Спосіб визначення водного дефіциту листя рослин

Спосіб визначення водного дефіциту листя рослин, який передбачає збудження фотосинтезуючого об'єкта опроміненням його у діапазоні хвиль від 400 до 500нм та реєстрацію залежності флуоресценції від температури у діапазоні хвиль від 650 до 770нм, який відрізняється тим, що в ньому перед збудженням флуоресценції нативного хлорофілу листка рослини проводять його темпову адаптацію, потім опромінюють листок, приймають, виділяють, вимірюють та реєструють сигнал C2 2 (19) 1 3 85524 Найближчим за суттю до запропонованого способу є [«Способ исследования биологических объектов» SU 1254360, A1, G01N 21/64 от 30.08.86. Бюл. №32]. Спосіб прототип включає збудження фотосинтезуючого об'єкта опроміненням його у діапазоні довжин хвиль від 400 до 500 нм, нагрівання та реєстрацію залежності інтенсивності флуоресценції зразка від температури у діапазоні довжин хвиль від 650 до 770нм, селекцію фотосистем за піками термоіндукції, зокрема фотосистеми II за піком при температурі 50÷60°С і визначення за формулами відносного вмісту фотосистем, функціональної активності хлоропластів та генетичної стійкості рослин. Спільними рисами прототипу та запропонованого способу є збудження фотосинтезуючого об'єкта опроміненням його у діапазоні хвиль від 400 до 500нм та реєстрація залежності флуоресценції від температури у діапазоні хвиль від 650 до 770нм. Причиною, що зважає досягненню очікуваного технічного результату є те, що у способі прототипі не визначено флуоресцентні діагностичні ознаки, що корегують з водним дефіцитом листка, не визначено способу їх вимірювання та інтерпретації, а використані ознаки, зокрема β і γ піки термоіндукції визначені при температурах 50÷60 та 60÷70°С не корелюють з водним дефіцитом листка. Крім того спосіб прототип для реалізації потребує паралельних вимірювань на контрольній рослині для порівняльної оцінки. В основу винаходу покладена технічна задача створення такого способу, тобто вибору вимірювання та інтерпретації діагностичних ознак, який на основі вимірювань фізичних показників, зокрема характерних значень флуоресценції індукції та термоіндукції нативного хлорофілу, дозволить з мінімальними витратами праці і часу, без використання контрольної рослини надійно і експресне визначити у польових умовах дефіцит вологи у листях, тобто діагностувати вологозабезпеченість та посухостійкості рослин. Вирішення поставленої задачі досягається тим, що запропонований спосіб включає збудження флуоресценції фотосинтезуючого об'єкта опромінення його у діапазоні хвиль від 400 до 500нм та реєстрацію залежності індукції флуоресценції від температури у діапазоні хвиль від 650 до 770нм, а також тим, що в ньому перед збудженням флуоресценції нативного хлорофілу листка рослини проводять його темнову адаптацію, потім опромінюють листок, приймають, виділяють, вимірюють та реєструють сигнал індукованої флуоресценції і після досягнення стаціонарного значення флуоресценції листок нагрівають з постійною швидкістю підвищення температури нагрівання до 8÷10°С/хв, продовжуючи вимірювання сигналу флуоресценції, визначають максимальне та стаціонарне значення індукції флуоресценції, а також значення піку флуоресценції термоіндукції у діапазоні температур від 10 до 35°С, а водний дефіцит листка визначають за формулою 1æ F -F F -F ö D = Do + ç K1 st SO + K2 a st ÷ , 2ç Fm Fm ÷ è ø 4 де D - поточне значення водного дефіциту вологи листка; Do - оптимальне значення водного дефіциту листка; FSO - значення сигналу стаціонарної флуоресценції при оптимальному водному дефіциті; Fm - максимальне значення флуоресценції індукції; Fst - стаціонарне значення флуоресценції індукції; Fα - значення піку флуоресценції термоіндукції у діапазоні температур 10-35°С; К1, К2 - коефіцієнти, кореляції між дефіцитом вологи та значеннями флуоресценції індукції та термоіндукції. Відмінними ознаками запропонованого способу є те, що в ньому перед збудженням флуоресценції нативного хлорофілу листка рослини проводять його темнову адаптацію, потім опромінюють листок, приймають, виділяють, вимірюють та реєструють сигнал індукованої флуоресценції і після досягнення стаціонарного значення флуоресценції листок нагрівають з постійною швидкістю підвищення температури нагрівання до 8÷10°С/хв, продовжуючи вимірювання сигналу флуоресценції, визначають максимальне та стаціонарне значення флуоресценції індукції, а також значення піку флуоресценції термоіндукції у діапазоні температур від 10 до 35°С, а водний дефіцит листка визначають за формулою 1æ F -F F -F ö D = Do + ç K1 st SO + K2 a st ÷ , 2ç Fm Fm ÷ è ø де D - поточне значення водного дефіциту вологи листка; Do - оптимальне значення водного дефіциту листка; FSO - значення сигналу стаціонарної флуоресценції при оптимальному водному дефіциті; Fm - максимальне значення флуоресценції індукції; Fst - стаціонарне значення флуоресценції індукції; Fα - значення піку флуоресценції термоіндукції у діапазоні температур 10-35°С; К1, К2 - коефіцієнти, кореляції між дефіцитом вологи та значеннями флуоресценції індукції та термоіндукції. Введення у запропонований спосіб нових ознак, зокрема темнову адаптацію листка перед опроміненням, визначення максимального та стаціонарного значень флуоресценції індукції, нагрівання листка з постійною швидкістю збільшення температури тільки після досягнення стаціонарного значення флуоресценції, а також визначення пікового значення флуоресценції термоіндукції у діапазоні температур 10÷35°С, способу вимірювань та інтерпретації результатів вимірювань дозволило з мінімальними витратами праці і часу, без використання контрольної рослини експресно і надійно визначити у польових умовах водний дефіцит листя, тобто діагностува ти за функціональними ознаками вологозабезпеченість та посухостійкість рослин. 5 85524 Запропонований спосіб визначення водного дефіциту листя ґрун тується на використанні в якості діагностичних ознак біофізичних властивостей нативного хлорофілу, а саме флуоресценції індукції та термоіндукції. На Фіг. зображено криві індукції флуоресценції і термоіндукції при оптимальному зволожені листка І та при дефіциті вологи II. Поточні значення індукції флуоресценції проходять в часі фаз у плато 1, швидку наростаючу фазу 2, досягають максимального Fm значення 3, проходять повільну спадаючу фазу 4 і досягають стаціонарного значення. У випадку оптимального зволоження І це FSO (6, Фіг.), а при дефіциті вологи II це Fst (5, Фіг.). Пік Fα хвилі термоіндукції 7 при дефіциті вологи II. Перед вимірюванням здійснюють темнову адаптацію листка рослини. Це необхідно для приведення системи фотосинтезу в початковий стан та для одержання однозначних сигналів максимальної та стаціонарної флуоресценції. Тривалість адаптації від 3 до 120хв впливає на точність визначення максимального Fm (3, Фіг.) та стаціонарних Fst (5, Фіг.) і FSO (6, Фіг.) значень флуоресценції, особливо при опроміненні листка з інтенсивністю менше насичуючої. У нашому випадку стаціонарне значення флуоресценції Fst використовують як для визначення початку нагрівання листка для одержання сигналів термоіндукції так і для визначення дефіциту вологи листя. Тому для надійного становлення стаціонарної флуоресценції потрібна темнова адаптація на протязі не менше 3хв. Збудження флуоресценції хлорофілу виконують у спектральному діапазоні його поглинання, тобто в діапазоні фотосинтетично активної радіації (ФАР) від 390 до 730нм. В цьому діапазоні існують два основні максимуми поглинання нативного хлорофілу на хвилях 430 і 660нм та два слабо виражених (500 і 600нм). За межами цього діапазону збудження флуоресценції хлорофілу взагалі малоефективне. Крім того, інші пігменти рослин, що поглинають світло і передають енергію на реакційні центри хлорофілу, характеризуються максимумами поглинання у тому ж діапазоні. При збудженні флуоресценції на хвилях більше 500нм виникають значні суто технічні труднощі при виділенні сигналів флуоресценції у діапазонах хвиль від 670 до 770нм на фоні збуджуючого опромінення, оскільки в цьому випадку потрібні вузькополосні світлофільтри. Вибираючи хвилю збудження флуоресценції нативного хлорофілу, враховують, з одного боку, максимум поглинання (λ=430нм), а з іншого, технічні складнощі виділення сигналу флуоресценції на фоні опромінення, тобто λ≤500нм. Тому оптимальним для збудження флуоресценції хлорофілу є діапазон від 400 до 500нм. Джерелами збудження можуть служити сонячне проміння, ртутна лампа або лампа розжарення з відповідним фільтром, а також суперяскраві вузькополосні світлодіоди з необхідною довжиною хвилі. Флуоресценцію хлорофілу спостерігають в усьому діапазоні хвиль від 670 до 770нм з вираженими максимумами на 680 та 730нм. На хвилі 680нм її пов'язують здебільшого з роботою фотосистеми II, а флуоресценцію на хвилі 730нм - з 6 фотосистемою І. Тому вимірювання флуоресценції в усьому діапазоні від 670 до 770нм безпосередньо охоплює роботу обох фотосистем фотосинтезу. Сигнали флуоресценції на фоні опромінення виділяють з допомогою спектральних приладів, зокрема світлофільтрів з відповідною смугою пропускання від 670 до 770нм, наприклад, скляних або майларових. Прийом оптичних сигналів флуоресценції та перетворення їх для подальшого вимірювання в сигнали електричні здійснюють з допомогою фотоприймачів, якими слугують фотоелектронні перемножувачі або напівпровідникові фоточутливі елементи, зокрема фотодіоди чи фототранзистори. Після початку освітлення орієнтовно через 90 сек. поточне значення флуоресценції досягає стаціонарного рівня. Стаціонарну флуоресценцію Fіе (5, Фіг.) визначають шляхом порівняння двох поточних значень флуоресценції на відстані не більше 20 сек між ними. Умовою визначення стаціонарного значення є Fi-Fi+1≤0,5%Fm. З досягненням стаціонарного рівня Fst (5, Фіг.) починають нагрівання листка і вимірювання флуоресценції термоіндукції. Освітлену зону листка нагрівають з постійною швидкістю підвищення температури в межах 8÷10°С/хв. При нагріванні проявляються так звані хвилі термоіндукції, тобто поточні значення флуоресценції у діапазоні хвиль від 670 до 770нм проходять ряд пікових значень. Кожна з хвиль термоіндукції викликана певними фізіологічними процесами і проявляється у певному діапазоні температур. Так, у діапазоні фізіологічних температур від оточуючої до 35°С (до 90 сек) виникає α хвиля (7, Фіг.), пов'язана з впливом водного та світлового режиму на фотосинтетичні реакції. У процесі нагрівання листка продовжують вимірювання флуоресценції у діапазоні хвиль від 670 до 770нм. У проміжку після початку нагрівання і до температури 35°С виділяють пік (7, Фіг.) флуоресценції Fα, який визначають як значення одного з трьох послідовних вимірювань, яке більше за попереднє і наступне значення. Умовою визначення піку є співвідношення Fαi-1Fαi+1, де Fi - поточне значення. Пікове значення флуоресценції фіксують і на цьому вимірювання закінчують. Відомо, що при оптимальних умовах зволоження ґрунту, температури та вологості, повітря оптимальний водний дефіцит листя D0 рівний 8÷10% в залежності від виду або сорту рослини. Такий водний дефіцит листя забезпечує оптимальні умови транспірації і фотосинтезу. При цьому значення стаціонарної флуоресценції FSO (6, Фіг.) оптимальне. Порушення фотосинтезу під впливом збільшення водного дефіциту листя або інших чинників, наприклад, ураження вірусною строкатістю, викликає збільшення стаціонарної флуоресценції Fst в порівнянні з FSO. Тому збільшення Fst не можна одночасно ідентифікувати як вплив тільки водного дефіциту листка. Збільшення Fst є необхідною але недостатньою умовою водного дефіциту листка. При цьому водний дефіцит листка D визначають за формулою: F -F D = Do + K1 st SO Fm 7 85524 де Do - оптимальний водний дефіцит; FSO стаціонарне значення флуоресценції індукції при оптимальному водному дефіциті, Fst - поточне значення стаціонарної флуоресценції індукції, Fm максимальне значення флуоресценції, Кі - коефіцієнт кореляції між водним дефіцитом та стаціонарною флуоресценцією. Амплітуда піку 7 (Фіг.) (α-хвилі) термоіндукції Fα, визначена у діапазоні температур 10÷35°С при підігріванні листка теж залежить від дефіциту вологи листка відмінному від оптимального Do. При цьому дефіцит вологи визначають за формулою: F -F D = Do + K 2 a SO Fm де Fα - значення піку термоіндукції; К2 - коефіцієнт кореляції між водним дефіцитом та амплітудою піку термоіндукції. Збільшення Fα може бути викликане як збільшенням дефіциту вологи листка так і перезволоженням ґрунту тому тільки одночасне збільшення Fst та Fα та врахування обох цих показників при визначенні дефіциту вологи можна однозначно трактувати як збільшення дефіциту вологи листя. Крім того, індикатором оптимального дефіциту вологи листка може бути Fα≤Fst. Де фіцит вологи листя визначають за формулою: 1æ F -F F -F ö D = Do + ç K1 st SO + K2 a st ÷ 2ç Fm Fm ÷ è ø Порядок реалізації способу наступний: листок рослини, або його робочу зону витримують у темряві не менше 3хв, збуджують нативний хлорофіл робочої зони шляхом опромінення її у діапазоні довжин хвиль від 400 до 500нм, приймають, виділяють, вимірюють і реєструють сигнали індукованої флуоресценції, виділяють максимальне Fm та стаціонарне Fst значення флуоресценції. Після досягнення стаціонарного значення Fst починають нагрівання робочої зони листка із швидкістю наростання температури 8÷10°С/хв з одночасним вимірюванням сигналу флуоресценції термоіндукції і виділяють амплітуду піку термоіндукції Fα. Далі здійснюють розрахунок дефіциту вологи в листк у. Приклад застосування способу. Спосіб був застосований для визначення дефіциту вологи листя у лабораторних і польових умовах стаціонарних, дрібноділянкових та вегетативни х дослідах. У 8 польових умовах використовувались рослини які зазнавали природне періодичне затоплення та посухи. У ве гетаційних дослідах створювали умови періодичного затоплення та посухи. Об'єктами були листки яблунь. Вологість ґрунту визначали термостатно-ваговим способом та з допомогою тензіометрів. Показники флуоресценції нативного хлорофілу визначали з допомогою спектрального мікрофлуориметра та хронофлуорометра «Флоратест» [патент UA 12382] з оптоелектронним сенсором [патент UA 13481] з незначними доробками для вимірювання термоіндукції. Опромінення листків здійснювали на довжині хвилі 470нм. Вимірювання сигналу флуоресценції здійснювали через майларовий світлофільтр у діапазоні хвиль від 670 до 70нм. У ряді дослідів визначали стаціонарну флуоресценцію FSO при оптимальному зволожені ґрунту (80% ППВ) та оптимальному дефіциті вологи в листях (6-8%). При цьому F0=0,2F m. При умові засухи вологість ґрунту 30-40% ППВ водний дефіцит листя 16-18%, сигнал Fst=0,3Fm, а сигнал піку термоіндукції складав Fα=0,39 Fm. На основі експериментальних даних були визначені коефіцієнти К1 та К2 для листків яблуні усереднені по периметру крони дерева з урахуванням експозиції. Листки вибирались в середній частиш пагонів, вимірювання проводились в середній частині листка з 5 кратною повторністю. Так К1=70, К2=78. Запропонований спосіб визначення водного дефіциту листя рослин, як видно з його опису, може бути реалізовано у виробничих умовах з використанням серійних хронофлуорометрів, які здійснюють вимірювання та реєстрацію поточних значень флуоресценції індукції та термоіндукції. Експресне визначення дефіциту вологи безпосередньо у листях дозволяє оцінювати вологозабезпеченість рослин при нормуванні зрошення, діагностувати термо та посухостійкість рослин т. як дефіцит вологи визначають через фунціональні зміни фотосинтезу. Разом з хронофлуорометром «Флоратест» та відповідним сенсором, запропонований спосіб матиме промислове застосування при масових тестуваннях посадкового матеріалу садових і ягідних культур у відповідних господарства х, розсадниках, сорго-випробувальних станціях, тощо. 9 Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 85524 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601