Спосіб інактивації фенолів у культурі miscanthus giganteus

Реферат: Спосіб інактивації фенолів у культурі Miscanthus giganteus включає стерилізацію матеріалу, використання для розмноження та укорінення модифікованого середовища за прописом Мурасіге і Скуга, культивування при 16-годинному фотоперіоді при температурі 24±2 °C, використання антиоксиданту. Як експлант використовують ризоми, які стерилізують 0,2-0,4 % розчином сулеми за експозиції 60-90 хв. Для розмноження у середовище Мурасіге і Скуга додають кінетин - 0,5-1,0 мг/л, бензиламінопурин (БАП) - 0,2-0,5 мг/л, цукрозу - 30 г/л та антиоксидант - аскорбінову кислоту - 1,5-2,0 г/л. Для укорінення у середовище Мурасіге і Скуга додають індолілоцтову кислоту (ІОК) - 0,2-0,5 мг/л і 30 г/л цукрози. UA 78943 U (54) СПОСІБ ІНАКТИВАЦІЇ ФЕНОЛІВ У КУЛЬТУРІ MISCANTHUS GIGANTEUS UA 78943 U UA 78943 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, рослинництві, зокрема для розмноження і отримання розсади цінних селекційних матеріалів та збереження генотипу вихідної форми. Перспективною енергетичною культурою є Miscanthus giganteus, який має стерильне насіння та розмножується тільки ризомами. Тому, важливим моментом є використання для отримання розсади цієї культури біотехнологічних методів, а саме клонального мікророзмноження. Для клонування використовують різні експланти. В результаті травм, які отримуються експлантом при ізолюванні, активуються фермент окислювальні феноли рослин. При цьому продукти окислення фенолів не тільки викликають потемніння тканин і живильного середовища, але і можуть інгібувати ділення і ріст введеної частини рослини. Одним із способів подолання та зниження фенольного окислення є включення в живильне середовище антиоксидантів. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є клональне мікророзмноження смородини і антиоксидант для клонального мікророзмноження смородини (Пат. № 2080060 РФ, опубл. 27.05.97, МПК А01Н4/00, C12N5/00. Способ клонального микроразмножения смородины и антиоксидант для клонального микроразмножения смородины). Даний спосіб базується на використанні клонального мікророзмноження смородини. Як експлант використовують вегетативні органи рослини: бруньку та апікальний кінець стебла. Бруньки смородини беруть в лютому - квітні, тоді коли вони знаходяться у фазі спокою і штучно пробуджують їх або у фазу активного росту травні - червні. Вихідні пагони обробляють розчином антиоксидантів: діетилдитиокарбомат натрію (ДІЕКА) та аскорбінової кислоти за співвідношенні 0,4-0,5 г/л та 1-2 г/л і етилендіамінтетраацетат натрію (ЕДТА) - 0,8-1,0 г/л. Після зрізування експланту з материнської рослини їх очищають від верхніх листків, промивають проточною водою протягом 1-1,5 години та ополіскують дистильованою водою. Матеріал стерилізують від сапрофітної мікрофлори, використовуючи при цьому 0,1 %-ний розчин діациду за експозиції 10 хвилин. Після цього експланти промивають стерильною дистильованою водою, переносять у чашки Петрі і наносять по декілька крапель стерильного антиоксидантного розчину. Матеріал знаходиться в краплинах з антиоксидантного розчину 5-10 хвилин, а потім його пересаджують на живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга. Культивування проводять за температури 24±2 °C та протягом фотоперіоду 16 годин. Через 2-3 тижні після введення відмічено розвиток експлантів. Отримані мікрокліни (через 4-5 тижні) ділять і висаджують на середовище для укорінення, попередньо також у стерильних чашках Петрі наносять по декілька крапель антиоксидантного розчину. Укорінені рослини пересаджують у ґрунт. Відомий і пропонований способи вегетативного розмноження мають спільні ознаки: стерилізація експлантів та отримання життєздатних проростків, живильні середовища для розмноження та укорінення, використання антиоксидантів, пересадка укорінених рослин у ґрунт. Однак, відомий спосіб клонального мікророзмноження смородини є доволі трудомістким, не дає можливості отримати достатньої кількості стерильного життєздатного матеріалу та високого коефіцієнту розмноження і ризогенезу, потребує додаткових три етапи обробки у чашках Петрі експлантів антиоксидантним розчином та створює довший термін культивування рослин до пересадки у ґрунт. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб інактивації фенолів у культурі Miscanthus giganteus, що дозволить зменшити витрати та термін культивування, отримати 99,0 % стерильних життєздатних проростків, удосконалити склад живильних середовищ для розмноження і укорінення, додаючи бензиламінопурин (БАП) - 0,2-0,5 мг/л, індолілоцтову кислоту (ІОК) - 0,2-0,5 мг/л, цукрозу - 30,0 г/л, а для розмноження ввести модифікацію із антиоксиданту і одержати укорінені рослини, збільшити коефіцієнт розмноження. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі використовують як експлант бруньки та апікальний кінець стебла, які очищають від верхніх листків, промивають проточною водою протягом 1-1,5 години та ополіскують дистильованою водою. Проводять обробку вихідних пагонів розчином антиоксидантів: діетилдитиокарбомат натрію (ДІЕКА) та аскорбінової кислоти при співвідношенні 0,4-0,5 г/л та 1-2 г/л і етилендіамінтетраацетат натрію (ЕДТА) - 0,81,0 г/л. Стерилізація забезпечують 0,1 %-ним розчином діациду за експозиції 10 хвилин та промивають стерильною дистильованою водою. У чашки Петрі переносять експланти і наносять по декілька крапель стерильного антиоксидантного розчину, у якому вони знаходяться 5-10 хвилин, а потім їх пересаджують на живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга. Культивування проводять при температурі 24±2 °C та протягом фотоперіоду 16 годин. Отримані мікрокліни ділять і висаджують на середовище для укорінення, попередньо також у стерильних чашках Петрі наносять по декілька крапель антиоксидантного розчину. Укорінені рослини пересаджують у ґрунт. 1 UA 78943 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 У запропонованому способі використовують ризоми, які промивають дистильованою водою, стерилізують 0,2-0,4 % розчином сулеми за експозиції 60-90 хвилин, що дозволяє отримати 99 % стерильних і життєздатних проростків, які в подальшому пересаджують на модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з доданням кінетину - 0,5-1,0 мг/л, БАП 0,2-0,5 мг/л, цукрози 30 г/л та антиоксиданту аскорбінової кислоти - 1,5-2,0 г/л. Культивування проводять при температурі 24±2 °C та протягом фотоперіоду 16 годин, що забезпечує отримання дев'яти новоутворених пагонів. Для укорінення використовують ІОК - 0,2-0,5 мг/л та цукрози -30 г/л і проводять пересаджування у ґрунт на 11-12 добу. Новими відмінними від існуючого прототипу ознаками є: - введення в стерильну культуру ризом міскантусу; - використання для стерилізації 0,2-0,4 % розчин сулеми; - експозиція 60-90 хвилин; - додавання у середовище для розмноження кінетину - 0,5-1,0 мг/л, БАП - 0,2-0,5 мг/л, цукрози 30 г/л та аскорбінової кислоти - 1,5-2,0 г/л; - використання цукрози; - для укорінення рослин додавання ІОК - 0,2-0,5 мг/л та цукрози - 30 г/л; - кількість обробок антиоксидантами - 1 раз введення у живильне середовище; - використання розчину одного антиоксиданту; - пересаджування рослин у ґрунт на 11-12 добу. Відмінні від прототипу ознаки при взаємодії з відомими дозволяють отримати високий вихід стерильних життєздатних експлантів, оптимізувати та здешевити склад модифікованого живильного середовища за прописом Мурасіге і Скуга, зменшити додаткові три етапи обробки антиоксидантним розчином матеріалу, отримати високий коефіцієнт розмноження і ризогенезу, скорочує термін культивування рослин до пересадки у ґрунт. Ефективність нового способу клонального мікророзмноження міскантусу у культурі in vitro вивчали на Miscanthus giganteus. Результати досліджень вказують, що використання 0,2-0,4 % розчину сулеми за експозиції 60-90 хвилин для стерилізації ризом забезпечує стерильність експлантів на 99,0 %. Введення до живильного середовища Мурасіге і Скуга кінетину - 0,5-1,0 мг/л, БАП - 0,2-0,5 мг/л, цукрози 30 г/л та антиоксиданту аскорбінової кислоти - 1,5-2,0 г/л дозволяє отримати дев'ять додаткових пагонів та вдвічі збільшити коефіцієнт розмноження. Не доцільною та трудомісткою є триразова обробка у чашках Петрі розчином антиоксидантів рослинного матеріалу. Економічно не вигідним та не рентабельним для міскантусу є використання суміші антиоксидантів діетилдитиокарбомат натрію (ДІЕКА) та аскорбінової кислоти при співвідношенні 0,4-0,5 г/л та 12 г/л і етилендіамінтетраацетат натрію (ЕДТА) - 0,8-1,0 г/л. Додавання при укоріненні до живильного середовища ІОК 0,5-1,0 мг/л та цукрози - 30 г/л забезпечує високий відсоток укорінених рослин уже на 11-12 добу. Спосіб інактивації фенолів у культурі Miscanthus giganteus здійснюється таким чином: за експлант використовують ризоми, які промивають дистильованою водою 1-2 рази, стерилізують 0,2-0,4 % розчином сулеми за експозиції 60-90 хвилин, що дозволяє отримати 99 % стерильних і життєздатних проростків, які в подальшому пересаджують на модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з доданням кінетину - 0,5-1,0 мг/л, БАП - 0,2-0,5 мг/л, цукрози - 30 г/л та антиоксиданту аскорбінової кислоти - 1,5-2,0 г/л. Для укорінення використовують модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з ІОК - 0,2-0,5 мг/л та цукрозою - 30 г/л. Рослини пересаджують у ґрунт на 11-12 добу. Культивування проводять при температурі 24±2 °C та протягом фотоперіоду 16 годин, що забезпечує отримання дев'яти новоутворених пагонів (див. таблицю). 2 UA 78943 U Таблиця Спільні та відмінні показники ефективності використання запропонованого способу інактивації фенолів у культурі Miscanthus giganteus Показники Відомий Запропонований Стерилізація 0,1 % розчин діоциду 0,2-0,4 % розчин сулеми Експозиція 10 хвилин 60-90 хвилин бруньки, апікальний кінець Експлант ризоми стебла Стерильність експлантів, % 78 99 Мінеральна основа середовища для MS MS розмноження і укорінення БАП, мг/л 0,6 0,2-0,5 Кінетин, мг/л 0,5-1,0 ІОК, мг/л 0,3-0,6 0,2-0,5 ДІЕКА, г/л 0,4-0,5 Аскорбінова кислота, г/л 1-2 1,5-2,0 ЕДТА, г/л 0,8-1,0 1 раз додавання у Кількість обробок антиоксидантом, рази 3 рази поверхнево середовище Кількість новоутворених пагонів, шт. 6,0 9,0 Цукроза, г 20,0 30,0 Довжина фотоперіоду, годин 16,0 16 Температура культивування, °C 24±2 24±2 Коефіцієнт розмноження 6 9 Придатність рослин до пересаджування у 28-32 11-12 ґрунт, доба 5 Впровадження запропонованої корисної моделі дає можливість отримати високий вихід стерильних життєздатних експлантів, оптимізувати та здешевити склад модифікованого живильного середовища за прописом Мурасіге і Скуга, зменшити додаткові три етапи обробки антиоксидантним розчином матеріалу, отримати високий коефіцієнт розмноження і ризогенезу, скорочує термін культивування рослин до пересадки у ґрунт. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб інактивації фенолів у культурі Miscanthus giganteus, що включає стерилізацію матеріалу, використання для розмноження та укорінення модифікованого середовища за прописом Мурасіге і Скуга, культивування при 16-годинному фотоперіоді при температурі 24±2 °C, використання антиоксиданту, який відрізняється тим, що як експлант використовують ризоми, які стерилізують 0,2-0,4 % розчином сулеми за експозиції 60-90 хвилин, для розмноження у середовище Мурасіге і Скуга додають кінетин - 0,5-1,0 мг/л, бензиламінопурин (БАП) - 0,2-0,5 мг/л, цукрозу - 30 г/л та антиоксидант - аскорбінову кислоту - 1,5-2,0 г/л, для укорінення у середовище Мурасіге і Скуга додають індолілоцтову кислоту (ІОК) - 0,2-0,5 мг/л і 30 г/л цукрози. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3