Спосіб одержання фактора ix із біологічних джерел та фактор, одержаний вказаним способом

1 Спосіб одержання фактора IX із біологічних джерел за допомогою хроматографії, який відрізняється тим, що перед розділенням за допомогою афінної хроматографії вказане джерело піддають обробці сульфатом амонію у концентрації від 1,5 до 2,3 мол/л 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як біологічне джерело використовують плазму крові або плазму, яку виснажено по фактору VIII і фібріногену шляхом відокремлення крюпреципітату (крюзбідненої плазми) 3 Спосіб за п 1 або 2, який відрізняється тим, що після осадження білка здійснюють видалення сульфату амонію і збагачення фактора IX шляхом адсорбції фактора IX на хроматографічному матеріалі, що здатний використовуватися для хромато графії з гідрофобною взаємодією (НІС) 4 Спосіб за п 3, який відрізняється тим, що хроматографічний матеріал, який містить адсорбований фактор IX, обробляють водним розчином з іонною силою, яка призводить до відділення фактора IX від вказаного матеріалу для НІС 5 Спосіб за п 3 або 4, який відрізняється тим, що фракції, які одержані після відділення фактора IX від вказаного матеріалу, піддають етапу, у якому зменшують концентрацію солі у розчині, що містить фактор IX, наприклад за допомогою ультрафільтрації або діафільтрацм 6 Спосіб за п 5, який відрізняється тим, що далі здійснюють афінну хроматографію на матеріалі субстрату, який модифіковано гепарином 7 Спосіб за одним з пп від 1 до 6, який відрізняється тим, що інактивацію вірусу здійснюють ХІМІЧНИМИ і/або фізичними засобами 8 Спосіб за п 7, який відрізняється тим, що фізична інактивація вірусу включає теплову обробку при 60-65°С протягом 5-30 годин, зокрема після здійснення афінної хроматографії на гепарині, ВІД Даний винахід стосується способу приготування фактора IX із біологічних джерел методом хроматографії, а також самого фактора IX, який може бути одержаний за способом, ВІДПОВІДНИМ ДО даного винаходу Під час приготування фактора IX, наприклад із плазми крові, перш за все ВІДДІЛЯЮТЬ крюпреципітат Заморожену цитратну плазму розморожують і активності яких становить 0,01 імунізуючої одиниці/мг (IU/mg) протеїну Згідно ЗІ способом, який відомий із рівня техніки, вітамін К -залежні фактори скипання крові зв'язуються методом екстрагування з анюнообмінниками, наприклад з диетиламшоетилом (DEAE) Sephadex, без поновлення ворожої дії альбуміну Однак, внаслідок збіднених реологічних властивостей DEAE Sephadex, дана операція повинна завжди виконуватися як операція екстрагування твердої фази у періодичному процесі Фракції, отримані після елюювання DEAE Sephadex, використо основну КІЛЬКІСТЬ фактора VIII і фібріногену ВІДДІ ЛЯЮТЬ методом центрифугування Отримана таким способом крюзбіднена плазма містить у собі вітамін К -залежні фактори скипання крові, величина О ПОВІДНО до п 6 9 Спосіб за п 7, який відрізняється тим, що хімічна інактивація вірусу включає теплову обробку зразка, який містить фактор IX, неюнними детергентами / діалкілованими або триалкілованими фосфатами 10 Фактор, що одержаний ВІДПОВІДНО ДО способу за одним із пунктів 1-9 ю о о (О 46005 вують як стартовий матеріал для очищення групи фактора IX Однак у даних фракціях здійснюється Поверхневий шар фракції, яку піддавали обтакож збагачення протеаз, внаслідок чого спостеробці протеїновим преципітуючим агентом, нанорігають утрати у виході очікуваного матеріалу, сять на ВІДПОВІДНИЙ хроматографічний матеріал і тобто у виході фактора IX, із - за протеолітичного можуть промивати Елюювання фактора IX, придигерирування, а також відмічають підвищення єднаного до колонки, який ще містить у собі факризику тромбогенності препарату тор IX, може виконуватися буфером, що включає у невисокій концентрації протеїновий преципітуючий Задача, яку вирішує даний винахід, полягає у агент, причому іонна сила розчину елюенту таким створенні і запровадженні способу, який знизив би способом знижується по відношенню до розчину, вказані вище ризики без додавання інгібіторів проякий використовують для нанесення на хроматогтеази Несподівано дійшлися висновку, що дану рафічний матеріал Фракція, що містить фактор IX, задачу можна вирішити за допомогою викорисякий отримують методом елюції із хроматографічтання способу, основні ознаки якого визначені фоної колонки, що включає матеріал гідрофобної рмулою даного винаходу Даний спосіб включає хроматографії (НІС), збирають і піддають подальпідцання обробці біологічного джерела, шо містить шій опріснювальній обробці з використанням ВІДфактор IX, протеїновим преципітуючим агентом ПОВІДНИХ засобів Така обробка може здійснюваПрикладом біологічного джерела, зокрема, є платися, наприклад, методом ультрафільтрації і/або зма крові або крюпреципітат, із якого еліміновані діафільтрацм фактор VIII і фібріноген (крюзбіднена плазма) Концентрація протеїнового преципітуючого Наступне відділення фактора IX, наприклад агента, зокрема, становить від 1,5 до 2,3мол/л, від супроводжуючого фактора X виконується у перевагу має від 1,75 до 1,9мол/л Значення відваріанті виноходу, що становить перевагу, метоносяться до концентрацій протеїнового преципітудом афінної хроматографії на гепарін - модифікоючого агента, які є у наявності у джерелах, що місваному субстраті Коли іонна сила розчину, який тять фактор IX (кінцева концентрація) включає дані фактори, є відносно низькою, останні будуть приєднуватися до хроматографічного маЗокрема, сульфат амонію визнають за протеїтеріалу Елюювання штерферентного фактора X, новий преципітатний агент якщо такий є, здійснюють завдяки обробці розчиСпосіб, ВІДПОВІДНО до даного винаходу, знижує ном, що містить хлорид натрію з концентрацією від протеолітичну активність, при наймі, на один по150 до 300ммол/л За такими умовами, фактор IX рядок величини Крім того, інтерферентні компобуде залишатися зв'язаним з гепарин - афінним ненти, наприклад фактор VII і фактор II, видалясубстратом При зростанні іонної сили розчину, ють завдяки операції осадження перед здійсненприблизно, у два рази фактор IX почне ВІДДІЛЯТИСЯ ням операції хроматографічного очищення факВІД поверхні афінного субстрату тора IX Також елімінують протеїни С і S У випадку з фактором VII може бути досягнута Знезараження вірусу може відбуватися замайже повна елімінація Фактор II також може бути вдяки здійсненню ВІДПОВІДНИХ ХІМІЧНИХ та/або фіелімінованим майже у повній мірі (від 70 до 90%), зичних процесів Фізичний метод знезараження тоді як елімінація протеїнів С і S становить лише вірусу полягає, головним чином, у тепловій оброблизько 50 % бці відповідної фракції при температурі від 60 до 65°С протягом проміжку часу від 5 до ЗО годин У поверхневому шарі фракції, що піддається Таку теплову обробку можуть здійснювати, зокобробці протеїновим преципітуючим агентом, акрема, після супроводжуючої гепарин - афінної тивність фактора IX, звичайно становить від 20 до хроматографії ХІМІЧНИЙ метод знезараження віЗО імунізуючих одиниць / мг (IU/mg), що відповідає русу полягає, наприклад, у обробці фракції, що питомій активності від 1 до 5 імунізуючих одиниць / містить фактор IX, неюнними поверхневими коммг (IU/mg) понентами та діалкільними або триалкільними Згідно З даним винаходом, операцію осафосфатами Зокрема, можуть використовуватися дження, переважно ту, яку здійснюють з викорискомбінації подвійного (Tween) та три-п-бутилового танням сульфату амонію, виконують з подальшою фосфату (TNBP) Способи знезараження вірусу хроматографічною сепарацією фракції, що збагарозкриті у ЕР 0131740 або у роботі Horowitz et al чена фактором IX Позитивним є те, що в умовах Blood, 79(1992)826 високих концентрацій солі протеїни можуть відчувати на собі результати різної міри гідрофобних Способи знезараження вірусу можуть бути тавзаємодій ВІДПОВІДНО ДО даного винаходу, фактор кож комбінованими, наприклад такими, які розкриті IX, переважно, вступає у зв'язок у присутності віду WO 94/1734 Перевагу становить ситуація, коли носно високих концентрацій солі, наявність яких хімічне знезараження вірусу виконують після ультспостерігають при протеїновому осадженні, з хрорафільтрації / діафільтрацм, яку здійснюють після матографічним матеріалом, що здатний приймати гідрофобної хроматографії участь у процесі гідрофобної хроматографії (НІС) Беручи за основу плазму, дійшлися висновку, У той же час, цим знижують високу концентрацію що при використанні способу згідно з даним винасолі, що отримують внаслідок протеїнового осаходом, повний вихід фактора IX ' з високою мірою дження Зокрема, мають можливість використовучистоти може підвищуватися на величину від 20 вати хроматографічний матеріал, що вже приєддо 30% нав на матеріалі субстрату гідрофільну гнучку вітку На фіг показаний графік- схема ПОСЛІДОВНОСТІ (щупальце) До даних спейсерів ковалентним зв'яоперацій способу, ВІДПОВІДНО ДО винаходу, який зком приєднані ВІДПОВІДНІ ліганди, зокрема гідровключає ПОСЛІДОВНІ етапи хроматографічного очифобні ліганди, наприклад пропіл, бутил, фенілові щення Стрілки вказують, які фракції ВІДДІЛЯЮТЬСЯ, 46005 ється, також містить іони фосфату Результатом а які залишаються у ВІДПОВІДНИХ елюатахта повегідрофобної хроматографії є залишковий фактор рхневих шарахVII і фактор IX, який знаходиться у стані приєдНаведений нижче приклад ілюструє винахід нання Фактор X буде приєднаним до матеріалу на Створюють умови для відтавання замороженої 70 - 80% Елюцію суміші фактор IX / фактор X вицитратної плазми і активізують м при температурі конують на розчині сульфату амонію, що містить від 0 до 3°С Фактор VIII і фібріноген ВІДДІЛЯЮТЬ від 1 2 до 1,4мол/л Елюент - вільний від фактора методом центрифугування Одержана крюзбідVII і не має значної протеолітичної активності Пинена плазмова фракція містить вітамін -К-залежні тома активність фактора IX у суміші фактор IX агенти скипання крові з питомою активністю бли/фактор X становить від 5 до 15 імунизуючих одизько 0,01 імунізуючих одиниць /мг (IU/mg) Поданиць / мг протеїну льший етап отримання (відлову) продукту включає екстрагування твердої фази або хроматографію на Сульфат амонію, що є присутнім у елюаті, виюнообмінниках диетиламшоетилу (DEAE), віддідаляють за допомогою ультрафільтрації та діафілення імуноглобуліну (IgG) та альбуміну Вітамін льтрацм Знезараження вірусу детергентами здійК-залежні агенти скипання крові характеризуються снюють обробкою 1% Tween 80/0,3% TNBP активністю, що становить від 10 до 50 імунізуючих Далі, після відділення детергенту, одержану одиниць і відповідає фактору збагачення близько фракцію піддають гепариновій афінній хроматог3500, виходячи з фактора IX рафії Фактори X і IX повинні зв'язуватися з гепариновим гелем при низькій осмолярності (низьких Після відлову продукту наступає етап самого осмотичних властивостях) Фактор X отримують очищення До фракції, яку отримують, після завепромиванням з використанням буферу, що містить ршення етапу відлову додають сульфат амонію, 0,25мол/л NaCI Фактор IX повинні піддавати елющоб одержати кінцеву концентрацію близько ції при зростанні концентрації хлориду натрію до 1,9мол/л Протеїни С і S видаляють до 50%, тоді 0,45мол/л Внаслідок цього, одержують фактор IX, як фактор II видаляють у КІЛЬКОСТІ ВІД 70 до 90, а присутність якого в елюаті характеризується від ЗО фактор VII майже повністю Поверхневий шар, що до 50 імунізуючими одиницями / мл (IU/ml) з питоотримують при осадженні сульфату амонію, підмою активністю > 100 дають гідрофобній хроматографії на ВІДПОВІДНО модифікованому гелі зі щупальцями Концентрація Отриману даним способом фракцію, що міссульфату амонію у розчині, що використовується, тить фактор IX, опріснюють і люфілізують (висустановить 1, 75мол/л Буфер, що використовушують в умовах вакууму) 46005 Списіб приготування фактора ЇХ Питома активність Стартовий Плазма/кріозбіднена плазма матеріал близько 0,01 ( - фібріноген t • фактор VIII * Відлов DEAE-юносбмінне екстрагування твердої фаз W 0.5-1 - ІмунОгЯОбулін І - альбумін \ вітамін -К • залежні фактори скипання крові |0 - 15 імунізуючих одиниць / мл (Ilf/nil) близько 3500 коефішскт збагачення для фактора IJC Подальше Очищення: сульфатамотсве осадження І, 75- І,9мол/л - протеїни CVS f вичерпування фактора [1: близько 80% вичерпування фактора VII: близько 100% Елімінація лрот активності: гідрофобна Щупальцева хроматографія (НІС) 5-15 вичерпування протеолітичної активяостч: ]0Q% внчерпуаанкя фактори VII 100% ГТолірування(фшішна обробка): renpjn-афшна іроматографія: ІОО - 200 вичерпування фактора Ц: 100% вичерпування фанюра X; ЗОО^о Кінцеза концентрація фактора ЇХ: 50 імунізуючих одкнниь І мл Коефіцієнт збагачення для фактора IX. близько 8000 ФІГ. ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71