Спосіб діагностики злоякісних пухлин людини

Данное изобретение относится к медицине, более конкретно к клинической онкологии, в частности касается способов диагностики злокачественных опухолей человека, которые могут найти применение при массовых профилактических обследованиях населения. Одной из главных проблем клинической онкологии является диагностика злокачественных опухолей в начальной стадии их развития, когда существующие методы лечения бывают наиболее эффективными. Современная онкологическая наука располагает рядом методов скрининговой диагностики злокачественных новообразований, позволяющих судить о наличии или отсутствии опухоли в момент обследования. В частности, широкое распространение получила профилактическая маммография, проводимая с целью ранней диагностики злокачественных новообразований молочной железы у женского населения [Holleb A.G. Review of Breast Cancer Screening Guidelines. Cancer Supplement, 1992; 69:1911-1912]. Известен также метод цитологического скрининга злокачественных опухолей шейки матки [Guzick DS. Efficacy of screening for cervical cancer. A review. Am. J. Public Health, 1978; 68:125-134]. Однако, использование большинства известных методов скрининговой диагностики направлено на выявление опухоли только одного органа и при проводимом обследовании могут быть пропущены другие злокачественные новообразования. Поэтому до настоящего времени существует проблема создания универсального способа диагностики злокачественных опухолей, отвечающего требованиям, предъявляемым к скрининговым методикам. Ряд исследователей считает, что наиболее перспективным в этом направлении являются методы, основанные на определении опухолевых маркеров в биологических жидкостях организма, в частности, в крови. Так, известен способ диагностики злокачественных опухолей человека, основанный на выявлении в крови обследуемого белковых фракций специфичных для злокачественного роста. [Короткоручко В.П. Осадочная реакция на рак при диагностике опухолевой болезни. - Киев: Наукова думка. - 1S67. - 80 с]. Выявление этой белковой фракции осуществляли путем выдерживания сыворотки крови в растворе соляной кислоты с последующим осаждением белка азотной кислотой и дальнейшим растворением его в дистиллированной воде. Образующийся осадок белков сыворотки крови онкологических больных в отличии от здоровых людей не растворялся. Результат реакции, получившей название осадочной реакции на рак (ОРР), учитывали по визуальному определению белкового осадка. Этот известный способ является универсальным и позволяет выявить различные формы и локализации злокачественных новообразований. Однако он обладает не достаточной специфичностью, т.к. ОРР часто бывает положительной при воспалительных и других неопухолевых заболеваниях. Кроме того, способ довольно трудоемкий (требуется приготовление сыворотки крови обследуемого) и травматичный (кровь для исследования берется из вены). Поэтому для проведения массовых профилактических исследований такой способ будет мало эффективен. В основу данного изобретения поставлена задача создать такой способ диагностки злокачественных опухолей человека, в котором путем оригинальной методики выявления в мазке крови, взятой преимущественно из пальца обследуемого, определенных белковых фракций (кальций-белковых комплексов), характерных для злокачественного роста, удалась бы повысить специфичность и чувствительность способа одновременно со снижением его трудоемкости и травматичности, что позволяет, в конечном итоге, использовать этот способ для массовых профилактических обследований с целью онкологического скрининга. Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики злокачественных опухолей человека, основанном на выявлении в крови обследуемого белковых фракций, специфичных для злокачественного роста, согласно изобретению, в процессе анализа готовят мазок крови, взятой, преимущественно, из пальца обследуемого, и последовательно наносят на него раствор комплексона, стандартную сыворотку крови, а затем проявитель кальций-белковых комплексов (КБК) и после экспозиции на свету сравнивают цвет и структуру полученного пятна с цветом и структурой пятна на эталоне, выполненном аналогичным образом на мазке крови здорового человека, и при обнаружении различий диагностируют злокачественную опухоль. Патентуемый способ позволяет на основе предлагаемой обработки мазка крови визуализировать КБК, обнаружение которых, по мнению авторов, является более достоверным и информативным признаком злокачественного роста. Вероятнее всего, как считают авторы, КБК в процессе жизнедеятельности малигнизированных клеток отщепляются от их ДНК и сбрасываются в кровь (shedding effect), а затем захватываются лимфоцитами и при определенных условиях обработки, предлагаемых в соответствии с настоящим изобретением, могут быть обнаружены в мазке даже периферической крови. Таким образом, способ согласно изобретению позволяет проводить обследования, используя мазок крови из пальца, что практически не приводит к развитию осложнений и значительно снижает трудоемкость. Указанный выше патогенез злокачественного роста характерен для опухолей любых локализаций и различного гистогенеза. С учетом вышеуказанного, можно утверждать, что патентуемый способ является универсальным, простым в исполнении, не травматичным, достаточно специфичным и, следовательно, его можно использовать при массовых профилактических обследованиях населения с целью онкологического скрининга. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения целесообразно, чтобы концентрация раствора комплексона была выбрана в пределах от 1% до 25%. Было установлено, что при концентрации раствора комплексона менее 1% значительно удлиняется время реакции, а при концентрации свыше 25% - структура (зернистость) пятна определяется менее четко. Кроме того, желательно также, чтобы в качестве проявителя КБК был использован раствор азотнокислого серебра с концентрацией в пределах от 0,1% до 0,5%. Раствор азотнокислого серебра является наиболее эффективным проявителем, причем если концентрация этого раствора будет выбрана менее 0,1%, продолжительность реакции увеличивается, пятно недостаточно прокрашивается и слабо проявляется зернистость. Более высокие концентрации этого раствора, а именно: свыше 0,5%. вызывают закрашивание очертания зернистости и затрудняют учет реакции. Важным моментом постановки реакции является соблюдение количественного соотношения используемых реагентов. Согласно одному из вариантов осуществления данного способа, предпочтительно выбирать соотношения раствора комплексона и проявителя равными (1,5—3): 1. Выбор в данном соотношении раствора комплексона менее 1,5 приводит к недостаточному прокрашиванию пятна, а более 3 -к полному закрашиванию получаемого изображения. И наконец, согласно еще одному из аспектов данного изобретения, оптимальным может быть выбор времени экспозиции. Так, при экспозиции на свету более 4 часов в пятне наблюдается закрашивание структуры, а мене 2 часов - недостаточная проработка и соответственно снижение информативности результата. Сущность патентуемого способа станет более понятной из приведенных ниже подробного описания лучшего варианта его осуществления и конкретных примеров производимой в соответствии с этим способом диагностики. Патентуемый способ заключается в следующем: на мазок крови, взятой из пальца обследуемого и равномерно размазанной по предметному стеклу, наносят раствор комплексона, например 0,5 мл 5%-ного раствора, затем через некоторое время, приблизительно 5-10 мин, на этот же участок наносят 0,1 мл стандартной сыворотки крови любой группы, после чего добавляют 0,3 мл реактива-проявителя КБК (преимущественно раствор азотнокислого серебра). В качестве комплексона, как правило используют раствор этиленгликоля-бис (b-амино-этилэфир)-N,N-тетраацетата (ЭГТА), или раствор двунатриевой соли этилендиамин-Ν,Ν,Ν,Ν-тетраацетат (ЭДТА). Добавление всех выше указанных реагентов производится на свету с последующей экспозицией в течение двух - четырех часов. Результат учитывают по разнице в цвете и структуре, полученного пятна после реакции на мазке обследуемого и на мазке эталоне. Последний представляет собой мазок крови из пальца пациента, признанного практически здоровым и приготавливается аналогично мазку обследуемого. Многочисленные опыты с мазками крови практически здоровых людей в исследованиях по предлагаемому способу позволили определить признаки, характерные для эталона: желтую или желто-коричневую окраску краевой зоны пятна, наличие зернистости светло-коричневого цвета с четкими очертаниями в средней и центральной зонах пятна. Если цвет и структура пятна на мазке крови обследуемого пациента совпадают с эталоном, то это свидетельствует об отсутствии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. Если краевая зона пятна на мазке крови обследуемого имеет светло-коричневый или коричневый цвет, а в средней и в центральной зонах определяется зернистость темно-коричневого или буро-коричневого цвета с размытыми очертаниями, то полученный результат свидетельствует о наличии в организме обследуемого злокачественной опухоли. Различные случаи диагностики, осуществляемой в соответствии с заявляемым способом, описаны в приведенных ниже примерах 1-8. Пример 1. Доставлен мазок крови пациента Α., взятой из пальца при профилактическом обследовании. Во время врачебного осмотра пациент жалоб не предъявлял. На мазок нанесено 0,5 мл 15%-ного раствора (ЭГТА), через 10 мин добавлено 0,1 мл стандартной сыворотки крови, а затем 0,3 мл 0,2%-ного раствора азотнокислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивались через 2,5 ч. При этом на мазке пациента А. определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдаются выраженные различия в окраске зернистости, что свидетельствуют о наличии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. Комплекс клинико-рентгенологических и эндоскопических методов обследования позволил обнаружить у пациента рак желудка второй стадии. Гистологическое заключение - железистый рак. Пример 2. Доставлен мазок крови пациента Н., взятой из пальца с подозрением на рак легкого. На мазок нанесено 0,5 мл 5%-ного раствора ЭГТА, в то же место добавлено 0,2 мл стандартной сыворотки крови и еще через некоторое время 0,3 мл - 0,2%-ного раствора азотнокислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивали через 2 ч. При этом на мазке крови пациента Н. в зоне реакции обнаружена краевая желто-коричневая окраска, в центре пятна коричневая зернистость с четкими очертаниями. При сравнении цвета и структуры пятна с эталоном картина полностью совпадает, что свидетельствует об отсутствии злокачественного опухолевого процесса. Поставленный диагноз подтвержден при морфологическом изучении операционного материала - в препаратах обнаружена туберкулома - казеома. Пример 3. Доставлен мазок крови пациентам., который обратился к терапевту с жалобами на увеличение лимфатических узлов шеи. От пункционной биопсии больной категорически отказался. На мазок нанесено 0,3 мл 15%-ного раствора ЭДТА через некоторое время в то же место добавлено 0,1 мл стандартной сыворотки крови, а затем - 0,1 мл 0,1%-ного раствора азотнокислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивали через 4 часа. При этом на мазке пациента М., определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдаются различия в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. В дальнейшем результат подтвержден при морфологическом исследовании (лимфосаркома). Пример 4. Доставлен мазок крови ребенка К., родственники которого обратились в поликлинику по месту жительства с целью обследования ребенка в связи с потерей им массы тела и общим недомоганием. На мазок нанесено 0,2 мл 20%-ного раствора ЭДТА в то же место добавлено 0,1 мл стандартной сыворотки крови и через некоторое время - 0,1 мл 0,4%-ного раствора азотнокислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивали через 2 ч. При этом на мазке ребенка К, определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдаются выраженные различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. Ребенок был госпитализирован в онкологическое учреждение, где после тщательного обследования установлен диагноз - опухоль Вильмса справа. При морфологическом исследовании удаленного препарата обнаружена эмбриональная нефробластома. Пример 5. Доставлен мазок крови пациентки С, взятой у нее из пальца во время операции на молочной железе (секторальной резекции). На мазок нанесено 0,25 мл 10%-ного раствора ЭГТА, добавлено 0,3 мл стандартной сыворотки крови и еще через некоторое время - 0,1 мл 0,2%-ного раствора азотнокислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивались через 3 час. При этом на мазке пациентки С, определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдаются выраженные различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. Результат совпал с данными гистологического исследования (аденокарцинома). Пример 6. Доставлен мазок крови из пальца пациентки Ц., с подозрением на злокачественную опухоль толстой кишки. На мазок нанесено 0,2 мл 25%-ного раствора ЗГТА, добавлено 0,1 мл стандартной сыворотки крови, а затем - 0,1 мл 0,5%-ного раствора азотно-кислого серебра. Процеcсе нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивались через 2 часа. При этом на мазке пациентки Ц. определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдается выражение различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. При ректоромано-скопии обнаружена опухоль верхне-ампулярного отдела прямой кишки. Гистологическое заключение - адено-карциона. Пример 7. Доставлен мазок крови пациента Д., обратившегося к врачам по поводу темно-вишневого опухолевого образования на коже спины. На мазок нанесено 0,15 мл 3%-ного раствора ЭДТА, затем в то же место добавлено 0,2 мл стандартной сыворотки крови, после чего еще - 0,1 мл 0,4%-ного раствора азотнокислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивались через 2 ч. При этом на мазке пациента Д. определяется плотно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдаются выраженные различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. Больному было произведено широкое иссечение опухоли в пределах здоровых тканей. Гистологическое заключение - меланома. Пример 8. Доставлен мазок крови пациентки Л., обратившейся к гинекологу с жалобами на кровянистые выделения из влагалища, На мазок нанесено 0,3 мл 15%-ного раствора ЭГТА, затем в то же место добавлено 0,3 мл стандартной сыворотки крови и еще через некоторое время - 0,2 мл 0,5%-ного раствора азотнокислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивались через 4 ч. При этом на мазке пациентки Л. определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами, При сравнении полученной картины с эталоном наблюдается выраженные различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. Больной произведено диагностическое выскабливание. При гистологическом исследовании обнаружен плоскоклеточный рак шейки матки. Оценка диагностической эффективности способа проводилась в соответствии с рекомендациями Комитета экспертов Международной федерации клинической химии по референтным величинам. С целью определения диагностической чувствительности и диагностической специфичности, нами изучены результаты применения способа у 50 практически здоровых лиц (доноров) и больных раком легких, пищевода, желудка, прямой кишки, молочной железы, матки и лимфатической системы (по 50 пациентов в каждой группе). Чувствительность и специфичность определялась по общепринятой методике. Полученные результаты представлены в табл. 1 и 2. Разработанный способ диагностики злокачественных опухолей человека не травматичен, высоко информативен, прост в проведении. Этот способ может быть использован для диагностики всех форм злокачественных новообразований. Высокая диагностическая чувствительность 89,4% и специфичность 86% позволяют считать перспективным его применение для скрининга злокачественных опухолей при массовых профилактических обследованиях населения.