Спосіб отримання подвоєних гаплоїдів у культурі in vitro цукрових буряків

Реферат: UA 76086 U UA 76086 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується селекції сільськогосподарських культур, зокрема створення гомозиготних ліній з використанням біотехнологічних методів. Перехід від популяційної до гібридної селекції перехреснозапильних культур, до яких відносяться цукрові буряки, викликав необхідність створення нового вихідного матеріалу гомозиготних ліній. Класичним методом, який використовують для створення таких ліній є метод інбридингу. Новим напрямком в бiотехнології цукрових буряків є індукована гаплоїдія in vitro. Важливість отримання гаплоїдів пов'язана з можливістю їх використання для створення гомозиготних рослин методом подвоєння числа хромосом. Використання методу гаплоїдії у 5-6 разів прискорює процес гомозиготації селекційного матеріалу при відсутності інцухт-депресії. Існує декілька методів індукції подвоєних гаплоїдів, їх ефективність визначається виходом дигаплоїдних форм рослин. Як поліплоїдизуючий фактор найбільш широко застосовується колхіцин. Існує декілька способів обробки гаплоїдних рослин цукрових буряків колхіцином з метою переведення їх на дигаплоїдний рівень, які відрізняються способом обробки колхіцином рослини, його концентрацією, часом дії, а також фазою розвитку рослини в момент обробки. Відомий спосіб обробки колхіцином гаплоїдів /D Hallnink., Keimer В. /Gen. Manipulat. Plant. Breed.: Proc. Int. Symp. (Berlin (West), Sept. 8-13 19). Berlin; N. Y., 1986. P. 307-309, який характеризується тим, що колхіцином обробляють: - точки росту вкорінених гаплоїдних рослин в ґрунті, використовують 0,1 % розчин колхіцину. Спільними ознаками із способом, що заявляється є обробка колхіцином точок росту, але відомий спосіб забезпечує не великий вихід подвоєних гаплоїдів і становить - 8,4 % і передбачає додатковий етап культивування - укорінення гаплоїдних клонів та садіння їх у ґрунт. Крім цього відомий спосіб є трудомістким, має низьку ефективність і є небезпечним для здоров'я працюючого, тому що колхіцин має мутагенні властивості і при багаторазовому накапуванні розчину колхіцину високих концентрацій, він випаровується. Відомий спосіб отримання подвоєних гаплоїдів цукрових буряків у культурі in vitro з використанням модифікованого агаризованого середовища Гамборга І Евелега (В 5) з колхіцином / Знаменская В.В./ Принципы и методы создания и поддержания исходного материала на современном этапе селекции сахарной свеклы / Автор, дис. докт. с.-х. наук Рамонь. 1999 г. 40 с. Відомий і пропонований спосіб мають спільні ознаки застосування колхіцину для обробки матеріалу. Цей спосіб є найбільш близьким за сукупністю ознак до запропонованої корисної моделі, де апікальні гаплоїдні бруньки, отримані із незапліднених насіннєвих зачатків цукрових буряків, культивованих in vitro, обробляють колхіцином в концентрації 0,005 %, 0,01 %, 0,02 % на середовищі Гамборга на протязі двох i трьох діб. Частота утворення подвоєних гаплоїдів при 0,005 % колхіцину складала 10-35 %, при 0,01 % - 5-10 %, при 0,02 % - 5-15 % оброблених бруньок. Спільними суттєвими ознаками для відомого і пропонованого способу є використання колхіцину, як полiплоїдизуючого фактору, гаплоїдних бруньок стерильних рослин, вирощених in vitro, та концентрація колхіцину у агаризованому живильному середовищі - 0,02 %. Але незважаючи на це, відомий спосіб не забезпечує отримання достатньої кількості подвоєних гаплоїдів цукрових буряків, тому що концентрація колхіцину та час його дії і живильне середовище не є оптимальними для них. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб отримання подвоєних гаплоїдів цукрових буряків в культурі in vitro. Для цього використовуються біотехнологічні методи і живильне середовище з оптимальним складом i концентрацією колхіцину при певній експозиції, що дає змогу одержати високий вихід стабільних подвоєних гаплоїдів без підвищення концентрації колхіцину в середовищі, і збільшити економічність і безпечність способу. Поставлена задача вирішується тим, що отримання подвоєних гаплоїдів цукрових буряків у культурі in vitro здійснюється методом культивування гаплоїдних бруньок на агаризованому живильному середовищі з колхіцином 0,02 % і додавання NaCl в концентрації 0,2 % - 0,5 %. На відміну від відомого способу, згідно якому культивування гаплоїдних бруньок проводили на середовищі з колхіцином без додавання NaCl. Використання селективного середовища з колхіцином і NaCl дозволяє підвищити кількість подвоєних гаплоїдів без збільшення концентрації колхіцину в середовищі. Як вихідний експлант використовують стерильні гаплоїдні бруньки, які рослина модифікованому агаровому середовищі Гамборга і Евелега (В5) (С200) [Редько В.І., Ільєнко І.І., Білоус В.О. Методичні рекомендації по мікроклональному розмноженню цукрових буряків. К. 1 UA 76086 U 5 10 15 20 25 30 1997. С. 14], обробку колхіцином проводять в агаризованому живильному середовищі того ж складу з додаванням колхіцину в концентрації 0,02 % і NaCl в концентрації 0,2 % - 0,5 %, та культивують 4-5 діб. Після другого пасажу на середовище С200, без колхіцину, частина бруньок, меристематичні клітини яких мали змінену кількість хромосом, становила 70,00-93,75 %. Вихід стабільних подвоєних гаплоїдів складав 40,00-63,64 % в залежності від генотипу. Таким чином, новими ознаками корисної моделі, якими характеризується спосіб отримання подвоєних гаплоїдів цукрових буряків у культурі in vitro порівняно з відомим способом для обробки гаплоїдних бруньок колхіцином є: - відмінний склад живильного середовища; - додавання до селективного середовища з колхіцином 0,2-0,5 % NaCl; - час дії колхіцину на гаплоїдні клони - 4-5 діб; - одночасно отримуються тетрагаплоїди. Ці нові, відмінні від прототипу ознаки при взаємодії з відомими ознаками, забезпечують нові технічні властивості, а саме забезпечують високий вихід дигаплоїдних та тетрагаплоїдних клонів. Застосування живильного середовища з 0,2-0,5 % NaCl і 0,02 % колхіцину для обробки гаплоїдних бруньок дозволяє під дією осмотичного тиску, викликаного іонами Сl , акумулювати колхіцин у клітині швидше, тому збільшується полiплоїдизуючий ефект без підвищення токсичного навантаження колхіцину на геном. Спосіб отримання подвоєних гаплоїдів у культурі in vitro цукрових буряків здійснюється таким чином: отримують стерильну культуру незаплiднених насіннєвих зачатків цукрових буряків; отримані регенеранти аналізують за рівнем геному; проводять клонування гаплоїдних бруньок на модифікованому середовищі Гамборга і Евелега (В 5); готують селективні середовища на основі середовища Гамборга i Евелега (B5), додають колхіцин - 0,02 % і NaCl0,2-0,5 %. В кожну колбу на 100 мл наливають по 20 мл середовища, закривають кришечками з фольги. На стерильне селективне середовище висаджують по 5-6 гаплоїдних бруньок і культивують 4-5 діб в термальних приміщеннях при температурі 22-25 °C, освітленні 3000-4000 лк, відносній вологості 65-70 % та фотоперіоді - 16 годин. Оброблені таким чином бруньки пересаджують на агаризоване середовище без колхіцину. Після другого пасажу на середовищі С200 без колхіцину проводять цитологічний аналіз кількості хромосом. Як видно з таблиці, оцінка плоїдності після другого пасажу показала, що найбільший вихід бруньок, меристематичні клітині яких мали змінену кількість хромосом, спостерігався на третьому варіанті середовища (колхіцин - 0,02 %, NaCl-0,5 %). Він становив при експозиції 4 доби - 81, 81 %, із них подвоєних гаплоїдів - 63,64 %. При експозиції 5 діб подвоєних гаплоїдів 26,67-40 % в залежності від генотипу. Одночасно були отримані тетрагаплоїди 10-25 %. 35 Таблиця 1 Зміна рівня плоїдності в залежності від концентрації NaCl у середовищі № Селекційний з/п номер 1. Вл.-1(1)-1(2) 2. 178-15-2(6) 3. 181-13 Варіант І-4д II-4 д III-4 д І-5д II-5 д III-5 д І-5д II-5 д III-5 д x 41,67 30,00 18,19 17,65 20,00 6,25 14,28 0 6,67 х2х 25,00 20,00 9,10 23,53 33,34 31,25 21,43 26,67 Плоїднiсть, % 2х 2 × 4х 4х 16,67 16,67 0 40,00 0 10,00 63,64 9,10 0 23,53 17,65 40,00 37,50 12,5 35,71 21,42 35,00 40,00 25,00 26,67 6,67 26,67 Анеуплоїди 17,65 6,67 12,50 7,14 6,67 Примітка: 1) І - 4 д - 0,02 % колхіцину / 4 доби; II-4 д - 0,02 % колхіцину + 0,2 % NaCl / 4 доби; III-4 д - 0,02 % колхіцину + 0,5 % NaCl / 4 доби, відповідно для 5 діб аналогічно. 2) х - гаплоїдний рівень геному; х2х - міксоплоїдний рівень геному; 2х - диплоїдний рівень; 2 × 4х - міксоплоїдний рівень геному; 4х - тетраплоїдний рівень геному. 2 UA 76086 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб отримання подвоєних гаплоїдів цукрових буряків у культурі in vitro, що включає культивування гаплоїдних клонів цукрових буряків на середовищі Гамборга і Евелега (В 5) з концентрацією колхіцину в середовищі - 0,02 %, який відрізняється тим, що культивування клонів здійснюють на модифікованому середовищі з колхіцином з додаванням 0,2-0,5 % NaCl, час дії колхіцину на гаплоїдні клони - 4-5 діб та одночасно отримуються тетрагаплоїдні клони. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3