складом компонентів і створення оптимальних умов збереження. У відомому способі умови збереження мікророслин використовують для збільшення коефіцієнту подальшого розмноження, пересаджуючи рослини кожні 2-3 тижні на нове поживне середовище. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб довготривалого збереження мікророслин буряків в умовах in vitro шляхом застосування поліпшеного живильного агаризованого середовища з якісним і кількісним складом компонентів живлення та створення оптимальних умов, що дає змогу культивувати та довгостроково зберігати мікророслини без пересадки їх на нове живильне середовище, а це сприяє економії реактивів і робочого часу. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі довготривалого збереження мікророслин буряків в умовах in vitro, що включає культивування та збереження мікророслин на модифікованому агаризованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга в умовах фотоперіодичного освітлення, позитивній температурі, відносній вологості повітря 80% при пересаджуванні мікророслин кожні 2-3 тижні на нове свіже живильне середовище, згідно корисної моделі, живильне середовище містить 1/2 дози макро-, мікро солей та по 1мг/л тіаміну, піридоксину, нікотинової кислоти і додатково містить пролін - 2мг/л та аскорбінову кислоту - 1мг/л, а збереження мікророслин проводять при температурі повітря 3-6°С, 14-16 - го 16702 4 годинному фотоперіоді та освітленні 1-2клк, що не потребує систематичного пересаджування мікророслин на нове живильне середовище. Відомо застосування аскорбінової кислоти для стимуляції розвитку пазушних бруньок цукрових буряків в культурі in vitro [Физиология и биохимия культурных растений. - 1983. Т. 15. №4. - С. 354], а в запропонованому способі аскорбінова кислота використовується як елемент живильного середовища в якості вітаміна для підтримки імунної системи буряків, що зберігаються довгостроково при понижених температурах. Пролін в запропонованому способі використовується як відомий кріопротектор [А.К. Глянько. Температурный стресc: механизмы термоустойчивости, рост, развитие и продуктивность растений // Сельскохозяйственная биология. - 1996. - №3. С.3-19]. Впровадження запропонованого способу довготривалого зберігання мікророслин цукрових буряків в умовах in vitro дає змогу значно збільшити термін зберігання рослин - до 11-12 і більше місяців (досліди 2004-2005 р.) без пересадки на нове поживне середовище, що сприяє економії дорогих матеріалів, робочого часу, запобігає ураженню рослин та середовища патогенною мікрофлорою при багаторазових пересадженнях, особливо у літній період. В дослідах вивчали вплив температурного режиму, освітлення, складу поживного середовища на ріст та розвиток мікророслин та тривалість збереження в умовах знижених позитивних температур. Вивчення температурного режиму зберігання мікророслин in vitro показало, що в умовах культуральної кімнати при температурі 24-26°С протягом місяця зберігаються майже всі рослини, але на 30у добу зберігання нижні листки у рослин відмирають, середовище темнішає, а на 45 добу - третина рослин гине, решта - майже не придатна для подальшого розмноження, на 60-у добу залишається біля 10% рослин, але всі вони уражені листовими гнилями, не придатні для подальшого культивування, середовище темне (табл.1). Зниження температури культивування уповільнює процеси старіння, як рослин, так і середовища. Вже при температурі 10-14°С на 60-у добу депонування залишаються живими без значних ушкоджень більше половини рослин. До 93 доби доживає 12% рослин. Культивування рослин при температурі 34 та 5-6°С сприяє збереженню більшої кількості мікророслин. Оптимальною виявилася температура 5-6°С, при якій до 93 доби збереглися всі рослини, навіть без жодного ушкодженого листка. За чотири місяці збереження було відбраковано внаслідок ураження рослин або середовища патогенною мікрофлорою тільки 5% рослин, 95% рослин збереглося, стільки ж рослин збереглося і до 335 доби ( біля 11 місяців) культивування. 5 16702 6 Таблиця 1 Вплив температурного режиму культивування на збереження мікророслин цукрових буряків Температура,°С 3-4 5-6 10-14 30 діб 100 100 100 45 діб 90 100 85 Рослини, що збереглися, в % до висаджених 60 діб 93 доби 125 діб 186 діб 85 100 95 95 95 52 0 Вивчення впливу режиму освітлення - короткий день (8-10 годин), довгий (14-16 годин та цілодобове освітлення), показало, що зберігання мікророслин при низьких позитивних температурах в умовах довгого дня сприяє виживанню рослин. При довжині дня 14-16 годин та цілодобовому освітленні рослини краще зберігаються. Так, при 8-10 годинах освітлення за 60 діб депонування збереглося 63% рослин, тоді, як при освітленні 1416 годин та цілодобовому на ту ж саму дату збере 335 діб 95 глися всі рослини, що були висаджені - 100% (табл. 2). Ростові процеси уповільнюються, але рослини ростуть та розвиваються. Листовий апарат у рослин, що зберігаються в умовах довгого дня, темно-зеленого кольору, менш ушкоджується патогенною мікрофлорою. На відміну від них, у рослин, що зберігалися в умовах короткого дня, листя світло-зеленого кольору, що говорить про нестачу хлорофілу, рослини уражені патогенною мікрофлорою. Таблиця 2 Вплив фотоперіоду на збереження мікророслин цукрових буряків в умовах знижених температур. Довжина дня 8-10 годин освітлення 14-16 годин освітлення 24 години освітлення Рослини, що збереглися, в % до висаджених 60 діб депонування 93 доби депонування 63 100 95 100 95 Таблиця 3 Вплив складу поживного середовища умов культивування на збереження мікророслин цукрових буряків Рослини, що збереглися, в % до висаджених Склад живильного середовища та умови збереження 45 діб 60 діб 93 доби 122 доби 186 діб 335 діб Запропонований спосіб 100 100 95 95 95 95 Найближчий аналог 57 31 Умови збереження за запропонованим способом, склад середовища за найближчим анало- 100 100 95 91 80 69 гом Культивування мікророслин за запропонованим способом обумовило збереження на 335 добу 95% мікророслин, тоді як в умовах збереження за запропонованим способом при складі середовища за найближчим аналогом збереглося на 26% мікророслин менше (69%). При збереженні за найближчим аналогом вже на 45 добу залишилося біля половини рослин, на 60 добу - менше 1/3 рослин, а на 93 добу не залишилося жодної рослини, усі загинули (табл. 3). На 186 добу (6 місяців) депонування мікророслини перебували у такому морфологічному стані (табл. 4): при збереженні за пропонованим способом рослини мали - 85,7% неушкоджених добре розвинутих листків, 7,1% - частково ушкоджених та 7,1% - засохлих, клонування рослин не відбувалося; при збереженні рослин в запропонованих умовах знижених температур, але на середовищі найближчого аналога, рослини мали тільки 58,3% від загальної кількості неушкоджених листків, 25,0% частково ушкоджених та 16,7% таких, що засохли, загальна кількість листків була на 14,2% менше, ніж у запропонованому способі, на 28,6% менше було неушкоджених листків. При збереженні мікророслин на середовищі за найближчим аналогом відбувалося їх клонування (в середньому 3 клони на рослину), що послабило мікророслини та було одним з факторів погіршання їх загального стану, зменшення кількості рослин, що вижили. 7 16702 8 Таблиця 4 Стан мікророслин через 6 місяців збереження в умовах низьких позитивних температур Характеристика мікророслин Загальна кількість листків, шт. Неушкоджених листків, % до загальної кількості Частково ушкоджених листків, % до загальної кількості Засохлих листків, ±% до загальної кількості Кількість нових клонів на рослині, шт. Склад живильного середовища та умови збереження Умови збереження за запропоноваЗапропонований ним способом, склад середовища за спосіб найближчим аналогом 14±1,1 12±0,7 На 335 добу депонування різниця за морфологічним станом між рослинами, що зберігалися за пропонованим способом та таких, що зберігалися в запропонованих умовах знижених температур, але на середовищі найближчого аналога посилилася, особливо за кількістю неушкоджених листків, яких у першому варіанті налічувало 80%, а в дру Комп’ютерна верстка А. Крулевський 85,7 58,3 7,1 25,0 7,1 1,2±0,1 16,7 3,4±0,2 гому - тільки 45%. Спосіб здійснюється таким чином. Мікророслини буряків вирощують до стану 5-7 листків і пересаджують на поліпшене живильне агаризоване середовище і зберігають при температурі 3-6°С та освітлення 1-2клк, 14-16 годинному фотоперіоді. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601