Плазміда бактерій (варіанти), молекула днк (варіанти)

Винахід відноситься до плазмід бактерій. Плазміди це маленькі, особливі хромосоми, частіше всього круглі та окремі реплікаційні ДНК-молекули, які знаходяться у всіх бактеріях і так само в деяких еукаріотах, і так само в мітохондріях. Розміри плазмід варьїруються від біля 1,5 до 300kb. Плазміди бактерій як правило кругові, ковалентно замкнені і надміцні. Часто вони є носіями генів резистентності до антибіотиків або важких металів, генів для метаболізації нетипових субстратів або генів для ряду видів специфічних характеристик, які метаболізуть властивості або чинники вірулентності. Деякі плазміди можуть переноситись з однієї клітини до іншої. Тоді патогенність бактерій на сьогоднішній погляд також частково обумовлюються через властивості плазмід, виправдовуючи величезний інтерес до вивчення властивостей плазмідних ДНК. До сім'ї бактерій групи Escherichia, належать 14 основних і 6 подальших видів і як відомо, їх різні властивості можуть розвиватися. Типові приклади - Escherichia, Salmonella і Klebsiella. Escherichia coli (E.coli) є класичним об'єктом генетики бактерій. Першою властивістю і характеристикою різних чинників вірулентності з Е.coli, дають можливість пояснити те, що штами цього виду різні. Патогенність тварин представлена від невірулентності до найвищої вірулентності. Таким чином як і для групи Escherichia так і для штаму Е.coli готовий ряд з чинників вірулентності був описаний і частково добре охарактеризований. Для патогенності штаму Е.coli сірчаної групи О6: K5 стає чинником вірулентності, як наприклад гемолізини і Р-фібринадгезіни, які не виступають у визначенні апатогенної заміщеної цієї сірчаної групи. Вірулентні гени в ентеробактеріях, як правило знаходяться у великих плазмідах (са.60кb). Але є і ентеробактерії з маленькими, так званими, криптичними плазмідами, функції яких до сьогоднішнього дня ще не чітко визначені. Відомо, що як і у випадку з Е.соlі, вірулентні чинники, що найменше, частково присутні і в генах плазмід, тому виникає потреба в подальших дослідженнях по виявленню і характеризації плазмід в ентеробактеріях, і особливо, в кишкових паличках, наприклад, для того щоб сприяти кращій діагностиці і терапії при інфекційних хворобах, пов'язаних з ентеробактеріями. Плазміди, так звані, бактерії носії або синтезована ДНК, можуть бути використані в мікробіологічній аналітиці або діагностиці, в медичній терапії або профілактиці, а так само в фізіологічних нормах живлення. Крім того, плазміди, і особливо Е.соlі, відомі експресивні вектори в геній технології, викликають інтерес у вивченні властивостей такого роду плазмід. З цього приводу були проведені молекулярно-генетичні дослідження зі штамами Е.соlі DSM 6601. Одержаний штам послідовності ДНК був підданий за допомогою цифрової програми секвентному аналізу ДНК, і були проведені порівняння отриманих послідовностей ДНК з іншими бактеріями. Штам DSM 6601 має дві маленькі плазміди з величиною 3177 і 5552bр, які були позначені як pMUT1 і pMUT2. ДНК маленької плазміди pMUT1 була склонована після залишкового розпаду з ензимом Hindlll, як лінійний фрагмент на вектор pUC18, була встановлена послідовність ДНК. Це видно на Фіг.1. Так отримана послідовність ДНК була піддана гомологічному порівнянню з ген-EMBL-цифровими даними; порівняні дані представлені на Фіг.2. Для цього порівняння було визначено зріз Hindlll як позиція 1. З позиції 200 по 800bр. ДНК-плазмідй, pMUT1 відомих гомологенів показує редуплікаційне місцерозташування інших ентеробактеріальних плазмід, особливо плазмід NTP1, NTP16, і CloDF13. В області від позиції 950bр до плазмід NTP16, починається великий гомолог, який був заздалегідь ізольований від Salmonella typhimurium. Цей гомолог охоплює mobAген, який є мобілізаційним для плазміди NTP16. Виходячи з цього були знайдені, від позиції 1790 до 1920bр, відомі гомологи генів раrА і сеr, які мають значення для стабілізації безперервної передачі і розподілу плазмідних молекул при розподілі клітки. Для інших ДНК-регіонів відомі гомологи не були ідентифіковані. Виходячи з цього була описана послідовність ДНК плазміди pMUT1 в секвенті амінокислотною послідовністю і проаналізована на наявність кодів. Було досліджено 6 можливих кодів, що читаються. Вдалося знайти 5 відкритих кодів, що читаються з величиною амінокислот 143, 62, 56, 49 і 48. Графічне зображення аналізу на Фіг.3 (3а) ДНК великої плазміди pMUT2 після лінійного аналізу з органічним ензимом SphI, а також субклонування на вектор pUC18, було остаточно секвестировано. Послідовність ДНК показана на Фіг.4. Так отримана послідовність ДНК була досліджена за допомогою цифрових даних ген-EMBL на гомологи по відношенню до широко відомих послідовностей ДНК. Результат графічно зображений на Фіг.5. ДНК- плазміди pMUT2 показують відомі гомологи по відношенню до інших CoLE1- плазмід Е.соlі в позиції 890 до 1660bр. Інший відомий гомолог плазміди CoLEl знаходиться в районі 3800-4950bр. Йдеться про гомологи мобілізованого регіону плазмід CoLE1. У районі позиції 3770-4980 були знайдені гомологи плазмід Пастарелля гаемолітик штаму AI. На цій плазміді знаходяться гени, які закодовані для антибактеріальної стійкості протеїнів. Гомологи знаходяться і поза генною областю, так що йдеться про можливість послідовностей, які є важливими для мобілізації плазмід. Були індентифіційовані два регіони, де відомі гомологи вказують на інші ентеробактеріальні плазміди. Тут йдеться мова про природне поновлення і мобілізаційне оновлення, які є важливими для цих плазмід. Для pMUT2 інших ДНК-відрізків не було визначено відомих гомологів. Послідовність ДНК плазміди pMUT2 була трансквитірована на амінокислотну послідовність, і проаналізована на наявність відкритого коду, що читається. Дані графічно зображені на Фіг.3. Було знайдено 5 відкритих кодів з амінокислотними послідовностями в 327, 318, 264, 76 і 63. Вони не були знайдені досі в невідомих плазмідах pMUT1 і pMUT2, ні в їх комбінаціях, ні в штамі Е.соlі або в інших інтеробактеріях. Наявність плазмід, мабуть стосується метаболічних, медичних і інших властивостей штаму DSM6601. Дослідження плазмід сприяє точному визначенню і аналізу ентеробактерій і особливо в групі - Escherihia. Виходячи з цього ці плазміди пропонуються, як безпечні експресивні вектори для генної технології. Приклад 1. Плазміда-ізолятор. Ізоляція плазмід-ДНК керуючись способом (Birnboim A.C. і Doly J. (1979) Nucl. Acids Res. 7:1513-1523 A). 3ml LB - середовища прищеплюють бактеріям і через ніч при температурі 37°С струшують. Цю культуру центрифугують в склянці Еппендорфа, залишок середовища видаляють піпеткою. Клітинний осадок ресуспендують в 100m1 розчину І (50mМ глюкози; 10mМ EDTA, pH8; 25mМ Tris-HCl, pH8). Після 5 хвилин інкубації при кімнатній температурі додають туди 200m1 розчину II (0,2N NaOH; 1% SDS) розмішують і ставлять на 5 хвилин в морозилку. Потім вливають ще 150m1 розчину III (3М Na-ацетат, pH4,8), струшують недовго до випадання хромосомних ДНК (у вигляді пластівців) і поміщують ще на 5 хвилин в морозильник. Хромосомні ДНК, що випали і клітинні залишки пропускають через центрифугу і верхню частину з плазмідами ДНК переливають в нову склянку. Для очищення плазмід ДНК додають 50m1 фенолу і 150m1 хлороформiзоамілакоголю (24:1), і після короткого струшування 2 хвилини центрифугують. Рідку частину піпеткою переносять в нову склянку. ДНК-плазмід виділяють з двома дозами холодного етанолу і 10 хвилин пропускають через центрифугу. Центрифугат обробляють 70% етанолом і висушують. ДНК- плазміди ресуспендують в 20мл дистильованої Н2O і зберігають при 20°С. Приклад 2. ДНК-секвентизація по методу [Sanger F., Nicklen S. і Coulson (1977) Proc. Natl. Acad. Sei USA 74: 54305467]. Для денатурації змішують 8m1 (1,5bis 2mg) плазміди ДНК з 2m1 і 2N NaOH недовго центрифугують і 10 хвилин інкубують. ДНК, що випала з'єднують з 3m1 3М Na-ацетат, pH4,8, а також 7m1 дистильованої Н2О і 60m1 холодного чистого етанолу і залишають на 15 хвилин при температурі 70°С. ДНК, що випала, 10 хвилин, центрифугують, промивають 70% етанолом і просушують. Для реакції аніліровання денатуріроване ДНК суспендують в 10m1 дистильованої Н2О і змішують з 2m1 анілірованного буфера. Осад інкубують 20 хвилин при температурі 37°С. Вміст охолоджують 10 хвилин при кімнатній температурі і після відразу ж використовують або заморожують при температурі - 20°С. Для реакціїмаркірування використовують 3m1 маркера (Labelling), 1m1 [a-Р32]dATP і 2мл Т7-полімерази (Т7-полімераза розбавлена 1:5 з інзимнорозбавленим буфером) і потім після недовгого змішування 5 хвилин інкубують при кімнатній температурі. Для реакції готують секвентний склад ( на одну склянку 2,5m1 'G'-, 'А'-, Т- і 'С'- mix "short") підігрівають заздалегідь при 37°С. Після закінчення реакції-маркірування добавляють по мірі потреби 4m1 до чотирьох секвентних складів і розмішують недовго піпеткою. Термінаційна реакція 5 хвилин інкубується при температурі 37°С. Для закінчення термореакції додають 5m1 розчину. Склад поміщують в інкубатор з температурою 95°С на 2 хвилини і потім ставлять в морозилку. Кожні 2мл реакції накладають на секвент [25,2г мочевини, 22ml Н2О дистильованої води, 6m1 10´ТВЕ, 10m1 поліакриламіда (40%), 2ml аммоніумперсульфата (16mg/ml), 60m1 TEMED] в ряд 'G', 'А', 'T', 'С'. Електрофорез відбувається при 40Ват і 1500Вольт 4,5 години.