Спосіб визначення енергетичного потенціалу мітохондрій

Реферат: Спосіб визначення енергетичного потенціалу мітохондрій включає інструментальне обстеження тканин. Отримують електронограми ультратонкого зрізу тканини при збільшенні їх зображення 8000-10000, морфометрично визначають об'ємну щільність мітохондрії, визначають кількість непошкоджених кріст в мітохондріях досліджуваного зразка, визначають кількість мітохондрій в досліджуваному зразку, та визначають значення енергетичного потенціалу мітохондрій. UA 85295 U (12) UA 85295 U UA 85295 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини і біології, а саме до способу визначення енергетичного потенціалу мітохондрій, що може бути використано для діагностики порушень утворення енергії в мітохондріях, а також показник у способах ранньої або диференціальної діагностики мітохондріальної недостатності, в способах модифікації мітохондріального метаболізму, в способах підвищення проліферативної активності мітохондрій, як кількісну прогностичну ознаку, в способах раннього прогнозування мітохондріальних захворювань, або як маркер граничних параметрів впливу в способах корекції вторинних мітохондріальних змін, лікування мітохондріальних порушень, в способах впливу на організм шляхом адекватної доставки біологічно активних речовин в мітохондрії, для діагностики хвороб різної етіології, як маркер граничних параметрів впливу при застосуванні засобів патогенетичного лікування захворювань за допомогою тканеспецифічного регулювання мітохондріальних процесів, та ін. Забезпечення організму енергією здійснюється мітохондріями клітин. Мітохондрії - це клітинні органели, "енергетичні "станції", що беруть участь в процесах енергоутворення, в них відбувається - окислення вільних жирних кислот та углеводів із звільненням активної форми оцтової кислоти (ацетил-КоА), ферментативне декарбоксилювання піровиноградної кислоти в ацетил-КоА, цикл трикарбонових кислот, окислювальне фосфорилювання. Основною функцією мітохондрій є окислювальне фосфорилювання, що полягає в етерифікації неорганічного фосфору з утворенням макроергів, - це аденозинтрифосфат (АТФ, АДФ, АМФ) і креатинфосфат. Мітохондрії злокалізовані в місцях найбільших енергозапитів і синтезуються додатково при збільшенні енергоспоживання органами і тканинами (Лузиков В.Н. Регулирование формирования митохондрий: молекулярный аспект. - М.: Наука, -1980.). Тому визначення енергетичного потенціалу мітохондрій є вкрай важливим показником перебігу різних процесів в клітинах біологічних об'єктів. Відомий спосіб діагностики порушень утворення енергії в мітохондріях гепатоцитів (RU2465599, МПК G01N 33/50, G01N 33/573, дата публікації: 27.10.2012), що включає визначення в сироватці крові ферментів аспартатамінотрансферази (ACT), аланінамінотрансферази (АЛТ), креатинфосфокінази (КФК), лактатдегідрогенази (ЛДГ) і при підвищенні активності ферменту ACT при збереженні нормальної активності ферментів АЛТ, КФК, ЛДГ діагностують рівень енергопродукувальної функції мітохондрій гепатоцитів. Недоліком способу є застосування для діагностики складних та малодоступних методів визначення кількісного складу ферментів спартатамінотрансферази (ACT), аланінамінотрансферази (АЛТ), креатинфосфокінази (КФК), лактатдегідрогенази (ЛДГ) що ускладнює визначення енергетичного потенціалу мітохондрій. Відомий спосіб кількісної оцінки біоенергетичних процесів людини in vitro (RU2010146389, МПК G01N 33/00, дата публікації заявки: 20.05.2012), що полягає в тому, що на суспензію ізольованих тканин тварин мітохондрій впливають у фізіологічній концентрації сироваткою або низькомолекулярною фракцією сироватки крові пацієнта, потім полярографічним методом в досвіді і контролі визначають інтенсивність споживання кисню мітохондріями і утворення АТФ в двох дихальних ланцюжках - "сукцинатної", коли субстратом окислення є бурштинова кислота, і НАД-залежної, по різниці вимірюваних параметрів визначають міру порушення відповідних біоенергетичних показників. Недоліком такого способу є застосування для діагностики складного та малодоступного способу кількісного визначення полярографічним методом в досвіді і контролі інтенсивності споживання кисню мітохондріями і утворення АТФ що ускладнює визначення енергетичного потенціалу мітохондрій. Відомий спосіб визначення енергетичного потенціалу мітохондрій по інтенсивності окислювального фосфорилювання в мітохондріях гепатоцитів, в якому висновок здійснювали по спаду неорганічного фосфату, зміст якого визначали розробленим В.Г. Григорян і співавт. (В.Г. Григорян, В.С. Кирошка, Т.И. Шинкарева, Г.Г. Цимбаларь. Биоэнергетические и пластические процесси при легочной патологии. - Кишинев, 1985.-97 с.) методом ультрафіолетової спектрофотометрії фосфатно-молібдатного комплексу, що має максимум світлопоглинання при 320 ммк. Для цього використали гомогенат тканини печінки, інкубаційну суміш осаджували 10кратним об'ємом 5ХУ і центрифугували. З надосадкової рідини відбирали по 0,5 мл і переносили в пробірки, що містять 25 мл 0,1 розчину молібдату амонію на децинормальній сірчаній кислоті, перемішували і спектрофотометрирували в 1 см кюветах при 320 мкм проти проби, що містить 0,5 мл 5ХУ і 25 мл розчину молібдату амонію. Кількість аденілових нуклеотидів (АТФ) визначали після їх електрофоретичного розділення на папері і елюювання децинормальною соляною кислотою, спектрофотометрією в ультрафіолетових променях (Г.В. Воскобойников. Количественное определение свободных тканевых рибонуклеотидов методом высоковольтного электрофореза. - Биохимия, 1966. - Вып. 5. - С. 1041-104). 1 UA 85295 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Проте спосіб є громіздким, оскільки для його виконання необхідно використати матеріал (тканина печінки) біопсію і сьогодні в лабораторній діагностиці використовуватися не може. Недоліком такого способу є його складність, багатостадійність, застосування опосередкованих даних, на які впливають багато інших чинників, що знижує достовірність отриманих даних. Задачею корисної моделі є створення способу визначення енергетичного потенціалу мітохондрій, в якому за рахунок застосування нових дій та показників енергетичного потенціалу мітохондрій забезпечується можливість кількісного визначення енергетичного потенціалу мітохондрій на детальнішому структурно-функціональному рівні біологічної організації тканин, що дозволяє підвищити достовірність даних щодо енергоутворюючої функції мітохондрій. Для вирішення поставленої задачі спосіб визначення енергетичного потенціалу мітохондрій включає інструментальне обстеження тканин. Новим у способі є те, що отримують електронограми ультратонкого зрізу тканини при збільшенні їх зображення 8000-10000, морфометрично визначають об'ємну щільність мітохондрії, визначають кількість непошкоджених кріст в мітохондріях досліджуваного зразка, визначають кількість мітохондрій в досліджуваному зразку, та визначають значення енергетичного потенціалу мітохондрій за формулою: ЕПМ = VvMx Ч Кр./ Мх. де: ЕПМ- енергетичний потенціал мітохондрій; VvMx- об'ємна щільність мітохондрії; Кр.- кількість непошкоджених кріст в мітохондріях досліджуваного зразка; Мх.- кількість мітохондрій в досліджуваному зразку. Проведення досліджень за способом забезпечує можливість кількісного визначення енергетичного потенціалу мітохондрій на детальнішому структурно-функціональному рівні біологічної організації тканин, що дозволяє підвищити достовірність даних щодо енергоутворюючої функції мітохондрій. Спосіб ілюструється прикладом його застосування. При проведенні досліджень був застосований високовольтний електронний мікроскоп ПЕМ 125 (Україна, Суми). На кресленні представлено ділянку зображення електронограми ультратонкого зрізу тканини з досліджуваним зразком, при збільшенні зображення 10000, на якому показано наявні мітохондрії з крістами в цих мітохондріях досліджуваного зразка. На кресленні показано присутні у досліджуваному зразку мітохондрії 1 різної форми з крістами 2, наявними в цих в мітохондріях 1 досліджуваного зразка. Спосіб здійснювали наступним чином. Отримували за допомогою мікроскопа збільшені зображення зразка, визначали об'ємну щільність мітохондрії - (VvMx); кількість мітохондрій 1 в досліджуваному зразку - (Мх.); кількість непошкоджених кріст 2 в мітохондріях 1 досліджуваного зразка -(Кр.). При проведенні досліджень враховувалися лише непошкоджені крісти, які повноцінно виконують свою функцію лише утому випадку, коли їх цілісність не була порушена. При проведенні підрахунку враховувалися лише ті непошкоджені крісти, які на електронограми мали чітко окреслені, не розпливчасті контури, та були цілими, або розділеними не більш ніж на два фрагменти. Потім визначали значення енергетичного потенціалу мітохондрій за формулою: ЕПМ = VvMx Ч Кр./ Мх. = 26,23 Ч 642/ 26=647,7 Проведення досліджень за способом забезпечує можливість кількісного визначення енергетичного потенціалу мітохондрій на детальнішому структурно-функціональному рівні біологічної організації тканин, що дозволяє підвищити достовірність даних щодо енергоутворюючої функції мітохондрій. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення енергетичного потенціалу мітохондрій, що включає інструментальне обстеження тканин, який відрізняється тим, що отримують електронограми ультратонкого зрізу тканини при збільшенні їх зображення 8000-10000, морфометрично визначають об'ємну щільність мітохондрії, визначають кількість непошкоджених кріст в мітохондріях досліджуваного зразка, визначають кількість мітохондрій в досліджуваному зразку, та визначають значення енергетичного потенціалу мітохондрій за формулою: ЕПМ = VvMx Ч Кр./ Мх. де: ЕПМ - енергетичний потенціал мітохондрій; 2 UA 85295 U VvMx - об'ємна щільність мітохондрії; Кр. - кількість непошкоджених кріст в мітохондріях досліджуваного зразка; Мх. - кількість мітохондрій в досліджуваному зразку. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3