Спосіб клонального мікророзмноження міскантусу

Реферат: Спосіб клонального мікророзмноження міскантусу включає стерилізацію насіння міскантусу, використання для розмноження та укорінення модифікованого середовища за прописом Мурасіге і Скуга. Як експлант використовують насіння, яке стерилізують 35 % розчином Білизни за експозиції 30 хвилин. Для розмноження у середовище Мурасіге і Скуга додають БАП 0,4-0,8 мг/л. Для укорінення у середовище Мурасіге і Скуга додають ІОК - 0,5-0,8 мг/л та НОК - 0,5-0,8 мг/л і 30 г/л цукрози. Культивування проводять при 16-годинному фотоперіоді за температури 24±2 °C з інтенсивністю освітлення 4000-4500 лк, відносній вологості 70-80 %. UA 76088 U (54) СПОСІБ КЛОНАЛЬНОГО МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ МІСКАНТУСУ UA 76088 U UA 76088 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, зокрема для розмноження і отримання розсади цінних селекційних матеріалів. Враховуючи важливість виробництва альтернативних видів біопалива, які можуть бути отримані з біоенергетичної сировини сільськогосподарського призначення, необхідно розвивати селекцію енергетичних культур. У світовій селекційній практиці для прискорення її результативності використовують біотехнологічні методи, які дозволяють не тільки розмножувати та зберігати матеріали, створені традиційними методами, а й отримувати нові форми на основі передових досягнень біотехнології. Практичний інтерес для виготовлення біопалива iз фітомаси представляють такі рослини: світчграс (просо лозоподібне), міскантус, сорго й ряд інших біоенергетичних культур. Міскантус належить до відділу покритонасінних (Angispermal), клас однодольних (Monocatyledoneae), ряд (Glumifloreae), сімейства злакових (Gramineae), рід Miscanthus (Anderse), вид Miscanthus. Враховуючи те, що насіння міскантусу є дуже дрібним, важливим було розробити клональне мікророзмноження цієї культури. Відомим є розмноження Miscanthus x giganteus in vitro (Spilard Toth Pal Pero Nutrient Uptake of Miscanthus in vitro cultures // Jornal of Natural Fibres Volume 3 issue 1 June 2006 P. 17-21). За цим відомим способом проводять стерилізацію рослинного матеріалу Miscanthus, використовуючи 80 % етанол та експозицію 60 хвилин. Стерильні життєздатні проростки пересаджують на модифіковане 0,5 мг/л Бензиламінопурину (БАП) та 20 г/л цукрозою середовище Мурасіге і Скуга та отримують через 40 діб культивування за температури 21 °C, при 16-годинному фотоперіоді три пагони від одного. Для укорінення використовують живильне середовище Мурасіге і Скуга з додаванням 0,5 мг/л індоліл-3 масляної кислоти (ІМК) та 20 г/л цукрози. На 14 добу укорінені рослини міскантусу придатні для пересаджування їх у польові умови. Відомий і пропонований способи вегетативного розмноження мають спільні ознаки: стерилізація насіння та отримання життєздатних стерильних проростків, живильні середовища для розмноження та укорінення, пересадка укорінених рослин у ґрунт. Однак, відомий спосіб клонального мiкророзмноження міскантусу не дає можливості отримати достатньої кількості стерильних життєздатних проростків, високого коефіцієнту розмноження і ризогенезу та потребує більшого терміну культивування рослин до пересадки у ґрунт. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб клонального мiкророзмноження міскантусу, що дозволить отримати 95 % стерильних життєздатних проростків, удосконалити склад живильних середовищ для розмноження і укорінення, додаючи БАП - 04,-0,8 мг/л, ІОК - 0,8-1,2 мг/л, НОК - 0,6-1,0 мг/л, цукрози 30,0 г/л, одержати 99,0 % укорінених рослин, збільшити коефіцієнт розмноження. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі розмноження міскантусу використовують пазушні бруньки, які поверхнево стерилізують етанолом 80 % за експозиції 60 хвилин. Пророслі експланти пересаджують на модифіковане живильне середовище за прописом Мурасіге i Скуга з доданням БАП - 0,3 мг/л, а для укорінення ІМК - 0,5 мг/л, що дозволяє отримати три новоутворені пагони. Культивування відбувається за температури 21 °C та довжині фотоперіоду 16 годин. У запропонованому способі використовують насіння, яке промивають дистильованою водою, стерилізують 35 % розчином Білизни, що дозволяє отримати 95 % стерильних і життєздатних проростків, які в подальшому пересаджують на модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з доданням БАП 0,4-0,8 мг/л та цукроза 30 г/л при культивуванні за температури 24±2 °C та довжини фотоперіоду 16 годин, що забезпечує отримання шістнадцять новоутворених пагонів. Для укорінення додається НОК - 0,61,0 мг/л та ІОК - 0,8-1,2 мг/л та цукроза 30 г/л, що забезпечує 99 % укорінених рослин, які можна пересаджувати у ґрунт на 10 добу. Новими відмінними від існуючого прототипу ознаками є: - введення в стерильну культуру насіння міскантусу; - використання для стерилізації Білизни - 35 %; - експозиція 30 хвилин; - додавання у середовище для розмноження БАП - 0,4-0,8 мг/л та цукрози 30 г/л; - використання цукрози; - для укорінення рослин додавання НОК 0,6-1,0 мг/л та ІОК 0,8-1,2 мг/л; - температура при культивуванні 24±2 °C; - пересаджування рослин у ґрунт на 10 добу. 1 UA 76088 U 5 10 15 20 Відмінні від прототипу ознаки при взаємодії з відомими дозволяють отримати високий вихід стерильних життєздатних експлантів, оптимізувати склад модифікованого живильного середовища за прописом Мурасіге і Скуга, збільшити в п'ять разів коефіцієнт розмноження рослин міскантусу. Ефективність нового способу клонального мiкророзмноження міскантусу у культурі in vitro вивчали на насінні п'яти сортів: New, Late, Sinensis, Sachariflorus, Early. Результати досліджень вказують, що використання розчину Білизни 35 % за експозиції 30 хвилин забезпечує стерильність експлантів на 95 %. Введення до живильного середовища Мурасіге і Скуга БАП - 0,4-0,8 мг/л, дозволяє отримати шістнадцять додаткових пагонів. Додавання при укоріненні до живильного середовища НОК 0,6-1,0 мг/л та ІОК 0,8-1,2 мг/л та цукрози 30 г/л, забезпечує 99, 0 % укорінених рослин уже на 10 добу. Спосіб клонального мiкророзмноження міскантусу здійснюється таким чином: насіння миють у дистильованій воді, проводять стерилізацію експлантів 35 % розчином Білизни, який забезпечує 95 % життєздатних проростків. На модифіковане живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга (БАП 0,4-0,8 мг/л) пересаджують рослини і культивують за температури 24±2 °C та довжині фотоперіоду 16 годин з інтенсивністю освітлення 4000-4500 лк, відносній вологості 70-80 %. Додавання у середовище даної кількості гормона стимулює утворення шістнадцяти нових пагонів уже на третьому пасажі. Після отримання необхідної кількості рослин їх пересаджують на модифіковане живильне середовище з додаванням НОК 0,6-1,0 мг/л та ІОК - 0,8-1,2 мг/л та цукрози 30 г/л, що забезпечує 99 % укорінених рослин. Використання НОК та ІОК у запропонованій кількості дозволяє отримати високий відсоток укорінених рослин та пришвидшити придатність міскантусу до пересаджування у ґрунт уже на 10 добу. Таблиця Показники ефективності використання запропонованого способу розмноження міскантусу Показники Стерилізація Експозиція Експлант Стерильність експлантів Мінеральна основа середовища для розмноження і укорінення Гормони БАП мг/л ІОК мг/л НОК мг/л ІМК мг/л Кількість новоутворених пагонів, шт. Укорінення, % Цукроза Довжина фотоперіоду, годин Температура культивування, °C Коефіцієнт розмноження Придатність рослин до пересаджування у ґрунт, доба Відомий спосіб Запропонований спосіб Етанол 80 % Білизна -35 % 60 хвилин 30 хвилин Пазушні бруньки Насіння 54 95 % MS MS 0,3 0,5 3,0 20,0 16,0 21 3 0,4-0,8 0,8-1,2 0,6-1,0 16 99,0 30,0 16 24±2 16 14 10 25 Впровадження запропонованої корисної моделі дає можливість отримати 95,0 % стерильних життєздатних проростків, забезпечить 99,0 % укорінення рослин, зменшить термін культивування міскантусу і пришвидшить його пересаджування у польові умови, та дозволить у п'ять разів збільшити коефіцієнт розмноження. 30 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб клонального мікророзмноження міскантусу, що включає стерилізацію насіння міскантусу, використання для розмноження та укорінення модифікованого середовища за прописом Мурасіге і Скуга, який відрізняється тим, що як експлант використовують насіння, яке стерилізують 35 % розчином Білизни за експозиції 30 хвилин, для розмноження у середовище Мурасіге і Скуга додають БАП 0,4-0,8 мг/л, для укорінення у середовище Мурасіге і Скуга 2 UA 76088 U додають ІОК - 0,5-0,8 мг/л та НОК - 0,5-0,8 мг/л і 30 г/л цукрози, культивування проводять при 16-годинному фотоперіоді за температури 24±2 °C з інтенсивністю освітлення 4000-4500 лк, відносній вологості 70-80 %. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3