Спосіб визначення спектра ізоформ лактатдегідрогенази при діагностиці диспепсії неонатальних телят

Реферат: Спосіб визначення спектра ізоформ лактатдегідрогенази при діагностиці диспепсії неонатальних телят включає комплексне вивчення фізіолого-біохімічного стану крові. Додатково у печінці електрофоретично визначають спектр множинних молекулярних ізоформ лактатдегідрогенази. UA 75164 U (12) UA 75164 U UA 75164 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної медицини, зокрема до способів біохімічного діагностування структурно-функціонального стану клітин печінки за умов розвитку диспепсії. Для оцінки стану здоров'я неонатальних телят упродовж перших тижнів визначається динаміка біохімічних показників крові (Рецкий М.И., Шабунин С.В., Золотарев А.И., Близнецова Г.И., Чусов Д.Б. Динамика биохимических показателей крови у новорожденных телят в первую неделю жизни //Сельскохозяйственная биология, 2009, № 6, стр. 94-98.). Дані таких досліджень свідчать, що в цей період багато біохімічних показників крові суттєво і швидко змінюються. Це стосується низки таких показників крові, як гематокритне число, вміст гемоглобіну, концентрацій глюкози, холестерину, триацилгліцеролів, загального білка, альбуміну, глобулінів, креатиніну, сечовини, білірубіну, а також активності ряду ензимів - гамма-глутамілтрансферази, лужної фосфатази, лактатдегідрогенази, аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази. Треба визнати, що всі вищеперераховані та інші біохімічні показники крові значною мірою віддзеркалюють загальний стан здоров'я неонатальних телят, але конкретно вони не торкаються структурно-функціонального стану печінки і конкретно не стосуються розладів травної системи та захворювання тварин диспепсією. Стосовно даних про порушення функціонування шлунково-кишкового тракту і, зокрема, про одне з найпоширеніших захворювань новонародженого молодняку великої рогатої худоби диспепсію, що часто супроводжується діареєю, стоять ближче до нашої корисної моделі результати досліджень експериментаторів В.О. Постоєнка і Д.А. Засєкіна [Постоєнко В.О., Засєкін Д.А. Антиоксидантна дія апіфітопрепаратів при патологіях органів травлення у тварин / Науковий вісник Національного аграрного університету, 2004, Вип. 72, стор. 201-204 ]. У цій роботі наводяться біохімічні показники крові телят здорових і хворих на гострі розлади травлення, а точніше - диспепсію незаразної етіології. При цьому акцентується, що у крові хворих диспепсією телят вірогідно знижується вміст загальних ліпідів, вітамінів Е і А та каротиноїдів, натомість збільшується ступінь гемолізу еритроцитів та кількість гідропероксидів ліпідів. Недоліком цього прототипу вважається зосередженість експериментального дослідження лише на обмежених біохімічних показниках крові, за якими досягається тільки певна опосередкована уява про можливі зміни в клітинах печінки неонатальних телят при диспепсії. Найближчим по суті прототипом до нашої корисної моделі є відомий довідник В.М. Лівшифця і В.І. Сідельникової (Биохимические анализы в клинике /Лившифц В.М., Сидельникова В.И. Справочник. Шестое дополненное издание - М.: Триада - X, 2006. - 216 с). У цій праці наводиться інформація про визначення в крові спектра ізоформ лактатдегідрогенази та акцентується на зміни величин окремих ізозимів у зв'язку з розвитком певних захворювань, у тому числі із порушеннями печінки вірусного, токсичного, травматичного характеру і при загостренні хронічних гепатитів. Головними недоліками основного прототипу є опосередкованість оцінки структурнофункціонального стану печінки за даними про співвідношення ізозимів лактатдегідрогенази у крові, а не безпосередньо в печінці, а також і те, що ці дані стосуються лише людини, а не тварин, і тим більше - не новонароджених телят та ще й захворюванням диспепсією. Задача корисної моделі - розробити біохімічний спосіб прямого діагностування порушень структурно-функціонального стану безпосередньо у клітинах печінки при диспепсії неонатальних телят. В основу корисної моделі поставлена задача для проведення високоефективного діагностування порушень структурно-функціонального стану клітин печінки у неонатальних телят при диспепсії використати спосіб визначення спектра множинних молекулярних лізоформ маркерного ензиму лактатдегідрогенази безпосередньо у цитозоль-мікросомальній фракції гепатоцитів. Новизна корисної моделі полягає в тому, що, крім наведених у прототипах та в інших джерелах літератури, характеристик крові, які лише опосередковано вказують на певну ступінь порушень структурно-функціонального стану клітин печінки неонатальних телят при диспепсії, одержуються нові і прямі докази серйозних пошкоджень клітинних структур за допомогою способів визначення змін у спектрі множинних молекулярних ізоформ маркерного ензиму лактатдегідрогенази безпосередньо у цитозоль-мікросомальній фракції гепатоцитів, тобто в основному місці його внутрішньоклітинної локалізації. Поставлена задача вирішується тим, що спочатку з допомогою біопсії від хворих диспепсією неонатальних телят (або після їх забою) відбирається декілька грамів печінки. А для контролю та порівняння беруться також зразки печінки від клінічно здорових новонароджених телятаналогів. Відібрані зразки тварин гомогенізуються в трис-сахарозному буфері (0,25 М сахароза, 0,025 М KСl, 0,005 М MgCl2, 0,05 М трис-НСl буфер, рН 7,4 при 37 °C). Потім проводиться 1 UA 75164 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 екстракція розчинних білків упродовж чотирьох годин при 4 °C, після чого гомогенат центрифугується 20 хвилин при 15000 g і 4 °C. Одержаний надосад цитозоль-мікросомальна фракція гепатоцитів використовується як джерело маркерного ензиму лактатдегідрогенази. Спектр множинних молекулярних ізоформ лактатдегідрогенази одержується за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі [Голубий Е.М., Шавкун В.Е. Изучение полиморфизма белков и ферментов в биологических жидкостях и тканях сельскохозяйственных животных методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле. Метод. Рекомендации. Львов: Институт биологии животных, 1982 - 18 с.]. Прописи розчинів для полімеризації гелю, сам процес електрофорезу та всі інші методичні підходи й необхідні деталі подаються у багатьох посібниках (Маурэр Г. Диск-электрофорез. - М.: Мир, 1971, 247 с.; Корочкин А.И., Серов О.Л., Пудовкин А.И. и др. Генетика изоферментов. - М.: Наука, 1977, 278 с.; Голубий Е.М., Шавкун В.Е. Изучение полиморфизма белков и ферментов в биологических жидкостях и тканях сельскохозяйственных животных методом дискэлектрофореза в полиакриламидном геле. Метод. Рекомендации. Львов: Институт биологии животных, 1982 - 18 с.; Меньшиков В.В. Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, 368 с.; Мельничук С.Д., Калачнюк Л.Г, Калачнюк Г.І. та ін. Робочий зошит з дисципліни "Біохімія тварин з основами фізичної та колоїдної хімії" (1 частина) для студентів факультету ветеринарної медицини. Навчальне видання. - К.: НУБіПУ, 2012. - 112 с.). У наведених та багатьох інших джерелах науково-навчальної літератури детально описуються також і способи інтерпретації одержаних електрофоретичних даних, зокрема, множинних молекулярних ізоформ лактатдегідрогенази. Кількісна оцінка одержаних спектрів здійснюється за допомогою денситометрії на мікрофотометрі із спеціальною приставкою, в яку входить електронний перетворювач і підсилювач постійного струму. На самозаписуючому електронному потенціометрі приводиться запис показань мікрофотометра безпосередньо на діаграмну стрічку. Із денситограм проводиться розрахунок площ піків і одержуються дані у цифровому вигляді, які далі піддаються статистичній обробці та виражаються у формі таблиць. Ефект від використання способу визначення спектра ізоформ лактатдегідрогенази при диспепсії неонатальних телят характеризуються наступним прикладом. Приклад. Для проведення досліджень використовували 1-7-добових новонароджених телят, яких за принципом груп-аналогів (рівнозначних за віком, породою, статтю, вагою) розділяли на дві групи по 5 голів у кожній з масою тіла 28-36 кг. Телята першої (І, контрольної) групи були клінічно здоровими, другої (II, дослідної) - хворими із чіткими ознаками диспепсії аліментарної природи. Після забою телят обох груп від кожної тварини відбирали зразки печінки, які гомогенізували в трис-сахарозному буфері та проводили екстракцію розчинних білків упродовж чотирьох годин при 4 °C. Гомогенат центрифугували 20 хвилин при 15000 g і 4 °C. В одержаній надосадовій цитозоль-мікросомальній фракції електрофоретично в поліакриамідному гелі визначали спектр множинних молекулярних ізоформ лактатдегідрогенази. Після денситометрії електрофореграм одержані цифрові дані обробляли статистично і отримані результати експериментальних досліджень виражали у вигляді таблиці. Наведені у таблиці дані свідчать, що у цитозоль-мікросомальній фракції гепатоцитів - в основному місці локалізації лактатдегідрогенази у клітині спектр множинних молекулярних ізоформ цього важливого ензиму вірогідно відрізняється у неонатальних телят з ознаками диспепсії при порівнянні з контрольними телятами. Якщо у клінічно здорових телят основні молярні відсотки приходяться на ЛДГ3 (26,35) і ЛДГ4 (43,65), то за умов диспепсії молярна частка усіх перших чотирьох ізоформ вірогідно знижується (Р