Спосіб апробації біологічно активних речовин і підбору оптимального складу кормових добавок для тварин in vitro

1 Спосіб апробації біологічно активних речовин і підбору оптимального складу кормових добавок для тварин in vitro, що базується на використанні біологічного тест-об'єкта, який відрізняється тим, що як біологічний тест-об'єкт використовують культуру клітин гранульозного шару фолікулів яєчника корів, яку культивують in vitro у середовищі RPMI-1640, додаючи досліджувані біологічно активні компоненти кормових добавок у наростаючих дозах, при цьому ефективність і якість оцінюваних добавок визначають за інтенсивністю споживання кисню тестоб'єктом, а особливості впливу компонентів на окремі ланки генерації АТФ і реалізації кисню у ланках дихального ланцюга з'ясовують за допомогою внесення інгібіторів 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як інгібітор термінальної ділянки (цитохромоксидази) Винахід відноситься до галузі кормовиробництва, зокрема до застосування біологічно активних речовин сільськогосподарським тваринам, а саме до способів оцінки дії біологічно активних добавок на внутрішньоклітинні процеси обміну речовин у тварин Винахід може бути застосований в комбікормовій промисловості на підприємствах з різними формами власності при апробації виготовлених добавок до раціону для визначення оптимального їх складу і співвідношення компонентів Традиційні способи апробації кормових засобів (комбікормів, кормових добавок і преміксів), базуються на використанні лабораторних та с/г тварин (АС 1565468, 402176 1556626 328547) Проведення класичних досліджень на тваринах в цілому трудомістке і потребує численних та тривалих експериментів, витрати коштів Крім цього, встановити оптимальний компонентний та КІЛЬКІСНИЙ склад кормових добавок та відслідкувати вплив поєднання біологічно активних речовин на обмінні процеси в організмі надзвичайно важко Тому, виникла необхідність пошуку нових способів апробації добавок до раціонів сільськогосподарським тварин з метою їх цілеспрямованого застосування, визначення оп тимальних доз та співвідношення компонентів у багатоскладових преміксах Знайдено технічне рішення (Кравців Р Й , Стадник А М , Остапів Д Д , Лозинська Г І Окисно ВІДНОВНІ процеси в тканині найдовшого м'яза спини при нормалізації мікроелементного складу раціонів бичків - Львів, -2000 - Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С 3 Гжицького - Т 2 - 4 4 - С 94-97) Автори використовували мітохондрм та мікросомальноцитозольну фракції тканини найдовшого м'яза спини бугайців, яким згодовували оцінюваний премікс, тобто апробація проводилася in vivo Недоліком відомого рішення є те, що спосіб не прогнозує ефективності використання біологічно активних речовин Крім цього, після забою тварин дослідження проводились на органелах, що не забезпечує виявлення процесів, зміни метаболізму використовують натрію азид (5 -10" 3 М), а для дослідження вільнорадикального окиснення жирних кислот - натрію етилендіамштетраацетат (6-10" 4 М) у ЦІЛІЙ КЛІТИНІ За рахунок здатності мембран клітини диференційовано реагувати на подразники цілісна структура забезпечує захист органел від впливу факторів зовнішнього середовища Запропонований нами спосіб усуває недоліки прототипу та забезпечує високу чутливість до біологічно активних речовин і можливість оптимального підбору компонентного складу преміксів О о 00 ю 58100 та кормових добавок В основу винаходу покладено завдання розробити ефективний та зручний спосіб встановлення оптимальних кількостей та співвідношень біологічно активних речовин з метою цілеспрямованої корекції обміну речовин у тварин та підвищення продуктивності, доступний для використання у від годівельних господарствах з різною формою власності Технічний результат досягають шляхом використання біологічного тест-об'єкта - культури клітин гранульозного шару фолікулів яєчника корів, яку культивують у середовищі RPMI-1640 (Flow Laboratories) додаючи досліджувані біологічноактивні компоненти кормових добавок у наростаючих дозах, при цьому ефективність і якість оцінюваних добавок визначають за інтенсивністю споживання кисню тест-об'єктом, а особливості впливу оцінюваних компонентів на окремі ланки дихального ланцюга з'ясовують за допомогою внесення інгібіторів Інтенсивність дихання клітин гранульозного шару фолікулів яєчника характеризує метаболічні процеси у КЛІТИНІ в присутності певних кількостей біологічно-активних речовин та їх поєднань і дозволяє здійснити оптимальний підбір КІЛЬКІСНОГО І ЯКІСНОГО складу компонентів кормових добавок Для встановлення особливостей впливу біологічно активних речовин на окремі ланки генерації АТФ і немітохондріальні процеси, які зумовлюють споживання кисню, з метою диференціювання процесів синтезу енергії та розпаду структурних елементів, визначення змін біохімічного статусу та характеру метаболічних процесів, що відбуваються у КЛІТИНІ внаслідок дії біологічно активних речовин, використовували інгібітори термінальної ділянки дихального ланцюга (цитохромоксидази) натрію азид (ІЧаІЧз 5-10 М), вільнорадикальне окислення жирних кислот інгібували ІЧаЕДТА б-Ю" 4 М Таким чином, заявлений спосіб забезпечує попередню оцінку ефективності застосування бюлопчно-активних речовин і дозволяє здійснити підбір оптимального складу та співвідношення компонентів кормових добавок, а також дозволяє заздалегідь визначати ДОЦІЛЬНІСТЬ застосування тих чи інших біологічно-активних речовин і поєднати компоненти кормових добавок у найбільш ефективних співвідношеннях При проведенні патентно-інформаційного пошуку авторами і заявником знайдено технічне рішення, яке містить найбільшу КІЛЬКІСТЬ суттєвих ознак, спільних із заявленим способом використання тест-об'єкту, за станом обміну речовин якого судять про ДОЦІЛЬНІСТЬ використання кормових добавок для сільськогосподарських тварин (Кравців Р Й , Стадник А М , Остапів Д Д , Лозинська Г І Окисно ВІДНОВНІ процеси в тканині найдовшого м'яза спини при нормалізації мікроелементного складу раціонів бичків - Львів, -2000 - Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С 3 Гжицького -Т 2 -Ч 4 -С 94-97) Однак, наявність зазначених, спільних з прототипом ознак, недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з заявленим способом не виявлено Це дозволяє зробити висновок про ВІДПОВІДНІСТЬ заявленого технічного рішення критерію винаходу"новизна" Заявлений спосіб забезпечує досягнення технічного результату - використання у якості тестоб'єкта для апробації біологічно активних речовин і підбору оптимального складу кормових добавок для сільськогосподарських тварин культури клітин гранульозного шару фолікулів яєчника корів, яку культивують in vitro в середовищі RPMI-1640 (Flow Laboratories), додаючи біологічно активні компоненти кормових добавок у наростаючих дозах, при цьому ефективність і якість оцінюваних добавок визначають за інтенсивністю споживання кисню тест-об'єктом, а особливості впливу компонентів на окремі ланки генерації АТФ і реалізації кисню у ланках дихального ланцюга з'ясовують за допомогою внесення інгібіторів Заявлене технічне рішення належить до галузі кормовиробництва, зокрема до виробництва біологічно активних кормових добавок для сільськогосподарських тварин, а саме до способів оцінки дії кормових добавок на внутрішньоклітинні процеси обміну речовин у тварин Винахід може бути застосований у кормовиробничій промисловості на підприємствах з різними формами власності при апробації виготовлених добавок для вивчення їх оптимального складу і ДОЦІЛЬНОСТІ співвідношення компонентів Заявлений спосіб здійснюють наступним чином 1 У корів після забою, відбирають яєчники та шляхом аспірації фолікулів отримують суспензію клітин Центрифугують (2000об/хв), декантують, суспендують у фосфатно-сольовому буфері 2 Одержану культуру клітин гранульозного шару фолікулів яєчника корів шкубують in vitro 1012 годин у середовищі RPMT-1640 (Flow Laboratories) 3 До середовища інкубації додають наростаючі дози біологічно активних речовин, які передбачається ввести в кормову добавку для тварин 4 Визначають інтенсивність дихання тестоб'єкта полярографічне (нг/О/мл суспензії клітин за хвилину) у термостатованій кюветі кюветі (t = 38°C) з автоматичною реєстрацією перебігу процесу 5 Для встановлення особливостей впливу біологічно активних речовин на окремі ланки генерації АТФ і вільно радикального окислення жирних кислот до середовища інкубації додають інгібітори термінальної ділянки дихального ланцюга (цитохромоксидази) - натрію азид (5-10 М), вільнорадикального окислення жирних кислот - ІЧаЕДТА ( 6 - 1 0 ^ М) 6 Аналізуючи одержані дані спостерігають за інтенсивністю дихання тест-об'єкту, визначають оптимальні дози біологічно активних речовин, які передбачається ввести в кормову добавку 7 Проводять поєднання біологічно активних компонентів додають у середовище інкубації гранульози і встановлюють склад багатокомпонентної кормової добавки 58100 Вивчення зв'язків МІЖ інтенсивністю дихання клітин гранульози in vitro та внесенням у середовище інкубації біологічно активних речовин проводили в умовах лабораторії Львівської державної академії ветеринарної медицини кафедри ветеринарно-санітарної та радіологічної експертизи Для цього у середовище визначення додавали мікроелементи у вигляді солей у дозах, ВІДПОВІДНО до норми у сироватці крові (мкг/ЮОмл сироватки, 2, 3) FeSO4-100, ZnSO4-100, MnSO4-5, CuSO4-100, CoSO4-0,4, KJ-3,9, на половину нижчі та у п'ять - і десятикратно вищих кількостях, порівняно з оптимальною Крім цього, виготовлено премікс з досліджуваних солей мікроелементів, який також вносили у середовище визначення половина норми, в 2 рази вище від норми в сироватці крові Апробовано метіонін (0,01 та 0,05мкг/мл), цистеїн ( 0,2мкг/мл), метюнати марганцю 0,05, МІДІ 0,05, кобальту 0,03, цинку 0,05мкг/мл та цистешати заліза 0,02, МІДІ 0,02, марганцю 0,02, кобальту 0,01мкг/мл) Розроблено та апробовано премікс №1 (метюнат марганцю 0,05, метюнат МІДІ 0,05, метюнат кобальту 0,03мкг/мл), премікс №2 (метюнат марганцю 0,05, метюнат МІДІ 0,05, метюнат кобальту 0,03, метюнат цинку 0,05мкг/мл), премікс №3 (метюнат марганцю 0,05, метюнат МІДІ 0,05, метюнат кобальту 0,03, метюнат цинку 0,05, метюнат заліза 0,025мкг/мл), премікс №4 (цистешат заліза 0,02, цистешат МІДІ 0,02, цистешат кобальту 0,01, цистешат марганцю 0,0 мкг/мл), премікс №5 (FeSO4-0,05, CuSO4-0,05, MnSO4-0,05, CoSO4-0,03, цистеш-0,02мкг/мл), премікс №6 (FeSO4-0,05, CuSO4-0,05, MnSO4-0,05, CoSO4-0,03, мкг/мл) Перевірено in vivo (на бугайцях чорно рябої породи) ефективність заявленого способу Для цього апробовані in vitro біологічно активні речовини та багатокомпонентні премікси згодовували тваринам протягом 90 днів Після чого визначали фізіологічний статус бугайців та оцінювали продуктивність тварин Вивченням зв'язків МІЖ пропорційно зростаючими дозами мікроелементів у середовищі визначення та інтенсивністю дихання клітин гранульози in vitro встановлено особливості впливу окремих мікроелементів і їх преміксу При цьому, нормалізація вмісту всіх без виключення мікроелементів у середовищі визначення стимулювала на 2,4-24,4% дихальну активність клітин При збільшенні дози в п'ять і більше разів норми інтенсивність поглинання кисню відрізнялася підвищення вмісту заліза мало стимулюючу дію, яка при десятикратній дозі досягала максимального значения (36,7±6,28нг-атом 0/0,1 мл суспензії клітин/хв), внесення цинку, та йоду у 5 та 10 кратних дозах не змінювало дихальної активності порівняно з величиною, встановленою при їх оптимальній КІЛЬКОСТІ (23,3-24,6нг-атом 0/0,1 мл суспензії клітин/хв), збільшення МІДІ та кобальту у середовищі визначення інгібувало споживання кисню, яке знижувалось на 2-Знг-атом 0/0,1 мл суспензії клітин/хв 7,1-11,9%) Додавання в середовище дослідження преміксу у половині від норми в сироватці крові підвищувало дихальну активність клітин з 28,8±1,73 до 36,9±2,69нг-атом 0/0,1 мл суспензії клітин/хв (28,1%) Наступне збільшення мікроелементів до норми сироватки крові ще стимулювало поглинання кисню на 21,4% Двократно вища доза суміші не підвищувала дихальну активність культури, яка була в межах значення, встановленого при нормі (41,1±3,13нг-атомО/0,1 мл суспензії клітин/хв) Таким чином, встановлено, що нормалізація вмісту мікроелементів в середовищі визначення стимулювала дихальну активність даної культури, а отже і генерацію АТФ Надлишок мікроелементів не однозначно впливав на інтенсивність поглинання кисню і залежав від ролі конкретного мікроелемента в обміні речовин На дихальну активність даної культури клітин суттєво впливали вміст йоду і селену (гро,37), марганець (г|=0,32), мідь (л=0,22) і кобальт (л=0,38) Проведено апробацію ряду біологічно активних речовин амінокислот (метіоніну, цистеїну), солей мікроелементів, металоорганічних сполук мікроелементів з амінокислотами та багатокомпонентних преміксів (табл 1) Дихання культури клітин гранульози, шкубованої 12 годин, становило 14,04±0,67нг-атом 0/0,1 мл суспензії клітин за хвилину (контроль) Внаслідок внесення у середовище інкубації метіоніну у дозі 0,05мкг/мл дихальна активність культури практично не змінювалася, при збільшенні дози до 0,1мкг/мл зростала на 15,5% При додаванні цистеїну приріст споживання кисню склав 36,5%, метюнату марганцю-20,3%, метюнату міді-25,0 %, порівняно до контролю Мепонат цинку та метюнат кобальту знижували дихальну активність на 15-20% Таблиця 1 Дихальна активність культури клітин гранульози за дії БАР (нг атом О/0,1 мл клітин/хв) Умови досліду Контроль метіонін метіонін цистеїн метюнат марганцю метюнат МІДІ метюнат цинку метюнат кобальту Доза досліджуваного чинника (мкг/мл) 0,1 0,05 0,2 0,05 0,05 0,05 0,03 Інтенсивність дихання (нгатом 0/0,1 мл клітин/хв) 14,04±0,67 16,22±0,47 14,00±1,44 19,17±0,33 16,89±0,98 17,55±0,27 11,23±0,41 11,93±0,85 58100 8 Продовження таблиці 1 Дихальна активність культури клітин гранульози за дії БАР (нг атом 0/0,1 мл клітин/хв) Премікс№1 - метюнат марганцю 0,05 0,05 0,03 - метюнат МІДІ - метюнат кобальту Премікс №2 - метюнат марганцю 18,71±0,43 0,05 0,05 0,03 0,05 - метюнат МІДІ - метюнат кобальту - метюнат цинку Премікс №3 - метюнат марганцю 19,42±0,29 0,05 0,05 0,03 0,05 0,025 - метюнат МІДІ - метюнат кобалыу - метюнат цинку - метюнат заліза Премікс №4 - цистешат заліза 39,94±0,97 0,02 0,02 0,02 0,01 - цистешат МІДІ - цистешат кобальту - цистешат марганцю Премікс №5 - FeSO4 - CuSO4 - MnSO4 - COSO4 - цистеїн Премікс №6 - FeSO4 - C11SO4 - MnSO4 - COSO4 21,09±0,58 0,05 0,05 0,05 0,03 0,2 18,12±0,58 0,05 0,05 0,05 0,03 При додаванні метюватних преміксів №1 та №2 споживання кисню культурою клітин зростало на 333% та 383% ВІДПОВІДНО Найкращий резуль тат отримано при додаванні до середовища інкубації культури п'ятискладового метюнатного преміксу №3 - дихальна активность була вищою, ніж у контролі на 184,5% Внесення неорганічних солей МІДІ, кобальту, марганцю, заліза збільшувало інтенсивність поглинання кисню на 21,4%, додавання амінокислоти цистеїну разом з неорганічними солями змінювало дихальну активність, на 28,5% відносно контролю Споживання кисню культурою клітин при внесенні чотирискладового цистешатного преміксу зростало на 50%, порівняно з контролем Встановлені зміни дихальної активності культури клітин при дії різних форм мікроелементів та хелатних преміксів свідчать про їх здатність проникати у клітину і включатись в 17,13±0,67 метаболічні процеси, стимулювати споживання кисню та генерацію АТФ Таким чином, із апробованих добавок найбільш ефективними виявились премікси металоорганічних сполук біотичних елементів, а саме - метюнатів у прописі метюнат марганцю 0,05, метюнат МІДІ 0,05, метюнат кобальту 0,03, метюнат цинку 0,05, метюнат заліза 0,025мкг/мл (премікс №3), та пистешатів у прописі цистешат заліза 0,02, цистешат МІДІ 0,02, цистешат кобальту 0,01, цистешат марганцю 0,02мкг/мл (премікс №4) Встановлення особливостей впливу біологічно активних речовин на окремі ланки генерації АТФ і процесів, які зумовлюють споживання кисню при використанні інгібіторів окремих ланок дихального ланцюга показано на Фіг Проведено апробацію добавок in ПІДГОДІВЛЮ проводили за схемою (табл 2) vivo Таблиця 2 Схема проведення досліду Групи Контрольна І дослідна II дослідна III дослідна IV дослідна V дослідна КІЛЬКІСТЬ тва рин у групі 10 10 10 10 10 Характер ГОДІВЛІ основний раціон (ОР) ОР+метюнш 0,01мг/кг ОР+цистеш 0,02мг/кг ОР+премікс №6 (FeSO4 0,05+CuSO4 0,05+MnSO4 0,05+CoSO4 0,03мг/кгж/м) ОР+премікс №3 (метюнат марганцю 0,05+метюнат МІДІ 0,05+метюнат кобальту 0,03+метюнат цинку 0,05+метюнат заліза 0,025мг/кг ж/м) ОР+премікс №4 (цистешат заліза 0,02, цистешат МІДІ 0,02, цистешат кобальту 0,01, цистешат марганцю 0,02мг/кгж/м) 58100 Дослідженнями встановлено порівняно низьку ефективність застосування метіоніну та цистеїну, вищу сольового преміксу №5, а найкращий результат отримано при додаванні до раціону метю 10 натного преміксу №3 та цистешатного №4 (табл 3) Отже, результат, отриманий in vivo, підтверджує дані експериментального матеріалу m vitro Таблиця З Результати апробації добавок in vivo 6,73±0,14 І дослідна група 6,76±0,13 II дослідна група 6,79±0,21 III дослідна група 6,84±0,32 IV дослідна група 7,00±0,17 106,01 + 1,61 106,60±1,20 105,8±1,49 112,94±1,17 118,11 + 1,56 *** 118,21 + 1,90 Загальний білок, г/л 80,0±0,89 82,8±0,90 83,1±0,99 83,2±0,60 84,9±0,42 84,0±0,67 АлАТ ммоль/год/л) 0,43±0,02 0,48±0,02 0,47±0,03 0,48±0,0,07 0,53+0,03 0,52+0,04 Ac AT ммоль/год/л Середньодо-бові прирости 1,00±0,09 648 1,14±0,02 713 0,86±0,03 727 0,88±0,04 746 1,27+0,07 819 1,12±0,07 798 Показник Контроль Еритроцити, 10'7л Гемоглобін, г/л Отже, спосіб забезпечує високу чутливість і відтворюваність, низьку вартість, швидке отримання результатів, надійність контролю за якістю проведення досліджень Культура клітин гранульози не вимагає спеціальних обробок (трипсинізація, особливі умови підготовки та культивування), характеризується ГЛІКОЛІЗОМ та диханням Комп'ютерна верстка Н Лисенко V дослідна група 7,11±0,18 (характерно для метаболізму живих організмів) Отже, забезпечує максимально подібні умови метаболізму, властиві для організму тварин Таким чином, отримані результати дозволяють прогнозувати вплив біологічно активних речовин на організм тварин і цілеспрямовано їх використовувати Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна