Спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин людини

Спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин людини шляхом визначення клітинних маркерів, який відрізняється тим, що в мазку лейкоконцентрату венозної крові визначають відсотковий вміст клітинних форм гранулоцитарного, лімфоідного, моноцитарного, плазмоцитарного, еритроідного відростків і при наявності більш 5% бластних клітин і більш 2% нетипових малігнізованих форм діагностують наявність злоякісного процесу в організмі Винахід відноситься до медицини, а саме до онкології і може бути використаний для діагностики злоякісних пухлин людини Нормальний вміст клітин у венозній крові людини добре вивчено і подано в літературі (Поспелова Р А Лейкоконцентрация в клинической практике М Медицина-І973-22 с ) По Р А Поспєловій КІЛЬКІСНИЙ та якісний параметри венозної крові людини практично не відрізняються від даних периферійної крові Це положення потребує уточнення у зв'язку з екологічної ситуації, що складається в урбанізованих регіонах нашої держави Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб діагностування злоякісних пухлин людини (АС СРСР № 1432008, МКИ C01N 33/9, БИ N 39, 1988), який міститься в тому, що в мазку визначають відсотковий вміст малих лімфоцитів (діаметр 7,5мкм) і при його зниженні до 15% та нижче і при наявності сенсибілізації лімфоцитів діагностують злоякісну пухлину в організмі Відомий спосіб орієнтований на визначення вмісту лімфоцитів у капілярної крові, взятої з пальця (не венозної крові), що суттєво знижує діаг капілярів ускладнена Малі лімфоцити та "голі ядра" являють собою достатньо мобільну клітинну популяцію, яка деформує свої параметри внаслідок чисельності екстремальних ситуацій та має свої бюритмічні флуктуації Зниження КІЛЬКОСТІ малих лімфоцитів є неспецифічним процесом і не може відображати тільки наявність злоякісного процесу Використання в реакції продавлення проминання лейкоцитів нестандартних водно солених екстрактів алогеніх пухлин робить цей тест нестандартним, знижує обґрунтованість судження о наявності пухлини в організмі хворого В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу діагностики злоякісних пухлин в організмі дослідом лейкограми лейкоконцентрату венозної крові шляхом оцінки тонких морфологічних критеріїв та нових типів клітин, відображаючи структуру та функцію практично усіх ростків кровотворення, що дозволяє визначити ранні ознаки патології і здійснити ранню діагностику злоякісних процесів Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики злоякісних пухлин людини шляхом клітинних маркерів , згідно винаходу, в мазку венозної крові визначають відсотковий вміст клітинних форм гранулоцітарного, лімфоидного, моноцітарного, плазмоцітарного, ерітроідного паростків кровотворення і при наявності більш ніж ностичну ЦІННІСТЬ, т я КІЛЬКІСНІ характеристики периферійної крові (капілярної) достатньо лабільні, схильні до суттєвих коливань, а міграція великих клітин та клітинних елементів, володіючих підвищеною адгезівностю, із венозного русла до 1 ю 57272 5% бластних клітин та більш 2% нетипових малігнізованих форм діагностують злоякісну пухлину в організмі Висока інформативність методу забезпечується в значній мірі збагаченням препарату ядерними клітинами, звичайно не представленими у мазках крові, взятої з пальця В одному полі зору під великим збільшенням можна спостерігати від ЗО до 70 ядерних елементів крові Це дає можливість оцінити функцію системи кровотворення, імунітету шляхом вивчення морфологічних маркерів, та виявляємо загальноприйнятими методами В умовно здорових людей лейкограма лейкоконцентрату венозної крові (ЛВК) виглядає слідуючим чином (див таб 1) Таблиця 1 Контрольні показники леикограми лейкоконцентрату венозної крові умовно здорової людини № п\п Найменування показника Недиференцовані бласті Лімфобласті Міелобласті типичні Міелобласті атипичні Плазмобласті Єритробласті Me гал області Ретикуломегал області Нормобласті поліхроматофільні 10 Нормобласті оксіфильні 11 Нормобласті базофильні 12 Монобласті 13 Микролімфоціти 14 Мали лімфоціти 15 Середні лімфоціти 1 2 3 4 5 6 7 8 9 16 Гипербазофільни ЛІМООЦІ ти 17 Проміелоціти 18 Міелоціти 19 Метаміелоціти 20 Палочкоядерни трофілоціти 21 Сегментоядерни філоціти 22 Єозшофіли 23 Базофіли 24 Моноціти 25 26 27 Показник (відсотковий) або знак до 0,1 до 0,1 до 0,1 0 0 0 0 0 0,2 0,2 0,2 до 0,2 0 5,0-10,0 15,0-20,0 до 1,0 суцільної крові Далі кров відстоюють при кімнатної температурі протягом 1 години При цьому ерітроціти осаджуються і над ними формуется супернатант, який містить ядерні клітини Супернатант відсмоктують і центрифугують при відносному прискоренні 1000 - 1500G протягом Юхв Осадок ресуспензують і готують препарат за принципом виготовлення мазка периферійної крові Мазки витримують у метиловому спирті не менше 15хв, або етиловому спирті не менше 5хв Потім мазки висушують на повітрі Приготовані фіксовані мазки розміщують в штатив-контейнер, який опускають в кювету з робочим розчином барвника та витримують в ньому суворо визначений час, підібраний для кожної парти фарби Романовського - Гімза Звичайний час фарбування від 35 до 45хв Потім штатив переносять в кювету з водопровідною водою, після промивки мазки ставлять вертикально в штатив для суміння Далі проводять мікроскопічний дослід Підрахунок лейкоцитів ведуть під великим збільшенням /х 1000/ по лінії Меандера, тобто відступивши 2 - З поля зору і потім по зигзагу Проводять підрахунок не менше 300 клітин, враховуючи поруйновані клітини При аналізі ЛВК людини найбільш інформативним критерієм є появлення в венозній крові клітинних елементів - нетиповіх та бластніх не властивих морфологічному ЯКІСНІ зміни морфології клітини венозної крові Особливій увазі підлягає сполучення цих двох компонентів реєстрація нехарактерних для периферійної крові клітинних елементів та клітин зі зміненою морфологією Приклад 1 Хвора Ш Н П 84-х років Звернулася до лікарягематолога зі скаргами на пухлино видне утворення у правій молочній залозі Дані ЛВК подані в таблиці 2 0 до 0,1 до 0,2 нейнейтро до 0,5 40,0-60,0 0,1-1,0 0,1-0,5 5,0-8,0 АНІЗОЦІТОЗ (-) ДО (+) Анізохромія Малігнізовані клитині (-) До (+) 0 Сутність методу полягає в концентріруванні клітин, які містять ядро, венозної крові людини з наступним мікроскопуванням сухих фіксованих і пофарбленних мазків лейконцентрата, вивчанням морфології клітин і диференційованим підрахунком їх процентного співвідношення Спосіб здійснюють слідуючим чином В стерильну пробірку беруть кров з ліктьової вени в КІЛЬКОСТІ 20см2 у пробірку з гепарином фірми "Бюхемі" (Австрія) із розрахунку 25 М Е на 1мл Таблиця 2 Лейкограма ЛВК хворої Ш Н П Номенклатура клітини ЛВК 1 2 Мікролимфоцити Середні лімфоцити Лімфоцити з ядерними конволютами Веретеноподібні мононукляри Важко що диференціюються мононукляри Промиелоцити Миелоцити Метамиелоцити Кільцевоядерні нейтрофилоцити Гігантські нейтрофилоцити Сегментоядерні нейтрофилоцити ПІКНОТИЧНІ нейтрофилоцити Нейтрофилоцити грануляції Відсоток з порушенням 1,49 7,86 1,49 2,98 0,37 0,74 2,24 1,87 1,49 0,37 37,82 2,24 0,74 57272 Продовження таблиці 2 1 2 Дегенеративні форми нейтрофило1,12 ЦИТІВ Моноцити Еозинофіли Лімфобласти Міелобласти типові Міелобласти нетипові Міеломонобласти Плазмобласти Плазмоциди Me гал области (мікрогенерації) Нормобласти базофильні Нетипові клітини Ретикулярні клітини Кариорексис Анизоцитоз Анизохромія Вакуолізація клітин 4,86 2,98 1,49 1,49 0,37 9,73 1,87 0,74 2,24 5,99 2,98 1,87 1,12 + + + Наявність мікролімфоцитів, мононуклеарів, що важко диференціюються, лімфоцитів із ядерними конволютами на фоні явної лімфопени - меньш 12%, дозволяє запідозрити імунодефіцит Зсув уліво клітин гранулоцітарного паростка аж до проміеловдгпв указує на наявність запального осередку, що підтверджується реєстрацією в ЛВК плазмобластів і клітин плазматичного ряду Бластоз вище 5% указує на високу можливість онкогеннонебезпечної ситуації У даному випадку бластоз досягає 20% Наявність мієломонобластів характерно для злоякісного процесу Злоякісний ПЛИН процесу документується наявністю нетипових клітин - 2,98%, ретикулярних елементів -1,87% і кариорексісем Таким чином, на пухлинний процес указують (якщо відкинути сумнівні морфологічні критерії) бластоз понад 5% і наявність нетипових клітинних форм, що практично не зустрічаються при доброякісному плині процесу Хвора спрямована до онколога з діагнозом онкогенонебезбечна ситуація, активний процес Рекомендовано оперативне лікування Пацієнтка прооперована на другу добу після госпіталізації При гістологічному дослідженні віддаленої залози визначена аденокарцинома Приклад 2 Хворий К Е Ф , 1926 р народження звернувся до лікаря зі скаргами на болі в області зпигастрм Госпіталізований з діагнозом рак шлунку, II клінічна група У периферичній крові ознаки анемії, лімфоцитоз (47%) Прооперований, в антральному ВІДДІЛІ шлунка виявлена виразкова форма новотвору розміром 3,5 * 2,5см Гістологічної - ослизлена аденокарценома У ранньому післяопераційному періоді відзначена кровотеча в області післяопераційного шва При дослідженні лейкограми лейкоконцентрату венозної крові отримані дані за гострий лейкоз у ЛВК проглядалися недиференційовані бластні елементи (30,42%), міелобласти (6%), лімфобласти (2,02%), мегалобласти (2,23%), ретикуломегалобласти (0,2%), а також нетипові (1,21%) і ретикулярні елементи (0,84%) Таким чином, у хворого виявлена як локальна злоякісна пухлина, так і системне захворювання крові Сполучення двох нозологічних форм указує на принципову можливість ранньої діагностики онкогенонебезпечних ситуацій за допомогою лейкоконцентрату венозної крові Приклад З Хвора Б В И , 60 років, звернулася до лікаря 31 03 95 із скаргами на болі в області шлунка Робочий стаж 40 років , останні 8 років займалася рентгеноспектральним аналізом Лейкограма ЛВК подана в таблиці З Таблиця З Лейкограма ЛВК хворий Б В И , 60 років Показники Мікролимфоцити Малі лімфоцити Середні лімфоцити Лімфоцити з ядерними конволітами Лімфоритикулярні клітини НК - клітини Мієлоцити Метаміелоцити Паличкоядерні нейтрофилоцити Сегментоядерні нейтрофилоцити Дегенаративні форми нейтрофилоЦИТІВ Нейтрофилоцити з пперсегментированими ядрами Нейтрофилоцити з пікнотичними ядрами Нейтрофилоцити з утратою межсегментарних зв'язків Гігантські нейтрофилоцити Моноцити Міеломоноцити Міеломонобласти Недиференційовані бласти Недиференційовані бласти з ашіастичными ядрами Нормобласти оксифільні Нормобласти базофільні Мегалобласти Плазмобласти Плазмоцити Нетипови клітини Малигнизовані клітини Ретикулярні клітини Вакуолізіровані клітини ТІНІ Боткіна - Гумпрехта Еозинофіли Базофіли Інші морфологічні знаки анизоцитоз анизохромія Порушення грануляції нейтрофилоцитів ппогрануляція Відсоток 3,03 7,16 5,5 2,2 0,82 1,37 0,55 1,65 1,1 38,56 1,65 1,65 2,2 1,65 1,1 1,65 1,65 1,65 4,4 3,03 1,1 1,1 1,1 0,82 0,55 2,75 4,4 1,1 1,65 3,03 0 0 ++++++ + ++ Дані лейкограми вказують на наявність високого ступеню ризику онкогенонебезпечної ситуації, яка потребує негайного втручання Хвора прооперована, видалена пухлина шлун 57272 ку, гістологічної -железістии рак Приклад 4 Хворий С Н Т звернувся 04 06 94 р із приводу збільшення лімфатичних шийних вузлів Лейкограма ЛВК подана в таблиці 4 Таблиця 4 ЛейкограмаЛВКС НТ Показники Малі лімфоцити Середні лімфоцити Промиелоцити Миелоцити Паличкоядерні нейтрофилоцити Сегментоядерні нейтрофилоцити Гігантські нейтрофилоцити Дегенеративні форми нейтрофілоцити Міеломонобласти Моноцити Еозинофіли Базофіли Плазмобласти в стадії пікноза Плазмоцити Не/диференційовані бласти Me гал области Анизоцитоз Анизохромія Макроцитоз Відсоток 7,7 15,3 0,3 2,7 1,8 37,1 4,6 3,3 9,4 9,9 1,2 1,8 1,5 0,6 1,8 0,3 +++ + ++ Висновок гранулоцітарний зсув вліво аж до промиелоцитів (0,3%), а також наявності міеломонобластів, плазмобластів у стадії пікноза, плазмоцитів, недиференційованих бластів указують на наявність онкогенонебезпечної ситуації - лімфогранулематозу При пункції лімфоузла лімфогранулематоз підтверджено Приклад 5 Хвора О Л С звернулася до лікаря зі скаргами на дискомфорт в області черевної порожнини зліва Дані ЯВК подані в таблиці 5 Таблиця 5 Лейкограма ЛВК хворого О Л С Номенклатура клітин Відсотки 1 2 Малі лімфоцити Середні лімфоцити Мета мієлоцити Паличкоядерні нейтрофілоцити Сегментоядерні нейтрофілоцити Дегенеративні форми нейтрофіло 0,33 ЦИТІВ Гшерсегменторовані нейтрофілоцити Про моноцити Монобласти Моноцити Еозшофили 9,0 1,34 1,65 50,0 6,0 3,3 1,34 0,99 2,64 2,31 Продовження таблиці 5 1 2 Базофили Плазмобласти М і ел области Недіференційовані бласти Міеломонобласти Властна клітина з оксифильною цитоплазмою Ретикулярна клітина Нетипові клітини Малигнизовані клітини Клітини З вакуолями Клітини накопичення Двоядерні нетипові клітини Анізохромія Анізоцитоз Поліхроматофільні еритроцити 0,66 1,78 0,99 1,78 1,65 0,33 1,34 1,78 5,33 1,78 0,33 0,99 + + + ++ За даними ЛВК відзначається лімфопенія (9,33%), зацікавленість гранулоцитарного паростка, бластоз понад 5% і виражена малігнизація ЛВК - малігнізовані КЛІТИННІ елементи визначаються на рівні 5,33% ЗЛОЯКІСНІСТЬ процесу підтверджується наявністю нетипових клітин (1,78%), тобто важко що диференціюються форм, виявленням клітин із вакуолями, клітин накопичення Хвора прооперована в онкологічному відділенні через три доби після надходження Діагноз аденокарцинома селезінкового рогу товстого кишечнику Приклад 6 Хвора П Т Н , 34 року, виявила в груди пухлино видне утворення розміром із горошину і звернулася до лікаря Дані ЛВК подані в таблиці 6 Таблиця 6 Лейкограма ЛВК хворий П Т Н Показник Відсотки Мікролимфоцити 3,67 Малі лімфоцити 10,49 Середні лімфоцити 7,87 Проміелоцити 0,26 Мієлоцити 1,04 Метаміелоцити 0,26 Паличкоядерні нейтрофилоцити 1,04 Сегментоядерні нейтрофилоцити 41,99 Нейтрофилоцити з токсичною зернис0,52 тістю Моноцити 9,18 Еозинофіли 1,57 Базофіли 0 Міеломоноцити 2,6 Міеломонобласти 7,34 Недиференційовані бласти 3,13 НК - клітини 1,04 Мононуклеари з аплазією ядра 2,6 Нетипові клітини 1,04 Малігнізовані клітини 4,19 Зроблено висновок об наявність злоякісного 10 Продовження таблиці 7 57272 процесу Таким чином, аналіз ЛВК дозволяє діагностувати початкові стадії онкопроцесу Приклад 7 Хворий К В В обстежений із приводу скарг у черевній порожнині Дані ЛВК подані в таблиці 7 Таблиця 7 Лейкограма ЛВК хворого К В В Номенклатура клітин 1 Малі лімфоцити Середні лімфоцити Лімфоретикулярні клітини Проміелоцити Мієлоцити Метаміелоцити Паличкоядерні нейтрофилоцити Сегментоадерні нейтрофилоцити Гігантські нейтрофилоцити Нейтрофилоцити вакуолізіровані Нейтрофилоцити що деградують Моноцити Міеломоноцити Мононуклеари з ядерними конволютами Плазмоциди Недіфіренційовані бласти Міеломонобласти Комп'ютерна верстка С Волобуєва Відсотки 2 12,65 18,98 0,75 1,51 1,26 8,86 1,01 22,78 0,75 0,75 5,0 0,75 1,51 2,53 5,0 9,62 2,02 1 Нормобласти Ретикулярні клітини Кариорексис Веретонообразні клітини Мононукляри, що деградують Нетипові клітини Мегакаріоцити Гігантські тромбоцити Анізоцитоз Анізохромія Еозинофіли 2 1,51 1,51 1,01 1,51 0,25 2,53 0,25 0,50 + ++ + ++ 0,75 У леикограмі ЛВК відзначається зсув вліво аж до промиелоцитів (1,51%) на фоні різко вираженої деградації клітин гранулоцитарного ряду Виражено бластоз - понад 5% (15%), нетипових елементів -2,53% Відзначається зацікавленість тромбоцитарної ланки Гематологічний діагноз високий ступінь онкогенонебезпечної ситуації Хворий помер, на розтині - рак легенів Таким чином, знаючи природу шкідливого чинника й оцінюючи стан клітинних елементів ЛВК, можна визначити інтенсивність впливу токсиканта на організм людини, що робить метод необхідним інструментом для досліджень в області антропобиошдикацм і клінічної екології Запропонований спосіб достатньо простий і точність діагностики злоякісної пухлини складає 96% Підписано до друку 05 07 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна