Спосіб одержання лікарського препарату церулоплазмін

Спосіб одержання лікарського препарату церулоплазмін шляхом гомогенізації ВІДХОДІВ виробництва імуноглобулінів або альбумінів в розчині хлористого натрію, сорбції на юнообміннику, елюції і очищення препарату етиловим спиртом і сумішшю спирт-хлороформу, стерилізуючої фільтрації та люфілізацм, який відрізняється тим, що сорбцію церулоплазміну проводять розчином хлористого натрію при рН 5,0-5,2, елюцію проводять 0,24-0,26М розчином хлористого натрію при рН 5,5, а розчин церулоплазміну після спиртового і спирт-хлороформного очищення піддають ультрафільтрації на порожнистих волокнах під 100 до 150кДта витримують при t=60°C протягом 10 годин Винахід відносится до технології одержання ферменту крові людини - церулоплазміну і може бути використаний при виробництві медичних препаратів Церулоплазмін - МІДЬВМІСНИЙ фермент плазми крові Він виконує функцію транспорту МІДІ, будучи донором ІОНІВ Си 2+ для ферментів дихання, окислює більшість біологічно активних сполук, має антиоксидантні і радюпротекторні властивості, необхідний для кровотворення Цей фермент відноситься до групи білків "гострої фази", що здійснюють захист організму від шкідливого впливу чинників хімічної, фізичної та біологічної природи Як лікарський препарат, церулоплазмін був створений вченими Інституту експериментальної патологи, онкології і радіобіології їм Р Є Кавецького НАН України та спеціалістами Київського державного підприємства по виробництву бактерійних препаратів "Бюфарма" і зареєстрований в Україні 11 10 1996 року за №11/96/322/6 Церулоплазмін - ефективний препарат для лікування важкохворих (септичні процеси, серцевосудинні, ОНКОЛОГІЧНІ захворювання) і надання допомоги в екстремальних ситуаціях (важкі травми, опіки, опромінення) Особливо показане застосування церулоплазміну у хворих, що перенесли термінальний стан різного генезу (патент України №22022, 1997) Хороші результати застосування церулоплазміну одержані при лікуванні хворих з гострим та хронічним остеомієлітом, ревматизмом, інфекційним ендокардитом, ішемічною хворобою серця Церулоплазмін рекомендований МОЗ України для лікування залізодефіцитних, гемолітичних, а також нормохромних анемій у осіб, які працювали і продовжують працювати в зоні Чорнобильської АЕС, при цьому лікування іншими засобами, в тому числі препаратами заліза, у цих хворих, як правило, не ефективне (Информационное письмо №165-95 МОЗ Украины «О нововведениях в системе здравоохранения») Випускається церулоплазмін Київським державним підприємством по виробництву бактерійних препаратів "Бюфарма" ВІДОМІ способи одержання церулоплазміну грунтуються на сорбції його на ДЕАЕ-сорбенті з наступним очищенням методами сольового або спиртового осадження, гельфільтрацм, перекристалізації (патент UA №2019, 1994) Суттєвим недоліком відомих промислових способів одержання церулоплазміну є великі втрати його в процесі виділення на різних технологічних етапах, відсутність стадії термічної обробки для забезпечення вірусологічної безпеки у ВІДПОВІДНОСТІ з вимогами міжнародних стандартів О о (О Найбільш близьким способом того ж призначення до заявленого способу, який ми беремо за прототип, є спосіб одержання церулоплазміну, що включає гомогенізацію ВІДХОДІВ виробництва імуноглобулінів в розчині хлористого натрію, сорбцію на юнообміннику, елюцію і очищення препарату етиловим спиртом і сумішшю хлороформетиловий спирт, стерилізуючу фільтрацію та лю6 філізацію (Патент України №1319, МПК А61К35/16, 1989) Ця технологія забезпечує досить низький вихід церулоплазміну (в межах 0,40,5г на 1кг осаду) Причини, що перешкоджають при використанні прототипу одержати очікуваний технічний результат, обумовлені тим, що умови сорбції і елюції церулоплазміну з юнообмінника не дозволяють досягти оптимального виходу церулоплазміну і очистки його від баластних білків Крім того, за відомою технологією не забезпечуються необхідні вимоги міжнародного стандарту щодо вірусологічної безпеки препаратів, оскільки, недостатня очистка церулоплазміну за відомим способом призводила б до втрати ферментативної активності в умовах довготривалого витримування його при високій температурі В основу винаходу, що заявляється покладено завдання удосконалення способу одержання церулоплазміну шляхом зміни рН та молярності розчину хлористого натрію при сорбції та елюції, умов ультрафільтрації та стерилізуючої фільтрації забезпечити збільшення виходу кінцевого продукту, не погіршуючи його фізико-хімічних характеристик, спрощення і здешевлення технології та дотримання міжнародних норм стерилізації для одержання лікарського апірогенного препарату Поставлене завдання вирішується тим, що у відомому способі одержання церулоплазміну шляхом гомогенізації ВІДХОДІВ виробництва імуноглобулінів в розчині хлористого натрію, сорбції на юнообміннику, елюції і очищення етиловим спиртом і сумішшю хлороформ-етиловий спирт, стерилізуючої фільтрації та люфілізацм, згідно з винаходом сорбцію церулоплазміну проводять розчином хлористого натрію при рН 5,0-5,2, а елюцію проводять 0,24-0,26М розчином хлористого натрію при рН 5,5, а розчин церулоплазміну після спиртового і спирт-хлороформного очищення піддають ультрафільтрації на порожнистих волокнах від 100 до 150кД і витримують при t=60°C протягом 10 годин При сорбції 0,07-0,09М розчином хлористого натрію при рН 5,0-5,2 досягається оптимальна сорбція церулоплазміну і не відбувається суттєвої сорбції інших білків Елюція 0,24-0,26М розчином хлористого натрію при рН 5,5 перешкоджає вимиванню баластних білків з юнообмінника, що дозволяє на даному етапі одержати максимально чистий розчин церулоплазміну На етапі ультрафільтрації на порожнистих волокнах від 100 до 150кД після спиртового і спиртхлороформного очищення доводять ступінь очистки до такого рівня, що подальше витримування його при t=60°C протягом 10 годин, як це вимагається за міжнародним стандартом для досягнення вірусологічної безпеки, не призводить до втрати 61200 церулоплазміном фізико-хімічних властивостей і його ферментативної активності Спосіб одержання церулоплазміну здійснюється шляхом гомогенізації ВІДХОДІВ виробництва імуноглобулінів або альбумінів, як донорської так і ретроплацентарної крові в 0.05М розчині хлористого натрію, сорбції церулоплазміну на ДЕАЕцелюлозі при рН 5,0-5,2 і відмивання баластних білків 0,07-0,09М розчином хлористого натрію при рН 5,0-5,2, елюції церулоплазміну 0,24-0,26М розчином хлористого натрію при рН 5,5, осадження білків етанолом в кінцевій концентрації 65-75 об%, розчинення осаду в 0,25 М розчині хлористого натрію, осадження баластних денатурованих білків сумішшю етанол-хлороформ (24-26об% і 24об% ВІДПОВІДНО) при рН 5,2-5,3 і t=24-26°C, відділення осаду центрифугуванням, осадження кінцевого продукту із надосадної рідини, витримуючи її протягом 12 годин при t= -10°С в присутності етилового спирту з кінцевою концентрацією 4555об%, розчинення осаду в фізіологічному розчині, ультрафільтрації розчину на порожнистих волокнах від 100 до 150кДта прогрівання розчину при t=60°C протягом 10 годин Одержаний розчин церулоплазміну після стерилізуючої фільтрації розливають в ампули чи флакони і зберігають у вигляді розчину чи люфілізують Цей спосіб повністю задовольняє вимоги міжнародних стандартів щодо вірусологічної безпеки препаратів Суть винаходу пояснюється конкретними прикладами виконання Приклад І Зкг фракції IV по Кону сироватки донорської крові гомогенізують в 30л 0.05М розчину хлористого натрію при t=5°C До гомогенату додають 0,3кг ДЕАЕ-целюлози Доводять рН до 5,0 додаванням 0,135л 1н соляної кислоти Суміш залишають при слабкому перемішуванні на 18 годин при 1=5°С Церулоплазмін, сорбований целюлозою відмивають від баластних білків на нутч-фільтрі через бавовняну тканину охолодженим до t=5°C 0.07M розчином хлористого натрію при рН 5,0 до тих пір, поки оптична ЩІЛЬНІСТЬ промивної рідини на виході стане не менше 0,1 при Е280 Потім сорбент переносять в хроматографічну колонку і проводять елюцію церулоплазміну 0.25М розчином хлористого натрію при рН 5,5 і t=O°C, Одержують 1,3л елюату з оптичною ЩІЛЬНІСТЮ при Еєю рівною 0,275 і рН 5,42 Доводять рН суміші до 6,8 додаванням 2мл 1н лугу (NaOH), додають 3,9л охолодженого до t= -2°C 96% етилового спирту (кінцева концентрація 75об%) і перемішують протягом 1 години Після витримування протягом 1 години при t= -2°C суміш центрифугують протягом 2-х годин при 16000об/хв Потім 5 1 Г осаду розчиняють в 0,5л 0.25М розчину хлористого натрію при t=5°C і центрифугують протягом 2-х годин при 16000об/хв для відокремлення денатурованих баластних білків, що не розчинилися Доводять рН надосадної рідини до 5,2 1н розчином соляної кислоти і додають 0,13л 96% етилового спирту і 0,28л хлороформу (кінцева концентрація спирту 24-26об% і хлороформу 2-4об%) Суміш перемішують протягом ЗО хвилин і осад, що утворився, ВІДДІЛЯЮТЬ центрифугуванням при 16000об/хв протягом 1 го дини 0,65л центрифугату перемішують з 0,89л 96% етилового спирту (кінцева концентрація спирту 55%), витримують 12 годин при t= -10°С і центрифугують 1 годину при 16000об/хв Осад церулоплазміну, що утворився розводять в 70% етиловому спирті і ВІДДІЛЯЮТЬцентрифугуванням протягом 1 години при 3000об/хв і потім розчиняють його в 0,155л 0.85М фізіологічного розчину хлористого натрію і центрифугують протягом ЗО хвилин при 3000об/хв Для видалення СЛІДІВ хлороформу і спирту церулоплазмін піддають ультрафільтрації через порожнисті волокна від 100 до 150кД Одержують 0,156л розчину церулоплазміну з концентрацією 20,1мг/мл Вихід ЦІЛЬОВОГО препарату приблизно 1,3г на 1кг осаду, оптичний коефіцієнт 0,036 біологічна активність 16 одиниць Розчин церулоплазміну витримують протягом 10 годин при t=60°C, піддають стерилізуючій фільтрації і розливають в ампули Приклад II 30кг фракції III по Кону сироватки ретроплацентарної крові гомогенізують в 300л 0.05М розчину хлористого натрію при t=5°C До гомогенату додають Зкг ДЕАЕ-целюлози Доводять рН суміші до 5,0 додаванням 1,350л 1н соляної кислоти Суміш залишають при слабкому помішуванні на 18 годин при t=5°C Целюлозу з сорбованим на ній церулоплазміном відмивають від баластних білків на нутч-фільтрі через бавовняну тканину охолодженим до t=5°C розчином 0.09М хлористого натрію при рН 5,2 до того часу, поки оптична ЩІЛЬНІСТЬ промивної рідини на виході не стане меншою 0,1 при Е28о Потім сорбент переносять в хроматографічну колонку і проводять елюцію церулоплазміну 0.26М розчином хлористого натрію при рН 5,5 і t=O°C Одержують 12л елюату з оптичною ЩІЛЬНІСТЮ 0,275 при Ебю Доводять рН суміші до 6,8 додаванням 20мл 1н лугу (NaOH), додають 36л охолодженого до t= -2°C 96% етилового спирту (кінцева концентрація 75об%) Після витримування протягом 1 години при t= -2°C суміш центрифугують при 16000об/хв протягом 2-х годин Потім 470г осаду розчиняють в 5л 0.25М розчину хлористого натрію при t=5°C і центрифугують при 16000об/хв протягом 2-х годин для відділення денатурованих білків, що не розчинилися Доводять рН надосадноі рідини до 5,2 додаванням 1н розчину соляної 61200 кислоти і підігрівають до t=25°C додають 1,3л 96% етилового спирту і 0,28л хлороформу (кінцева концентрація спирту 24-26об% і хлороформу 24об% ВІДПОВІДНО) Суміш перемішують протягом ЗО хвилин і осад, що утворився, ВІДДІЛЯЮТЬ центрифугуванням при 16000об/хв протяюм 1 години 6л центрифугату перемішують з 7,9л 96% етилового спирту (кінцева концентрація 55%), витримують 12 годин при I F -10°С І центрифугують 1 годину при 16000об/хв Осад церулоплазміну, що утворишся, розводять в 70 % етиловому спирті і ВІДДІЛЯЮТЬ центрифугуванням проіягом 1 години при 3000об/хв, потім розчиняють його в 1,550л 0.85М розчином хлористого натрію і центрифугують протягом ЗО хвилин при 3000 об/хв Для видалення СЛІДІВ хлороформу і етилового спирту розчин церулоплазміну піддають ультрафільтрації через порожнисті волокна від 100 до 150кД з розміром пор 0,220мкм Одержують 1,530л розчину церулоплазміну з концентрацією 20,2мг/мл Вихід ЦІЛЬОВОГО препарату приблизно 1г на 1кг осаду, оптичний коефіцієнт 0,04, біологічна активність 18 одиниць Розчин церулоплазміну витримують протягом 10 годин при 1=60°С, піддають стерилізуючій фільтрації і розливають в ампули Як видно з прикладів, вихід цільового продукту збільшився майже в два рази в порівнянні зі способом-прототипом, при цьому біологічна активність препарату не знизилась Заявлений спосіб одержання церулоплазміну не вимагає додаткового обладнання і фінансових витрат Київське державне підприємство по виробництву бактерійних препаратів "Бюфарма" має всі можливості для одержання церулоплазміну заявленим способом Результати дослідної перевірки церулоплазміну наведені в таблиці В результаті перевірки дослідних серій церулоплазміну встановлено, що його фізико-хімічні характеристики відповідають вимогам Фармкомітету і Тимчасової фармакопейної статті і зберігаються протягом 2-х років Результати випробувань п'ята серій препарату "Розчин церулоплазміну" 2% виготовленого на Державному Київському підприємстві "Бюфарма" в процесі зберігання 61200 IOGJ- 6 MIC Теж 04 0!» 96 12 Те ж *I8OJ« 03.97 MC I bo»IS Теж 71097. MC I ms&£.6498 j>3 07£0898 24 see. Теж 2? MC Теж I Теж Теж ТЕЖ Те к. 0,38 Теж 7,(1 Теж Теж Теж Теж Теж 0,05 O 4 D6 Теж Теж Теж Теж 038 Теж Те ж | Те ж Теж Теж Теж Теж Теж Теж Теж 0,375 Теж 6.S5 Теж 1е ж Теж Теж 0,04 0045 0,028 10, 5 ОД 0045 0,026 10. 5 Теж Теж 038 Теж 6,95 і ЕЖ ТЕЖ Теж Теж Теж Теж Теж Теж 0,36 Теж го Теж Теж Теж Теж Відповідає 70 ,6 Від- Від- Сте- Ага- Нетопові- пові- ри- родає дає льня ген- ннй а ыий 70 , 70 , Теж Теж Теж Теж Теж 7,і)5 Теж Теж Теж Теж Теж Опаяесдп юча рідина бя. Ї їїозита Не 0,5 вна переВК щує їС Ж Теж Texd Теж ІС Ж 11 од 0945 0,26 од 0646 0,025 10 ),05 Q04 0,03 4 10 15, 2 а -53,62% Р-46,58% « -53,62% Р-46,38% а-53,62% р -46,38% п-53,62% ' 0 -46,38% а -53,-й2% 0 -46,38% а -53,62% g -46,38% КИІ Ьб05~ 40496 Eo 05.96 BHX. 3 12S 17,12-96ЇМІЄ 12 6.05Ю05 97 MIC. 18 £511MIC И297 24 18 05B.8&S8 MIC 27 MSL9S ]• ного кольору їїжжт- Позиівна тивна Тгж Теж 0,49 Теж Теж Теж 0,48 Теж Теж Теж 0,48 Теж Теж Тек Теж 1 0,45 Тс ж 7,0 Теж Теж Теж Теж Теж Теж Теж Теж G-,45 Теж 7,3 Теж Теж Таж Таж Теж Теж Теж Теж Теж Теж Теж Теж Теж Теж Теж Тє ж. Теж Теж MIC , Теж Теж Теж Теж Теж ОД U045 0,029 Н, а-53,62% 8 J3 -46,38% ОД С045 0,027 14, а-53,52% 5 £-46,38% од CQ45 0,027 14, а -53,52% 0 р -46,38% ОД (,044 і 0,027 13, а-53,62% 6 р-46,31ft од £,044 9,027 13. \ 2 - 5 Д 6 Ж 5 ! р-4638% 1 61200 10 Продовження таблиці Зберігання В сухому МІСЦІ при температурі не вище +5°С Пакування Серм30396,40496 по 5мл в ампули типу іп-5, ТУ У 004809-005-96 Серії 50696,10997, 21297 у флакон ФО ТУ-64-2-10-87 Комп'ютерна верстка Н Лисенко Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119