Спосіб ліофілізації водного розчину активованого білка с, ліофілізована фармацевтична композиція, яка містить активований білок с, одержаний вказаним способом

Цей винахід, у загальному плані, має відношення до способу зниження саморозкладу активованого білку С під час обробки та очищення. Білок С є сериновою протеазою та природним антикоагулянтом, який відіграє роль у регулюванні гомеостазу шляхом інактивації Факторів Va та VlIIa у системі згортання крові. Людський білок С утворюється in vi vo головним чином у печінці у вигляді одноланцюгового поліпептиду, який складається з 461 амінокислоти. Ця молекула-попередник піддається численним посттрансляційним модифікаціям, до яких належить 1) гідроліз 42-амінокислотної сигнальної послідовності; 2) протеолітичне видалення з одноланцюгового зимогену залишку лізину у положенні 156 та залишку аргініну у положенні 157 з одержанням молекули 2-ланцюгової форми (тобто легкого ланцюгу з 155 амінокислотних залишків, який приєднано через дисульфідний місток до важкого ланцюгу з 262 амінокислотних залишків, до складу якого входить серинова протеаза); 3) залежне від вітаміну K карбоксилювання дев'яти залишків глутамінової кислоти, згрупованих у перших 42 амінокислотах згаданого легкого ланцюгу, наслідком чого є одержання дев'яти залишків гамма-карбоксиглутамінової кислоти (GLA); та 4) приєднання вуглеводу у 4 місцях (одне у згаданому легкому ланцюзі та три у згаданому важкому ланцюзі). До складу згаданого важкого ланцюгу входить добре відома серинпротеазна триада Asp257, His211 та Ser360. І, нарешті, циркулюючий 2-ланцюговий зимоген активується in vivo тромбіном на поверхні фосфоліпіду у присутності іону кальцію. Активація є наслідком видалення додекапептиду на N-кінцевій ділянці згаданого важкого ланцюгу з утворенням активованого білку С (аРС), який має ферментну активність. У злагоді з іншими білками, активований білок С функціонує як, можливо, найважливіший негативний регулятор згортання крові, наслідком якого є тромбоз. На жаль, аРС може також саморозкладатись, наслідком чого є зниження його функціональності, як антикоагулянта. Визнаним шляхом розкладу активованого білку С у цій галузі є протеолітична вирізка на згаданому лізиновому залишку у положенні 308 важкого ланцюгу, наслідком чого є утворення фрагменту зі 111 амінокислот. Цей продукт розкладу у данній галузі називають фрагментом ЕАК. Увагу під час здійснення попередніх спроб зниження саморозкладу було концентровано на зведенні утворення згаданого фрагменту ЕАК до мінімального рівня. Найбільшої уваги заслуговує спосіб зменшення саморозкладу аРС до мінімального рівня, який було розкрито Проті (Prouty) та іншими, ЕР 0662513 від 12 червня 1995 року, суть якого полягає у регулюванні рН у межах від приблизно 6,3 до 7,0; інкубуванні аРС у 3М сечовині; або підданні аРС впливу граничних концентрацій солі (вище 0,4М або нижче 0,05М). Заявники відкрили другий важливий шлях розкладу - наслідком саморозкладу N-кінцевої ділянки згаданого легкого ланцюгу може бути вирізка на будь-якій стороні згаданого гістидинового залишку у положенні 10. Цей шлях розкладу веде до утворення двох інактивованих продуктів. Згадана N-кінцева вирізка перших дев'яти залишків згаданого легкого ланцюгу дає дез(1-9)активований білок С, згадана N-кінцева вирізка перших десяти залишків згаданого легкого ланцюгу дає дез(1-10)активований білок С. Цей шлях розкладу, про який раніше не повідомлялось, веде до втрати антикоагуляційної активності внаслідок видалення критичних залишків карбоксиглутамінової кислоти у положеннях 6 та 7. Таким чином, зведення до мінімуму рівня продуктів саморозкладу дез(1-9) та дез(1-10)активованого білку С є важливою умовою для одержання активної фармацевтичної лікарської форми активованого білку С високого рівня чистоти. Ці варіанти були раніше невідомими продуктами розкладу і їх надзвичайно важко, якщо взагалі можливо, видалити за допомогою традиційних способів очистки. Умови зведення їх утворення до мінімального рівня були раніше невідомими. Ідентифікація Заявниками цього важливого шляху саморозкладу активованого білку С надала можливість відкриття умов обробки та одержання лікарських форм для підвищення рівня чистоти та активності згаданого активованого білку С Заявники продемонстрували, що при низьких рівнях рН (наприклад, нижче 6,3), згаданий шлях саморозкладу, який сприяє дез(1-9)аРС або дез(1-10)аРС, домінує над згаданим 308-309 шляхом саморозкладу, однак застосування підвищених концентрацій хлориду натрію (більше, ніж 150мМ) при рН нижче 6,3, суттєво зменшує об'єм реакції саморозкладу згаданого дез(1-9)аРС та/або дез(1-10)аРС. Відповідним чином, цей винахід надає спосіб обробки активованого білку С при іонній силі вище, ніж 150мМ та при рН у межах від приблизно 5,5 до менше, ніж 6,3. Утворення дез(1-9)аРС та дез(1-10)аРС за цих умов значно зменшується. Цей винахід, таким чином, надає поліпшений спосіб обробки водного розчину активованого білку С без небажаного розкладу. На Фіг. наведено первинну структур у активованого людського білку С для полегшення ілюстрування згаданого у цьому описі шляху саморозкладу, опис якого наводиться. Основу термінології, прийнятої у цьому описі, складає числове позначення основної послідовності людського активованого білку С. Фахівцю у цій галузі зрозуміло, що основна послідовність інших видів активованого білку С може незначно змінюватись, наслідком чого є термінологічні зміни, визначені у цьому описі. Цей винахід надає водні розчини активованого білку С та поліпшений спосіб обробки таких розчинів, який включає обробку при іонній силі, яка перевищує 150мМ, та при рН у межах від приблизно 5,5 до менше, ніж 6,3. Цей винахід додатково надає спосіб очищення активованого білку С шля хом хроматографічного розподілу, який включає елюювання згаданого активованого білку С під час згаданого хроматографічного розподілу за допомогою водного елюювального розчину, який має іонну силу над 150мМ та рН у межах від приблизно 5,5 до менше, ніж 6,3. Цей винахід додатково надає спосіб концентрування розчину активованого білку С шляхом фільтрування, який включає подачу згаданого активованого білку С на фільтрувальну мембрану у вигляді водного розчину, який має іонну силу над 150мМ та рН у межах від приблизно 5,5 до менше, ніж 6,3. Цей винахід надає також активований білок С, одержаний за допомогою способів, опис яких наведено. Цей винахід, врешті-решт, надає фармацевтичні лікарські форми активованого білку С, до складу яких входить менше 10% (мас.) дез(1-9)аРС та/або дез(1-10)аРС. Усі скорочені позначення амінокислот, які використано у розкритті цього винаходу, відповідають прийнятим Патентним відомством США, згідно до §1.822(В)(2) 37 Зводу федеральних правил. Для цілей цього винаходу, які розкрито та заявлено у цьому описі, використано наведені терміни, визначення яких наведено далі. Термін аРС або активований білок С означає білок С, який було одержано рекомбінантними способами або з плазми. аРС включає та є, переважно, людським білком С, хоча аРС може включати також білок інших видів або похідні, які мають протеолітичну, амідолітичну, ефіролітичну та біологічну (антикоагулянтну або профібринолітичну) активність білку С. Приклади похідних білку С наведено у патенті США №5,453,373, який було видано на ім'я Герліца (Gerlitz) та інших, та у патенті США №5,516,650, який було видано на ім'я Фостера (Foster) та інших; описи до згаданих патентів включено до цього опису у повному об'ємі як посилання. АРТТ - тромбопластиновий час (час утворення згустку плазми при доданні частково активованого тромбопластину). Термін "водний" означає суміші розчинників, а також застосування тільки води, як розчиннику. Термін "водний", за переважним варіантом, означає лише воду, як розчинник. Термін "хроматографічний розподіл" означає спосіб хроматографування, який визнано і який застосовується у цій галузі, у тому числі, ви тіснювальне хроматографування, аніонне хроматографування, катіонне хроматографування, гідрофобне хроматографування, хроматографування з оберненою фазою і т.ін. Термін "проточна фільтрація" означає розподіл за допомогою тангенціального потоку через фільтрувальну мембрану, причому згаданий продукт затримується згаданою мембраною (наприклад, фільтрація з метою концентрування або діафільтрація) або проходить через мембрану (наприклад, фільтрація з метою видалення вірусу). PC - зимоген білку С. Термін "обробка" означає типові фізичні процеси хімічної технології, які застосовуються при одержанні активованого білку С, наприклад, хроматографування на колонках, фільтрація (проточна вздовж потоку, проточна, кінцева), ліофілізація, перекачування або зберігання. r-аРС - рекомбінантний активований білок С, який було одержано шляхом активування зимогену білку С in vitro або шляхом безпосередньої секреції активованої форми білку С прокаріотичними клітинами, еукаріотичними клітинами або трансгенними тваринами, у тому числі, наприклад, секрецією із лінії клітин 293 нирок людини у вигляді зимогену, з подальшим очищенням та активуванням за методами, добре відомими досвідченому фа хівцю та наведеними у патенті США №4,981,952, який було видано на ім'я Яна (Yan), та WO 97/20043 на ім'я Коттінхема (Cottingham). Цей винахід має відношення до поліпшеного способу обробки активованогобілку С. Цей винахід, зокрема, має відношення до обробки активованого білку С шля хом здійснення операцій збагачення білку або концентрування та очищення білку з одночасним зменшенням рівня саморозкладу. Цей винахід відрізняється присутністю такої обробки, і, зокрема, таких операцій модифікування, збагачення та очищення, які здійснюються з використанням водного розчину згаданого білку за умов, опис яких наведено. Комбінація умов, які заявлено у цьому описі, зводить до мінімуму утворення дез(1-9)аРС та дез(1-10)аРС. Дез(1-9)аРС та дез(1-10)аРС надзвичайно важко видалити за допомогою відомих способів очищення, тому їх утворення під час виготовлення фармацевтичних лікарських препаратів аРС бажано звести до мінімального рівня. Активований білок С, одержаний за згаданих заявлених умов, є по суті вільним від варіантів дез(19)аРС та дез(1-10)аРС. Взагалі, фармацевтичні лікарські форми аРС, одержані за згаданих умов, є по суті вільними від дез(1-9)аРС та дез(1-10)аРС і, взагалі, мають менше 10%(мас), за переважним варіантом менше 8%(мас), за більш переважним варіантом менше 5%(мас.) і за найбільш переважним варіантом менше 3%(мас.) цих варіантів, індивідуально або у комбінації. Ліофілізовані фармацевтичні лікарські форми, одержані з застосуванням аРС, одержаного, як описано та заявлено у цьому описі, демонструють поліпшену стійкість у розчиненому стані (перед ліофілізацією) та 24-48-годинну стійкість після відновлення. Не більше 5% зниження активності спостерігається у межах часу до п'яти днів при температурі від 2°С до 8°С, до 50 годин при температурі 15°С, та до 40 годин при температурі 25°С. Раніше, до появи цього винаходу, подібна стійкість була недосяжною. Завдяки старанному регулюванню рН, іонної сили та, за переважним варіантом, температури, саморозклад активованого білку С у водних розчинах під час обробки та одержання лікарських форм може бути знижено до рівнів, раніше недосяжних, зокрема, за відсутності сечовини або інших агентів денатурування, гістидину, гідрохлориду лізину або альбуміну. У більш широких межах практичного втілення цього винаходу передбачається, що обробка білку С включає різноманітні типові фізичні процеси хімічної технології, операції фізичного відокремлення та очищення, у тому числі, обробку хроматографічними засобами та засобами проточної фільтрації, наприклад, для очищення білкової композиції, концентрування білкового розчину або для заміни розчиннику, а також можливі способи хімічної та ферментної обробки. Обробка білку, яка передбачається цим винаходом, включає, зокрема, очищення стандартними хроматографічними способами, наприклад, іонообмінним хроматографуванням, гідрофобним хроматографуванням і т.ін., та концентрацію білку шляхом ультрафільтрації та подібних способів. Обробка білку передбачає також включення зберігання згаданого білкового розчину у баках для збереження і тому подібні етапи, які є підготовчими до згаданого очищення та концентрування. З метою зменшення нестійкості, уся обробка згаданого розчину активованого білку С, у тому числі різні етапи очищення та концентрування білку, здійснюється за умов, опис яких наведено. Такі етапи обробки спрямовано на кінцеве виділення згаданого білку, як правило, у вигляді ліофілізованого порошку, з метою його введення до складу фармацевтичної лікарської форми. рН згаданого водного оброблювального розчину знаходиться на рівні від приблизно 5,5 до менш, ніж 6,3. За більш переважним варіантом на рівні від 5,7 до менш, ніж 6,3. За ще більш переважним варіантом рН знаходиться на рівні від приблизно 5,6 до приблизно 6,2. За ще більш переважним варіантом рН знаходиться у межах від приблизно 5,8 до приблизно 6,2. За ще більш переважним варіантом рН знаходиться у межах від приблизно 5,9 до приблизно 6,1. Найбільш переважний рН дорівнює приблизно 6,0. До складу репрезентативних буферних систем для забезпечення ефективного регулювання рН входять Трис-буфер ацетат, цитрат натрію, цитрат калію, цитрат-гліцин та фосфат натрію. До складу більш переважних буферних систем входять цитрат натрію та фосфат натрію. Найпереважнішим буфером є цитрат натрію. Переважна молярність згаданої буферної системи знаходиться у межах від 10мМ до 50мМ. Найбільш переважна молярність знаходиться у межах від 20мМ до 40мМ. Досвідченому фахівцю відомі численні інші доступні буферні системи, які також можна використати для підтримки рН у згаданих межах. Іонна сила згаданих оброблювальних розчинів є др угим критичним елементом цього винаходу. Іонну силу, як правило, одержують шляхом додання фармацевтично прийнятних солей, за переважним варіантом хлориду натрію або хлориду калію. Іонну силу за переважним варіантом, яка перевищує або дорівнює 150мМ, одержують за допомогою концентрації солі у буферному розчині, яка перевищує 150мМ. Для полегшення процесу у цілому (від початку до кінця) концентрація солі за переважним варіантом не повинна перевищувати 1000мМ. За більш переважним варіантом концентрація солі повинна знаходитись у межах від приблизно 200мМ до 1000мМ. Раніше гадали, що концентрації вище 50мМ та нижче 400мМ є неприйнятними. Додатковою умовою для забезпечення мінімального рівня саморозкладу є температура. За переважним варіантом робоча температура під час обробки розчину повинна знаходитись у межах від 0°С до 10°С, за більш переважним варіантом вона повинна знаходитись у межах від 2°С до 8°С; за межами згаданих температур відбувається суттєвий саморозклад активованого білку С. Припустимим, однак, без пошкодження цілісності згаданого активованого білку С, є нетривале перевищення температури 10°С. Концентрація активованого білку С не є критичною для цього винаходу. Суттєвим є те, що можливість обробки білку з високими концентраціями значно підвищується за умов, опис яких наведено. Переважна концентрація білку складає від приблизно 1мг/мл до приблизно 50мг/мл, за більш переважним варіантом від 1мг/мл до 30мг/мл, за ще більш переважним варіантом від 1мг/мл до 20мг/мл, і за найбільш переважним варіантом від 1мг/мл до 10мг/мл, хоча придатними вважаються і більш високі або більш низькі концентрації. Активований білок С, одержаний згідно до наведеного опису, є придатним для лікування різноманітних набутих хворобливих станів, які залучають внутрішньосудинне згортання, у тому числі тромботичну апоплексію, глибокий венозний тромбоз, емболію легеневої артерії, тромбоз периферичних артерій, емболи серцевого та периферичноартеріального походження, гострий інфаркт міокарду, генералізований тромбогеморагічний синдром та гострі перед- або посткапілярні оклюзії, у тому числі, трансплантаційний тромбоз або тромбоз сітківки ока. Активований білок С є ідеально придатним до введення в лікарські форми у ліофілізованому стані з наповнювачем. Наповнювач, за переважним варіантом, підбирають таким чином, щоб він поліпшував стійкість молекули у твердому стані. До прикладів таких наповнювачів належать цукроза, трегалоза та рафіноза. Досвідченому фа хівцю відомо багато інших доступних наповнювачів, які також можуть бути застосовані у активованому білку С. Концентрація наповнювача у лікарській формі є критичною змінною процесу ліофілізування. Переважним наповнювачем є цукроза з концентрацією у розчині, який призначено до ліофілізування, від 15мг/мл до 30мг/мл. Найпереважніша концентрація цукрози у згаданому розчині, який призначено до ліофілізування, складає 15мг/мл у лікарській формі з вмістом аРС, який дорівнює 2,5мг/мл. Найпереважніша концентрація цукрози у згаданому розчині, який призначено до ліофілізування, складає 30мг/мл у лікарській формі з вмістом аРС, який дорівнює 5,0мг/мл. Наведені далі приклади представлено для ілюстрування та пояснення винаходу. Об'єм цього винаходу не повинен розглядатись, як такий, що обмежується цими прикладами. У разі, якщо не вказано інше, усі посилання на частини та відсотки засновано на масі та усі температури виражено у градусах за Цельсієм. Препарат 1 Одержання людського білку С Рекомбінантний людський білок С (зимоген) було одержано з лінії клітин 293 людських нирок за способами, добре відомими досвідченому фахі вцю, наприклад, за способами, які викладено у патенті США №4,981,952, який було видано на ім'я Яна (Yan), опис якого у повному об'ємі включено до цього опису як посилання. Ген, який кодує людський білок С, розкрито та заявлено у патенті США №4,775,624, який було видано на ім'я Бенга (Bang) та інших, опис якого у повному об'ємі включено до цього опису як посилання. Плазмідою, яку було використано для експресування людського білку С у лінії клітин 293, була плазміда pLPC, яку розкрито у патенті США №4,992,373, який було видано на ім'я Бенга (Bang) та інших, опис якого у повному об'ємі включено до цього опису як посилання. Опис конструкції плазміди pLPC наведено також у Європейській патентній публікації №0445939 та у роботі Гріннелла (Grinnell) та інших, 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192. які також включено у повному об'ємі до цього опису, як посилання. Стисло, згаданою плазмідою було трансфектовано лінію клітин 293, після чого стійкі трансформанти було виявлено, субкультивовано та вирощено у безсироваткових живильних середовищах. Після зброджування безклітинне живильне середовище було одержано шляхом мікрофільтрування. Згаданий людський білок С було відокремлено від культуральної рідини за способом Яна (Yan), патент США №4,981,952, опис якого у повному об'ємі включено до цього опису як посилання. Освітлене живильне середовище розводили до 4мМ у етилендіамінтетраоцтовій кислоті (EDTA) перед тим, як його було абсорбовано аніонообмінною смолою (Fast-Flow Q, компанія Pharmacia). Після промивання 4 об'ємами колонки 20мМ Трис-буфером, 200мМ NaCl, рН7,4, та 2 об'ємами колонки 20мМ Трис-буферу, 150мМ NaCl, рН7,4, зв'язаний зимоген рекомбінантного людського білку С елюювали 20мМ Трис-буферу, 150мМ NaCl, 10мМ СаСІ2, рН7,4. Чистота одержаного елюйованого білку, за даними електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію, перевищувала 95%. Додаткове очищення згаданого білку здійснювали шляхом його розчинення (3М) у NaCl, з подальшим адсорбуванням на гідрофобну інтерактивну смолу (Toyopearl Phenyl 650M, компанія TosoHaas), яку було урівноважено за допомогою 20мМ Трис-буферу, 3М NaCl, 10мМ СаСl2, рН7,4. Після промивання 2 об'ємами колонки урівноваженого буфер у без СаСl2, одержаний зимоген рекомбінантного людського білку С елюювали за допомогою 20мМ Трис-буферу, рН7,4. Одержаний елюйований білок готували до активування шляхом видалення залишкового кальцію. Згаданий зимоген пропускали через металеву афінну колонку (Chelex-100, компанія Bio-Rad) з метою видалення кальцію та поновно зв'язували з аніонообмінною смолою (Fast Flow Q, компанія Pharmacia). Обидві згадані колонки розміщували послідовно та урівноважували за допомогою 20мМ Трис-буфер у, 150мМ NaCl, 5мМ EDTA, рН7,4. Після завантаження згаданого білку, колонку Chelex-100 промивали одним об'ємом колонки того ж самого буферу перед її відокремленням від згаданої послідовності. Згадану аніонообмінну колонку промивали 3 об'ємами колонки урівноважувального буферу перед елююванням білку за допомогою 0,4М NaCl, 20мМ суміші Трис-буферу-ацетату, рН6,5. Концентрації білку рекомбінантного людського білку С вимірювали шляхом визначення екстинкції ультрафіолетового випромінювання на 280нм. Е0,1%=1,81. Препарат 2 Активація рекомбінантного людського білку С Тромбін великої рогатої худоби сполучали з активованою сефарозою (Activated CH-Sepharose 4В (компанія Pharmacia)) у присутності 50мМ ГЕПЕС-буферу, рН7,5 при температурі 4°С. Згадану реакцію сполучення здійснювали на смолі, якою вже було заповнено колонку, з використанням приблизно 5000 одиниць тромбіну/мл смоли. Розчин тромбіну циркулював через колонку впродовж приблизно 3 годин перед доданням 2-аміноетанолу (МЕА) до концентрації 0,6мл/л циркуляторного розчину. Одержаний розчин, який вміщував МЕА, додатково піддавали циркуляції впродовж 10-12 годин для забезпечення повного блокування на смолі амінів, які не прореагували. Після блокування тромбін, зв'язаний зі смолою, промивали 10 об'ємами колонки 1М NaCl, 20мМ Трис-буфером, рН6,5 для видалення усього неспецифічно зв'язаного білку, та використовували у реакціях активування після урівноважування у активаційному буфері. Очищений rНРС розчиняли (5мМ) у EDTA (для утворення хелатних сполучень з будь-яким залишковим кальцієм) та розбавляли до концентрації 2мг/мл за допомогою 20мМ Трис-буферу, рН7,4 або 20мМ суміші Трис-буфер у-ацетату, рН6,5. Цей матеріал пропускали через тромбінову колонку, урівноважену при температурі 37°С за допомогою 50мМ NaCl та 20мМ Трис-буфер у, рН7,4, або 20мМ суміші Трис-буферуацетату, рН6,5. Швидкість потоку регулювали таким чином, щоб забезпечити приблизно 20-хвилинну тривалість контактування rНРС та тромбіну на смолі. Потік, який витікав, збирали та негайно перевіряли на амідолітичну активність. У разі, якщо одержаний матеріал не мав специфічної активності (амідолітичної), порівняно до встановленого стандарту аРС, його поновно пропускали через згадану тромбінову колонку для завершення активування rНРС. Після цього одержаний матеріал розбавляли 1:1 за допомогою 20мМ буфер у, як згадувалось перед тим. Антикоагулянтну активність активованого білку С визначали вимірюванням подовження часу згортання у аналізі коагулювальної активності крові при доданні частково активованого тромбопластину (АРТТ). Стандартну криву було одержано у буфері для розбавлення (1мг/мл сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (BSA) (чистого для радіоімунологічних проб), 20мМ Трис-буфер, рН7,4, 150мМ NaCl, 0,02% NaN3) з концентрацією білку С у межах 125-1000нг/мл, у той час як проби було виготовлено у декількох розведеннях у згаданому діапазоні концентрацій. До кожної кювети з пробою додавали 50мкл холодної конячої плазми та 50мкл відновленого частково активованого тромбопластинового реактиву (АРТТ Reagent, компанія Sigma), та інкубували при температурі 37°С впродовж 5 хвилин. Після інкубування до кожної кювети додавали 50мкл відповідних проб або стандартів. Для визначення основного часу згортання крові замість проби або стандарту додавали буфер до розбавлення. Таймер фіброметру (CoA Screener Hemostasis Analyzer, компанія American Labor) запускали після додання до кожної проби або стандарту 50мкл 30мМ СаСl2 (температура 37°С). Концентрацію активованого білку С у пробах вираховували за допомогою лінійного рівняння регресії зі стандартної кривої. Час згортання представляє собою середнє як мінімум трьох повторів, у тому числі зразків стандартних кривих. Концентрації білку рекомбінантного людського білку С вимірювали шляхом визначення екстинкції ультрафіолетового випромінювання на 280нм. Е0,1%=1,85. Приклад 1 Хроматографічний розподіл аРС Розчин аРС (електропровідність приблизно 14мСм та рН5,7) вносили до колонки (9,5см (висота)´9см (ширина)) S-Sepharose Fast Flow з катіонообмінною смолою, яку було послідовно з'єднано з колонкою (25см (висота)´14см (ширина)) Q-Sepharose Fast Flow з аніонообмінною смолою. Обидві колонки було попередньо урівноважено за допомогою 20мМ цитрату натрію, рН6,0 та 150мМ NaCl. Навантаження згаданої колонки становило 10 грамів аРС на літр аніонообмінної смоли. Згадану колонку промивали >2 об'ємами колонки урівноваженого буферу та піддавали ступінчастому елююванню за допомогою 20мМ цитрату натрію, рН6,0, та 400мМ NaCl. Усі операції здійснювали при температурі 2-8°С та при лінійній швидкості потоку 60см/годину. Незважаючи на те, що аРС мав високу активність (539одиниць/мг за результатами АРТТ проби) та достатньо високу концентрацію під час хроматографування (пік>20г/л) та у загальному головному потоці (10грамів/л), одержаний продукт залишався стійким. Результати цих спостережень було підтверджено за допомогою відновлювальної та невідновлювальної мас-спектрометрії легкого ланцюгу, гідролізованого трипсином, яка майже не виявила (