Спосіб визначення енергетичного метаболізму міокарда

Спосіб визначення енергетичного метаболізму міокарда, що включає аналіз інтенсивності різних метаболічних циклів в одному зразку тканини міокарда шляхом паралельного порівняння активності цитоплазматичної та мітохондріальної фракцій різних ферментів енергетичного метаболізму після проведення ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції з виконанням зрізів досліджуваної тканини, який відрізняється тим, що додатково проводять гістохімічну реакцію на сукцинатдепдрогеназу, отримують гранули солі тетразолію, а надалі заливають зріз у суміш епона з аралдітом, визначають КІЛЬКІСТЬ ТОЧОК перетинів ЛІНІЙ, які припадають на структуру досліджуваної тканини, обчислюють питомі та загальний питомий Винахід відноситься до медицини, зокрема до визначення, вимірювання, або реєстрації з діагностичною ціллю та може бути використаним в патологічній анатомії та патофізіології, переважно для визначення функціонального стану серцевосудинної системи Відомий спосіб визначення енергетичного метаболізму міокарда, що включає аналіз інтенсивності різних метаболічних циклів в одному зразку тканини міокарда шляхом паралельного порівняння активності цитоплазматичної та мітохондріаль об'єм високоенергетичних мітохондрій та оцінюють рівень енергетичного метаболізму міокарда, за умови, якщо КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолію становить до 10 одиниць, а загальний питомий об'єм 3 високоенергетичних мітохондрій - менше 0,27мкм , встановлюють низький рівень енергетичного метаболізму, якщо КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолію становить 10-15од , а загальний питомий об'єм високоенергетичних мітохондрій становить 0,280,31 мкм3, - середній рівень, а якщо КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолію сягає більше 15од і загальний питомий об'єм високоенергетичних мітохондрій більше 0,31 мкм3, - високий рівень енергетичного метаболізму, при цьому питомі та загальний об'єми високоенергетичних мітохондрій обчислюють за формулами Vn=PH/P, де Vn - питомий об'єм високоенергетичної мітохондрм, мкм3, Рн - КІЛЬКІСТЬ точок перетину ЛІНІЙ стандартної окулярної вставки, які припадають на високоенергетичну мітохондрію, Р - загальна КІЛЬКІСТЬ ТОЧОК перетину ЛІНІЙ станда ртної окулярної вставки, V=Vni+Vn,, де V- загальний об'єм високоенергетичних мітохондрій, мкм3, V n i - питомий об'єм однієї високоенергетичної мітохондрм, мкм3, і - КІЛЬКІСТЬ досліджуваних високоенергетичних мітохондрій ної фракцій різних ферментів енергетичного метаболізму після проведення ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції з виконанням зрізів досліджуваної тканини, у ВІДПОВІДНОСТІ з яким, проводять спектрофотометричну реєстрацію утворення відновленої форми нікотинаміддинуклеотида в інкубаційному середовищі [1] Причиною, що стримує досягнення очікуваного технічного результату, є неможливість паралельно з ГІСТОХІМІЧНИМ проводити морфологічний аналіз 00 о о (О біологічного зразка, що знижує інформативність методу В основу винаходу поставлено задачу розробити такий спосіб визначення енергетичного метаболізму міокарда, який шляхом одночасного ГІСТОХІМІЧНОГО та морфологічного аналізу міокарду підвищує інформативність способу при використанні Означений вище технічний результат досягається тим, що у відомому способі визначення енергетичного метаболізму міокарда, що включає аналіз інтенсивності різних метаболічних циклів в одному зразку тканини міокарда шляхом паралельного порівняння активності цитоплазматичної та мітохондріальної фракцій різних ферментів енергетичного метаболізму після проведення ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції з виконанням зрізів досліджуваної тканини, який відрізняється тим, що, додатково проводять гістохімічну реакцію на сукцинатдепдрогеназу, отримують гранули солі тетразолія, а надалі заливають зріз у суміш епона з аралдітом, визначають КІЛЬКІСТЬ точок перетинів ЛІНІЙ, які припадають на структуру досліджуваної тканини, обчислюють питомі та загальний питомий об'єм високоенергетичних мітохондрій, та оцінюють рівень енергетичного метаболізму міокарда за умови, якщо КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолія становить до 10 одиниць, а загальний питомий об'єм високоенергетичних мітохондрій менше 0,27мкм3 - встановлюють низький рівень енергетичного метаболізму, якщо КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолія становить 10-15од , а загальний питомий об'єм висококенергетичних мітохондрій становить 0,280,31 мкм3 - середній рівень, а якщо КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолія сягає більше 15од і загальний питомий об'єм висококенергетичних мітохондрій більше 0,31 мкм3 - високий рівень енергетичного метаболізму, при цьому питомі та загальний об'єми високоенергетичних мітохондрій обчислюють за формулами 60078 аналізу визначають рівень енергетичного метаболізму міокарда, чим підвищують інформативність способу ГІСТОХІМІЧНИМ критерієм стану енергетичного метаболізму міокарду є КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолія в цитоплазмі та мітохондріях клітини, яка є показником активності сукцинатдепдрогенази (СДГ) - ключового ферменту циклу трикарбонових кислот Морфологічним критерієм рівня енергетичного метаболізму є питомий об'єм високоенергетичних мітохондрій Визначення енергетичного метаболізму міокарда має особливе значення при ряді захворювань серцево-судинної системи, які потребують діагностичної біопсії міокарда [2, 3] Vn=PH/P, де Vn - питомий об'єм високоенергетичної мі3 тохондрм, мкм , Р н - КІЛЬКІСТЬ точок перетину ЛІНІЙ стандартної окулярної вставки, які припадають на високоенергетичну мітохондрію, Р - загальна КІЛЬКІСТЬ ТОЧОК перетину ЛІНІЙ ста ндартної окулярної вставки, V=Vni+Vn,, де V - загальний об'єм високоенергетичних мітохондрій, мкм3, V n i - питомий об'єм однієї високоенергетичної мітохондрм, мкм3, і - КІЛЬКІСТЬ досліджуваних високоенергетичних мітохондрій Приведені показники, за якими оцінюють рівень енергетичного метаболізму міокарда, є оптимальними, що доведено багаточисленими дослідженнями Причинно-наслідковий зв'язок сукупності істотних ознак з означеним вище технічним результатом полягає в тому, що для визначення енергетичного метаболізму міокарда проводять ГІСТОХІМІЧНИЙ аналіз зразку, а потім, після додаткової обробки, проводять морфологічний аналіз, визначаючи КІЛЬКІСТЬ високоенергетичних мітохондрій, їхній загальний об'єм, за допомогою математичного Для доведення можливості відтворення способу з отриманням вищезазначеного технічного результату, проведено дослідження на 4 серцях щурів Результати проведених досліджень на експериментальних тваринах дозволили встановити, що рівень енергетичного метаболізму залежить не тільки від активності СДГ, але і від загального питомого об'єму високоенергетичних мітохондрій Визначення цих показників підвищує інформативність заявляемого способу у порівнянні з прототипом Отже, сукупність відокремлюючих ознак винаходу, що заявляється, є істотною, бо має причинно-наслідковий зв'язок з підвищенням інформативності ВІДОМОСТІ, ЩО підтверджують можливість здійснення способу визначення енергетичного метаболізму міокарда, що заявляється, полягають в наступному Для здійснення способу визначення енергетичного метаболізму міокарда необхідне таке обладнання і матеріали як набір реактивів, крюстатний мікротом, ультрамікротом, електронний мікроскоп, стандартні окулярні вставки Фіксування та заливку матеріалу виконують за традиційною схемою [4] Спосіб визначення енергетичного метаболізму міокарда виконують наступним чином Відразу після взяття бюптату його охолоджують рідким азотом Потім на крюстатному мікротомі отримують зрізи 20мкм завтовшки Зрізи розміщують в інкубаційному середовищі, яке складається з основного розчину (2мл), 1М сукцинату (0,2мл), 0,5% менадюн (2-3 краплі), феназінметасульфат (0,1мг), рН7,5 Інкубацію проводять 5-15 хвилин при температурі 37°С Після промивки в фізіологічному розчині (15 хвилин) фіксують в охолодженій суміші, яка містить 2% розчин параформу і 2,5% глютарового альдегіду на 0,1 М фосфатному буфері (рН7,3) Матеріал дофіксовують у 1% розчині чотирьохоксидного осмію на тому ж буфері, зневоджують в охолоджених розчинах спиртів і ацетонів зростаючої концентрації і заливають в суміш епона з аралдітом На ультрамікротомі отримують ультратонкі зрізи 1мкм завтовшки, які контрастують ураніл-ацетатом і цитратом свинцю та оцінюють в електронному мікроскопі При проведенні візуального обстеження бюптату за допомогою електронного мікроскопа визначають КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолія, яка випадає в осадок при ГІСТОХІМІЧНІЙ реакції на СДГ За 60078 допомогою методу точкового аналізу [5] з викорисРівень енергетичного метаболізму залежить танням стандартних окулярних вставок визначавід активності сукцинатдепдрогенази в мітохондріють питомий об'єм високоенергетичної мітохондрм, ях та питомого об'єму високоенергетичних мітохоякий розраховують за формулою ндрій в міокарді Ці показники можуть змінюватись в залежності від функціональної активності міокаVn=P,/P, рда Якщо КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолія, яка де Vn - питомий об'єм високоенергетичної мі3 утворюється в процесі ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції на СДГ, тохондрм, мкм , 3 становить до 10 одиниць, а ЗПО менше 0,27мкм , Рі - КІЛЬКІСТЬ точок перетину ЛІНІЙ стандартної то оцінюють рівень енергетичного метаболізму як окулярної вставки, які припадають на структуру, низький, якщо КІЛЬКІСТЬ гранул 10-15од , а ЗПО Р - загальна КІЛЬКІСТЬ ТОЧОК перетину ЛІНІЙ ста0,28-0,31 мкм - рівень середній, а якщо КІЛЬКІСТЬ ндартної окулярної вставки, 3 гранул більше 15од і ЗПО більше 0,31 мкм - як Загальний питомий об'єм (ЗПО) високоенергевисокий тичних мітохондрій визначають за формулою Таким чином, після проведення експерименV=Vni+Vn,, тального випробування запропонованого способу де V - загальний об'єм високоенергетичних мі3 визначення енергетичного метаболізму міокарда тохондрій, мкм , заявником встановлено, що заявлений спосіб моV n i - питомий об'єм однієї високоенергетичної же бути широко використаний у роботі патологоамітохондрм, мкм3, натомічних відділень та дослідницьких морфологіі - КІЛЬКІСТЬ досліджуваних високоенергетичних чних і патофізіологічних лабораторій для заявляемітохондрій мого рішення задачі утому вигляді, як воно охараОцінюють рівень енергетичного метаболізму в ктеризоване у незалежному пункті формули Підміокарді за КІЛЬКІСТЮ гранул солі тетразолія та по тверджена можливість його здійснення за допомоЗПО високоенергетичних мітохондрій в зразку гою вказаних у заявці, або відомих до дати пріориЯкщо КІЛЬКІСТЬ гранул становить до 10 одиниць, а тету, діагностичних приладів і середовищ Спосіб, ЗПО менше 0,27мкм3, то оцінюють рівень енергещо втілює заявляємий винахід, при здійсненні затичного метаболізму як низький, якщо КІЛЬКІСТЬ безпечує досягнення позитивного результату, а гранул становить 10-15од , а ЗПО 0,28-0,31 мкм3 саме визначення енергетичного метаболізму міосередній рівень, а якщо КІЛЬКІСТЬ гранул сягає бікарду дає можливість паралельно з ГІСТОХІМІЧНИМ льше 15од і ЗПО більше 0,31 мкм3 - як високий проводити морфологічний аналіз зразка тканини У ВІДПОВІДНОСТІ з винаходом для оцінки рівня енергетичного метаболізму міокарду необхідно оцінити дві групи тварин тих, що знаходились у стані спокою (перша група), та тих, які перенесли фізичне навантаження плаванням (друга група) Приклад 1 Перша група тварин Забір бюптату зроблений у 2 тварин, які знаходились у стані спокою Виготовлення ГІСТОЛОГІЧНИХ препаратів робили за описаною в незалежній частині методикою Встановлено, що КІЛЬКІСТЬ гранул солі тетразолія у 1-го щура - 11од, ЗПО 0,28мкм3 - рівень енергетичного метаболізму середній, у 2-го щура КІЛЬКІСТЬ гранул - 13од , ЗПО 0,291 мкм3 - рівень енергетичного метаболізму середній Приклад 2 Друга група тварин Забір бюптату зроблений у 2 тварин, які були в умовах фізичної напруги на протязі тижня Виготовлення ГІСТОЛОГІЧНИХ препаратів робили за описаною в незалежній частині методикою 1-й щур КІЛЬКІСТЬ гранул становила 17од , 2-й щур КІЛЬКІСТЬ гранул становила 19од , ЗПО - 0,325мкм3 Рівень енергетичного метаболізму оцінений як високий, ЗПО - 0,34мкм3 Рівень енергетичного метаболізму високий Комп'ютерна верстка Л Ціхановська Отже, розроблений об'єкт відповідає умовам "промислова придатність", "новизна", "винахідницький рівень" і може бути кваліфікований винаходом України Джерела інформації 1 Спосіб визначення енергетичного метаболізму міокарда Заяв 95115094 України, МПК А61В10/00 G01 N33/48 / Козлов В О , Твердохліб І В, Шпонька І С (Дніпропетровська державна медична академія) - №22444А - заявл 28 11 95 опубл 03 03 98 2 Черпаченко Н М , Жданов В С , Виверт А М Изменения активности ферментов миокарда больных дилатационной кардиомиопатией и связь этих показателей с нарушениями сократительной функции миокарда и коронарным атеросклерозом //Арх пат -1992 - Т 54 - №9 -С 12-18 3 Цыпленкова В Г , Постнов Ю В Диагностическая ценность эндомиокардиальной биопсии в кардиологической терапевтической клинике // Арх пат -1991 - Т 5 3 - №9 - С 38-43 4 Карупу В Я Электронная микроскопия - К Вища школа, 1984 - 162с 5 Автандилов Г Г Медицинская морфометрия Руководство - М Медицина, 1990 -384с Підписано до друку 06 10 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна