Спосіб встановлення ступеня токсичності комбінованих пестицидів за допомогою визначення швидкості і ефективності дихання мітохондрій печінки

Спосіб встановлення ступеня токсичності комбінованих пестицидів за допомогою визначен 3 льний аналіз із прототипом дозволяє зробити висновок, що спосіб, який заявляється має відмінні ознаки: буфер трис-НСl замість трис-оксиметиламінометану, замість інгібіторів дихального ланцюга (ціаніди, динітрофенол) застосовують стандартні розчини комбінованих пестицидів, які відносяться до похідних дитіокарбамінової кислоти і оксатиїну. Субстратами окислення для даного методу вибрані а-кетоглутарова, глютамінова + яблучна і янтарна кислоти. Спосіб виконується таким чином. Печінку тільки-но забитої тварини виймають і охолоджують. Після чого відділяють наважку масою 5-10г і гомогенізують у охолоджуючому гомогенізаторі при температурі 0-4°С. Потім гомогенізат змішують з попередньо підготовленим вуглеводним середовищем у співвідношенні 1:50, ретельно перемішують і настоюють у холодильнику 12-18 годин. Після настоювання суміш знову ретельно перемішують, центрифугують протягом 1 хв. при 800об/хв. і поміщають у холодильник. Для досліджень беруть осад (рідину) і оцінюють дихальну активність мітохондрій по поглинанню кисню із полярографічної соти. Соту, об'ємом 1см3 заповнюють середовищем інкубації, а потім вносять суспензію мітохондрій (70мкЛ). Вимірювання проводять при температурі +30°С. Для стимуляції дихання і визначення дихального контролю у середовищі інкубації додають 200нмоль АДФ у об'ємі 10мкЛ. Середовища виділення і інкубації, а також субстрати окислення і розведення АДФ готовлять на бідистильованій воді. Операції по розрахунку дихання проводять у такій послідовності: 1) Після включення полярографічної установки, при зупиненій мішалці, заправляють газообмінну камеру середовищем інкубації з вибраним субстратом дихання. 2) Включають мішалку і механізм, що протягує стрічку (ЕПП), очікують час стабілізації показників оксиметру по прибору - перо самописця при цьому встановлюється у визначеному місці і записує вертикальну лінію у правій частині стрічки діаграми ЕПП; 3) У соту оксиометра вводять суспензію мітохондрій (70мкЛ), яка вміщує не менш 1-3 мг білка. При цьому перо самописця зміщується вліво і регіструє швидкість поглинання кисню (початкова швидкість при окисленні субстрату дихання - V1). 4) Через 1-2 хвилини, після початку дихання, додають АДФ (10мкЛ, але не більше 20мкЛ), спостерігають значне підвищення швидкості поглинання кисню (V2) до того часу, поки весь доданий АДФ перетворюється у АТФ. Після вичерпання АДФ швидкість дихання знижується і змінює нахил кривої на діаграмі (швидкість V3), що характеризує відредагований стан мітохондріальної системи, тобто швидкість поглинання кисню в умовах вичерпаного екзогенного АДФ (Фіг.1); 5) запис проводять до зупинки дихання мітохондрій. Кут нахилу полярографічної кривої відображає швидкість переходу системи в черговий метаболічний стан. Відсутність чіткої реакції міто 41847 4 хондрій на АДФ свідчить про відсутність міцного супряження окислення і фосфорилювання у досліджуваному об'єкті. Для повної характеристики функціонального стану електротранспортного ланцюга мітохондрій розраховують також коефіцієнти дихального контролю за Ларді-Вельманом (V2/V1) і ЧансомВільямсом (V2/V3), а також - коефіцієнт фссфорилювання (інтенсивність фосфорилювання, ІФ) швидкість поглинання АДФ за 1сек., у розрахунку на 1мг білка. Для експериментів використовують наступні субстрати окислення: а-кетоглутарому кислоту, сукцинат (бурштинова кислота) і глутамат з малатом (глютамінова з яблучною кислоти) у концентрації 10мМ. Бурштинова кислота є одним із енергетично активних метаболітів циклу Кребса при утворенні АТФ в мітохондріях. А-кетоглутарова кислота при окислювальному декарбоксилюванні утворює сукциніл-СоА і СО2. Ця реакція каталізуєтся a кетоглутаратдегідрогеназним комплексом. Малат окислюється у оксалоацетат у реакції ЦТК НАДзалежною малатдегідрогеназою. Додавання глутамата до малату необхідно для умов попередження ингібуючої дії оксалоацетату. Глутамат, який вводить оксалоацетат у трансаміназну реакцію, дозволяє зняти, щавелеоцтове гальмування реакції біологічного окислення. За графіком поглинання кисню розраховують параметри тканинного дихання: а) початкову (V1), котра означає стан «покою»; б) швидкість поглинання кисню V2 (стан «збудження»; в) швидкість окислення V3 після витрати АДФ («відрегульований» стан). Інтенсивність дихання (V1; V2; V3) розраховують за швидкість поглинання кисню у одиницю часу на одиницю білка мітохондрій: (V) = нмоль 02 х сек-1 х мг білка-1 Розраховують показники дихального контролю: - за Чансом, як співвідношення V2/V3 і - за Ларді - V2/V1. Ефективність фосфорилювання (ЕФ), АДФ/О, розраховують як співвідношення кількості АДФ, який додають в середовище, до кількості засвоєного кисню від моменту введення АДФ до точки його повного вичерпання. При цьому враховують, що у 1мл вмісту соти при +30°С вміщується 234нмоль О2. Розрахунок інтенсивності фосфорилювання (ІФ), тобто швидкості синтезу АТФ за зменшенням АДФ і розрахунку на одиницю маси білка мітохондрій: (ІФ) = нмоль АДФ • с-1 • мг білка-1 Вміст білка мітохондрій у полярографічній соті (об'ємом 1см3) знаходиться на рівні 3,0-4,0мг. Спосіб встановлення ступеню токсичності комбінованих пестицидів за допомогою визначення швидкості і ефективності дихання мітохондрій печінки є досить чутливим, може використовуватись у лабораторіях з ціллю діагностики отруєння тварин токсикантами. 5 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 41847 6 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601